Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Дигоксиноподобный ингибитор Na, K-АТФазы яда жаб Bufo marinus и роль его эндогенных аналогов у млекопитающих

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Дигоксиноподобный ингибитор Na, K-АТФазы яда жаб Bufo marinus и роль его эндогенных аналогов у млекопитающих"

На правах рукописи

f\ п

УДК 612.015.1;61:г.018:616.12-ООО.asi. 1

Дмитриева Г£натл Игоревна

Д11Г0|\0ИИ0П0Д0ЕНЬЙ ИНГИБИТОР Na.K-АТФазы ЯДА ЖАБ Bufo marinas И РОЛЬ ЕГО ЭНДОГЕННЫХ АНАЛОГОВ У МЛЕКОПИТАЮЩИХ

03.00.13 - Фиаиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1996

Работа выполнена в Институте эволюционной физиологии и Оиокимии им. И.М.Сеченова РАН

в

Научные рукашдители:

кандидат медицинских наук А.Я.Багров доктор Сиолоппеских наук H.H. Лукомская

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, лауреат государственной премии СССР В Л!. Лебедев кандидат биологических наук Г.П.Гусев

Ведущая организация: Государственный Медицинский Университет им. академика И.II.Павлова

Защита состоится << » 1996 г. в << Я ]>> часов на заседании диссертационного совета К 002.89.01 при Институте эволюционной физиологии и биохимии им.И.М.Реченоьа РАН (194223, Санкт-Петербург, пр. М.Торзаа, 44). 0 диооертацией можно ознакомился в библиотеке Института модсциоикЛ физиологии им. И.М.Сеченова.

Автореферат разослан <</[ у >>

Ученый секретарь диссертационного совета

Актуальность проблемы. В течение последних грех десятилетий во многих лабораториях мира ведутся интенсивные поиски эндогенных регуляторов активности Na.K-АТФазы. Уабаин-чувствительная На.К-АТФаза является одним из ключевых м-мбранних ферментов, регулирующих трансмембранннй транспорт одновалетных катионов (Na.K-наоос), одновременно являясь специфическим рецептором для ииги^и-торюв группы сердечных гликозидов. Взаимодействуя с узнающим участком Na.K-ATCPaBH, сердечные гликозиды вызывают угнетение активности Na.K-АТФазы и Na,K-Hacoca. Тот факт, что высокоспешфич-кнй и селективный рецептор для сердечных гликозидов сохранился в процессе эволюции у многих видов животных - веский аргумент в пользу существования природного лиганда этого рецептора. Вероятно, этот лиганд, названный эндогенным дигиталисоподобным фактором (ЭДФ), регулирует активность Na.K-АТФаэы и играет важную роль в 'осуществлении основных функций клетка. Были установлены биологические свойства ЭДФ : он стимулирует натрийуреа, вызывает вазо-констрикцип и положительный инотропный эффект, a тагае обладает дигсжсиноподоОной иммунореактивностыо (обзоры: Schoner, 1992; (totо et al.,1991)

ЭДФ млекопитающих, являясь натрийуретическиы фактором, играет существенную роль в поддержании водно-солевого баланса организма и принимает участие в патогенезе различных форм артериальной гипертензии (Haddy. et al, 1987;Gonick, 1986). . На различных моделях экспериментальной гипертензии (преимущественно при объем-вавксимых формах) было показано, что увеличение концентрации ЭДФ в плазме крови, первоначально имеющее адаптивное значение и направленное на выведение избытка натрия и воды, также играет существенную роль в развитии вазоконстрикции.По-видимому, избыточное образование ЭДФ приводит к угнетению натриевого транспорта в мембране гладких мышц сосудов, что, в свою очередь,активирует Na+ -Cat-+ обмен и способствует их сокращению (Blaustein et al., 1987).

Была изучена роль ЭДФ в патогенезе острого инфаркта миокарда (Багров и соавт.,1987,1989;Bagrov et al. ,1989). Вероятно, при состояниях, требующих увеличения работы сердца (в частности, при инфаркте миокарда), в плазме крови происходит повьшиСле концентрации эндогенного дигоксиноподобного ингибитора На,К-АТФазы. За--держха натрия внутри ииокардиоцитов приводит, как известно, к

увеличению концентрации внутриклеточного кальция. Это, в свою очередь, повышает сократимость миокарда. Следовательно, ЭДФ может являться физиологическим регулятором сократимости сердца (de Pover,1984; Navaratham et al.,1990; Bagrov et al. ,1991,1991a;' Kûiin et al. , 19У5).

Од unira, чрезмерное увеличение концентрации ДДО в пла-зме крови выбывает, вместо .физиологического эффекта, ч£енмерное угнетение активности На,К-АТФааи, что, в свою очередь, провоцирует развитие аритмий. Так де как и в рассмотренном вше примере с гипертонической оолезмыо, в этом случае важную роль играет "побочный" 3<f«î«KT первоначально адаптивного действия "ДО.

Вопрос о химической структуре 'ДО до настоящего времени остается открытым. Большинство исследователей считают, что эндогенный дигиталисоподобний фактор является сте^юидом и синтезируется г, коре надпочечников. Исследования последних лет показывают, что ткачи человека содержат несколько веществ, способных угнетать Na, К-АТФазу и впаимодейотвовать с антителами к дигоксину (Kelly et а 1.,1985; Shaikh et al.,1991;Doris,1994), но лишь уайаин бил выделен из плазмы человека и достоверно идентифицирован ( Ludens et al.,1991). Однако, уайаин ле может являться единственным эндогенным ингибитором натриевого насоса, играющим клмчевую роль в патогенезе гипертенэии, поскольку не является актш.иым вааококстрик-торо.ч (Yuan et. al., 1993).

Несомненный интерес при поиске ответа на вопрос о природе назоактивного ЭДФ млекопитающих представляют стероидные соединения класса оуфадиенолидов - эндогенные ингибиторы Ма,К-АТФааы, синтезируемые в паротидных железах и коже амфибий (Barbier et al.,1959; Fl 1er,1978), которые, в силу особенностей их эволюции (приспособление к смешанным-пресно-соленым ареалам), выработали особую систему, позволяющую обеспечивать гибкую регуляцию чрез-кожного транспорта натрия - Na,К-АТФаэу и ее регуляторы.

