Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фосфорилирование Na, К-АТФазы протеиназами С и А

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Фосфорилирование Na, К-АТФазы протеиназами С и А"

московский государственный лкбенжгет

им. Ы.В. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет ^ На правах рукописи

ЧИБАЛИН АЛЕКСАНДР ВАЛЕРИЕВИЧ

УДК 577.152.34 ФООФОИШКВАНИЕ На.К-АТФззы ПРОТЕИНКИНАЗАШ С И А 03.00.04 - биохимия

. АВТОРЕФЕРАТ диссертации нэ соискание учэкой степени кандидата биологических нзук

москеэ - 1ээз

Работа; выполнена в Отдела кинетики биохогачоскит, цроцэс-сов ИИЧ РАН, на кафэдре биохимии Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова и в Институте фармакология и токсикологии университета Лозанны.

Научный руководитель: .кандидат биологических наук,

Л.А.Еасилэц

Официальные ошононтн: доктор биологических наук,

> профессор Б.А.Ткачук

кандидат биологических наук, И.А.Гривенников

Ведущая организация - Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения.

Защитз состоится "?(-" 1ЭЭЗг. в в_" часов на

заседании Специализкровавяого Совета .Д. 053.05.32 при Московском государственном университете им. М. Б. Ломоносова по адресу: г. Ыосква 119899, Ленинские горы, Биологический факультет.

О диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан ¿¿/ 7УС 1393 г.

Т

Ученый секретарь Специализированного совета,

кандидат биологических наук Ю.Н.Лвйкин

ОБЩЯ XAPAÄTEPKQTlSiA РАБОТЫ Л::ту?';ьность ироблс-чы. Рзгу-пзцня кесгчх гаутралэтачзых проносив ос^г.зотвлпвтск путем ковалезтнсй иодхсикецзз Озлкаг. Однз-г. гл зглбо.'ве распространенных путоЗ ггсззлзнтной иодгфакзцаж является роЕкцгЕ фэсфзрзлзровшшя, катгтагруэмаэ npoToznicisa-33.V2. Фосфоргляровзнгэ ктрзат вашуп роль в рогулпц22 азгтшзю-сти как цэтсгиа?м2гичос:ппс формантов, так и многих гвмбрЕнных тпгнспзртшп систем а_ кратких згвотнаг. гсгилзртэр,

Из -капая, Са-::глэл, Сз"*т-АТФззз рлггиатаческЯ rsxäpasa, пзреносгчяк глгкозн , способна ЯосфсшлироЕзться гратаишпшсгкя in vitro и in vivo (CaxaToü, 1992; С1аив2п, 1SB3; Kaozssrst, 1937). а такая модификация ?<:9мйраншх пэргнсггсютз приводят к нзкзЕекшм их гранспсрткрух^ей асяггяости.

Являясь 0Д2Е!Я 23 ИЕКСрЭЕНКХ ЕврвЛОСЧДКСВ ТОПОВ, 1?а,К-АТФаза нграет хлхзчезуо роль в годдсркснии изннсго гог£эо-стаза клоткп. Несмотря нэ значительное количество эхспзргглсп-тйлышх данных о функиЕншхгеезии этого йесинта, мехашсгмн регуляции ого ектевности изучена нсдсстатг.чно.

И?29СТЕ0, ЧТО ItpOMS СТбТЮНДОХ И Т2рв02ДНШС ГОр'.'-ОЕСВ.

Ектгвярущих трЕзсирлпцшз генов КаД-АТОССЗЫ (Glo>: et al, 1S38), пз сктпзпсс-хь этого фермэЕта в р^зллшшх тканях суизстзеэЕО злшот квтэхолееш! v. другие гошсяц, сгпжвзрухгциа сксто?»у вто-рзчннх посредников {Коиетиачи, IS€2; Ткачук, Болдыревs 1375; .C-ieöBen ei al,1?34; Severin et al, 1974; Soneiol, 1S79). Существуй: данньо в пользу того, что С—й0лкн прантализг ввпосрвд-ствоннаэ участие в передаче гсркоквлыюго смгезлз па Ла.,К-АТФазу (Eaniierio et al, 1S90; Eanilenta et al, 1391Недавно было установлено, что активатора Ератеинкиззгл С (ИКС) и

>

J

цДЖ-завигарай протешвошазн (1Ш.) oiasiLEQDT ' соотвотствошю гнгибЕрущэв и ахтЕБируюцеа дейстЕиэ на АТФ-ггдрохазнув к кон-гсЕысяоргжрущрй аэт'ггпгасть иг,к-АТ0згн in 3iitu к in vivo (Ertrtorello, ¿perla, 19Э9; lynch ei al, 1935; Yacileia et ai, 1550; Toilets, Ectoars, 1992). ÎOM лэ jüoego до кедгггавго времэнЕ еэ Слиа EasacïHO, kqímí ла этот дорыэнт фосфорипк-руЕзться шхзтшеязазагаЕ к кеккэ jchobks да етого сэсЗюдаглг. Ус\12КОБЛонго зозио^Еостн такого ¿о^'юлглзрозвппя

2 огс istejîbâoo кзучзеео еэсознузл» дзи екяснзе^: ¿iüzahhcr.a

рогулзцгп ciKisaäöCTZ 5а,К-АТФазь£.

Цэль ssatoszpS р^бога за^тлалзсь б геалгдезэнип фосфорп-лирозанЕЕ кад-МОзкг сротеинктаэут a r¡ g как: in ^iiro, teic h В уехпэзлях, ЕрКйЯНЕЗЕЕНХ к in vivo - в гсг.'.ог*шгтах ооцетоз Хспораэ laeviä .

