Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фосфорилирование Na, К-АТФазы протеинкиназами C и A

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Фосфорилирование Na, К-АТФазы протеинкиназами C и A"

РГ8 ОД

»»Л * ПТ> ."Г"

/. ;! ,Ч,П' ¿Л:-

МОСКОВСКИ* ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи ЧИБАЛИН АШШАВДР ВМЕЕЕЕВИЧ

УДК 577.152.34 Ш5ФОРИЖРОВАНИЕ N2, К-АТФззн ПРОТЕИНКШАЗАШ С И А

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1933

Работа- выполнена в Отдела кинетики биологических цроцэс-сов 1ШИ РАН, на кафэдре биохимии Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова и в Института фармакологии и токсикологии

кандидат биологических наук,

Л.А.Васшюц • доктор биологических наук, профессор Б.А.йсачук кандидат биологических наук, И.А.Гривенников

Ведущая организация - Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения.

Заздгаа состоится "7б" 1993г. в часов на

заседании Специализировашого Совета Д. 053.05.32 при Московском государственном университете вы. Ы. В. Ломоносова по адресу: г. Москва 119899, Ленинские горн, Биологический факультет.

С диссертацией мохно . ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан '¿Ч тэзз г..

Ученый секретарь

Специализированного совета, ----

кандидат биологических наук Ю.Н.Лайкин

университета Лозанны. Научный руководитель: Официальные аппонэнга:

\

------- - ОРШЯ ХАРАЙТЕИОТИКА РЛБОТН

Актуальность проблемы. Регуляция многих внутриклеточных процессов осуществляется путем ковалентной модификации балков. Одним из наиболее распространенных путей ковалентной модификации являются реакции фосфорилироввния, катализируемые протеинкина-зами. Фосфоршшрование играет ватную роль в рагулящш активности как цитопяарматических ферментов, тая и многих мембранных транспортных систем в, клетках животных. Na+/Iíf- антипортвр, На+-канал, Са2+-кзпал, Сз2+-АТФззз шшзаатичесвой мембрана, переносчик глюкозы , способны (расформироваться протеинкинвзами in vitro u in vivo (Caraíoii, 1992; Clausen, 1988; Kaozmsrek, 1987), и такая модификация мембранных переносчиков приводит к изменениям их транспортирующей активности.

Являясь одним из мембранных переносчиков ионов, Na.K-АТФаза играет ключевую роль в поддержании конного гомео-стаза клетки. Несмотря на значительное количество экспериментальных данных о функцинированик этого фермента, механизмы регуляции его активности изучены недостаточно.

Известно, что кроме стероидных и тирвоидных гормонов, активирующих транскрипцию генов Na.K-АТФазы (Qiok et al, 19Б8), из активность этого фермента в различных тканях существенно влияет хатзхслшины и другие гормсны, аютширущиа систему вторичных посредников (Кометиани, 1968; Ткачук, Болдырев, 1975; .Gieasen et al, 1934; Severin et al, 1974; Soheiva, 1979). Существуют данные в пользу того, что G-балки принимают непосредственное участив в передаче гормонального сигнала на Яа,к-АТФазу (Eanilenko et al, 1990; Danilenlco et al, 1991). Недавно было установлено, что активаторы протеинкиназы С (ПКС) и

>

ц&чФ~завяга$моЯ протэянкинвзы (1Ш.) отзывают ссотвэтстванно ингибнруицэе и аютварущее действие на АТФ-гидролазнув и ион-трансяоршрущузс акпшость iía.K-АТФазы in sutu и in vivo (Eertorello, Aperia, 19S9; lynch et al, 1935; Yasileta et al, 1990; Vas lleta, Sofcaaz-z, 1992). Тем 3Q ilOEea до. ьедсвнэго времени не сйло известно, коввт т этот ^лрыаят фасфоряж-роватъся протешкиназага и кскко условия для этого НбсЗюда-а. Ус^ановланта прг-шдишзсьЕоЗ возмогнопт-л такого ^офоршщрозяпня и его детальное изучение необходимо для гаяснэнип нехьннгыа регуляции активности На,к-АТФазы.

Цэль настоящей, работы заключалась в исследования фосфзри-лкрования НаД-ЛТФзза протеинккназвми А и С как in vitro, так и в условиях, прибяЕненных к in vivo - в ггаогчнатах оощяоз Хетюриз lacvití .

В работа предусматривалось решение следухщих вадач: -идентнфакация субъэдиниц, фосфорилкруешк ПЙС и ПКА в препаратах очкаэкной Еа,к-АТФазы и в мшфосоглах.

-идентификация фосфоршируемых аминокислотных остатков и локализация участков фэсфорилировангя ферлента IKC и IUÍA.

-исследование возможности фосфорилировашя Ка,к-АТФазы в гомогенатах ооцитов Ienopua lasvla под действием активаторов протэишишяз..

Научная новизна работы. В ходе работы установлено, что ПКС и ПКА способны аффективно фс сформировать а-субъзданэду Ka,K-A3®asH ез различных источников. Определены участки фосфэ-рилирования фермента обеими протеинкиназоди, идентифицированы акцепторные аминокислоты, исследована временная зависимость реакции. Установлено, что специфические активаторы ПКС форбол-

!жригтзтзц8тат (ШЛ) и. 1.3-даоктапа^г.-Бп-гл^царо-н (úics) и акпЕэтü¡sd Е:л - ilAJX' а дкбутирил-цАМЭ сгимужрупт фосфори-шрозаш» а-суОьэдаыцы Яа.к-АТФазы вндогепзыми протвикюгнйгаки в гокогекатах ост^ггоч Аелэрул laevla .