Недавно было показано (Ваgrov et al.,1993), что яд жзб Bufo marlnus, имеющий в своём составе буфадиенолиды , является активным ваао^нстриктором, что может свидетельствовать в пользу Оуфа-диенолидной природы ЭДФ.

Б качестве кандидатов на роль вазоактивного ЭДФ млекопитаю-шлх из соединений группы буфадиенолидов рассматривались ранее Оуфалин (Kieval et al.,1988; Cress et al., 1991; Panesar,1994) и

резиЯуфагенин (Licht.st.ein et aL.ltWî). Однако, убедительные данные о том, что эти соединения действительно удовлетворяют всем требованиям, предъявляемым к ЭДФ. a также сведения oó их реальном присутствии в органигме млекопитающих в литературе отсутствуют

Таким обрааом. учитывал возможность синтеза Оуфпдиенодидов в организме позвоночных , участие данного клялпа соеяи!«чшй г, тис теме, ci(it>c!TP4npri!nm.Pü регуляцию чрезышюго транспорта н.птрта у амфибий, их дигиталисоподсОную иммунореактивность , использование в традиционной посточной медицине препаратов кожи жаб в качестве положительная инотропних средств и диуретиков, а также ярко выраженные вазоконстрикторнне свойства яда жаб Bufo mai mus, исследование биологических свойств ЭДф кожи жаб и поиск их аналогов у млекопитающих, в том числе и у человека, является обоснованным и перспективным.

Цель и задачи исследования. Црль' данной р.чботы злкгазчаяпсь в проверке гипотезы о буфапиенолидной природ« 'Ш мдекопитлвщих.

В ходе работа ставились следующие конкретные задачи:

Поиск среди буфадиеколидов яда жаСы Bufo шаг i nus веществ, облэдчощих, наряду со способностью мигрировать На, К-нагое, свойствами, ожидаемыми от ЭДФ : вазоконстрик! " рной активностью и дигоксикоподобной ИММУНОреаКТИЕНОСТЬЮ.

2. Исследование фармакологических свойств выявленного вещества (мариноОуфагешна) и сравнение механизма его вазоконстрик-торного действия с механизмом вазоконстрикторного действия уабаи-на.

3. Получение поликлопапьных антител к млринобуфагенину и разработка флюороиммуномотричесюто метода, для определения его (или подобного ему соединения) в организме млекопитающих.

4. Изучение природы ЭДФ, образующегося при остром расширении, внеклеточного пространства у собак.

5. Определение уровня маринобуфагениноподобного вещества в организме человека в остром периоде инфаркта миокарда.

6. Выделение и идентификация эндогенного Суфадиенолида(ов) у млекопиташих.

Научная новнака. В работе впервые исследованы ва^оконстрик-торные свойства буфадиенолидов яда жаб Bufo marlruC и выявлено вещество, которое придает яду свойства, присущие эндогенному дигиталису. Этим веществом является стероидное соединение маринобу-

фагс-нин (3,5 гвдрокси 14,15 эпокси Оуфадиенолид).

Установлены различия в механизмах вазоконстрикции, вызванной' двумя различными ингибиторами натриевого насоса, маринобуфагени-ном и уабаином.

Впервые получены поликлональные антитела к маринобуфагенину, и на щ основе разработан флюороиммунометрический метод определения маринобуфагеникноподобной иммунореактивнооти.

Обнаружено, что образование маринобуфагенииноподобного фактора в организме человека значительно возрастает в остром периоде инфаркта миокарда и при экспериментальной патологии.

Впервые удалось выделить из мочи человека методом высокоэффективной жидкостной хроматографии вещество с маринобуфагенинопо-добнок иммунореактивноотью, физико-химические свойства которого оказались неотличимыми от свойств маринобуфагенина, что позволяет нам утверждать, что вазоактивным ЭДФ человека является маринобу-фагенин или его стереоизомер.

Научио-практическая ценность работы. В ходе данной работы из мочи человека был выделен и идентифицирован новый эндогенный регулятор активности натриевого насоса, аналогичный ЗДО синтезируемому в паротидных железах амфибий-маринобуфагенину. Разработанный нами на основе полигональных антител флюороиммунометрический метод исследования позволяет производить измерения мариноОуфагино-подобной иммунореактивнооти в различных тканях, в разных физиологических и патологических условиях, что позволит, в комплексе с использованием антител к маринобуфагенину в физиологических экспериментах in vivo и In vitro расширить наши знания о механизмах регуляции водно-солевого баланса и сердечно-сосудистой системы , а также патогенезе, профилактике и лечении заболеваний, связанных о нарушениями этой регуляции.

Реализация результатов исследования. Разработанный нами флюороиммунометрический метод определения маринобуфагениноподобной иммунореактиЕности был использован в клинике неотложной кардиологии НИИ скорой ПОМО1ЦИ им. И.И.Джанелидзе.

AnjXv-ацня работы.Основные результаты работы Рыли доложены на Международной конференции "Натриевый насос",{ ТодтмсюсС Германия, 1993), конференциях европейской секции Международного общества по исследованию сердца (Иерусалим,1993 и Копенгаген,1904), Ежегодном заседании Совета по Еысокому артериальному давлениюАме-

- б -

рикакской сердечной ассоциации (Чикаго,1994), 15 и 16 конференциях Американского общества гипертензии (Нью-Йорк, 1995,1990)

Структура и объём работы. Диссертация изложена на j страницах машинописного текста, состоит ил введения, обзора литературы, результатов исследований, изложенных в 5 главах, каждая из которых состоит из описания материалов и методов, результатов и их обсуждения; заключения и юлкодсв; списка ясполг.черной литературы, который содержит /2-<? райот. Работа содержит ííñ рисунков и 1 таблицу.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Получение яда и его первичная обработка. Взрослые жабы обоего пола были получены.из Санкт-Петербургасаго и Латвийского (Рига) Зоологических парков. Яд получали , ..еуег and Linde, 1971) чз околоушных (паротидных) желез, аккуратно надавливая на их основания. При температуре 30°С яд кристаллизовался в течение нескольких дней и в дальнейшем хранился при t 1~10°С.