В работе upajscsaipmajscb рэгьшв слэдткзп: вадйЧ: -щентпй^ац1^1- суйо9д;з2ц, фспфорпггруагйхх. EEC ПКА в препаратах счеьэкноЗ Еа.К-АКазы н в КЙфОССМах.

-вдвагаЗьКЕция ¿осфорщкруегсс: ШШЕОХШСЛОТЕЫХ остатков и локагнзецзя участков фосщорлктаьаЕЕЯ фврганта ИКС к Шд.

-исол2дзб£к^э бселззеоскт фосфзркльровання в

гакагэнатах ооцегзе Zenop-js lasvis над дагепгза екшеаторэн

1го0т2пши1123..

Научн&п иовпзпа р&Оотн. В ходе работы установлено, что ШС Е ПКА cnscoömi еКи;:теззо фссфорЕпиразать а-суйьздззицу Ea.ï-ATffiasn из различных источпякое. Олрвдэленн участки фосцо-рзлпрования форганга oöeioai протоинкшмзЕаи, идентифицировала акцепторные оы^аохиаюти, ЕСЕЯздонана Брокзнная згшисинэсть рзггщкг. Усганоьлзно, что спзшф^естаха гхпхЕзторд I2CG ферйол-

!-зр1:етзтгцзтзт (НУ.) п Х.г-дасктзгоал-ел-г.'г^цзрол (¿1С2) п активатора - пАКО и дкбутирцл-цАПЭ стЕЧулгруст йосфора-.тшровышз а-суб'ьэдга.щы Нг.к-АЛЖсзы эндогепнкгст прстпиккинзсрдп е гогогенатзх осцетов Хепориз 1оэу1з .

Практическое саачэшга работы. Езлучосыв з работе экспэ-^аггнтзльнш данныэ рястгаряэт прэдставлетптэ о во^кзгЕыг путях рзгуляции сктпееостя Да.к-АТОазы. Лэлучзгано результаты ксполь-зузтся ггрт чтспг,1 сгюцкурса "Ваопггея коглЗраа" пп Е£ф?др? Су.о-тктл-лг Взологилгэсюго факультета МГУ, а разработанные F¿aтoд2-чеоою подходы могут Суть исполвзсеяек пря изучении другпг глэгйрачннх горэностзпсов еоеов.

АпрсСацяя работы. Результаты работы долсеэек на хсдлсква-укэ ксфэдры биохиглп Епологичзсюго факультета МГУ, па 2 Есэсо-езнок г5унш.'.энтельныэ я зряхетдЕнэ аспекты калэку-

.-.гтрнаа быо.тага^'- (Ссхзркпнд. 1391) н па 24 съо-иэ ЕвэВцарсаого ОбцоотЕа эт-еперг-таптальноЕ биологии (Базадь, 13Э2).

ПублкЕцни. По те:.;в диссзртазя! опубликовано 5 работ.

Структура и оСьеи гзеезртац^л. Диссертация состоит из яве-дзняя, соэсрэ .чктаратуры, эпзеегзя котодез нсслздсэзная, пзхо-Е9ЕИЯ результатов И ЕХ СбСТТКЗНИЯ, 2УЕОДЗВ 15 списка пгтирувней литературы. Работа ссдзржгт {2-.Н страниц азллЕСПзснсгс текста и рисуагтов. Сттсск литературы бхдйчззт2/$ петотнзкез. С0ДНК2АШЕ Г/БОТЫ НАЙТРЛАИ И ГЕТССТ ИССЛЕДОВАНИЯ Матаряалы. Сраязрат па.к-АТФпзэ из почак ЗцГо ха*1яиа, Еолкюгоналыпм антитела кэ субъэияЕцы йа.К-АТСагы из печзк Ви/о яхг1пи£ и монохлонзльные енп:тз.Л2 нз пд. отдз.чьЕые пептиды бши предоставлены профессором К. Геронт (Институт фзрмзкалопи

>

и токсикологе;, .Тозгкза). В ракете попользовал:! ирогеннгшназу из сердца быка фярт "sigua". Ос-сцт гаторззкзй лкггдзт Xmoyis laavln стадии vi {Dunont, 1572) ку-ПЬЕГШфоваЕ; з среде IES (itiller, ISS7). 3 ряда экакрзиешш для гкирэкигеассш Na.K-ATíesu в каэддЗ: ооцат предварительно гньензфСЕгш: Е иг а 0,3 иг ».tris, кодирущих cij к сугЗъвданцс! соответственно. нша; шттчзли

TpaEesq-zmissS iu vitre гиЕэгрззокжщоа ЕЕьхаушсг ДНК го гэтоду излтоне (liciten e'i al, ISS7).

ФоЕкцта ггпкрайсиапьвд кэ;дДт;ад оотит-об получали, тлк гошеано ргнзэ (Gssriug et si, 1939). Hü гсах стадиях фращнанпрзвевил с^дз гйдол°2ЕЯ содержала I к,\! дмиэтреЕтап (таг). Видолонгш КаД-АТОвза аз со^еыс; толез уткп ггрэводЕлг, как опЕсано .рззш (Багдкрог к со ал г., 1Э31).