Практическое саачэнив работа. Иол/чашчт е работе акспэ-"члеитз.чьшо даншэ рвсттарязъ? прэдстааяэгоз о воамзгшых путях регуляции активности на,K-lTOssa. Подученные результаты исполь-■зуэтея irpr: чтоеез сгэвдгрой '"Биохимия кемОрвн" пс ксфс^т)? био-хекеи Вчологзгсвского факультета МГУ, а разработаннЕв штода-ЧРСККО ПОДХОДЫ могут бЧТЬ ИСПОЛЬЗОЕВЕН пря KUríSHüü других мэнбрачных Пвр9Е0СЧ7!К0В КОКОВ.

Лпробация работы. Результаты работы доложен» на келлокни-уыэ КЕфэдрн биохимии Биологического факультета МГУ, на 2 Бсэсо-взаоа сгвкгсету»? '«тееемйять'Льг^? я лрвчлзднуэ асдактн кзлеку-Aq.'ii'ja бк-.таг^'- (Сскаргганд. I¿91) к на 24 оъо-зде Швэйкарсхсоо ООг.эс-тгг-- e:cc77ep!~:anTt"jj>HOfi бьелопо* (Баээдъ, 1932).

í'C'^TEi/.rjivi. По теме дасог.р'А^цйк опубжкоЕШ=о 5 работ. Сг-ру^я'ря и oowrc гчясзртзццл. Дисоер'хацкк сосютт- ж» вье-де£3>, ль-ера тури, ашгесЕЯ» кетодап и^лтодоаззия, ~з.>'0-

ex ойрда.ф, ¿heс^е и свисха иущ^ьнол •шморчтуры. Pódora родаркг? .tWcrpasEK отжкегагаег: т?кста и

(-пег* .>-íroi>sYvp" Бхлетазг 2/3 пг^св.

СОДЗГСйНЖ ГЛЕМН tUi'H-R'OH 55 MSTC3Í ИССЛЕ^СВАШП йстггвго-та. Пр-лэиат Нг-тг-'.Т^азу кз точек Ju/o «ü*í>vjc, Еолислоне.чловэ енгатсла кз субъэданицв йа,Х-А1Фазы из почак Bufo wjjrUvdc, tí •«опок.'онг.льлае антитзла нз ¡с отдэльечь лбггшды балл пр-здоота^тэш срофзссором К. Герат (Ккстатут фзрчзкологяя

и токсикологии, Лозанна). В работа испйяьзоваян иЛЫЗ-зав&ыьух) цротеишашазу из сердца бкка фарш "Sigaa". Ооциты tmopaoBofi лягушат стадал yî (Dumont,

I&72) кульгнвировааа з среде KES (Haller, IS87). В ряде экспериментов для гшарэкспрэссии Ка,х-АТФззы в каздыЗ ооцит предварительно иньецирсвади 5 нг и 0,3 нг WFKK, кодирующих aj и Pj субъвдатщ Ма.х-ИРФазы, соответственно. ыРЕН получали транскрлшуаЗ in vitro динеаршзазЕвноЯ плггаавдвой JtiHK по методу Мэлтона (Helton et al, 1987).

Фоакцяа гдгкросомальны! мемббзз оотсггоб получали, как описано ранээ (Geering et al, 1939). На асах стадиях фраэдонированая среда левая содержала i му дигиотрекгол (им). Вшшлвшш Кд,л-АТФавы из солевых «влез утки проводили, как описано рзнээ (Болдарав а со авт., 1981).

Протещлшга£_2 из ыозга крыш Евделшж по м-зтоду, преддсзок-«ому раяае (Kitterra si гХ, 1983).

Фосфоркдировзаав очшцвнной Ka.K-АТФвзи ж шкросом проводили в

среде ипкубацяи, содержащей 25 мМ трис-Eci, (рн 7,4), 100 шем

узбаин либо 120 иИ SaCi ж 1С мЫ KCi, а также 5 мМ MgC.i.g.

-on т «4i "51ГГА т uu Tvnm тг сут_тпп чхЛ! (son-*?nm

tlW^îw J[ , A M * " « A L.I1 L Л1 UVI A WW M МЦ l j A j MWWW

cpVEiCJib). Регкцйа щяЕздилг ирг S0°G e ïsiesas 2G - 20 îss s присутствии шш отсутствие 5 ыкг НаД-АТФазы лкбо 50 нкг бзж'.а микросом, 0,1-0,08 ЮТ ИКС, О,Б мЫ 0а012,- 0,15 нг/мл фосфмшгы-

да (азолвктгна) ш 50 нМ ни, либо (в случае ПШ в присутствии или отсутствие 0,23 тштоаа Х-100, 0,1 нкг каталитической субъвдшжца ША. Рэшщия останавливали добавлэнзем додедал-сульфата tu (SIB) до конечной концентрации 3,7%, либо денвту-р-лруодой ехэся и анализировали пробы методами клмувопреци-

ШП'пцли ЛИЗо злохстрсфороза В ПЛАТ, ccotegtctbqhuo.