Еццеленке стероидной фракции яда, качесгоенный анализ оё состсва. 2 г. хорошо высушенного секрета жабы Bufo marlnus экстрагировали хлороформом в аппарате Ссксклета в течение шестг часов. Растворитель удаляли в вакууме и получали 170 мг. сухого остатка, представляющего собой стероидную фракцию секрета (K.Meyer, 1959), Небольшую порцию полученной смеси растворяли в минимал'лом количестве этилового эфира уксусной кислоты и анализироалн методом тонкослойной хроматографии.(ТОО. .

Пластинки Sllufol UV 254 предварительно активировали в течение часа при 100°С; в качестве элюэнтов использовали этилацетат и систему этилацзтат : ацетон (9:1). Идентифицировали стероиды по хроматографтческой подвижности ( Rf ) в указанных системах э.газн-тов (R.Zelnlk,1362) и по цветной реакция со SbClS (K.Meyer, 19Ь'.'). Реакцию с трихлоридом сурьмы проводили следующим образом : пластинку тщательно высушивали от растворителя и смачивали 10S раствором SW313 в хлороформе. Затем пластинку нагревали в термостате при 80°С в течение 5-10 минут до развития характернее для данных соединений окраски. В качестве эталонных соединений ^пользовали 'коммерческие препараты Bufalln и Cinobufagln (фирмы 51ЭИА).

Препаративное выделение стероидов из ядя «аб Bufo mariñus.

Препаративное выделение стероидов осуществляли методом ТСХ на пластинках Kieselgel 60 F £54+366, 20x20 cm ( фирмы MERCK); в качестве элю.-) н та использовали этиловый эфир уксусной кислоты. Вымывали фракцию, дающую соответствующую данному стероиду качественную реакцию.Растворитель удаляли при пониженном давлении.

Исследование вааоконстрикторной активности веществ на препаратах аорты крысы и легочной артерии человека. Кольца сосудов (22,5 мм диаметром), немедленно после Еыделения подвешивали под нагрузкой ( 1 г.) в термостатируемые ванночки объемом 10 мл, содержащие питательный раствор ( в мМ : NaCl-130 KCl-4,7 CaClE -1,8 MgClS -1,0 NaM2P04 -0,4 NaHC03 -19, ГЛЮКОза-5,4 ), через который пропускали смесь 95Z кислорода и 5Z углекислого газа. Сокращения регистрировали в изометрическом режиме, используя датчик на тен-зорезисторах КТД-2Б, запись сокращения производили на перьевом самописце Н-338. Через 60 минут после помещения изолированных колец аорты в ваннчку, кумулятивно вводили увеличивающиеся концентрации исследуемых препаратов.

Определение активности уабаин-чувствительного Na,К-насоса в препарате аорты крысы. Активность Na,К-насоса в препарате аорты крысы определяли методом, основанным на использовании изотопа 8öRb+, трансмембранный транспорт которого в условиях эксперимента идентичен транспорту ионов калия (Hougen.1981).

Кольпа аорты диаметром 2-2,5 мм и весом 3-5 мг инкубировали в течение 30 мин в питательном растворе N1 (мМ): Na0l-12ü КС1-4 СаС]2-b,6 MgCi2- 2,0 NaHC03-24 глюкоза -5,6 (pH- 7,4 , t>32°C), через который пропускали смесь 95Z кислорода и БХ углекислого гааа. Затем препараты переносили в прбирки с питательным раствором такого же состава, но со сниженной концентрацией KCl (2мМ), в которые дооавляли исследуемые вещества и раствор 86 RbCl с таким расчетом, чтобы концентрация ионов КЫ не превышала 0,1 мМ. Измерения проводили в двух параллельных сериях - в присутствии и в отсутствие уабаика (1 мМ) . Пробы инкубировали при t>32°C в течение ХЛ-нин , не прекращая пропускать через раствор смесь кислорода и углекислого газа. Затем кольца аорты промывали питательным раствором N1, взвешивали и помещали в прОирки, содержащие 5 мл дистиллированной воды. Радиоактивность проб определяли через 1 «ас (по Черепкову) в гамма счетчике (LKB-Wallac).

Основываясь на постоянном соотношении K/Rb в среде инкубации, .активность Na, К-насоса определяли как разность в захг.ато рубидия в присутствии и в отсутствие оуабаина и выражали в пМ к /мг владного веса ткани / 15 мин.

Определение уэбанноподобной иммунореаитивности. Уровень содержания уабаиноподобной иммунореактивнооти определяли при помощи модифицированного коммерческого набора (Ouabain ELISA Kit фирм» New England Nuclear). Ячейки микрогитрационных пластинок били покрыты уабаиновым коныогатом. После внесения стандартов и исследуемых проб вносились первичные антитела ( 50 мкл). Второй этап инкубации подразумевал использование вторичных антител, конъюги-рованннх с пероксидазой хрена. Однако, мы использовали вторичные антитела goat -antirabblt, меченые европием (производство фирмы Wallac-Oy, Финляндия). После второй инкубации в лунки вносили по 200 мкл проявляющего раствора и в счетчике (1234 Delfia Arcus флуориметр) определяли конц> нтрацж осажденного европия.

Определение дигоксиноподоОной нымунореаитивности. Способ определения дигоксиноподобной иммунореактивнооти бил аналогичен способу определения уабаиноподобной иммунореактивнооти. В качестве первичных антител мы использовали антидигоксиновие антитела (Sigma Chemicals) в разведенки 1/8000 - 1/12000.

Определение маринобуфагенмноподобной иммунореактитюсти. Метод был впервые разработан нами на основе поликлональных антител .. к маринобуфагенину. . Разработка метода состояла из двух этапов : получения поликлональных антител и собственно разработки флюоро-иммунометрического метода определения маринобуфагениноподо&ной иммунореактивности.