прстестдате?? _с из шзге крысы ездзлязз: по v-этод?, прэдззозэк-

рзвзэ («i'vv-^i 2t 1933). gggjogKJ3g»3?srta очщчаной Ka. к-АТОзза и ».ыкроооп проводкш в срсде Еакуйецпг, содаргщэа 25 tói трио-HCi, (jH 7,4), ICO ынм угЗеиз лгбо I2Q i£* SsCl z 1С Ш XCl, a тгкзз 5 ügG.i-o, 5л15 »T-xT pn^ т «л; ЭДГА, I МЫ BTT 2 КЫСЭ ÍI'Ü I'J-^FÍ-iv'O (¿QQ-Z'JÜJ

РГЧ1/nsinm.^ J-П —: TTTV^TV-V тгсл rvfjOp. t п»зхтсото СП — рП

L/l..'*/ Ib.^W J - JVUÍU^I« i ¡n.UU^V'íJ. Vf il AWIW.^V

присутствии Ели отсутствие Б ¡г? НаД-ДЮаза ¿siSo 50 кг байка мы^чэзок, d.i-0,05 кс икс, 0,5 ксм 0ы01г= 0,1о ыг/ыя фэс^олишг-дз (азолахжзз) змл 50 hü jzióo (в схутаэ БКА) в присутствии ara отсутствие D,23 тритона Х-1СЮ, 0,1 ют каташпивссой субъзданкца ЕСД. остзнаыквапз доЗаапэнавм дэдеция-

сухъфатз зза (sus) до конечной концентрации 3.7%, дж5с данату-ртрущзй смэск м акалйзтоЕак пройи кэтода-ш ммунапроцд-

питещш либо элахтрофорэза в ПААГ, соотвотствчнпо.

Оосфорллгоовзндв_Ка.К-АТФвзи___зндогенннш протвкнкиназдот

проводам в освобожденных от гранул талгка гогюгснзтвх ооцитов 30 -жн при 25 °С в стандартной срзде инкубации (9 юм / ооцит), содергтащой ингибиторы протеаз, 100 ?.ыЫ узбаин в присутствии или в отсутствие 50 мкч цАИ® или 50 мни дибутирил-цАШ, а такне 0,2£ тритона Х-100, либо в присутствии или в отсутствие 100 нМ тик или 100 мкм dic8, а такта 1,5 мМ СаС1?. либо (в осутствие Саг+) 0,5 мМ ЭТТА. Реакции останавливала добввлзнизм sis до конечной концентрации 5,7% и проводили нммунопрсцшштажво. ТридсгнолИз и хдшпдтсинолиз Иа,к-АТФазы проводил! по мэтоду Моргансена (Jorgeneen, Farley, 1583) при соотношении формант: белок, равном 1:50 для трипсина и 1:6 для пмотршгсяна. ^^Р-фосфоамзнокислотныэ остатки^^определяли по мэтоду, списанному ранее (Boyle et al, 1991).

Электрофораз в долиакркламидном геле (ПААГ) и авторздиографая. Электрофорез прозодили в ШАГ з присутствии sds ео методу Лз?аии (iaemnli, 1970). По окончание электрофореза гель фиксировали, окрашивали Кума с си, отмывали в ннпнщег воде, высушивали и подвергали агторадиографии. Радиоактивность з полосах белков просчитывали в толуолъном сцинтмлляторэ EC-I06 либо измеряли по излучении Черенкова после солюЗзлйзации геля. Гели и азторадиограшк сканировали на лазерном денситометре иНговоап XL. i

Иимунопреципитшсао субъединиц ш.к-АТФазы проводили, как описано ранее (Gesring et al, IS85) и затеи анализировали пробы методом электрофореза с последупцеЯ авторадиогрэфгей. Кднцен^ецш_белков измеряли но методу Лоури (Lowry et al,

1951), либо, по цветной реакции с акидбвш черным (Sehafíner, Weismann, 1973).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Сосфоталированив I3KG и ПКА очищенных препаратов На.к-АТОазн из солевой вэлозы уткк и дочек Вц/о кот t тала.

Препарата Na.K-АТФазы фосфорилпровали протеинкипазами в двух основных состояниях: в присутствии сердечного гликозвда уабаина, пнгибирущего' АТФезпую актизность, и в присутствии ионов Na е К, обэшечивазщих проявление ферментативной активности.

Посла кэсуйации препаратов НаД-АТФазы с ГКО и [7-32Р]-АТФ наблюдалось включение метки е пслтаптида с молекулярной массой 100 кДа и 84 кДа (ñic.IA). Подипэптид о мол. массой 100 кДа соответствует а-субъединице Ka.K-АТФазы, а 84-кДа полипэптид -ПКС (PKG) , которая способна к автофосфорилировании. Включения матки в полшбпгиды, соотвэтствущиз по кол. массе р-субъвда-нице НаД-АТФазы ( 50 кДа - 56 кДз ), не происходило.

Интенсивность вклинения меченого фосфата в 100 кДа полк-пэптзд зависела от присутствия Ca2f в среде инкубации, и незна-чителыю стимулировалась при добавлении ГШ. (Рис. 1Л, 3), что, вероятно, связано с высоким содераанием фосфолишдов (0,5 кг/кг белка) в мекбраносвязанных препаратах КаД-АТФазн (Блюдзия и coaET., I96S), достаточным для активации ПКО. Очищенные препараты НаД-АТОаза Éa содержали примеси эндогенных протелн-кжназ (Рис. IA, I, 5). Пошшептид с мол. массой 100 хДа, соотва тствукщий а-субъе днище ИаД-АТФазы, фосфорилирозался

••■OWO тттпл timir/Somm птшполошпо ЛотаюиФО A rrvn и дгглч rtflo

«ШММ UMM '" — i^uymuu« и \J «UkU t | J A4W wu

уабаина в присутствии 120 ыМ JlaCl и 10 мМ КС1 (Рис. IA, 4, 7),

1 2 3 4 5 6 7 st

Л Г"

РКС + + + - + +

РМА -t- - + + + + +

ouabain + + + - + + -

Рис. I. йосформирование ИаД-АМазн из почек Бч/о тг1пшз (1-4) и из солевой железы утки (5-7) ШС (РКС). Авторадиогранма фосфориларозалшх белков (А) и ишунопрецшитирсванноа а-субъеданицы (В). Пробы анализировали катодом электрофореза в градиенте концентраций ПААГ (5-15^) о последугщей агторздгегрЕфЕвй. st- мзчекнз 14с бздкк - мзркзря с мол. массой 46, 69 и 100 кДа (стандарты).

