Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Дигоксиноподобный ингибитор Nа, К-АТФазы яда жаб Bufо marlnus и роль его эндогенных аналогов у млекопитающих

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Дигоксиноподобный ингибитор Nа, К-АТФазы яда жаб Bufо marlnus и роль его эндогенных аналогов у млекопитающих"

На правах рукописи УДК 612.016.1¡612.018;61б.12-008.331.1

Дмитриева Рената Игоревна

7

V.

даГОкЛШОПОДОЕНЫЙ ИНГИБИТОР Иа.К-АТФазы ЯДА ЖАВ Bufo marlnus И РОЛЬ ЕГО ЭНДОГЕННЫХ АНАЛОГОВ У МЛЕКОГШТАЩЙХ

03.00.13 - Физиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1996

Работа выполнена в Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова РАН

Научные руководители;

!<андид.эт медицинских к чу к А.Я.Багров доктор биологических наук Н.Н.Луксмская

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, лауреат государственной премии СССР В. П. Лебедев кандидат биологических наук Г.П.Гусев

Ёедущтл организация: Государственный Медицинский Университет им. академика И. Н.Павлова

Защита состоится << ОС 1996 г. в << часов

на заседании диссертационного совета К 0C2.89.0i при Институте эволюционной физиологии и биохимии им.И.М.Сеченова РАН (194223, Санкт-Петербург, пр. Ы.Торзга, 441. О диссертацией модно ознакомиться в библиотеке Института гяолвцноннй физиологии ш. И.М.Сеченова.

Аюг-орефера? раз осла!! << >> ^хСМУ 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

- г -

Актуальность проблемы. В течение последних трех десятилетий во многих лабораториях мира ведутся интенсивные поиски эндогенных рргулятороз активное™ Na.K-АТФагы. Уабаин-чувствительная Ма.К-АТФаза является одним из ключевых мембранных ферментов, регулирующих трансмембранный транспорт одновалетных катионов (Na.K-насос), одновременно являясь специфическим рецептором для ингибиторов группы сердечных гликозидов. Взаимодействуя с узнающим участком Na.K-АТФазн. сердечные гликозиды вплывают угнетение активности Na.K-АТФазн и Na, К-насоса. Тот фак!, что высокоспеиифич-ныи и селективный рецептор для сердечных гликозидов сохранимся в процессе эволюции у многих видов .тавотных - веский аргумент в пользу существования природного диганда этого рецептора. Вероятно, этот лиганд, названный эндогенным дигиталисоподобным фактором (ЭДФ), регулирует активность Ыа,К-АТФазы и играет важную роль в осуществлении основных функций клетки. Были установлены биологические свойства ЭДФ : он стимулирует натрийурез, вызывает вазо-констрикцию и положительный инотропный эффект, а также обладает дигоксиноподобной иммунореактивностью (обзоры: Schoner, 1992; Boto et al.,1991)

ЭДФ млекопитающих, являясь натрийуретическим фактором, играет существенную роль в поддержании водно-солевого баланса организма и принимает участие в патогенезе различных форм артериальной гипертензии (Haddy et al,lü87;Gorilck, 1986). На различных моделях экспериментальной гипертензии (преимущественно при объем-эависимых формах) было показано, что увеличение концентрации ЭДФ в плазме крови, первоначально имеющее адаптивное значение и направленное на выведение избытка натрия и воды, также играет существенную роль в1 развитии вазоконстрикции.По-видимому, избыточное образование ЭДФ приводит к угнетению натриевого транспорта в мембране- гладких мшпц сосудов, что, в свою очередь,активеруег Na+ -Са++ обмен и способствует их сокращению (Blaustem et al., 1987).

Была изучена роль ЭДФ в патогенезе острого инфаркта миокарда (Багров и ооавт.,1987,1089;BaeTOv et al.,1983). Вероятно, при состояниях, требующих увеличения работы сердца (в частности, при инфаркте миокарда), в плазме крови происходит повьшСле концентрации эндогенного дигоксиноподобного ингибитора Na.K-АТФазы. За-' дерхка натрия внутри миокардиоцитов приводит, как известно, к

увеличению концентрации внутриклеточного кальция. Это, в свою очередь, повышает сократимость миокарда. Следовательно, СЩФ молот являться физиологическим регулятором сократимости сердца (de River, 1984; Navarathnm et al.,1990; Ba^rdv et al. ,1991,1991a; Kohn et al.,199b).

Однако, чрезмерное увеличение концентрации ЗДЗ в плжме крови выбывает, вместо фиаиологического эф^кта, чрезмерное угнетение активности Нл,К-АТФапи, что, в свою очередь, провоцирует развитие аритмий. Так же как и в рассмотренном вше примере с гипертонической .болезнью, в этом случае важную роль играет ' но-бочнш" аффект первоначально адаптивного действия ИДО.

Вопрос о химической структуре '.ДО до настоящего времени остается открытым. RcJif.fflUHGTBO исследователей считают, что ьндоген-iiuii дигитаписоподсбньш фачтор является стероидом и синтезируется ti коре надпочечников. Исследования последних лот показывают, что ткали члкоьска содержат несколько веществ, спогоОнмх угнетать Na, К-АТФазу и взаимодействовать с антителами к дигоксину (Kelly et al. ,1905; Shaikh et. al. , 1991 ;Doris, 1994), но лишь уабаин бил выделен из плазмы человека и достоверно идентифицирован ( Ludens et al.,îylJl). Однако, уабаин не может являться единственным эндогенным ингибитором натриевого насоса, играющим ключевую роль в пато-геневе гипертенэии, поскольку не является актиьним ваэоконстрик-торох (Yuan et. al., 1993).

Несомненный интерес при поиске ответа на вопрос о природе назоактиьного ЩФ млекоиитакшум представляют стероидные соединения масса буфадиенолидов - эндогенные ингибиторы Na.K-АТФааы, синтепируемие в паротидкых железах и коже амфибий (Barbier et al.,1959; Filer,197ÖJ," которые, в силу особенностей их эволюции (приспособление к смешанным пресно-соленым ареалам), выработали особую систему, позволяющую обеспечивать гибкую регуляции чрез-кожного транспорта натрия - Na.K-АТФаау и её регуляторы.

Недавно Оьио показано (Bagrov et al.,1993), что яд жаб Bufo marinas, имеющий в своем составе буфадиенолиды , является активным ьазомнетриктером, что может свидетельствовать в пользу буфа-диенешздной природы ИДФ.