Для получения конъюгатов маринобуфагенина с бычьим сывороточным альбумином (БСА) и РНКазой, необходимых для иммунизации и покрытия твердой фазы для разделения сред, мы остановились на методе, описанном ранее для конъюгации с указанными белками дкгок-сина и уабаина (Curd and al., 1971). Метод основан на периодатном окислении углеводного остатка с последующим взаимодействием образовавшихся карбонильных групп со свободными аминогруппами белка. Так как маринобуфагенин представляет собой агликон, необходимо было предварительно синтезировать маринобуфагени;Сз- гликозид. Синтезировали этот гликозид по методу, описанному ранее для аль-" достерона, введя незначительные модификации . Иммунизацию кроли-

- в -

ков, выделение, очистку и контроль качества поликлональных антител проноЫ'Дили по стандартным методика (Катти,1901 )

Дли иммунизации хиеотиих мы использовали котюгат маринобу-фагенина с DCA, в качестве покрытия твердой фазы для разделения сред Сил испсльзовак кг.казглт магл«ю0у(1-аташа с РНКавой. Первым этапом разработка метода бил подбор оптимальной тьордой фазы . В лучк,-. мумслроципет.глиошп« пластин к.".по ил я по 1 Ci t midi раствора конмыахл к.-.н--инос.у'1дг«1Шй • I'iiKtisa. в возрасти щнх концентрациях из р-юч'-та 0,01 2,0 мкр/'iyîiir/. К качестве ссн^Лишюгииюпного буфера испсльгокши фосфатный Суфор (РВ:3). Пар. ил ель по контрольные л; нки ri'ji тыкали рапсорсм РМКэды в тех же концентрации.-.. Пластинка ин-к/(щ-пьак'л при ког.шатнсй темпс-рлтуре в точгние- 20 чгюов, после ч«го ::;:омывали 6 pas физиологическим ряотвпром : перше три раза с Тнин-ЙО (УХ) затем три раза - без детергента. Затем иммобилизи-ровпниый коныигат в течение паса инкубировали с заведомо избыточным количеством (ржведе.'ше 1/ЯЮ) антишринобуфагениновой антисыворотки ( 100 ыкл-'лунку ), поело чего содерлимсо лунок удаляли, лунки дпакды промипапи физиологическим раствором и вносили в них вторичные антитела (моченые европием goat-aritirahbit, Wallao-Oy,Финляндия) в рекомендуемой производителем концентрации (100 мкл/лунку). После часовой инкубации лунки промывали 6 раз, вносили по SCO мкл проявляющего ра'.твора и в счетчике (1234 Déifia Агоия флуориметр) определяли концентрацию оогвденного ев-рюпия,

Концентрация 1 миг/лунку, находящаяся в середине линейного участка кривой была признана оптимальной. Оптимальными разведениями первичных и вторичных антител оказались 1/4000 и 1/400, соответственно. Таким образом была получена рабочая калибровочная кривая в диапазоне от 10-12 до 10-4 моль/л. Естественно, в условиях конкретного эксперимента не было необходимости работать во всем диапазоне кривой, и мы пользовались участком от 0,001 до 100 нмодь/л. .

ЗДФ при остром инфарлте шяжарда (OHM) у ладей. Исследование било про—цено в НЯИ агорой помощи им. И. И. Джанелидзе (Ст-Петер-бург), с января 1994 по апрель 1995. В исследование включали пациентов, госпитализированных в отделение реанимации клиники неотложной кардиологии по поводу первого трансмурального ОИМ. (Минесоттский код i-1-i, 1-2-5, 1-2-6, 1-2-7) Пациенты с неста-

Оильной стенокардией, госпитализированные с подозрением на СШ и впооледотвие не подтвержденным, составили контрольную группу. Никто из обследуемых не принимал ранее препараты дигиталиса и не имел а анамнезе заболеваний, связанных с погашением концентрации ЭДФ в плазме крови (гипертенсшя 11-111, заболевания печени или почек, эндокринные рассторойства).

Венозную кровь забирали а 1, 2. 3, 4-5, V-10 и 14 дни от начала заболевания. Плазму отбирали, неполярную Фракцию экстрагировали на колонках оСращеино-фазовых Sep-Pak С18. Предварительно каядую колонку промывали 5 мл дистиллированной воды, затем 5 мл ацетонитрила и опять 5 мл дистиллированной воды. П^сле этого на колонку наносили пробу плазмы (0,2 мл), вымывали полярную фракцию 1 мл дистиллированной воды и затем элюировапи неполярную фракцию 40% ацетонитрилом. Растворитель удаляли в вакууме, концентрацию мариноОуфагениноподобного фактора в плазме определяли с использованием разработанного нами флюороиммунометрического метода для определения маринобуфагениноподоОной иммунореактивности и выражали в виде нмоль / л "маринобуфагениновых" эквивалентов.

Результаты анализировали статистически, используя и-тест Манна-Уитни и программу ANÜVA для повторных измерений.

Определение среднесуточного выведения маринобуфагашнопоЕоб-иого фактора человеком. Собирали суточную мочу и отбирали пробы по 1 мл. Концентрацию мариноОуфагениноподобного фактора в пробе определяли флэтороиммунометрическим методом и. вычисляли суточное выведение марияобуфагениноподобного материала.

Природа ЗДФ, образуннцегося при остром расширении внеклеточного пространства (РВП) у собак. Эксперименты были поставлены на 14 беспородных самцах собак массой 10-16 кг. За 24 часа до опыта животных не кормили и не поили. Непосредственно перед опытом животным проводили премедикацию (фенобарбитал 17 мг/кг, в/в). В течение эксперимента общая анестезия поддерживалась внутривенным капельным введением 0.5Х раствора тиамилата натрия.Животные были интубированы и в течение эксперимента находились на искусственной вентиляции лёгких смесью из 507. кислорода и Еоздуха. Правая и левая бедренные вены были катетеризированы поливиниловым и катетерами для введения физиологического раствора и измерения^/артериального давления (Ohmeda 7000). Правая плечевая вена была' катетеризирована для забора проб крови. Мочевой пузырь катетери-

пировали для сбора мочи.

Образ да венозной крови (2 мл.) собирали в гепаринизированные пгюбирки клвдне 5 минут в течение первых СО минут эксперимента и каяда«* 30 минут в течение последующих 1Ь0 минут, центрифугирояа-ли, полученную плз'му хранили при -?0 С до определения концентрации щ>. Концентрацию ЗДФ определяли фдюороиммунометрическим методом .