___КаД-АТФйЗк___эндогенными псотекзашназвэт!

проводили в освобозденннх от гранул яалтка гомогенатах ооцитов 30 гягн при 25 °С в стандартной среде инкубации (Э км / оонит ), содергэщёл ингибитора прэтезз, 100 у.жН упбгнн з присутствии или з отсутствий 50 JGW, ц.Уй& или 50 мкм дабутирил-цДУФ, а твкхе 0,2% тритона Х-100, либо в присутствии или в отсутствие 100 нМ ТяХ или 100 мкм cïic„, а таи» Хт5 мЧ либо (в осутстшв

Са2+) 0,5 мМ ЭГГА. Реакцию останавливала добавландам SES до коночной концентрации 5,7% и проводили ишунопрецшштацию. Триггсиноднз и гдпотрипсинолиз на.к-АТФазы цроводшек по мэтоду Иоргэксена (Jorgeneen, ïarley, IS83) при соотношении фермент:

белок, равной 1:50 для трипсина и 1:6 для химстрипсина.

ч?

Тн|осдх)ак^шр?гас.);о7шэ остатких определяли по методу, описанному ранее (,3oyle et al, 1991';.

Эдэктроф?т>ас: н полизкрилаэддном геле (ПАЛГ) z авторздиография. Электрофорез проводили в ШАГ з присутствии sas по методу .Язммли (Laemmii, 1970). По окончание электрофореза гель фиксирсзаш, окрашивала Нумвсои, отмывали з нншщей воде, высушзвали и подвергала г::торадиографии. Радиоактивность з полосах белков просчитывали в тэлуольном сцинтшмяторе SC-10S либо измеряли по излучению Черенкова после солкйализвции геля. Гели и авторадиограмш сканировали на лааарном денситометре yitrosoan XL. ;

йд^унопраципитацзд субъэдиниц_иа,Е-АТФазн проводили, как

описано ранее (Gearing et al, IS85) и затем анализировали пробы методом алвктрофзрззз с последующей звторадисгрэф-гей. КощанщоЦию_Оолков измеряли до методу Лоури (I/жгу et al,

1951), jfflöq по цветной реакции с аквдован черным (Sohaííner, Weismann, 1973).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУИШНИЕ I. Досфоршдгроваяие ПйО и ГОД очищенных гшвдвратов иа,к-АТФазы из сода вой аидозы утки и почек Bufo штатам,

Препараты Na.K-АТФазы фосфоршшровалц протеиякиназама в двух основных состояниях: в присутствии сердечного гликозида уабаина, ¡знгибирущего АТФазпую активность, и в присутствии ионов Na н К, обеспечивающих проявление ферментативной активности.

После инкубации препаратов На,К-АТ®азы с ИКС u [7-32?]-АТФ наблюдалось включение метки в полипептида с молекулярной массой IOO кДа и 84 кДа (Psc.IA). Полилэптид с мол. массой 100 кДа соответствует а-субъединице На,х-АТФазы, а 84-кДа полишптид -ШС (РКС) , которая способна к автофосфорилнрования. Включения метки в полишптиды, соответствущие по мол.' массе р-субъеда-ница Na.K-АТФззы ( 50 иДа - 56 кДз ), не происходило.

Интенсивность вшпиения меченого фосфата в 100 xRв полипептид зависела от присутствия Са2+ в среда 'инкубации, я незначительна стимулировалась при добавлении HJA (Рис. IA, 3), что, вероятно, связано с высоким содержанием фосфолипидов (0,6 мг/мг белка) в мембраносвязанных препаратах на,к-АТФазц (Блвдзин и со авт., I96S), достаточным для активации ШШ. Очищанныз препараты Ва,х-АТ®аза не содержали првмэси вндогенвых пратекн-киназ (Рис. IA, I, 5). Полипептид с мол. массой 100 кДа, соответствующий а-субъедипице На,к-АТФазы, фосфорилировался

«pertrvo imtf wtnewrtororo munanowiD гъ ТТТ.'Г1. TI Г_дгр^Г» rtoo

iutvuUM« 1UU1J uuiyi UjMuujfÚ4ViJ и uttW It t | * J жъл me wwu

уабаина в присутствии 120 мМ WaCl и 10 Ш KCl (Рис. IA, 4, 7),

1 2 3 4 5 С. 7 si

А Ш

^

Щ-

',-J

■ РКС

FKC + + + - + +

РЙЛА - + + + + +

ouabsin + + + + ' + -

Рас. I. Фосфорилирование Ыа,К-АТФазв из почек Bufo mar traía (1-4) и из солевой железы утки (S-7) ИКС (РКС). Авторадиограммв

фосфор^шдхзваншг белков (А) и вммуЕстрецвпитарованнай а-субъвданхца (В). Пробы анализировали методом электрофореза в градиенте концентрация ПЛАТ (5-15$) с последующей

u"z><tv\t\q плгчтттлс>г?1г*с1л + _ иагтоттио -^^р fía rrms — uonvonu г» млч иооглй

"-*1-- » kiu <vu Kj wwwnkj» >-/ mu« • JULIL>UU1Í

45, 69 и IDO кДа (стандарты).

хотя и менее интенсивно, чем в заингкбирсванных уабвином препаратах. Это объясняется снжконием концентрации меченого АТ<& в среде инкубации за счет его гидролиза ферментом. Специфическая шликлональная антисьгеоротка против а-субъединкци Ка,к-АТФзза праципитироЕЗла только фосфобелок с кол. кассой 100 .-кДа (Рко. IB).