хотя и менее интенсивно, чем в заингибировяЕПЫХ уабвином препаратах. Это объясняется снижением концентрации меченого АТФ в среде инкубации за счет его гидролиза ферментом. Специфическая голиклональная антисыворотка против а-субъединицы Иа,к-АТФззн преципитировала только фзефобелок с кол. массой 100 .-КДа (Рис. IB). :

При инкубации Na.K-АТФазы как с уабаиноа, так и в среде с Na+ и к* с каталитической субъединицэй ПКА (РКА) и [7-32р]-АТФ кн такте наблюдали вклотение метки в полипептид с мол. кассой 100 кДа (Рис. 2В). Фосфорилирование а-субъединицы фермента на-

Рсс. 2. Сосфорилировзние Ка,К-АТ5йзы из почек Eufo narlnua (1-5, II) и солевой жэлэзы утки <е-Ю) ГШ. Пробы I и 6 содзркали 10 мкМ цШ>- Пробы анализировали катодом электрофореза в градиенте копцантрпцк2 ШАГ (5-153) с поелодукцей .аЕторздкографязй. А. Гель, окраязягай Нумасси. в. Авторадиогрек-ма геля. с. Авторадиограмаш иммунопрэ-циштированных белков, et - мочэннз Селкн-мвркэрц с мол. массой 100, еэ. 45, 30, 14 нДа . -

бльдалось тегько посгэ солюбплизацки препаратов г'а.к-АТФазы 0,2% тритоном X-IQO (Triton) (Рис. 23, 4-5, Э-Ю),либо другой дэтергектагш (0,02 охталглшозпдом, 0,6S CHAPS, ш 0,12 KP-4Q-данныв из поавадоны). Препарат Ка,к-АТФазн не содержал примеси эндогенной ША (Рис 4А, I, 6). Антисыворотка против а-суОьзда-шщы хзшукопрзщшитцровалз фосфоришрозанянй 100 кДа белок -а-субъадишщу Фзрлента из обеих источников (Рис. 20).

Наши попытки фосфорилировать очищенный препарат Na.K-АТФазы ПКА в .отсутствие детергентов оказались безуспешный. По-вадкому, солзобилизация мембраны детергентами делает участок фзефоршпфзвзшя доступным для гидрофильной каталитической субъединица ПКА.

Таким образам, ки установили, что Ka.K-АТФаза из почек Би-

•v Щ.

- а

»4« i.i.|.|.|.|.j.|.

т„п* . .

• I-1- !•••!• -1»| I-.

А ш DSG B£KÄ вм

О 0

Si*\9:T ®s

1 »

С 0 D

: S%T 1 SS

< •

РКС Шз РКС вм

Рис. 3. Определение аиинокис-лот, фосфорилируэинх в а-субъ единице Na.K-AKssH из солевой xsjig3h утки (bsg) и почвк Bufo rarimia (El) протезн-кивазаыи С (РКО) и А (РКА). Авторадиограмма с пластинка целлюлозы после проведения двумерного электрофореза. S -фосфосерин, т -фосфотреонин.

/о таг1тшз и солевых желез утки фосфорилирувтся ПКС и ПКА как в активном, так и в заингибированном узбаиноы состояниях, и субстратом для протеинкиназ в обоих случаях является а-субъединицз.

2. Определение бминокислот. фосфорилируекых ПКП и ПКА в а-субъэдинкцэ На.К-АТОззы.

После фосфорилирования очищенных препаратов На,к-АТФазы и микросом протеинкиназами мы иынукопрециттировали меченую а-субъедсшицу, проводили электрофорез в ЕААГ и авторадкографяю, экстрагировали а-субъединицу из геля и гидрализовали в 6 н НС1 с госледупцим анализом мвченнх аминокислот кэтодом двумерного электрофореза на целлвлозных пластинках. Мы установили, что а-субъединица фермента из солевой железы утки фосфорилируется по остаткам серина и треонина как под действием ПКС, так и под действием ПКА (Рес.З, А, С).

В го время ПКА фосфорилировала в а-субъединиг,о фернекта из почек Bufa msrlmue только серия (Fhc.3, В); а-субъвдипвда Na.K-АТФазы из ооцитов Хетюриз laevlc фосфоришровалась ПКА таккз только по остатку серина (данные кэ приведены). Эти различия в фосфорилирозании ПКА ферментов из птиц и амфибий могут объясняться тем, что первичная структура а-субъеданкц Na.K-АТФаз из этих источников (в частности, количество я располокзяко участков Зосфорилирозандя ПКА), различается, в то время как у ферментов земноводных аминокислотные последовательности а-субъодиниц схожи.

3. Определение нексимзльного вклстения радиоактивного ФосФата в а-субъединицу Na.K-АТФазы.

Изучение временной зависимости вкличэния радиоактивного

фосфата в а-субьэдиницу КаД-АТФезн из солевой калезы утки,

«

проведенное при наличии всех активаторов фосфорилнрования, показало, что максимальное включение метки достигается за 60 мин и составляет 0,2 и 0,5 моль фосфата на моль белка для ПКО и ША, соответственно (Рис. 4).