Животные были разделены на три экспериментальные группы. Пяти собакам вьоднли только изотонический физиологический раст--лор. Ь животным за 4Ь минут до РЬП вводили поликлонадыше актиди-гексикоше антитела (50 мкг/кг в обьеме Я мл, ЬМрпа СЬеписа!;;). Для того, чтобы исключить неспецифические решедии, связанные с введением антител, 4 животным за 45 минут до РКП вводили контрольные (кроличьи л.нтимышиныо) антитела.

Исследование »¡очи чолэшжа методом имоокоэ&Н'нтншюй жпд-доденвй Первый этап исследования заключался в по-

лучении концентрировгшного экстракта мочи и выделении из него фракции с климатографическими свойствами, близкими к мариноОуфа-генину. .С этой целью 5 литров мочи экстрагировали 7,5 литрами хлорсфпрма, хлороформ удаляли при пониженном давлении, сухой остаток растворяли и минимальном количестве этилацетата и разделяли на фракции методом препаративной тонкослойной мюматог рафии, используя в качестве злюэнта ятилацетат. Зону и хроматогр.чфнческой подвижностью, соответствующей Я мзринобуфагенина в указанных условиях, вымывали ацетонитрилом и использовали для дальнейшего анализа.

Напученный экстракт анализировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке Ш.ТАРАК С18 ЗООА 3.9х1ГО , на!.»-; еЦзоп (модель 303, детектор модели 116). Колонку уравновешивали 0,1^ раствором трифторуксус.ной кислоты, исследования проводили в линейном градиенте ацетокитрила от 107. до 807. (О,IX трифторуксусной кислоты) и в иаократном режиме : 22.7. ацетонитрила (0,12 трифторуксусной кислоты), скорость подачи алюэнта на колонку составила 1 мл/млн. Поглощение регистрировали на 230 и 300 нм. Эта часть исследования была выполнена на оборудовании лаборатории химии пептидов ст. Петербургского института Особо Чистых Биопрепаратов совместно с Казаковым Г.П.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛГЛОВМШИ И ОБСУВДКНИЕ

Поиск вааоактивтог ву^алиеиол«о» из стороедчой ^¡».чнцик «.«л Мб ВнГо глаг1гш5. На данном ят.чпе проведииия -жспс-римг'н ел п' ^ -д нами всталд задача идентифицировать вещество (иди вещества). которым яд зелбн обязан свойствами, характоржлш ;;д;т С'Л1. С цмллт стероидная фрякцш» ада Ома иесл<»довгнп япмч качеоги^гжо методом ТСХ с примечи „ием характерных для буфлдленолидов цв«тннх реакций с хлоридом сурьмы, и разделена на ф[--иим. /.денткфициро-вать удалось 6 веществ.

Идентифицированные вещества были выделены и исследованы на ваг-оконстрикторную активность. Лишь одно вещество - маринобуфаге-нин - оказалось активным вагоконстриктором. Кром»? того, оно янля-ется главной составляющей частью стероидной фракции яда и, вероятно, именно его присутствиям объясняется' наличие у яда свойств, характерных для ЭДФ.

Результаты качественного анализа смеси представлены в таблице:

вещество КГ окраска со ЭЬС13 вазоионстрикцчя

(этклацетат)

р"зибуфагенин 0,75 фиолетовый +

буфалин 0,66 серо-голубой +

маринобуфагенин 0,50 зелено-коричневый +++

телоциноОуфагин 0,41 голубой +

гамабуфаталш • ■ 0,34 лиловый

геллебригенин 0,30 желтый +

Фармакологическое исследование вааоактивиого ЗД<£ яда каб Bufo marimís-мэринобуфагенина. сравнение с уабаином. Данная серия опытов была посвящена исследованию механизма действия выявленного вазоактивного ЭДФ и сравнению его действия с действием другого кандидата на роль ЗДФ - уабаина.

Как показано на рисунке 1 , сокраа, -лия колец аорты, вы?ванные уабаином (10-10G мкм/л), не имели выраженного дозазависимого характера и были относительно слабыми. Кроме того, развивались они медленно, достигая максимума спустя 15 минут nocv- введения препарата. Развившееся в ответ на введение уабаина сокращение-блокировалось фентоламином, а предварительная инкубация кольца

аорты с Фентоламином (2 мкм/л) предотвращала развитие сокращения в ответ на последующее введение уабаина.

Поликлональные антитела к дигоксину не оказывали влияния на вызванное уабаином сокращение.

Сокращения, вызванные маринобуфагенином (рис.1 ), имели устойчивый, дозл^ависимый характер, развивались быстро, достигая максимума в течение 1-3 минут.

+ Й

контроль

-5 -4 1одС(моль\л)

3

я

А о

К т ы

£ к

Ю л

н ч

" о

V

I

ж

о

кип 1(10,,И,

-6

-5 -4

1одС(моль\л)

Рис. 1. Вазоконстрикторные эффекты маринобуфагенина и уабаина на изолированных кольцах аорты крысы. ® уабаин

А маринобуфагенин Ш маринобуфагенин в присутствии

антител к дигоксину М ± т; п»0-9; *Р<0,05 по сравнению с контрольным значением; **Р<0,01 по сравнению с эффектом маринобуфагенина в отсутствие антител к дигоксину

Рис.2.Действие уабаина и маршюбуфагенина на активность Иа.К-насоса ( уайаин-чувствительный захват К'Ь) аорты крысы, ©уабаин

Оуабаин в присутствии фентол-

амина (2 мкм/л) Д маринобуфагенин Дмаринобуфагенин в присутствии фентоламина (2 мкм/л) М ± т; п«6-9;1*Р<0,05 по сравнению с контролем;**р<о,05 по сравнению с эффектом маринобуфа генина в отсутствие фентоламина

Предварительное введение фектоламина (2 мкм/л) не влияло на характер вызванных маринс^уфагенином сокращений , раавившееся в ответ на введение мариноо, ¿югенина сокращение фентоламином не блокировалось. Поликлональные антидигоксиновые антитела (15 мкг/мл)блокировали вазоконс.триктсрный эффект маринобуфагенина.