При .ганубации На, к-АТФязы как с уябаином, так и в среде с Ка+ и к+ с каталитической субъединицай ПКА (РКА) И [7-32Р]-АТФ мы такке наблидали включение метки в полипептид с мол. кассой 100 кДа (Рис. 2В). Фосфоршлфование а-суоьединивд фермента на-

2 ] 1 i t П * t| ni f.

РЧ4 * • * • 1'1-l-bJ •l/H

Tnio" - - ■ ¡.o^-t-i

■¡.(•1.1-i

Pite. 2. ФасфаршшроБИНИв Яа,£-А!Г2взи S из почек £u/o nnrlTuis (1-5, II) и co-

. — лавой гмлэзн утки (6-10) ПКА. Пробы I и 6 содержали 10 шсМ цШ?. Пройп еез-- ® лязироЕзли &зтодом элэктрофорзза в градиента концентраций ПААГ (5-152) с шслвдупцей .аБтарздографаай. А. Гель, окраязятай Кумасся. в. Авторадаогреа-ма геля. с. Авторздиог'раума клкунодрэ— цшштированных белков, ct - кочавыз 140 белкн-мвркэрц с кол. массой 100. 6Э, 46, 30, 14 кЕа .

бльлавось только после солюбшшзация препаратов Еа.К-АТФазы О,'¿Я тратонаа X-IGO (Tritón) (Рис. 23, 4-5, Э~Ю),либо другими детергентами (0,8й окхилтлзскозпдоа, 0,63 сндг£, или 0,1% кр-40-данше нз приведены). Препарат Na.K-АТФанн не содераал принеси эндогенной 12- (Рис 4А, I, 6). Аятисызоротка против а-субхэди-нкща икмуносрзцишзтЕровалэ фосфаршшрованннй 100 кДе белок -а-субъединвду фермента из обоих источников (Рис. 20).

Наш попытки фосфорялировать очищенный препарат Ma.K-АТФазы ПКА в .отсутствие детергентов оказались безуспешным. По-лидаиому, солхзбилизация мембраны детергентемя делает участок фосфоршшрования доступным для гидрофильной каталитической суСъеднницы ПКА.

Таким образом, ш установили, что Na.K-АТФаза из почек Su-

А ш DSG B BM

О i 0 !>s . 0

с 0 S%T t D ••Л*'

i РКС Ш5 1 • РКС BM

Рис. 3.. Опрвделзига аминокислот, фосфорилируеиых в а-субъ йданице Na,£-AISesu из солевой КЗ ЛОЗЫ утки (DSG) И почек Bufo maritata (БЫ) протеин-киназами О (НОТ) и А (РКА). Авторадиограмма с пластинки целлюлозы после проведения двумерного электрофоре з а. s -фосфосерин, т -фосфотреонин.

fo marlmij} и солевых желез утки фосфорилируется ИКС и ПКА как в активном, так и е заингибированном уэбаином состояниях, и субстратом для протеинкиназ в обоих случаях является а-субъединица.

2. Определение аминокислот. фосфорилируемых ПКС и ПКА в а-субъедиждде Нз.К-АТФззы.

После фосформирования очищенных препаратов №,к-АТФазы и микросом протеинкиназами мы иммукоцреципитировали меченую а-субъединицу, проводили электрофорез в ШАГ и авторадиографию, экстрагировали а-субъодияицу из геля и гидролизавали в 6 н HCl : с последущим анализом меченых аминокислот методом двумерного электрофореза на целлюлозных пластинках. Мы установили, что а-субъединица фермента из солевой железы утки фосфорилируется по остаткам серина и треонина как шд действием ПКС, так и под действием ПКА (Рис.3, А, С).

В то эй время ПКА фосфорилирозала в а-субъедашс'е фермента из почек Bufo marinua только серии (Fhc.3, В); а-субъедишща Na.K-АТФазы из ооцитов Хепориа lasvic фосфорилировалвсь ПКА также только по остатку серина (дагаые не приведены). Эти различия в фосфорилирозвяйи ПКА фармеятоз из птиц и амфибий могут объясняться тем, что первичная структура а-субъедннкц На,к-АТФаз кз этих источников (в частности, количество и расположение участков фосфорилирозения ПКА), различается, в то время как у ферментов земноводных аминокислотные последовательности а-субъодиниц схожи.

3. Оцредвчение максимального вклшения радиоактивного фосфата в а-субъедиаицу Na.K-АТФазы.

Изучение временной зависимости включения радиоактивного

фосфата в а-субъэдшшцу На.к-АТФазы из солевой келезы утки,

«

проведенное при наличии всех активаторов фосфорилирования, показало, что максимальное включение метки достигается за 60 мин и составляет 0,3 и 0,5 моль фосфата на моль белка для ПКО и ПКА, соответственно (Рис. 4).