В качестве кандидатов на роль вазоактивного ЭДФ млекопитающих из соединений группы буфадиеноладов рассматривались ранее буфалин (Kieval et al.,1988; Cress et al., 1991; Panesar,1994) и

резибуфагенин (Lichtsteln et а1..1У8б). Однако, убедительные данные о том, что эти соединения действительно удовлетворяют всем требованиям, предъявляемым к ЭДФ. а также сведения об их реальном присутствии в организме млекопитающих в литературе отсутствуют.

Таким образом,учитывая возможность синтеза буфчдиенолидов в организме позвоночных , участие данного класса соединений в системе, обеспечивающей регуляцию чрезкозшого транспорта натрия у амфибий, их дигитаяисоподобную иммунорежтивность , использование в традиционной восточной медицине препаратов кожи жаб в качестве положительных инотрогшых средств и диуретиков, а также ярко выраженные валокпнетрикторнне свойства яда xaft Bufo mai mus, исследование биологических свойств ЭДФ кожи жаб и поиск их аналогов у млекопитающих, в том числе и у человека, является обоснованным и перспективным.

Цель и задачи исследования. Цель данной работа заключалась в проверке гипотезы о буфадиенолидной природе ЭДО млекопитающих.

В ходе работа ставились следующие конкретнее задачи:

1. Поиск среди Оуфадиенолидов яда жабы Bufo marinus веществ, обладающих, наряду со способностью инп'биропагь Na, К-насос, свойствами, ожидаемыми от ЭДФ : вазоконстрик! 'рной астизностш и дигоксиноподобной иммунореактиЕностью.

2. Исследование фармакологических. свойств выявленного вещества (маринобуфагенина) и сравнение механизма его вазоконстрик-торного действия с механизмом вазоконстрикторного действия уабаи-на..

3. Получение пол шшональных антител к маринобуфагенину и разработка фдюороиммунометрического метода для определения его (или подобного ему соединения) в организме млекопитающих.

4. Изучение природы ЭДФ, образующегося при остром расширении внеклеточного пространства у собак.

5. Определение уровня маринобуфагениноподоОного вещества в организме человека в остром периоде инфаркта миокарда.

6. Выделение и идентификация эндогенного буфадиенолида(ов) у млекопитающих.

Научная новизна. В работе впервые исследованы ва^оконстрик-торные свойства буфадиенолидов яда хаб Bufo marlmC и выявлено веществ о, которое придает яду свойства., присущие эндогенному дигиталису. Этим веществом является стероидное соединение маринобу-

фагенин (3,5 гидрокси 14,15 эпокси буфадиенолид).

Установлены различия в механизмах вааоконстрикции, вызванной двумя различными ингибиторами натриевого насоса, маринобуфагени-ном и угйсшьом.

Впервые получены поликлональные антитела к маринобуфагенину, и на их основе разработан фиюороиммунометрический метод определения мариноОуфагеникноподобной иммунореактивности.

Обнаружено, что образование маринобуфагенииноподобного фактора в организме человека значительно возрастает в остром периоде инфаркта миокарда и при экспериментальной патологии.

Впервые удалось выделить из мочи человека методом высокоэффективной жидкостной хроматографии вещество с маринобуфагенинопо-добнок иммунореактивностью, физико-химические свойства которого оказались неотличимыми от свойств маринобуфагенина, что позволяет нам утверждать, что вазозктивным ЭДФ человека является маринобу-фагенин или его стереоизомер.

Научно-практнчесная ценность работа. В ходе данной работы из мочи человека был выделен и идентифицирован новый эндогенный регулятор активности натриевого насоса, аналогичный ЭДФ синтезируемому в паротвдных железах амфибий-маринобуфагенину. Разработанный нами на основе полиююнальных антител флюороиммунометрический метод исследования позволяет производить измерения маринобуфагино-подобной иммунореактивности в различных тканях, в разных физиологических и патологических условиях, что позволит, в комплексе с использованием антител к маринобуфагенину в физиологических экспериментах in vivo и in vitro расширить наши знания о механизмах регуляции водно-солевого баланса и сердечно-сосудистой системы , а также патогенезе, профилактике и лечении заболеваний, связанных с нарушениями этой регуляции.

Реализация результатов исследования. Разработанный нами флюороиммунометрический метод определения маринобуфагениноподобной иммунореактивности был использован в клинике неотложной кардиологии НШ скорой помаци им. И.И.Джанелидзе.

Апри.ди,ия работу.Основные результаты работы были доложены на Международной конференции "Натриевый насос",( Тодтмоосб Германия, 1993), конференциях европейской секции Международного общества по исследовании сердца (Иерусалим,1993 и Копенгаген.1994), Ежегодном заседании Совета по высокому артериальному давлениюАме-

- б -

ршсанской сердечной ассоциации (Чикаго, 1994), 15 и 16 конференциях Американского общества гипертеизии (Нью-Йорк, 1995,1996;

Структура и объем раооты. Диссертация изложена на ^ {£ страницах машинописного текста, состоит иа введения, обзора литературы, результатов исследований, изложенных в 5 главах, каждая из которых состоит из описания материалов и методов, результатов и их обсуждения; заключения и выводов; списка испольаован-ной литературы, который содержит f¿<f работ. Работа содержит £6 рисунков и 1 таблицу.

Публикации. По материала** диссертации опубликовано 11 работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Получение яда п его первичиая обработка. Взрослые жабы обоего пола были получены из Санкт-Петербургского и Латвийского (Рига) Зоологических парков. Яд получали ...леуег end Linde, 1971) из околоушных (паротидных) желез, аккуратно надавливая fía их основания. При температуре 30°С яд кристаллизовался в течение нескольких дней и в дальнейшем хранился при t 1-10°С.

Выделение стероидной фракция яда. качестпенный аиалкз оо состсва. 2 г. хорошо высушенного секрета жаби Bufo marlnus экстрагировали хлороформом D аппарате Ссксклета в течение шесте часов. Растворитель удаляли в вакууме и получали 170 мг. сухого остатка, представляющего собой стероидную фракцию секрета (К.Meyer, 1959). Небольшую порцию полученной смеси растворяли в минимальном количестве этилового эфира уксусной кислоты и анализироали методом тонкослойной хроматографии (ТОО.