На рисунке -Z ¡¡о.сааано, что в концентрации 10 мгал/л уабаин стимулировал, а в более высоких концентрациях yiнетал активность На, К-насоса в изолированных кольцах аорты крысы. Предварительное введение фентоламика (2 мкм/л) предупреждало развитие стимуляции активности насоса, однако не влияло на ингибиторный эффект высоких концентраций уабаина. В контрольных экспериментах фентоламин не имел собственного влияния на активность натриевого насоса в аорте крысы. В отдельной серии из 4 экспериментов норадреналин (2 мкм/ л) активировал натриевый насос в изолированных кольцах аорты крысы (3.710,4 и 11,7+2, нмоль К+ 30 мин/мг ; Р<0,001).

Маринобуфагенин дозазаЕисимым образом вызывая угнетение ж-тивности натриевого насоса в аорте крысы (рисунок 2) . Счзнтоламин (2мкм/л) не влиял на угнетение натриевого насоса маринобуфагени-ном.

Важным результатом данной серии экспериментов является тот факт, что , в отличие от уабаина, ни вазоконстрикторные свойства маринобуфагенина. ни его способность угнетать Na, К-насос не являются чувствительными к блокаде адренорецепторов фентоламином. Эти наблюдения позволяют нам сделать выводы о различных механизмах возникновения вазоконсирикции, вызываемой этими соединениями. Тот факт, что и стимуляция насоса, и вазоконстрикторный аффект уабаина блокировались фентоламином, говорит о Том, что, вероятно, (а) стимуляция Na,К-насоса била обусловлена выделением норадреналика из интрамуральных нервных окончаний сосудистой стенки ; (б) сокращение аорты в результате действия уабаина имеет преимущественно нейрогенное происхождение.

То, что маринобуфагенин угнетает Ыа.К-АТФазу (Shlmada al.,1985) и вызывает положительный инотропный эффект на npenapci тах сердечной мышцы (Chen and Kovarlkova, 196") , было показано ранее. Однако, механизм вазоконстрккторных эффектов маринобуфагенина до настоящего времени не был проанализирован. В отличие от y.'W'. :..:. маринобуфагенин не стимулировал активность натриевого насоса; при этом ни вазоконстрикция, ни угнетение натриевого на-

coca, вызванные маринобуфагенином, фентоламином не блокировались. Таким образом, вазоконстрикторный эффект маринобуфагенина может быть связан непосредственно с угнетением Na,К-насоса клеток гладких мышц сосуда. Ранее было показано, что сокращения, вызванные •ингибиторами Na,К-насоса, могут быть либо "миогенного", либо "нейрогенного" происхождения, в зависимости от вида животного и типа исследуемого кровеносного сосуда ( Adams et al.,1983; Marin et al.,1988). В нашем исследовании мы показали,. что сокращения аорты крысы , вызванные двумя различнми ингибитрами натриевого насоса, маринобуфагенином и уабаином, реализуются различными механизмами. Кроме того, результаты параллельных исследований, проведенных сотрудниками наший группы, свидетельствуют о том, что маринобуфагенин и уабаин являются лигандами двух рецепторов для ЗДО в сосуде, представленных двумя субъединицами Na,К-АТФааи: на мембранной фракции, содержащей мембраны гладкомьцпечных клеток и альфа-1 суб'ьединицу Na, К-AT1* чпы, маринобуфагенин обладает существенно большей активностью, тогда как уабаин более активен на мембраной фракции, содержащей мембраны нервных окончаний сосудистой стенки и альфа-3 субъединицу Na.K-АТФазы (Bagrov et al., 1996).

Различия в механизмах вазоконстрикторных эффектов, вызываемых маринобуфагенином й уабаином, косвенно подтверждаются и их различной иммунореактиЕНостью: маринобуфагенин показал в 20 раз более высокую перекрестную иммунореактивность с антидигоксиновыми антителами, чем уабаин. Таким образом, результаты данной части исследования убедительно показывают, что быстро действующий ингибитор Na+,K+-насоса маринобуфагенин регулирует тонус сосуда независимо от нейроэффекторного взаимодействия в стенках сосуда, вызывая сокращения, непосредственно связанные с угнетением натривого насоса гладкомышечных клеток. Полученные результаты можно рассматривать как подтверждение гипотезы о буфадиенолидной природе ЭД1 млекопитающих.

ЗД* ори остром инфаркте миокарда у людей. Ранее было показано, что у больных в острейшем периоде ОИМ существенно возрастает способность плазмы кроеи к угнетению Na.K-АТФазы и одновременно увеличивается концентрация ЗДФ в плазме крови (Bagrov et al.,1991;Bagrov et al.,1991a). Цель данной серии экспериментов

заключалась в исследовании изменения уровня эндогенного маринобу-фкчгениноподобного фактора в плазме крови у Сольных ОИМ.

В исследование были включены 14 пациентов с ОИМ (10 мужчин и Л женщины в возрасте от 50 до 72 лет, и 10 больных с нестабильной стенокардией и подозрением на ОИМ (40 -67 лет). Было установлено, что суточное выведение маринобуфагениноподоСиой иммукореактишгас-ти с мочой у пациентов в течение Первых суток после начала ОИМ было значительно поь'игено (ГСиЮ нмоль) по сравнению с больными нестабильной стенокардией (10t.4 нмоль). Как показано на рис.3, на 5 сутки после развития ОИМ концентрация ЭДФ в плазме снизилась до уровня контрольных значений (0,51.0,03 нмоль/л), тогда как в течение первых суток ОИМ наблюдалось ее существенное увеличение (1.5+ 0,5 нмодь/д).