Изменение концентрации протеинхиназ и их активаторов, увеличение или уменьшение концентрации тритона Х-100 (в случае ПКА) и замена его на другие детергенты, обработка препаратов Na.K-АТФазн ультразвуком, увеличение концентрации [7-32Р]-АТФ не приводили к увеличении вклшения метки в а-субъединицу. Уменьшение включения радиоактивности в а-субъеданицу фермента при инкубации проб_ более 60 мин мотет свидетельствовать о наличии в препаратах Na.K-АТФазы примеси активных фосфопро-теинфосфатаз. Однако добавление ингибиторов фосфатаз (5 Ш пирофосфата в I мМ паранитрофенилфосфата) не приводило ни к

Р /нкг

Рис. 4. ззвисгс.лсть фосфоршти-роаонЕЛ а-субъедикиш МаД-АТФазы кз солевой нелэзы утки протеин-киназами С (-0-) и А (-*-) от времени. Реакции) останавливали денэтуркругщей смесью и анализировали пробы катодом злэктро-|>юрзза в ПААГ с последующей автора, т?огра$яай.- Полосу, соотаег-ствукную фосфЬр^пфОЕйШШЙ а-субъ едтдпщэ фер.:ента. вырезали из геля и просчитывали включение метки в сцинтилляторе 20-105.

узеличенкю включения мэтки з а-суиъедирчцу. ни к испенгнпа фор;а кркво£. Ко^по заключить, что услснчя ггсовьде-ния реакции, сспользовениао нйми V-" ко.ипгстзанного епрэделсикг ысот&чия мзюеого фэсфауя в а- с.уСъодтшгоу лвллют сл опгскапьныгсг дгл ,тз".::гг> прзпарма Ка,К-АП>гзк.

Отсутствии стогиамвтряк вюткэзк-*«» фосфата в а-зубггдашлу ?ло:г;о с?ъяскигь хер5ктзи::оч ело-структурой чау'ргно-сзйпянпого ггрвтрэтя на,1С-А7Фзач из солзглх ~'0."сз утки, в к'-'го^ом часть фарк-нтс. ячть нс;тос7/с1!с длл

71роте::-лпзт8з; с г~жэ те;-;, что Ка.к-АТФазз монет вкдвдяться ужо в чаелкчио ^сфо^жрованои состоянии.

4. 7".—о тгуптггт-'^ пт-'р.

Т|¡гм-- пто^'-- п '/""¿'ТЗЧЗ 100 т*

згбьвдингаг' ЧКА ^чр"'-. -.'6 «гщ г»»сл° начале фосфоркшх-овзжя ¡;а,к-АТФазы из сои во» гялгзк у.-"". ЯаО приво-

Т7

л

с

Трипсин

с

N

N

Рис.' 5. Схема прогеолиза а-субъединицы Na,K-AT®asn трипсином

04.

(А) и химотрипсином ДВ) в присутствии Mg и уабаина. Т1 и Соучастии лротеолгза. С. Участки а-сУбъединицн, фосфорилируициеся ПКС (1) и ПКА (2).

. дало через 30 мин инкубации к двухкратному 'увеличению включения радиоактивного фосфата по сравквнию о уровнем фосформирования фермента, обеспечиваемым добавлением одной ПКС (данные не 1фи-воданы). Это сввдательствует о том, что по крайней мере некоторые участки, фосфорилирупциеся в а-субъединице фермента под действие» ПКА и ПКС, различны между собой.

Дня локализации участка, фосфорилируемого ПКО в а-субъеда-нице фермента из солевой железы утки, мы использовали метод ограниченного протаолиза по Иоргенсену (Joi-gensen and Parley, 1988) (си. Bsc 5). После преинкубации ШС с I мМ "холодной" АТФ для "насыщения" ее участков автофосфорилирования, добавляли Na.K-ATSasy, среду инкубация и [7-32Р1-АТФ до 50 ккН и инкубировали проба 30 мин при 30 °С. Рззкцив сстензалйвалк кзбнтком

100 UDa

41 kDa

С N

56 kDa

N

100 kDa

тт с.

ТТ kDa

35 KDa

тт

С N

40 kDa

-sfe

С

к

и

А

В

2

3 4

X А

43-'

»4-

67-

30

Рис. б. Протеолиз На.х-АЗФазн из солевой железы утки, фосфорклированвой ИКС, трипсином (А) и a-jumo трипсином (В).

Гель, окрашенный Кумасси (I и 2) и авторсдаограмкн фосфошптидов (3 и 4) до (I и 3) и теле (2 и 4) завершения цротеолиза . На ркс. указаны молекулярные массн белков в кДа .

"холодной" АТФ (1,5 мМ), затем проводили ограниченный протеолиз и анализировали получвыцуюся с?,-ось полипептидсв методом электрофореза в 7% ПЛАТ с последующей ввторадпографией. Карта протеолиза Ма,Х-АТФазы соответствовала литеретурзым данным.

После трипсинолизэ фосфорилированной а-субъединици значительная часть7 радиоактивной метки обнаруживалась в 41-кДа к-кондевом полапвптиде (Рас. SA), а посла тямотрипсинолиза - в 35-кДа полипептида (Рис. SB). Последний, согласно литературным данным (JorgenBen.and Parley, 1988), Енщэпляется из центральной части молекулы а-субъединнда. Из ерввнэвия пептидных карт и авторадаограмм, полуденных после трипсинолнза и химотрипсино-лиза- фермента, следует, что один из участков фоофоркпирования а-суОъединица н&д-АТФазн ПКС располохэн с в 41-кДа пептиде, полученном в результате трипсинолнза, и одновременно присут-

ствует в 35-кДа пептида, полученном в реаультаай химотрипси-нолиза, то есть локализован манду Сд- и Т^-цаетраш прствглизэ, а именно, в 17 кДа отрезке молекулы а-оубъаданиш (см.Рис. 50), находящемся в ЦЕтоилазматическом додана и содэркгдом центр сеязыезния нуклеотидов (Jorgensen, 1933).