Пластинки Sllufol UV 254 предварительно активировали в течение часа при 100°С; в качестве алиэнтов использовали этилацетат и систему этилацетат : ацетон (9:1). Идентифицировали стероиды по хроматографтческой подвижности ( Rf ) в указанных системах э.;.-озн-тов (R.Zelnlk,1962) и по цветной реакции со SbC13 (К.Keyer,195?). Реакцию с трихлоридом сурьмы проводили следующим образом : пластинку тщательно высушивали от растворителя и смачивали 10Х раствором SbOl?. в хлороформе. Затем пластинку нагревали в термостате при 80°С в течение 5-10 минут до развития характернее для данных соединений окраски. В качестве эталонных соединений ..-пользовали коммерческие препараты Bufalín и Cinobuíagin (фирмы SIGMA).

Препаративное выделение стероидов из ядя иаб Bufo marinus.

Препаративное выделение стероидов осуществляли методом ТСХ на пластинках Kleseig'el 60 F 254+366, 20x20 cm ( фирмы MERCK); в качестве элюэнта использовали этиловый эфир уксусной кислоти. Вымывали фракцию, дающую соответствующую данному стероиду качественную реакцию. Растворитель удаляли при пониженном давлении.

Исследование вааононстрнкгорной активности веществ на препаратах аорт и кризы и легочной артерии человека. Кольца сосудов (22,5 мм диаметром), немедленно после выделения подвешивали под нагруакой ( 1 г.) в термостатируемые Еанночки объемом 10 мл, со-держашие питательный раствор ( в мМ : NaCl-130 KCl-4,7 С'аС12 -1,8 MgClE -1,0 NaH2P04 -0,4 NaHC03 -19, глюкоза-5,4 ), через который пропускам смесь 952 кислорода и 52 углекислого газа. Сокращения регистрировали в изометрическом режиме, используя датчик на тен-зорезисторах КТД-2Б, запись сокращения производили на перьевом самописце Н-338. Через 60 минут после помещения изолированных колец аорты в ваннчку, кумулятивно вводили увеличивающиеся концентрации исследуемых препаратов.

Определение активности уабаин-чувствительного Ыа.К-насоса в препарате аорти крысы. Активность Na,К-насоса в препарате аорты крысы определяли методом, основанным на использовании изотопа 86Rb+, трансмембранный транспорт которого в условиях эксперимента идентичен транспорту ионов калия (Hougea,1981).

Кшьпа аорты диаметром 2-2,5 мм и весом 3-5 мг инкубировали в течение 30 мин в питательном растворе N1 (мМ): Ns.1l-120 КС1-4 CaCl2-b,C MgC12- 2,0 NaHC03-24 глюкоза -5.6 (pH» 7,4 , t«32°C). через который пропускали смесь 95Z кислорода и 5Z углекислого газа. Затем препараты переносили в прбирки с питательным раствором такого же состава, но со сниженной концентрацией KCl (2мМ), в líOTOpue добавляли исследуемые вещества и раствор 86 RbCl с таким расчетом, чтобы концентр;шмя ионов Rb+ не превышала 0,1 М. Измерения проводили е двух параллельных сериях - в присутствии и В отсутствие уабаика (1 мМ) . Пробы инкубировали при t-3Z°C е течение IXAt.mh , не прекращая пропускать через раствор смесь кислорода и углекислого гжа. Затем кольца аорты промывали питательным раствором N1, взвешивали и помещали в прбирки, содержащие 6 мл дистиллированной веды. Радиоактивность проб определяли через 1 час (по Черенкову) -в гамма счетчике (LKB-Wallac).

- ß -

Основываясь на постоянном соотношении K/Rb в среде инкубации, .активность Na,К-насоса определяли как разность в захвате рубидия в присутствии и в отсутствие оуаОаинэ и вырзу.али в пМ К /мг влажного веса ткани /15 мин.

Определение уабаиноподобной иммунореактивности. Уровень содержания уабаиноподобной иммунореактивности определяли при помощи модифицированного коммерческого набора (Ouabain ELISA Kit фирмы New England Nuclear). Ячейки микрогитрационных пластинок были покрыты уабаиновым конъюгатом. После внесения стандартов и исследуемых проб вносились первичные антитела ( 50 мкл). второй этап инкубации подразумевал использование вторичных антител, конгюги-рованных с пероксидааой хрена. Однако, мы использовали вторичные антитела erat -antlrabbit, меченые европием (производство фирмы Wallac-Oy, Финляндия). После второй инкубации в лунки вносили по 200 мкл проявляющего раствора и в счетчике (1234 Delfla Arcus флуориметр) определяли концентрацию осажденного европия.

Определение дигоксиноподобной иммунореактивности. Способ определения дигоксиноподобной иммунореактивности был аналогичен способу определения уабаиноподобной иммунореактивности. ¡3 качестве первичных антител мы использовали антидигоксиновые антитела (Sigma Chemicals) в разведении 1/8000 - 1/12000.

Определение маринобуфагенмноподобиой иммунореактивности. Метод был впервые разработан нами на основе поликлональных антител к маринобуфагенину. разработка метода состояла из двух этапов : получения поликлональных антител и собственно разработки флюоро-иммунометрического метода определения маринобуфагениноподобной иммунореактивности.

Для получения конъюгатсв маринобуфагенина с бычьим сывороточным альбумином (БСА) и РНКазой, необходимых для иммунизации и покрытия твердой фазы для разделения сред, мы остановились на методе, описанном ранее для конъюгации с указанными белками дигок-зина и уабаина (Curd and al., 1971). Метод основан на периодатном экислении углеводного остатка с последующим взаимодействием образовавшихся карбонильных групп со свободными аминогруппами белка. Гак как маринобуфагекин представляет собой агликон, необходимо Шо предварительно синтезировать маринобуфагенигСз-гликозид. Синтезировали этот гликозид по методу, описанному ранее для аль--юстерока, введя незначительные модификации . Иммунизацию кроли-

ков, вцдоление, очистку и конт(юль качества поликлональных антител npi.'iu;i.'vi;«!!< по от.шдлртнш методикам (Катти, lfîOl)

Дли иммуниздю'и ;<K60Tiiux мы коппль.^орато юмктгат мдршюОу-фга^нша с ССА, в качество покрытия твердой флзм для разделения