Результаты данного исследования показывают, что концентрация марннобуфагенилоподобного фактора в плазме крови у болы;'« в первые сутки ОИМ существенно превышает уровень содержания этого вещества у больных нестабильной стенокардией.Эти данные согласуются с ранее полученныеми результатами, свидетельствующими о повышении способности плазмы крови больных и экспериментал1 гных животных с

о

о 24 48 72 96 120 144 168 192 216 ВРЕМЯ С МОМЕНТА НАЧАЛА ОИМ (р ЧАСАХ)

Рис.3. Изменение маринобуфагениноподобной иммунореактивности план . крови Сольных ОИМ. О больные ОИМ фконтрольная группа

ОИМ к угнетению Na.K-АТФазы (Багров и соавт.,1987; Bagrov et al., 1989; Bagrov et a]., 1993). Отсутствие изменений маринобуфагенино-подобной иммунореактивности в плазме у больных с нестабильной стенокардией дает возможность предположить, что повышение у|ювня маринобуфагениноподобного фактора в плазме крови больных с ОШ было скорее всего связано с уменьшением сердечного выброса, а не являлось стрессорной реакцией, связанной с ангинозным приступом и Госпитализацией.

Природа ЭДФ, образующегося при остром расширении внеклеточного пространства у собак. Одними из первых экспериментов, показавших существование циркулирующего ингибитора Na.K-АТФааы в плазме крови млекопитающих, были опыты по острому расширению внеклеточного пространства (Р8П) (Pamnanl et al.,1991). В серии опытов, поставленных преимущественно на собаках, было показано, что быстрое внутривенное введение значительного объема изотонического раствора хлористого натрия приводит к стимулированию диуреза, нагрикуреза и сопровождается выделением ЕЩФ. Целью наших экспериментов было исследование возможной роли эндогенных маринобуфагениноподобных и уабаиноподобных факторов в реакции на острое расширение внеклеточного пространства (РВП) у собак. Для блокирования эффектов ЭДФ in vivo мы использовали по-ликлональные антитела к дигоксину, которые, как уже было показано, обладают способностью связывать маринобуфагенин.

До начала РВП уровень содержания маринобуфагениноподобной и уабаиноподобной иммунореактивности в плазме крови составил 0.Э0 + 0,16 нмоль/л и 0,019 ± 0,004 нмль/л соответственно.

В течение первых десяти минут РВП концентрация, маринобуфагениноподобной иммунореактивности в плазме крови увеличилась до 11, 87 + 3,15 нмоль/л (р < 0,01). Затем уровень маринобуфагениноподобной иммунореактивности снизился, и второе его увеличение в плазме крови произошло через 90 минут после' начала РВП. Уровень уабаиноподобной иммунореактивности в плазме крови в течение пер-вык 25 минут РВП увеличился в меньшей степени : 0,139 + 0,056 нмоль/л (р < 0,05 ). В период с 90 до 180 минут после начала РВП произошло второе увеличение уабаиноподобной иммунореактивности в плазме крови : 0,196 + 0,136 нмоль/л ( р < 0,05 ).

Максимальное выведение маршюбуфагениноподооной юшуиореак-тиьности с мочой наблюдали в течение первых 30 минут РВП ( 5763 + 1123 рмоль). В течение последующих 150 минут выведение ее постепенно снизилось на BOX (667 + 221 рмоль от 150 до 180 минуты РВЯ) Такой же была динамика выведения уабаиноподобной иымунореактив-ности. Предварительное введение животным антител к дигокс-ину приводило к существенному снижению выведения мар^ноГ>уфглГ(?кшюподоО~ ной имм^'но(у>пктизчостй и не влияло на экскрецию уяоаипоподобного фактора ( рис.4 ).

Таким образом, в данной серии экспериментов расширение внеклеточного пространства путем инфузии изотоничесюго раствора хлорида натрия в большей степени стимулировало образование эндогенного маринобуфатингаподоОного вещества, чем уабаиноподобного фактора. Поскольку это вещество связывалось антителами к дигокси-ну, есть основания полагать, что активируемый объемной нагрузкой ЕДО представляет собой эндогенный буфадиенолид.

^ т

Рио.4 Выведение маринобуфагениноподобного (А) и уабаиноподобного (Б) факторов в течение РВП у соОак. О Оеа предварительного введения антител к дигоксину Si с предварительным введением антител к дигоксину

0-30 30-6060-90 90-12012°-15(>150~180 ВРЕМ Я (мин)

Выделение и идентификация маринобуфаген.шоподоОного вещества КЗ мочи человека. У аяти здоровых людей нами было определено им-мунофлюорометрическим методом суточное выведение мариноОуфагени-ноподобного вещества: оно составило 8,2 +2.9 нмоль/день (средний суточный диурез составил при этом 967 + 201 мл). Из этой мочи был получен концентрированный экстракт, который- исследовали методом высокочувствительной жидкостной хроиатографии. В качестве стандартов использовали уабаин, маринобуфагенин. дигоксин. Суфалин и спироколактон . Ни одно из этих веществ совместно с маринобуфаге-нином не элюировалось. Раствор препарата в ацетонитриле наносили на колонку и элюировали 322 ацетонитрилом. Каждую минуту меняли приемник и определяли уровень мариноОуфагениноподобной иммуноре-активности в каждой фракции.

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ ФРАКЦИИ (мин) ' ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ ФРАКЦИИ (мин)

11 10 987654321

11 10 987654321.

Рис. Б. А.Профиль атоции экстракта мочи.

Б.Профиль алюции экстракта мочи в присутствии стандарта

— 11 10 987654321

ХРОМАТОГРАФИЧЙСКИЕ ФРАКЦИИ (мин)

В.Профиль злюции марино-буфагеииноподобной иммунореактивности

Как показано на рис.5, более 902 материала с маринобуфагени-ноподобной иммунореактивностью элюировалось на 8 минуте 32 X аце-тонитрилом. Там же показано, что добавление маринобуфагенинового стандарта к экстракту мочи дало четкое увеличение пика, соответствующего фракции 8 УФ спектр поглощения фракции 8 соответствовал УФ спектру поглощения, характерному для буфадиенолидов, в том числе и для маринобуфагенина.

Количественное выделение маринобуфагениноподобного вещества производили из мочи больных острым инфарктом миокарда по аналогичной методике. Было выделено 200 мкг вещества, проявившего ма-ринобуфагениноподобную иммунореактивность, имеющего УФ спектр поглощения, характерный для Оуфадиенолидов и хроматографически неотличимого от маринобуфагенинового стандарта. С выделенного вещества был снят масс-спектр, который тагане оказался практически неотличим от масс-спектра маринобуфагенина (рис.6).