К сояалэншо, испсл^зозанакй иегоднтешшй подход оказался нэиримэшэ^ш для поиска участка,. фэсфэшлирувшго ь а-субъ-единице фэрканта из солевой аалевн утки ПКА, поскольку протео-лиз в присутствии дага незначительных кодачеслз детергента приводом к образовании большого количества низкомолэкулярных пептидов, не идентифицируемых элэктрофореткчески. Для локализации втого участка мы использовали нестабильность а-суСъедя-ницы фермента из почек Вщ'о sarlnua. Было известно,что при инкубации фэрмэнга в срзде с 0,25 тритоном х-100 происходит зктивсцвл эндогенной протекназы, содеркацойся в прэпарате Еа.к-АТФазн. В этизс условиях предварительно фосфэрЕлароваянад а-субъединица фэрманга после 30 мил инкубация при 30 °С распадалась на ряд 32Р-содеркащих полешят^дэв с ьал. кассой 60г -Í0, 33, 28, 20, 14 кДа. (Ркс. 2V II; Pce. 7, I).

Проведя Ю'мукдфвциштациа смес:: ьткх полипептидов с рзз-дкнами аЕ-ита/тач, ка устокэзили. что антиаэоротка г.ротаз всей сс-субьедааф ?а,К-4ТЭези Bufo ?лгЬ,из (А-Р) прэгдакгьруе? как нгтакхау» ^(?5орглкроввнву» а-еубкЭДКЕацу, тек л ее **-р-со-дврэдие фраткзпт',' с кл. весом 60 и 33 кДь . Аиитма прог.з SG-4X5H2oro к-гдодееого юлшзйтида а- иуйъедзшдда (А-н) 1фецк-Ектируаг кехтг-ктельке ияшстзуы a-субьедензцу, s и врзкг кгк антй гсхз конссфЕятгьнги лептезнон датепяЕгкяг -

4-членного иепетиэ ка С-мгщэгоЯ части молёкулв (л-0)

si -1

| antibody I' А-Р A-N А-С

щ

■-■¡и Рас. 7. Определение участка 3 фосфорчлцроззния а-субъэдани-"¡3 цн лг.к-АТФазн ир почек ВцГо "3 таг1тгиа ПКА. Пробы анализи-рсзш методом электрофореза ~ в градиенте концентраций ПААГ ! (5-155?) с последующей автора-1 диографией (I) и илнунопреци-нитацией с различными тинами антител (2-4), (см. пояснзния в тексте). На рис. указаны массы белков - маркеров в НЦа (в!:).

пхз*

распознают как кнтактнув а-субъэдшшцу, так и все обрэзукдиеея из нее радиоактивные пептиды, наименьший из которых имеет мол. еос 12 хДа (Рис.7). Отсюда моево заключить, что учсеток фосфо-рилпровашя сс-субъедяницы lía,к- АТФаза из почек Safo tnarlnua ПКА рвсполокэн в С—концэесм 12 кДа полипептиде (Рис. 5(3).

Следует отметить, что в С-концевом фрагменте а-субьеданица Bufo marinas , который соответствует 12 кДа голипептиду, расположена последовательность аминокислот I0I0Arg-Arg-Ser1012 (OalBser ct al, 1992), предпочтительная для фосфорилирования ПКА (Eennelly, КгвЬв, 1991)- Эта последовательность имеется и у Iía.K-АТФазы из ооцитов Хетюриз lasvta (Verrsy et al, 19Э9). Не исключено, что С-концавой участок фосфорилируется я в молекула а-субъединицы Na.K-АТФазы из солевой железы утки, для которой первичная структура неизвестна.

5. Изучение фосфоршмрованкя Na.K-АТФвзц в субклеточных фракциях ооцитов Хепориа laevla.

Ооциты шпорцевой лягупки Хепориа laevla является удобным объектом для изучения транспорте ионов через мембрану in vivo. На ооцитах Хепориа laevla ранее, было показано влияние активаторов ПКА и ЩС на ион-транспортирундую активность На,К-АТФазы (Baaoal et ai, 1985; Khan et al, 1991," Vasilete et al, 1990; Vaailete, Bohwarz, I9S2). Однако фосфоршгароЕанпе На,к-АТФазы ооцитов Хепориа tasuls протеинкяназами до сих пор не было показано. Нам представлялось интересным выяснить возможность такого фэ сформирования как добавленными акзогенно протеинкиказаш, так и эндогенными протеинкиназами, содэржа-щимися в ооцитах. Для увеличения числа молекул На,к-АТФааы в плазматической мембране, мы инъецировали в каждый ооцит смесь матричных РНК aj и Pj-H30$opta субъедивнцг и инкубировали их в среде MBS 48 часов. За это время вновь синтезированные молекулы Ка.к-АТФвзн встраивались в плазматическую мембрану клеток. Как было показано ранее в лаборатории К.Гэринг, количество молекул насоса в мембранах ооцитов увеличивалось по сравнении с контролем в 5 раз (Jauniii et al, 1991).

ФосФорилирование Na.K-АТФазы мштоосомальных мембран ооцитов ПКА. В качестве источника Na.K-АТФазы мы использовали фракцию микросомальных мембран ооцитов Хепориа laevtá.Полученный нами препарат макросом не содержал примеси протеинкиназ, фэсфорилирувдих Иа.к-АТФазу (Рис.8А, 1-2). а-субъединица фермента в микросомах фосфоршщровалась под действием экзогенной. ПКА и в отсутствие детергентов, хотя предварительная солюби-лизация мембран тритоном Х-100 многократно усиливала эффект

РКА

БГТ 2 3 4 1 2 3 4

а

!