срс-д Сил iicncjiu-i'.rr.'ii: кпакгат мпг иноОус'пгспинл с МКагюй. Первым эталон гл-'рлОоткй кетодп бил подбор сптшшыюй тьердой фазы . В л/чхл иуас ni «цл1к:т«»»-лшик пв»»ии гкпоали но 100 мил раствора KOii:>«.rv.ï.\ к-ц*иноС'у|,чг»|;ин HiKaaa в гозр^.т-л- iatx коицггтрациях иа ¡■асч-'та 0,ш ¡¡>,0 №ï/»yur;/. В качестве сси-.йгн'диаа-июпнгго буфера к>лк>лг».йоя.'111й фосфлткнД Суфс-р (PEG). Иарлилол^но коятрольнш л., tirai к«... ; ийпш ралгеорз» ИЖаш в тех ле ко»«снтр.'ли!>.:;. Пязстйнчи ии-к'^мроьел'д при комнатной температуре в течение 20 часов, после ч<:1-о ¡.-р-.-шпйли 6 раз физиологическим p.vrnv.föM : первые три раза с Тнш- 20 (Я1) »¿тем три раэа - без детергента. Затем тдюбилизи-рпышшш конпегат в течение часа иикуОщюпали с заведомо избыточные кел'.'.еесты":».! (р; введение 1/5(10) антииариноОуфагениковой анти-сые.ороч ки ( 100 ькл.'луьку ), после чего содерлимее лунок удаляли, лунки двалдь проммяаяи физиологическим раствором и вносили в них втеричпда антитела (моченые европием eoat.-&"itiral-blt, Wal lac-Oy,Финляндия) в рекомендуемой производителем концентрации (}П0 мкл/луику). Пи;ле часовой инкубации лунки промывали 6 раз, вносили по "ОТ мкл проявляющего ра-твора к в счетчике (12М Delfia Arcus флуоримотр) определяли концентрацию остяенпого ев-[.юппн,

Концентрация 1м«г/лунку, находящаяся в середине линейного участка, кривой была признала оптимальной. Оптимальными разведениями первичных к вторичных .антител оказались 1/4000 и 1/400, соответственно. TfJttiM образом Сила получена рабочая калибровочная кривая в диапазоне от 10-12 до 10-4 моль/jî. естественно, в условиях конкретного эксперимента не было необходимости работать во всем диапазоне кривой, у. мы пользовались участием от 0,001 до 100 нмодь/л. .

ЗДФ при остром инфаркте миокарда (ОКМ) у ладей. Исследование было про .„::ено в НИИ скорой помозд им. И.И. Джанелидзе (Ог-Петер-Оург),. с яквяря 1994 по апрель 19У5. В исследование включали пациентов, госпитализированных в отделение реанимации клиники неот-лодной кардиологии по поводу первого трансмурального ОИМ. (Минесоттокий код 1-1-1, 1-2-5, 1-2-6, 1-2-7) Пациенты с неста-

Аильной стенокардией, госпитализированные с подозрением на ОИМ и впоследствие не подтвержденным, составили контрольную группу. Никто из обследуемых не принимал ранее препараты дигиталиса и не имел в анамнезе заболеваний, связанных с повышением концентрации 9ДФ в плазме крови (гипертензия II-III, заболевания печени или почек, эндокринные рассторойства).

Венозную кровь забирали в 1, 2, 3, 4-5, 7-10 и 14 дни от начала заболевания. Плазму отбирали, неполярную фракцию экстрагировали на колонках оСращрнно-фазовых Sep-Рак С18. Предварительно каждую колонку промывали 5 мл дистиллированной воды, затем 5 мл ацетонитрила и опять 5 мл дистиллированной воды. После этого на колонку наносили пробу плазмы (0,2 мл), вымывали полярную фракцию 1 мл дистиллированной воды и затем элюировапи неполярную фракцию 40Х ацетонитрилом. Растворитель удаляли в вакууме, концентрацию маринобуфагениноподобного фактора в плазме определяли с использованием разработанного нами флюороиммунометрического метода для определения маринобуфагениноподобной иммунореактивпости и вырзжа-ли в виде нмоль / л "маринобуфагениновых" эгаивалентоп.

Результаты анализировали статистически, используя U-тест Манна-Уитни и программу AN0VA для повторных измерений.

Определение среднесуточного выведения мэринобуфагениноподоб-ного фактора человеком. Собирали суточную мочу и отбирали пробы по 1 мл. Концентрацию маринобуфагениноподобного фактора в пробе определяли флюороиммунометрическим методом и вычисляли суточное выведение маринобуфагениноподобного материала.

Природа ЭДФ, образующегося при остром расширении внеклеточного пространства (РВП) у собак. Эксперименты были поставлены на 14 беспородных самцах собак массой 10-16 кг. За 24 часа до опыта животных не кормили и не поили. Непосредственно перед опытом животным проводили премедикацию (фенобарбитал 17 мг/кг, в/в). В течение эксперимента общая анестезия поддерживалась внутривенным качельным введением 0,5% раствора тиамилата натрия.Животные были интубированы и в течение эксперимента находились на искусственной вентиляции легких смесью из 50Х кислорода и Еоздуха. Правая и левая бедренные вены были катетеризированы поливиниловыми катетерами для введения физиологического раствора и измерения*^ артериального давления (Ohmeda 7000). Правая плечевая вена била' катетеризирована для забора проб крови. Мочевой пуаырь катетери-

пировали для сбора мочи.

Образцы венозной крови (2 мл.) собирали в гепаринизированные пробирки каждые 6 минут в течение первых оО минут эксперимента и каждые 1«) минут в течение последующих 1ЬО минут, центрифугировали, полученную гтлаг.му хранили при -70 С до определения концентрации ЭД'Х'. Концентрацию ЬД1> определяли (|иииог>оиммунометрическим метод-.«* .

Животные 01 и и разделены на три экспериментальные группы. Пяти ооО'иснм неодим только изотонический физиологический раст--нор. Ъ животным за -1Ъ минут до ИЛ1 вводили ноликлоналыше антиди-гоксиновое антитела (50 мет/кг в обьеме 2 мл, Н1рла СЬетЬ:а1г.). Для того, чтобы иошмить неснецифическле реакции, связанные с ькеденкем антител, 4 животным аа 45 минут до РВИ вводили контрольные (.кроличьи с.нтимишинио) антитела.