Изменение концентрации протеинкиназ и их активаторов, увеличение или уменьшение концентрации тритона Х-100 (в случае ША) и замена его на другие детергенты, обработка препаратов Иа.к-АГФазн ультразвуком, увеличение концентрации [7-32Р]-АТФ не приводили к увеличений включения метки в а-субъединицу. Уменьшение включения радиоактивности в а-субъединицу фермента при инцубацвн проб более 60 мин жжет свидетельствовать о наличии в препаратах Na.K-АТФазн примеси активных фосфопро-теинфосфатвз. Однако добавление ингибиторов фосфатаз (5 мМ шарофосфата в I кЫ паранитрофенилфосфата) не приводило нк к

Рис. 4- Зависимость фосфорили-раваныя а-субъадикщц Ыа,к-АТФэзы из солевой гелэзы утки протсин-киназамл С (-0—) и А (-8-) от времени. Реакции останавливали дзнятуркрущей сизсьв и анализировали пробы катодом элэктро-Форзза в ШАГ с последующей евто-радкографгай.- Полосу, соотзэт-ствуклую фосфорилированпой а-субъ едгдлщэ фергввта, нырозалн из геля и просчитывали включение метки в сцинтилляторе Ж0-106.

увеличении включения мэтки в а-субъедиЕицу, ни к из:аенбшта фор;д! кривое. Мазго заключить, что условия пссвадеыия реакции, использовалшв нами дзя ксшчгстввнного определения Екличания мвчокого фосфата в а-субъодчшшу являются оттвмалыаыки длл данного препарата Яа,К-АТЗззы.

Отсутствие стехиометрии вюшчэшя фосфата в а-субт-гдпницу М02НС) сбъяснить ХЕПЕКТЗрИОЙ сл07ют0й структурой шпбрано-свягзнного препарата йа.х-АТФазч из солзпес ¿ядсз у тух , в котором часть чоле;;ул Зармзнтй ;,:окэт Окгь недостугаз длл прото:;'лззтан1 с гг:жз что Ка,л-АК&аза моетт вндялятьс.я у «се в ч^сгугчио ^сфо^гроззнок состоянии. 4. Слзв.туэдяе учеспсов аЬ'та^аирозоКэд а-пубгедпгис! ЛКО ГГЧА^

Псс.пздовз'.з-'п.-^оз доОавпснкс е лрой: тр::тсзз Х-100 т. катьлиичвокой зубхеданвдч икд через -40 «етн поел? начала фосфортшх-овас^я ¡.'а.к-АТФазы из соловой калозы у.-"! ПЧС прксо-

100 MDa A

-:-с

T1

41 Иа 56 kDa

Трипсин

с н

100 M)a

С

тт Хкиотрипсш

сз

л 77 KDa

Н-с

тт

35 Ы)а 4G KDa н- С Н- С

С

1 2

Рис. 5. Схема прогеолиза с-суб^единицк Na.K-ATSasu трипсином

р4-

(А) и хинотркпскном (В) в присутствии Mg ,Р* и уабаина. Т1 и Соучастии протеолзза. С. Участки а-с у'бъедишшы, фосфорилирущиеея ПКС (1) И ПКА (2).

дало через 3Q мин инкубации к двухкратному увеличению включения радиоактивного фосфата но сравнению с уровнем фосфорилироваяия фермента, обеспечиЕаэмыы добавлением одной ПКС (данные не приведены). Это свидетельствует о том, что по краЯней мере некоторые участки, фосфзр&пирухщиеся в а-субьединице фермента под действием ПКА и ПКС, различны мевду собой.

Для локализации участка, фосфорилируемого ПКО в а-субъада-ницэ ферлэнтв из солевой железы утки, мы использовали метод ограниченного цротаолиза по Иоргенсену (Jorgensen ana Farley, 1988) (см. Sec 5). После праинкубацик ИКС с I мЫ "холодной" АТО для "насывдяия" ее участков автофосфррилировашя, добавляли Яа,к-АТ®2зу, среду кккубзцгк и [j-32Pl-&TS до 50 икИ и инкубировали проба 30 мин при 30 °С. РеакцЕг останавливали кзоитком

А

В

1 2 3 4

94- <=2¡— С3><=э

47-

ЕНЩЭ- 33

41

30-

- - 41

»4

67-

Ш

4 it:'

43-,

JO—

se?

.40

Ок

-77

-35 - —

Рис. б. Протеолиз Ка,к-АИазн из солевой гелазы утка, фосфорилированЕой ПКС, трипсином (Л) и а-гимотрипсином (В).

Галь, окраяэншй Кумасси (I и 2) и авторсдиограмкн фосфспептидов (3 к 4) до (I и 3) и послэ (2 и 4) зввэршения иротеолиза . На рис. указаны молекулярные массы белков в кДа .

"холодной" ATO (1,5 мМ), затем проводили ограниченный яротеолиз и анализировали получавдуюся смесь полипе птидов методом электрофореза в 1% ПААГ с яоследупцэй авторадпографиеЯ. Карта протеолиза Иа,К-АТФаза соответствовала литературным данным.

После трипсинолпза фосфорилированной а-субъединицы значительная часть радиоактивной мвтки обнаруживалась в 41-кДа к-концэвом полапептиде (Fue. 6А), а после химотршгеинолиза - в 35-кДа полипептиде (Рис. 6В). Последний, согласно литературным данным (Jorgensenjand Farley, 1988), Еыщештется из центральной часта молекулы а-субъоданицы. Из сравнения пептидных карт и авторадиогремм, полученных после трипranoлиза и химотрипсино-лкза ферглэнта, следует, что один из участков фосфорилирования а-субъедшшца Нг,К-АТФззы ПКС расположен с в 41-кДа пептиде, полученном в результате трипсинолаза, л одновременно присут-

ствует в 35-кДа пептиде, полученном в результат химотрипси-нолиза, то есть локализован шзду С^- и Т-£-цэптрзш1 прстеслкза, а именно, в 17 кДе отрз?.лв молекулы ci-субъодпницц (ск.Рис. 5С), находящемся в цктогиааматическом до^эне и содераачом центр связывания нуклеотидов (Joi^ensen, 1933).