¡'ГЖОП

I +

а-фсР.МА| - )- } ч- | »

|оизЬаш I ' ( + ) • 1

Ркс. а. Лвтсрадкограяма игйдунопрецшптиэоЕгетой а-оу<Тье дивана тп! ооцптоз Лсдироо 1аео1Вш л. Влияч*?в трт»тоте а-ТСО аз цосфзрилирование а-субъедашщы ??а,к-АТФззы ПКА. в. Сосас]иш1роваЕИЭ Ь'аД-АТВеза ПКА в мембранах ооцатов, в которые предварительно инъецировали с^ и р1 мРНК (+), по сравнении с контролем (-). Пробы содержали 0,2$ тритон Х--1С0. ск-болки с мол. массой 100 и 69 кДа .

протаншшзавы (Рио. 8А, 3-4); р-субъедияица ПКА но фойоразп-розаздь. га ародп&пагесй, что длг. На,к-д!ГФаг1:

нНА тз стсутстг.;<о .".с.гйргеЕгсБ. кпо.'лс высот:о5' а':;тлтостл прото-1£И0Ш2за кообшджо аакаикй состояние швзмя'гаескэй хехсра-ш, присутствие связанных с ней- "якорных*" белков, способных спэцЕфическх сбягчва"» 1Ш (Яагясйг еЬ а.\, 1952), .тлбо белков шпсскелзта, Е32К54одбаствупса с КаД-АТйгзой (ХосЬ а!, 1950), но отдаляемых от мембраны в процессе очистки Яа.К-Шоаи.

Бклютонке азткп л а-суйьедшзду ;-1а,Х-АХ5>азы 5 микросомах, полученных из ооцитов после аньекцни ат~ и рт-мРНК, увалячива-;лось в 4-5 раз по сравненшо с тем Ее количеством белка в контроле (нз инъецированиях ¡«РНК ооцитах), что согласуется с данными об увеличении количества молекул тт?.,К-ЛТФазя тз тшкядвтичес-коЯ момбране. Фермент в микроссмах фосфорилируется как в закн-гибированном уабаином, так и в активном состоянии (Рис. 8В).

фосфоршшрование Ка.к-АТФазы в гомогенатах ооцитов эндогенными протеянкиназами. Для исследования возможности фос-форилирования и^.к-АТФазы из ооштов Хепариа эндогенными протэ-инкенвзвми мы использовали гомогвкаты ооцитов, в которые предварительно инъецировали о^ и ^ ЫРНК. а-субъеданица Ыа,к-АТФ-азы в гомогенатах ооцитов не фэсфоршщювала сь в отсутствие активаторов протеинккназ (Рис. ЗА, 9В). При добавлении тритона Х-100 ягблэдаяось незначительное Екхтешь метки е а-субъедк-ницу (Рис. ЭА, 2). Это вклшенке шогохсратао возрастало при инкубации гомогената с тритоном Х-100 и цАМ® (аАМР) ели Дибутирил-ЦАМФ (ЙЬоАНР) (Рис. ЭА, 5-6), одеахо в отсутствие тритона Х-100 а-субъздиница не фзсфэршшровалась (Рис. ЭА. 3-

ТТпЛаитюхгио Ла*^ мро тплгро яп лЛтиЛ хгрлрлтги ) • ¡циид^хщпну Уи ии^шиилмш у^Цим ^«^м^мш^ммшииЛ

различных белков гомогената, тогда как спощфгееокое фосфори-Л1фование а-субъзданицы наблюдалось лишь щи инкубации проб совместно с активаторами 1ЖС (ЯЛА и в присутствие ионов

0а2+ (?ас.ЭВ, 4-5). В (йскапьциевой среда активаторы ЕКО-ве стимулировали фосфоршшрование а-субъадиншда (Рис. 9В, 2-3). Увеличение включения метки.в а-субъедопицу На.к-АТФазы под действием активаторов протэинкиназ является, по-видимому, специфическим процесса,?, поскольку добавление активаторов протвин-

91

киназ совместно с тритоном Х-100 или Са увеличивало лишь степень фэсфэрклирования а-субъединицы, незначительно отражаясь на общем уровне фэсфо,рилировашя белков гомогената.

р-субъеданица На,к-АТФазы в гомогенатах ооцитов при стимуляции эндогенных цротеивкиназ не фосфорилироввлась.

Фосфоршшрование На,К-АТФазы под действием активаторов протеинккназ мы проводили и в гомогенатах ооцитов, не иньецкро-

2В

2 3 4 5 6

1 2 3 4 5 st

dbcAMP ■ í ■ i ' . Uj. j 1,1 f»MA - * • ♦M

САПР - - - ♦1- + 1 dlCg - ■ + + j

Trilo» - * - - u » - + j Ca4"" + • j

Рис. 9. Ooсформирование з»а,к-АТФазн-в гомогэнатах оо;щтов Xenopus laevls при инкубации с активаторами ПКА (А) и ПКС (В). Алкквотн гоиогената, соответствуйте 8 гомогенизированным осцетвм (90 лил, 5-7 мг белха/мл) инкубировали 30 мин со 100 uvM f -у—д—АФЛ) p. TTpîiCyTGT22ï2 II ОТСУТСТВИИ ЗКТИВЗТСрОЗ протеинкинзз. Пробы анализировали методом иммуЕопрецкпитацго с поелодущиы электрофорезом е i>ajt и згторадкографшэп» st -^ ^П Лd —*SрН С МО 'í "SCCGu 30

ванных мШ, 3та эксперименты дали аналогичный результат, хотя включение метки в а-субьединицу фермента было в этом случае з 4-5 раз меньше (данные не привэдены).