К«сш1>д'«ан»<! »¡»ми чел.жокл методам ш«;оио:>:?,.К'лгилнай жид-«««гч'Ой *|юм«ши'р.-«1»1и. Первый этап исследования заключался в получении концентрированного экстракта мочи и выделении из него фракции с х[«матографическими свойствами, близкими к маринооуфа-генииу. С этой целью 5 литров мочи экстрагировали 7,5 литрами хлороформа, хлоре »¡и,рм удалили при пониженном давлении, сухой остаток растворяли и минимальном количестве атилацетата и разделяли на фракции методом препаративной тонкослойной \рюматог-[к-^^ии, используя в качестве злюзнта атилацетат. Зону ■.. хроматогрлфической подвижностью, соответствующей К маринобуфагенина в указанных условиях, вымывали ацетонитрилом и использовали для дальнейшего анализа.

Полученный зкетр.акт анализировали методом высокоэффективной жидкост1!ои хроматографии на колонке ОЬЫАРАК С18 300А 3,9x1 ГО , насос Н11еоп (модель 303, детектор модели 116). Колонку уравновешивали 0,3*. раствором трифторуксусной кислоты, исследования проводили в линейном градиенте ацетонитрила от 10Х до 80£ (0,1Х трифторуксусной кислоты)и в изократном режиме : 32Х ацетонитрила (0,1% трифторуксусной кислоты), скорость подачи ¿люэнта на колонку составила 1 мл/мин. Поглощение регистрировали на 230 и 300 нм. Эта часть исследования была выполнена на оборудовании даоора-тории химии пептидов Ст.Петербургского института Особо Чистых Биопрепаратов совместно с Казаковым Г.П.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

Поиск вааоактнзннх буфадиешугцпов из стероидной фракции яда жлй Bufo marinas. На данном этапе проявления эксперимента пео '-д нами встала задача идентифицировать вещество (или вещества). которым яд жабы обязан свойствен, характерными длл ЭДФ. С л той целью стероидная Фракция яда была исследована нами клчеотр'.'нно методом ТСК с примет »ис-м характерных для буфаниенолидов цветных решеций с хлоридом сурьмы, и рааделена на Фс ;,;;,.'нткфициро-

вать удалось 6 веществ.

Идентифицированные вещества были рыделенн и исследованы на вароконетрикторную активность. Лить одно вещесткл - маринооуфаге-нин - оказалось активным вазоконстриктором. Кроьм того, оно якля-етс.я главной составляющей частью стероидной фракции яда и, вероятно, именно его присутствием объясняется наличие у яда свойств, характерных для ЭДФ.

Результаты качественного анализа смеси представлены в таблице:

вещество КГ окраска со SbC13 вазопонстрикцня (этнлацетат)

резибуфагенин 0,75 фиолетовый +

буфялин 0,66 серо-голубой +

маринобуфагенин 0,50 зелено-коричневый +++■

телоцинобуфагин 0,41 голубой . +

гамабуфаталин 0,34 лиловый

геллебригенин 0,30 желтый +

Фармакологическое иссле, звание вззоактивиого ЭД# яда жаб Bufo mariniis-мариноСуфагекина, сравнение с уабаином. Данная серия опытов была посвящена исследовании механизма действия выявленного вазоактивного ЭДФ и сравнению его действия с действием другого кандидата на роль ЭДФ - уабаииа.

Как показано на рисунке 1 , сокраи, ¡шя колец аорты, вызванные уабакном (10-100 мкы/л), не имели выраженного дозазависимого характера и были относительно слабыми. Кроме того, развивались они медленно, достигая максимума спустя 15 минут nocv; введения препарата. Развившееся в ответ на введение уабаииа сокращение' блокировалось фенголамином, а предварительная . инкубация кольца

аорты с фентоламином (2 мкм/л) предотвращала развитие сокращения в ответ на последующее введение уабаина.

Поликлональные антитела к дигоксину не оказывали влияния на вызванное уаОалном сокращение.

Сокращения, вызванные маринобуфагенином (рис.1 ), имели устойчивый, дозамависимий характер, развивались быстро, достигая максимума в течение 1-3 минут.

кош роль

-5 -4 1одС(моль\л)

+

&

ю

со

н

й

■н

п

I

'§ |

к

л О

с; о

ы

Е« г;

.ш л

ь Г!

1) О

й I

К

О

к'0|11|>1>.,||.

-6

-5 -4

1одС(моль\л)

Рис.1.Вазоконстрикторные эффекты маринобуфагенина и уабаина на изолированных кольцах аорты крысы. © уабаин

Д маринобуфагенин 13 маринобуфагенин в присутствии

антител к дигоксину М + ш; п-б-9; *Р<0,05 по сравнению с коте льным вкаченном; **Р<0,01 по сравнению с эффектом маринобуфагенина в отсутствие антител к дигоксину

Рис.2.Действие уабаина и маринобуфагенина на активность Ма,К-насоса ( уайаин-чувствитель-ный захват РЬ) аорты крысы. @уабаин

Оуабаин в присутствии фентол-

амина (2 мкм/л) А маринобуфагенин Дмаринобуфагенин в присутствии фектодамина (2 мкм/л) М ± ш; п-6-9;*Р<0,05 по сравнению с контролем;**Р<0,05 по сравнении с эффектом маринобуфа генкна в отсутствие фентоламина

Предварительное введение фентоламина (2 мкм/л) не влияло на характер вызванных маринобуфагенином сокращений , развившееся в ответ на введение марииоо> ¡агенина сокращение фентолалином не блокировалось. Поликлональные антидигоксиновые антитела (16 мкг/мл)блокировали разоконстриктсрный эффект маринобуфагенина.

На рисунке 2 показано, что в концентрации 10 мкм/л уабаин стимулировал, а в Оолее высоких концентрациях yi нетал активность Na,К-насоса в изолированных кольцах аорты крысы. Предварительное введение фентоламика (2 мкм/л) предупреждало развитие стимуляции активности насоса, однако не влияло на ингибиторный эф{>ект высоких концентраций уабаина. В контрольных экспериментах фентоламин не имел собственного влияния на активность натриевого насоса в аорте крысы. В отдельной серии из 4 экспериментов норадреналин (2 мкм/ л) активировал натриевый насос в изолированных кольцах аорты крысы (3,7+0,4 и 11,7+2, нмоль К+ 30 мин/мг ; Р<0,001).