К сожалению, использованный методический подход оказался неприменимым для поиска участка,. фосфорулируеного ь . а-субъ-единица фермента из солевой аилеш утки ПНА, шскипьку прегео-лиз в присутствии дааз незначительных количес-.в детергента привода к образовании большого количества низкомолекулярных пептэдоЕ, не идентифицируемых электрофоретически. Для локализации этого участка мы ксесльзоезли нестабильность а-субъеди-ницы фврдента из почек Вы/о snrlvua. Было известно,что при инкубации фермента в среде с 0,2Й тритоном T-IOO происходи? активация эндогенной протеинвзы, содергадойся в препарате На.к-АТФазн. В этих условиях предварительно фосфорклированная а-субьединица фермента после 30 мил инкубации при 30 °С распадалась на ряд 32Р-оодерйащих полппбпт^дов с кол. массой 60, ЛО, 36 , 28, 20, 14 кДа. (Ркс. 2, II; Рис. 7, I).

Провадя игмукопра цихштацка смеси &тех полипептидов с рзз-ляна'.в: антитзлелк, кы установили. что антис:зоротка против всей а-субгздзсара Уа,к-АТЭезы Bufo rvfrua (A-F) првгтшатьруе? как интахтвую йастхзри-ифозаыда а-субьелтЕИЩ , тех л ье u~F-co-дэрьадие фрагазит*! с wax. явсоа 60 и '33 ;$>■ . Ак1,:телз пртпг; SG-чдэныого ¡«-концевого иэлыхсптида а- иуЗъедянщы (А-И) щко;-пктируаг исключительно интактаув a-субкдешцу, я ю врэкг K?ji антагола пропев хокс^рьятгьнои ьппгешзоъ детерощ"йтк -и-членнпго пепп'яв kj С-кочцэазй части молекулы (А-о)

Рас. 7. Определенна участка фосфорилирования а-субъздани-цн ИгД-АТФезн из почек Bufo marlruia ПКА. Пробы анализировали методом электрофореза в градиенте концентраций 7ТАДГ (5-152) с последузздей автора-диографизЯ (I) и ишунопрвци-питвцией с различными типами антител (2-4), (см. пояснзния в тексте). На рис. указаны массы белков - маркеров в кДа (st).

распознают как кнтактную а-субъедиквду, так и все образующиеся из нее радиоактивные пептида, наименьший из которых имеет мол. Еес 12 кДа (Рис.7). Отсюда моено-заключить, что участок фосформирования а-субъединида Иа,к- АТФазн из почек Bufo mrlmis ПКА расположен в С-концевом 12 кДа полипаптиде (Рис. 50).

Следует отметить, что в С-концевом фрагменте а-субъединицы Bufo mrlTvua , которой соответствует 12 кДа полшептвду, распо-логена последовательность аминокислот I0I0Arg-Arg-Ser1012 (JaiBser et al, 1992), предпочтительная для фэсфорилироваяия ПКА (Kennelly, КгвЬв, 1991). Эта последовательность имеется и у На,К-АТФазн из ооцитов Хепориз loavia (Temy et al, 1939). На ксклэчено, что С-концэвой участок фоофорилируется и в молекуле а-субьединицы íía.K-АТФазы из солевой келезы утки, для которой пзрЕичная структура неизвестна.

5. Изучение фосфорилирования__Из.к-АТОазц_в__суОкдаточшх

фратдуи_ооцитов__Xenogua__Igsvla^

Ооциты шпорцезой лягушш Zenopua lóenla являются удобным объектом для изучения транспорта ионов через мембрану in vivo. На ооцитах Xencrpus loevla ранее было показано влияние активаторов ПКА и ИКС на ион-транспортирупцую активность Ua.K-АТФазы (Езвоа1 et al, -1985; Khan et al, 1991; Vaeilete et al, 1990; Yasilete, Eohwarz, I9S2). Однако фосфорШШрОБание На.К-АТФззы сюцитов Хепорча loevla протеинкиназами до сих сор не было показано. Нам представлялось интересным выяснить возможность такого фосфоршшрования как добавленными экзогешо i

протеизкиказани, так и эндогенными протеинкиназаш, содержащимися в оощтах. Для увеличения числа молекул На,К-АТСази в плазматической мембране, мы инъецировали в каждый ооциг смесь матричных РНК ат и Pj-изоформ субъедишц, и инкубировали их в среде iíbs 48 часов. За это время вноеь синтезировашше моле-кули На,к-АТФазы встраивались в плазматическую мембрану клеток. Как било показано ранее в лаборатории Н.Гаринг, количество молекул насоса в мембранах ооцитов увеличивалось по сравнении с контролем в 5 раз (Jaunin et al, 19Э1).