Максимальный уровень фосфорилирования фермента при инкубации гомогонага с цАМФ и тритоном Х-100 достигался за 30 глин инкубации и превышал бззапьный уровень более чем в 40 раз, оставаясь стабильным еще 30 мин. В сравнении с этим включение метки в а-субъсдинипу под действием Шк и а±с8 проходило с меньшей скорость» и достигало максимального уровня, в 30 раз превышающего базальный, за" 40-50 мин. Максимальное включение мэтки в а-субъедгашху при действии активаторов ПКА в 2 раза превышало ишочение фосфата при действии активаторов ШС. Это соответствует данным, полученных нами йри фосфорилировании

а-субъедикицы Ka,К- АТФааы из солевой хселеаы уткп под действием ПКС и ША in vitro (Рис. 4). Следует отметить, что похожая временная зависимость стимуляции Еонтранспортируюсцей ектишости Иа,к-АТФазы наблюдалось при инъекции цАЖ и diCg з ооцитк Хепориз laevla (Vssilete and Sohnarz, 1ЭЭ2).

Приведеышб выше даннаа свидетельству о том, что а-субъ-единида Иа,к-АТФазы в оодагах Хзяориз laevla способна сформироваться вндогенвнми протеанкиназвки.

вывода

1. Протенкинаэа С и нротешшинвза А фосфэрилирувт а-оубъе-диницу Ka.K-АТФазы из солевой аелезы у-пси, почек жабы Bufo morínua и ооцктов Хепарив laavLa. Пратекпкияаза А фосфорили-рует а-субьеданицу очицэнного феркзнта только в присутствии детергентов, тогда как а-субьедашца НгД-АТбазы в препаратах михросомвлъных кзмбрая ооцягов Xenopua laevla способна фосформироваться протенкиназой А в отсутствие детергентов.

2. Максимальное тяататв фосфата в а-суоъедишщу Зеркеита из солевых желез утки составило 0,3 а 0,5 моль фосфата на коль а-субъединицы для протеинкиназ 0 и А, соответственно.

3. Протеишиназа С фосфорилирузт остатки Ser и Obi' в а-субьедкницв нз.к-АТФэзк из соловоС железы утки, причем участок фзсформирования находится в 17 кДа пептиде, расположенном в центральной части молекулы а-субъедашщы.

4. Цротеинкиназа А фосфзрилирует остатки Ser и Thr е а-субъеданкце КэД-АТФазы из . солевой гелезы утки а' только остаток Ser в а-субъвдюащах фермента из почек Bufo morínua и ооцитов Хепориз laevla. В а-субъедишще фермента из почек Bufo

marl aus участок 5ок5орклирозокял протзнкиназой А расположен s С-концэесм 1?. кда п8птнд!).

5, В гсмогенатах ооцитов Хегюриа lasvls а-субъедиг.ща Na.K-ATsasu фосфэра-'Зфуэтся прк стимуляция эндогенных проталн-kisjücj G а Л их знгазатэрзш форбслмириетэтацатгтоы и 1,2-дкок-цАМФ и дабутарпл-цй®, соответственно.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТНМЁ.'ЧЙССЕРТАЦЙИ:

1. Чз'баган A.B., Лапина О.Д., Петухов С.П., Взстлец Л.А. Фосфорзлирзвзниэ На,х-АТФвзн из с о лавах sesea утки протеинганазой 0. В сб. 2 Всэсоюзн. сшет. "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии". Москва. 1991.

Стр.205.

2. Чиба-лиа ¿.В., О.Д., Пэту.хоп С.Г.., Впстглзн Л.А. ®осфорклето!38Нй« Ha,x~/,T7v;.u аритеинкклазе? С к ц.У'.^-г.зэтя.гдоГ, црстаиккиизр.ой. // Биол. ме.чбршга, 1991. Т. 8. H.H. 0тр.1140-1141.

3. Chibslir. A.V., Vaeiluiü i.A. -2nd Gecrirc; К. Ehcephorylaticn of Хепохлиз by protein kinases. In: Abstraots of 24 th Arnual. testing of the USffEB/USSBE, // izperieziiia, .1392. Y.AS. P.A15-

4. Chibalin A., Yasilets L., Hennekee H.J., Prolong D-, Geering K. Bioephoiylation of Ка.К-АТРавг a-eubunitu in ssiarotscnec and lioaiogenatas of Xenopus oocytes resulting from the stimulation of protein kinase A and С // J. Biol. Chem., 1392. 7.267. М.Э1. £.22378-22334.

5. Chibalin A.T., bopina O.D., Petukhov S.V., Yasilefce I.A. Phosphorylation of the Na,K- ATPase by Ca.phcspholipid-

dependent and oAH?-deper;dent protein kinasee. Hnpping of the region phospiiorylated by Ca,phospholipid - dependent protein kinase. // J. Bioenerg. Biomeabr., 1993. 7.25. ?M. P.61-66.