Маринобуфагеник дозазависимым образом вызывал угнетение лк~ тивности натриевого насоса в аорте крысы (рисунок 2) . Фентоламин (2мкм/л) не влиял на угнетение натриевого насоса маринобуфагени-иом.

Важным результатом данной серии экспериментов является тот факт, что , в отличие от уабаина, ни вазоконстрикторные свойства маринобуфагенина, ни его способность угнетать На,К-насос не являются чувствительными к блокаде адренорецепторов фентоламином. Эти наблюдения позволяют нам сделать выводы о различных механизмах возникновения вавоконсирикции, вызываемой этими соединениями. Тот факт, что и стимуляция насоса, и вазоконстрикторный эффект уабаина блокировались фентоламином, говорит о том, что, вероятно, (а) стимуляция Na.K-Hacoca Сипа обусловлена выделением норадреналина из интрамуралькых нервных окончаний сосудистой стенки ;(б) сокращение аорты в результате действия уабаина имеет преимущественно нейрогенное происхождение.

То, что марииобуфагенин угнетает Na.K-А'ГФазу (Shi mart a al.,1985) и вызывает положительный инотропный эффект на преларо тах сердечной мышцы (Chen and Kovarikova, 196''') , было показано ранее. Однако, механизм вазоконстрикторных эффектов маринобуфагенина до настоящего времени не был проанализирован. В отличие от у.чо . • 1, мариноОуфагеник не стимулировал активность натриевого насоса; при этом ни вазоконстрикция, ни угнетение натриевого на-

coca, вызванные маринобуфагенином, фентоламином не блокировались. Таким образом, вазокинстрикторный эффект маринобуфагеница может быть связан непосредственно с угнетением Na,К-насоса клеток гладких мышц сосуда. Ранее Сило показано, что сокращения, вызванные •ингибиторами Na,К-насоса, могут быть либо "миогенного", либо "нейрогенного" происхождения, в зависимости от вида животного и типа исследуемого кровеносного сосуда ( Adams et al.,1983; Marin et al.,1988). В нашем исследовании мы показали,. что сокращения аорты крысы , вызванные двумя различим« ингибитрами натриевого насоса, маринобуфагенином и уабаином, реализуются различными механизмами. Кроме того, результаты параллель®« исследований, проведенных сотрудниками нашей группы, свидетельствуют о том, что маринобуфагенин и уабаин являются лигандачи двух рецепторов для УДО в сосуде, представленных двумя субъединицами Na.K-АТФазы: на мембранной фракции, содержащей мембраны гладкомышечных клеток и альфа-1 суб-ьединицу Na, К-AT1" шы, маринобуфагенин обладает существенно большей активностью, тогда как уабаин более активен на мембраной фракции, содержащей мембраны нервных окончаний сосудистой стенки и альфа-3 оубъединицу Na.K-АТФазы (Bagrov et al.,1996).

Различия в механизмах вазоионстрикторных эффектов, вызываемых маринобуфагенином й уабаином, косвенно подтверждаются и их различной иммунореактиркостью: маринобуфагенин показал в 20 раз более высокую перекрестную иммунореактивность с антидигоксиновыми антителами, чем уабаин.. Таким образом, результаты данной части исследования убедительно показывают, что быстро действующий ингибитор Na+,K+-Hacoca маринобуфагенин регулирует тонус сосуда независимо от нейроэффекторного взаимодействия в стенках сосуда, вызывая сокращения, непосредственно связанные с угнетением натривого насоса гладкомышечных клеток. Полученные результаты можно рассматривать как подтверждение гипотезы о буфадиенолидной природе ЭДФ млекопитающих.

ЭДФ при остром инфаркте миокарда у людей. Ранее Оьшо показано, что у больных в острейшем периоде ОИМ существенно возрастает способность плазмы крови к угнетению На,К-АТФазы и одновременно увеличивается концентрация ЭДФ в плазме крови (Bagrov et al.,1991;Bagrov et al., 1991a). Цель данной серии экспериментов

заключалась в исследовании изменения урогня эндогенного маринобу-фагениноподобного 'фактора в плазме крови у больных ОИМ.

В исследование были включены 14 пациентов с ОИМ (10 мужчин и Л женщины в возрасте от 50 до 72 лет, и 10 больных с нестабильной стенокардией и подозрением на ОИМ (40 -67 лет). Было установлено, что суточное выведение маринобуф.чгениноподобиой иммунореактивнос-ти с мочой у пациентов в течение первых суток после начала ОИМ было значительно повышено (60+10 нмоль) по сравнению с больными нестабильной стенокардией (10f.4 нмоль). Как показано на рис.3, на 5 сутки после развития ОИМ концентрация ЭДФ в плазме снизилась до уровня контрольных значений (0,5+0,03 нмоль/л), тогда как в течение первых суток ОШ наблюдалось ее существенное увеличение (1,5+ 0,5 нмоль/л).

Результаты данного исследования показывают, что концентрация маринобуфагенилоподобного фактора в плааме крови у болы-чх в перине сутки ОИМ существенно превышает уровень содержания зтого вещества у больных нестабильной стенокардией.Эти данные согласуются с ранее полученныеми результатами, свидетельствующими о повышении способности плазмы крови^больных и экспериментам гных животных с

W J3 J 2.0

О н с;

И О о

т $

&

о

0.5 -

1.0 ■

1.5

О

О 24

24 48 72 96 120 144 1б8 „2 216 ^ ВРЕМЯ С МОМЕНТА НАЧАЛА ОИМ (В ЧАСАХ)

Рис.3. Ивменение маринобуфагениноподобной иимунореактивности пла.- ; крови больных ОИМ. О больные ОИМ # контрольная группа

ОИМ к угнетению Na.K-АТФазы (Багров и соавт.,1987; Bagrov et al., 1989; Bagrov et al.,1993). Отсутствие изменений мариноСуфагенино-подобной иммунореактивности в плазме у больных о нестабильной стенокардией дает возможность предположить, что повышение У1ювня маринобуфагениноподобного фактора в плазме крови Сольных с ОИМ било скорее всего связано с уменьшением сердечного выброса, а не являлось стрессорной реакцией, связанной с ангинозным приступом и госпитализацией.