<Росфэрилирование Na.K-АТФазы микрооомальных мэмбрак сюцитов ПКА. В качестве источника Ка,К-АТФазы мы использовали фракции микросомальных мембран ооцитов Xenopua lóenla.Полученный нами препарат макросом не содержал примзси протеинюшаз, фосфорилирущих Ыа,К-АТФазу (Рис.8А, 1-2). а-субъединица фермента в микросомах фосформировалась под действием екзогенной ПКА и в отсутствие детергентов, хотя предварительная солюби-лизация мембран тритоном X-IOO многократно усиливала эффект

st 1 2 3 4

А ОМ*

¡РКА I - - j У

¡Triton I - + ! ' +

12 3 4

oc+ji cRN.A - - + •

ouabain + • ■I

Ркс. а. Лвтсраднограг.'-ча кздлунолрецшштироЕгнной а-субъеди-amci Яа.к-АТФазы из ооцитов Хетюриа laevla.. А. Влияние тритона 2-1 СО нз фосфорилироввнпе а-субъединицы на,к-АТФазн ПКА. з. Оосфоршагоованге каД-АТОеза ПКА в мембранах ооцитов, в которые предварительно инъецировали а^ к pj мРШС (+), по сравнении с контролем (-). Пробы содэрзали 0,2% тритон x-ICO. et-бэлки с мол. массой 100 и 69 кДа .

протоанкнэазы (Рио. 8А, 3-4); р-субъоданица ПКА не фосфорали-розалоь. Ун прозполагаем, что для фзсфоралирозгяня ??а,к-АТФазы ПКА в отсутствие детергентов, креме высокой активности проте-инкнназа необходимо и нэтавное состояние плазматической мембраны, присутствие связанных с ней. "якорных" белков, способных специфически связывать ПСА (Hirsch et al, 19S2), либо белков шксскелзта, Езгилодейстзугазтх с КаД-АТФазой (КооЪ et al, 1 SSO), но отделяемых от мембраны в процессе очистки Na.K-АТФазы.

Включение азтки в а-субъэдинщу НгД-АТФазн в кикросомзх,

полученных из ооцитов после инъекции ат- и рт-мРНК, увэличива-j

:лось в 4-5 раз по сравнению) с там im количеством белка в контроле (не ипьоцироЕаняых м?НК ооцитах), что согласуется с данными об увеличении кохичестзз молекул ??аД-АТФзпы в плазматической мембране. Сержант в микросомах фосфорилируотся как в заия-гибированном уабаинсм, так и в активном состоянии (Рис. 8В).

Фосфорилирование Иа.К-АТФазы в готогенатах ооцитов эндогенными протеинкиназами. Для исследования возможности фосфорилирования Ыа.к-АТСази из ооцитов Хепориа эндогенными протеинкиназами мы использовали гомогенаты ооцитов, в которые предварительно инъецировали о^ и мРНК. а-субъединица На.К-АТФ-азы в гомогенатах ооцитов не фосфорилировзлась в отсутствие активаторов протеинкиназ (Рис. ЭА, 9В). Цри добавлении тритона Х-100 наблэдалось незначительное включений метки в а-суЗъедк-ницу (Рис. ЭА, 2). Это вклшанев многократно возрастало при инкубации гомогената с тритоном Х-100 и цАШ> (оАКР) или дибутирил-цАМФ (йЬоАНР) (Рис. ЭА, 5-6), однако в отсутствие тритона Х-100 а-субъединацг не фэсфоршзфсвалась (Рис. ЭА. 3-

4\ ИпЛоо лосио Пч^ иео 1тгп«хгт>а пл пАппЛ 1тлро»л, ЛлпАапт* питооииа / • ^ЦиииАммими Цд ^ ии^ш ишшм и^Ции ¿^/¿(оиД муц и»кш т»<1

различных белков гомогекзта, тогда как сшоцифачеокое фосфори-

лироьание а-субъздиницы найщцалось лишь щгл инкубации проб

совместно с активаторами ИКС (ИЛА и сИС^) в присутствии ионов р 1

Па*'" /Риг» СТЗ \ Т5 Лопу о т,тшоолА Г'ПР 1Ю о у*|пд о о тотпл Т71ГЛ -

ии •» ки} ш и цуiк1 ^иуицд «мьи см

стимулировали фосфорилирование а-субъадиницы (Рис. 93, 2-3). Увеличение включения метки.в а-субъедипицу Иа.к-АТФазы под действием активаторов протеинкиназ является, по-видимому, специфическим процессом, поскольку добавление активаторов протеин-киназ совместно с тритоном Х-100 или Са увеличивало лишь степень фосфорилирования а-субъединицы, незначительно отражаясь на общем уровне фосфорилирования белков гомогената.

р-субъедшвща На,к-АТФазы в гомогзнатах ооцитов при стимуляции эндогенных протеинкиназ не фосфорилировалась.

Фосфорилирование Иа.к-АТФазы под действием активаторов протеинкиназ кы проводили и в гомогенатах ооцитов, не иньециро-

1 2 3 4 5 6

- лл1

1 2 3 4 5 St

dbcAMP - - + - * - I РИА - + - + -

cATt'P - - - - + 1 diC8 - - - +■

ГгПоп - + - - U ♦1 Ca** + - +

Рис. 9. Оосфоршшрованке ЯГа.к-АТФазьс з гомоганатах ооцитов Хгпориа laevls при инкубации с активатора®! ПН А (А) и ГЛОТ (В). Адаквотк гоиогената, соогветствз'гаше 8 гомогенизированным оошггам (90 ш, 5-7 мг белка/мл) инкубировали 30 мин со 100

i*vm г 1 - -о ттпт»п^г«пот*у?*т* УЯ птрг»\г>тг>т*тгтж ovmr»o»Tv-*Tv>o

iium:i £. | д. J u^iwj ^и^шш или; uikAiMUiuj^wu

протеиЕкш-шз. Пробы анализировали методом ЕммуЕопрещшитацни с лослэдущвм эл&нзрофорэзом в ШАГ и азгорадаографией. st -

vacr.rc.tn.tn ^ ^П rfo ttvtx_»« оттгг отит г» ил ч uonpní^ И С CQ т« ТПП ггТТо

шм и vuyuui iTiu^Jtkwjju и muiiumuuuuiu ии у у и>/) лд wwü * V V * г

ванных мШС. Эти эксперименты дали аналогичный результат, хотя включение метки в а-субъединицу фермента было в этом случае в 4-5 раз меньше (дакшз нз приведены).