100

%

о 100

%

365.2

......

401.2 1м+н1*

383.2

402.2 403.2

423.1

Оа/е

401.2

а

365.2 383.2 ¡зв4.2 402.2 403.2 423.1

, 1,111, 1-1,1 -л гЛЛ,............... >'||м,щ..........

340 350 360 370 380 390 400 410 420 430 440 450 4б0

не. 6.Масс-спектр маринобуфагенина (А) ;

Масс-спектр вещества, выделенного из мочи человека (Б)

б

ВЫВОДЫ.

1. Показано, что вещество из яда жаб Bufo marinas, обладающее дигоксиноподобной иммунореактивность» , вазоконстрикторныма -свойствами и способностью угнетать натриевый насос аорты крысы отличается от ранее описанных вазоконстрикторных ЭДФ (уабаин,бу-фалин.резибуфагенин) и является буфадиенолидом маринобуфагенином ( 3 ,5 гидрокси-14,15-эпокси буфадиенолидом)

2. Исследованы фармакологические свойства маринобуфагенина в сравнении с уабаином ; установлено, что что сокращения аорты крысы , вызванные двумя различнми ингибитрами натриевого насоса, маринобуфагенином и уабаином, реализуются различными механизмами. Ингибитор Na; К-насоса маринобуфагенин регулирует тонус сосуда, вызывая сокращения, непосредственно связанные с угнетением натри-вого насоса гладкомышечных клеток.Вазоконстрикторный эффект уаОа-ина связан с освобождением норадреналина из интрамуральных нервных окончаний. Эффект сопровождался стимулированием Na.K-АТФазы. 3. Получены поликлональные антитела к маринобуфагенину и на их сю-кове разработан флюороиммунометрический метод определения уровня мариноОуфагилоподобкой иммунореактивности.

4.Установлено, что острое расширение внеклеточного пространства путем внутривенного введения значительного количества изотонического раствора хлорида натрия в большей степени стимулирует образование эндогенного маринобуфагениноподобного фактора, чем эндогенного уабаина.

5.Показано, что в организме здоровых людей содержится мари-нобуфагениноподобное вещество и уровень маринобуфагешшоподобной иммунореактивности в крови резко возрастает в остром периоде инфаркта миокарда.

6.Из мочи человека методом высокоэффективной жидкостной хроматографии бьшо выделено ве/цество, неотличимое от маринобуфагенина по UV спектру поглощения, масс-спетрометричесим и хроматографичесим харатеристиам, а также цветной реации с трихло-ридом сурьмы, что является убедительным свидетельством в пользу гипотезы о буфадиенолидной природе ЭДФ (или одного из его компонентов) млекопитающих, в том числе и человека.

По результатах диссертации опубликовано 11 печати их работ.

1.Bag-rov Л. Y. .Roukhojatkina N. I. .Dmitrleva R. 1. ,Fedorova

0. V.,Anderson D.E. Differential vasoactive effects of endogenous digitalis -like factors (EDLF). Biol. Chem. Hoppe-Selyer, 1993,374, SP-180.

2.Ba?rov A.Y..Dmitrleva R. I..Fedorova O.V..Kuznesova E. A..Roulhojatkina N.I. Endogenous digitalis in acute myocardial ischemia/Infarction. Biol. Chem. Hoppe-Selyer,1993, 374, SP-181.

3.Bagrov A.Y..Fedorova 0. V. .Roukhojatkina N. I., Dmitrleva R. I. Endogenous digogsin-llke factor (EDLF):

pathophysiological role in acute myocardial Ishemla.(Abstract) J. Mol. Cell. Cardiol., 1993: 25 (Suppl 1); XI PS.

4. Bagrov A. Y., Dmitrleva R. I. .Roukhojatklna N. I.,Kuznesova Е.Л. Nature and "importance of endogenous digitalis-like factor in acute myocardial lsemia. J. Cell. Cardiol., 1994,26, 393.

b.Bagrov A.Y., Dmitrleva R.I., Fedorova O.V., Kuznesova E.A., Roukhojatklna N.!. Endogenous digitalis in acute myokardlal ishemla. The Sodium Pump, - W.Schoner and V.Bamberg (Eds).Stelnkopff.

6.Bagrov A.Y., Fedorova O.V.,Joy L.Austin-Lane, Dmitrleva R. I.,Anderson D.E. Endogenous marlnobufagenin-llke factor and Na,K-ATPase inhibition during voluntary hypoventilation. Hypertension, 1995, 26, 781-788.

7.Bagrov A.Y., Dmitrleva R.I..Fedorova O.V..Roukhojatklna N.

1. Marlnobufagenin-llke lmmunoreactive substance, a possible endogenous Na.K-ATPase inhibitor with vasoconstriktor activity. Am. J. Hypertens. (Abstract) igg5,8,65A.

8.Bagrov A.Y..Roukhojatklna N.I..Plnaev A.G..Dmitrleva R.I., Fedorova O.V. Effects of two endogenous digital Is-like factors, ouabain and marlnobufagenin in isolated rat aorta. Eur. J. Pharmacol., 1995, 274,151-158.

9. .А.Я.Багров, P.И.Дмитриева, Г.П.Казаков, О.В.Федоров'! Э.Хантер, У.Хоуэлд, В.М.Шпень. Эндогенный ин-ибитор Na.K-АТФазы буфодиенолидной природы, KXI) Международное совещание по эволюционной физиологии, Санкт-Петербург,1996, Тезисы докладов,с. 12.

10.Bagrov A.Y., Dmitrleva R. I..Fedorova O.V., A. P. Hunter,G. P. Kazakov, V.M.Shpm Evidence for a bufodteaol Ide Ha /K pump Inhibitor In human urine.Am. J. Hypertens., 1996, V. 9 } Ji

11.Bagiov A.Y., Fedorca 0. V., Dmitrleva R. I., French A.V..Anderson D.E. Plasma marinobufagenln-like and ouabaln-llke lnmunoreactlvlty during acute saline volume expansion In anesthetlsed dogs. Cardiovascular Research, 1906, vol.26 p.'VOi