Природа ЭДФ, образующегося при остром расширении внеклеточного пространства у собак. Одними из первых экспериментов, показавших существование циркулирующего ингибитора Na.K-АТФазы в плазме крови млекопитающих, были опыты по острому расширению внеклеточного пространства (Р8П) (Pamnanl et al.,1981). В серии опытов, поставленных преимущественно на собаках, было показано, что быстрое внутривенное введение значительного объема изотонического раствора хлористого натрия приводит к стимулированию диуреза, натрийуреза и сопровождается выделением ЭДФ. Целью наших экспериментов было исследование возможной роли эндогенных маринобуфагенинолодобных и уабаиноподобных факторов в реакции на острое расширение внеклеточного пространства (РВП) у собак. Для блокирования эффектов ЭДФ ln vivo мы использовали по-ликлональные антитела к дигоксину, которые, как уже было показано, обладают способностью связывать маринобуфагенин.

До начала РВП уровень содержания мариноОуфагениноподоОной и уабаиноподобной иммунореактивности в плазме крови составил 0,30 + 0,16 нмсхль/л и 0,019 ± 0,004 нмль/л соответственно.

В течение первых десяти минут РВП концентрация маринобуфаге-ниноподобной иммунореактивности в плазме крови увеличилась до 11, 87 + 3,15 нмоль/л (р < 0,01). Затем уровень мариноОуфагениноподоОной иммунореактивности снизился, и второе его увеличение в плазме крови произошло через 90 минут после'начала РВП. Уровень уабаиноподобной иммунореактивности в плазме крови в течение первых 25 минут РВП увеличился в меньшей степени : 0,139 + 0,056 нмоль/л (р < 0,05 ). В период с 90 до 180 минут после начала РВП произошло второе увеличение уабаиноподобной иммунореактивности в плазме крови : 0,196 + 0,136 нмоль/л ( р < 0,05 ).

УАБАИНСПОДОБНАЯ ИММУНОРЕАКТИВНОСТЬ (пмоль/ЭО кин)

МДРШЮБУФА! lZliiïHO-¡¡О.'КМЖЛЯ

иммунорьлк:ивнсхль

(п.чоль/30 мин)

g ts

а:

ib •-3

о о о о я.

s

Ф

te

о

Ьз g

О о kr Л S

о

к и

■о

-<

ш

я о

■о ta f ж to гг -н Я

tí с Л Г*. о g гз

s. ?

с » О e s н 0 s bj

О о ь> s » о «

>—3 ■о о 2

г s О Пт г * О г •в &

t.- te -I g я « о □ S S

■с н о •< ■о ta

* s S s о •о CJ er о s

& * s п -э О < й S ■—'

о о œ о s ■D .в Ö J p

я о о о г га у к о о &

о < EÖ о ■п 6? о ■о Л tr

ь -} a ii tr ra о

tr O. XZ СУ со H s s> О

tí О £ о .—- s ф Ti д ГС Ф

<i ь г u X » Ф rn

a* X g в a

Ш s ч g о ■s S g ф с

Ф V tö о о р X и

о S' S) •< Í0 ь H s S ф

3 Ï3 ф îa Ja

to (Jl О д ё о ю я .-V ф

ф iá H tn да ¡с СП а & 2;

ta С Ф я s л а CT О S S

ft o. •J ft Q ГГ а Ф Ô Ф

О <0 s » О а> СО й fei ts

•-5 o 23 з: ф 1+ ф S

(в TJ S д О a i Я ía ^ й 1

О o 3; Ф Ы CD S M < Ф ■а

О s S) го sz S i-*

О H « X to ?! i Ф = cx>

и W s S ь С" o

X Ф £ s о а S < ■а X & i

GJ ■< S ф о в. s ф <

С tS Î4 .... X За и о P

o S s n Cu Ф ï> ь СП a

-3 E CD a 3: ££ S Ö* о Ф 4

S ta О ф о s S н ■D Ф

о № CÖ -3 ■о j5 а о о s Œ s;

о P5 о ё гз H s S

г S о s: $< a

О S Ф ■о X и fe) ^ •< o

Л o о ф ï) 2 « s О Сх О1- о -ä 8 a o

н о о Q 1 "3 л ™ в ъ

s ■о Ö В ta О й E s o

í*3 о о 03 s 5

Ф ■< о v< о ?; ф ~

fca 6? о d 8? ä ■< îa o

р S э S ■Й" tí Ï3 s œ m

3 S К Ё •о б1 s I о s "TJ

^ о sr cc s w

я o Ф ч е.. о ¡T2 л X я .—i Î?

я и s я о о л. Ф

5=1 o СО с о s ■а ф /-S

S ь ■а Ф ь О Sí ф X

S 8. M 05 о ►3 -< е С 3 Ol o

О О W о Q я о T3

я X ~ Os Ф

ñ о л ы 2 о а •а s СО ö

s -J о ?» ч s Œ э Ф 1+ s

t о 1 t i о » • 1 —' i 1

- 1в -

Веделекие к ккеитифккация каркноОуфагек.шоподобного вещества на мочи человека. У пяти вдоровых людей нами было определено им-мунофлюорометрическим методом суточное выведение мариноОуфагени-ноподобного вещества; оно составило 8,2 ±2,9 нмоль/день (средний суточный диурез составил при этом 967 + 201 мл). Из этой мочи Оыл получен концентрированный экстракт, который- исследовали методом высокочувствительной жидкостной хроиатографии. В .качестве стандартов использовали уабаин, маринобуфагенин, дкгоксин, буфалин и спиронолактон . Ни одно из этих веществ совместно с маринобуфаге-нином не злюировалось. Раствор препарата в ацетонитриле наносили на колонку и злюировали 327. ацетонитршгам. Каждую минуту меняли приемник и определяли уровень мариноОуфагенииоподоОной иммуноре-активности в каждой фракции.

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ ФРАКЦИИ (мин) ' ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ ФРАКЦИИ (мин)

11 10 987654321

11 10 987654321

Рис.5. А.Профиль элхщии экстракта мочи.

Б.Профиль элюции экстракта мочи в присутствии стандарта

11 10 987654321 ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ ФРАКЦИИ (мин)

В.Профиль злюции мзрино-буфагениноподобной иммунореактивности

Как показано на рис.5, более 901 материала с маринобуфагени-ноподобной иммунореактивностью элюировалось на 8 минуте 32 7. аце-тонигрилом. Там же показано, что добавление маринобуфагенинового стандарта к экстракту мочи дало четкое, увеличение пика, соответствующего фракции 8 УФ спектр поглощения фракции 8 соответствовал УФ спектру поглощения, характерному для буфадиеколидов, в том числе и для маринобуфагенина.