Максимальней уровень фэсфорилирования фермента при инкубации гоиогоната с ц/Л® и тритоном Х-100 достигался за 30 мин инкубации и превышал безалъный уроЕзнь более чем в 40 раз, оставаясь стабильным еще 30 мин. В сравнении с этим включение метки в а-субъодшсшу под действием рна и <Ис8 проходило с меньшей скорость» и достигало максимального уровня, в 20 раз пр8вышяяц9го базалъшй, за 40-60 мин. Максимальное включение метки в а-субъединицу при действии активаторов ГШ. в 2 раза превышало включение фосфата при действии активаторов ПКС. Это соответствует двнанн, полученных нами При фосфорилировании

а-субъвдшпщы Ka,к- АТФааа кз солевой «елезы утки под дэйствием ПКС к ПКА in vitro (Рис. 4). Следует отметить, что похожая временная зависимость стимуляции ионтранспорг/рущей активности Na.K-АТФазы наблюдалось прк инъекции' цАЬ'Ф и dicfi з ооциты Хепориз lasvla (Yauilete and Sohnarz, 19Э2).

Приведенные вша данные свидетельствуют о том, что а-суОъ-единица На.К-ЛТФазы в ооцатах Xsnopus laevla способна фза±о-ршшроваться ендогеншши протеннкиназаки.

вывода

1. Протенкиназа 0 и протеинкиназа А фосфоршшрувт а-субъе-диницу iia.K-АТФазы из солевой яелэзы yz.ui, почек жабы Bufo marinua и ооцитов Хепорил laavla. Протеипниназа А фосфэрили-

V

рует а-субъединицу очщзшого фермэнта только в присутствии детергентов, тогда как а-субъедеица На.К-АТФавы в препаратах микросомвльных кэмбран ооцчтов Хепориз laevla способна фосформироваться протенканазой А в отсутствие детергентов.

2. КаксимальЕОэ ноачоаиэ фосфата в а-суоъедашщу феркента из солевых гелез утки составило 0,3 и 0,5 моль фосфата но ноль а-субъеданицы для протеивкиЕзз 0 и А, соответственно.

3. Протеиннинвзэ 0 фосфэрилируэт остатки Ser я Thr в а-субъединице ыа,к-А'1Фззы из солевой железы утки, причем участок фосфэршщрзвания находится в 17 кДа пептиде, рзспо-локенном s центральной части молекулы а-субъедянвцы.

4. Протеинкиназа А фосфэрилирует остатки Бег и Thг е а-субъединице На,К-А№йзы из . солевой гелэзы утки и только остаток Ser в а-субъединицах фермента из почек Bufo ¡norlmia и ооцитов Хепориз laevle. В а-субъедишще фермента из почек Bufo

marinus участок $осфори.г«розакия тгротоккинезой А расположен з 0-концзЕсн IP. кЦа пептидо.

5. В гскогенатах осцитов Хепсрив lasvls а-суоъедшппда ??а,к-АТ$зза фос$орш<руотсг: при стимуляции эндэгешшх щвтаан-кимз G и A их • зкгспззтораш форболг.мрастатацэтЕТсы и 1,2-дкок-твноЕЛ-зп-гвщвродом, и даоутир1!л-:;Ж, соответственно.

GÜM30R РАБОТ, (ШПЛЯКОЗ»Ш£5С ВО Т1Ж 'ЭДСОЕРТАЦЙМ:

1. Чг.Оыта A.B., Ленина О.Д., Пэтухоз С.П., Еесалец Л.А. Фасфор^тагоорзиаз КаД-АЗФазн из еодогш. адевз уткя протеииканззсй С. В сб. 2 Боэсоюзн. си«. "Теорэтптаскиэ и прикладные зссв«пя нотакулярной иног.огж". Москва. I93Í.

Стр. Ж.

2. Чкбглкн A.B., Jïonasn О.д., Пзгухоз С.П., Взсакгщ Л.А. О^сформлкровзнми íía.K-ATCf^u протзинкилазсй С и цАМФ-равгсииой цротоиккингной. // Биол. мембраны, 1991. Т.8. H.H. Отр-1140-1141.

3. Chifcslin Л.Т., 7asileto Ii.A. and Gee™ín~ К. ShcBpioi^laticH oí Хер.ориз ПяД-АЕРаее by protein kianees. In: Abstráete of 24tii Arnual. Setting oí the U5G"£3/U5SBE, // Ssperientia, 1S92. 7.¿8. P.A15.

4. Chibaiiri A-, Yasilete L., Herenekee S.u., Pralong D., Gearing K. Phosphoï-j-Iatiori oí lía.K-ATPaes a-Hubunitß in

; nioioBc^es and liGao^snates oí Хепорив oooytes resulting from the stinulaticn of protein Idjiase A and G // J". Biol. Chera., 1S92. 7.267. N.31. P.22378-22334.

5. Chibalin A.T., bspina O.D., Petukhov S.P., Yasiletc Ii.A. PhoQphorj'lation of the Na,K- ATPase by Ca,phcr¡phclipid-

dependent and оАЫР-dependent protein kinases. topping of the region phCEphorylated Ъу Ca,phospholipid - dependent protein кхпаве. // J. Bioenerg. Biomeabr., 1933. Y.25. H.1. P.61-66.

A

\j