Количественное выделение маринобуфагениноподобного вещества производили из мочи больных острым инфарктом миокарда по аналогичной методике. Было выделено 200 мкг вещества, проявившего ма-ринобуфагениноподобную иммунореактивность, имеющего УФ спектр поглощения, характерный для буфадиенолидов и хроматографически неотличимого от маринобуфагенинового стандарта. С выделенного вещества был снят масс-спектр, который также оказался практически неотличим от масс-спектра маринобуфагенина (рис.6).

100

%

401.2 [М*Н]4

365.2

38Э.2

402.2

403.2 423.1

........................................

Dale

340 350 360 370 380 390 400 410 420 430 440 450 460

¡ю.6.Масс-спектр маринобуфагенина (А) ;

Масс-спектр вещества, выделенного из мочи человека (Б)

ь

ВЫГОДЫ.

1.Показано, что вещество из яда хай Bufo marinas, обладающее дигоксиноподоОной иммунореактивностью , вазоконстрикторными ■свойствами и способностью угнетать натриевый насос аорты крысы отличается от ранее описанных вазоконстрикторных ЭДФ (уабаин.бу-фалин.резибуфагенин) и является буфадиенолидом маринобуфагенином ( 3 ,5 гидрокси-14,15-эпокси буфадиенолидом)

2. Исследованы фармакологические свойства маринобуфагенина в сравнении с уабаином ; установлено, что что сокращения аорты крысы , вызванные двумя различнми ингибитрами натриевого насоса, маринобуфагенином и уабаином, реализуются различными механизмами. Ингибитор Na, К-насоса маринобуфагенин регулирует тонус сосуда, вызывал сокращения, непосредственно связанные с угнетением натри-вого насоса гладкомншечных клеток.Вазоконстрикторкый аффект уаба-ина связан с освоспкдением норадреналина из интрамуральных нервных окончаний. Эффект сопровождался стимулированием Na.K-АТФазн. 3.Получены поликлональные антитела к маринобуфагенину и на их основе разработан флюороиммунометрический метод определения уровня маринобуфагиноподобкой иммунореактивности.

4.Установлено, что острое расширение внеклеточного пространства путем внутривенного введения значительного количества изотонического раствора хлорида натрия в большей степени стимулирует образование эндогенного маринобуфагениноподобного фактора, чем эндогенного уайаина.

5. Показано, .что в организме здоровых людей содержится мари-нобуфагениноподобное вещество и уровень маринобуфагешшоподобной иммунореактивности в крови резко возрастает в остром периоде инфаркта миокарда.

6.Из мочи человека методом высокоэффективной жидкостной хроматографии было выделено вещество, неотличимое от маринобуфагенина по UY спектру поглощения, масс-спетрометричесим и хроматографичесим харатеристиам, а также цветной реации с трихло-ридом сурьмы, что является убедительным свидетельством в пользу гипотезы о буфадиенолидной природе ЗДФ (или одного из его компонентов) млекопитающих, в том числе и человека.

По результатам диссертации опубликовано 11 печатных работ.

1.Bagrov Л. Y..Roukhojatklna N. I..Dmltrleva R. I..Fedorcva

0.V..Anderson D.E. Differential vasoactive effects of endogenous digitalis -like factors (EDLF). Biol. Chem. Hoppe-Selyer,1993,374, SP-180.

2.Bagrov A.Y..Dmltrleva R. I., Fedorova O.V. .Kuznesova E. A. .Roulhojatkina N.I. Endogenous digitalis in acute myocardial lschemla/lnfarctlon. Biol. Chem. Hoppe-Selyer,l993, 374, SP-181.

3.Bagrov A.Y..Fedorova 0.V..Roukhojatklna N.I., Dmltrleva R. I. Endogenous dlgogsln-Uke factor (EDLF):

pathophysiological role In acute myocardial lshemla. (Abstract) J. Mol. Cell. Cardiol., 1993: 25 (Suppl I); XI P5.

4. Bagrov A.Y., Dmltrleva R.I..Roukhojatklna N. I. .Kuznesova E.A. Nature and importance of endogenous digital is-like factor In acute myocardial isemia. J. Cell. Cardiol., 1994,26, 393.

5.Bagrov A.Y., Dmltrleva R.I., Fedorova O.V., Kuznesova E.A., Roukhojatklna N.!. Endogenous digitalis in acute myokardlal lshemla. The Sodium Pump, W.Schoner and V.Bamberg (Eds).Stelnkopff.

6.Bagrov A.Y., Fedorova O.V..Joy L.Austin-Lane, Dmltrleva R. I.,Anderson D.E. Endogenous marlnobufagenin-llke factor and Na,K-ATPase inhibition during voluntary hypoventilation. Hypertension, 1995. 26, 781-788.

7.Bagrov A.Y., Dmltrleva R.I..Fedorova O.V..Roukhojatklna N.

1. Marlnobufagenln-like lmmunoreactive substance, a possible endogenous Na,K-ATPase inhibitor with vasoconstriktor activity. Am. J. Hypertens. (Abstract) 1995.8,65A.

8.Bagrov A.Y. .Roukhojatklna N.I.,Plnaev A.Q. .Dinitrleva R. I., Fedorova O.V. Effects of two endogenous digitalis-like factors, ouabain and marinobufagenln in isolated rat aorta. Eur. J. Pharmacol., 1995, 274,151-158.

9..А.Я.Багров, Р.И.Дмитриева, Г.П.Казаков, О.В.Федорова. Э.Хантер, у.хоузлд, В.М.Шпень. Эндогенный шгибитор Na.K-АТФазы буфодиенолидной природы, 1(Х1) Международное совещание по эволюционной физиологии, Санкт-Петербург,1996, Тезисы докладов,с.12.

lQ.Bagrov A. Y.

Dmitrieva R. I..Fedorova O.V.

A.P.Hunter.G.P.Kazakov, V.M.Shpen Evidence for a bufodlenolide Na /K pump Inhibitor in human urine.Am. J. Hypertens., 1998, V.

ll.Bagiov A.Y., Fedoro"a O.V., Dmitrieva R.I., French A.V..Anderson D.E. Plasma marlnobufagenln-like and ouabaln-like lnmunoreactivlty during: acute saline volume expansion in anesthetlsed dogs. Cardiovascular Research, 1996, vol.26