Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Na,K-АТРаза как рецептор сердечных гликозидов: идентификация сигнального каскада, независимого от внутриклеточных концентраций Na+ и K+

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Na,K-АТРаза как рецептор сердечных гликозидов: идентификация сигнального каскада, независимого от внутриклеточных концентраций Na+ и K+"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. М. В. ЛОМОНОСОВА

На правах рукописи

АКИМОВА Ольга Алексеевна

Ш,К-АТРаза КАК РЕЦЕПТОР СЕРДЕЧНЫХ ГЛИКОЗИДОВ:

ИДЕНТИФИКАЦИЯ СИГНАЛЬНОГО КАСКАДА, НЕЗАВИСИМОГО ОТ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ КОНЦЕНТРАЦИЙ N8+ и К+

03.00.04 - Биохимия

Автореферат Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2006

Работа выполнена на кафедре биохимии биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, а также в лаборатории патофизиологии ионного транспорта факультета медицины университета Монреаля.

Научные руководителя:

Доктор биологических наук Доктор биологических наук, профессор

О. Д. Лопина С. Н. Орлов

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Доктор физико-математических наук, профессор

A.Е Медведев

B.А Твердислов

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт экспериментальной кардиологии Российского Кардиологического Научно-производственного комплекса Росздрава

Защита состоится "20" февраля 2006 года в 15ч. 30 мин. на заседании Диссертационного совета Д.501.001.71 в Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан ^^-^^^ООбг.

Ученый секретарь Диссертационного совета Кандидат биологических наук " М.В.Медведева

М^ -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Na,K-ATPa3a (Ыа,К-активируемая, Mg-зависимая аденозинтрифосфогидролаза, КФ 3.6.1.3) была впервые описана Йенсом Скоу в 1957 году (Skou, 1957). Фермент присутствует в плазматической мембране всех клеток животных и осуществляет электрогенный обмен трех ионов внутриклеточного Na+ на два иона внеклеточного К+, используя для транспорта ионов Энергию, освобождающуюся при гидролизе АТР. Известно, что Na,K-ATPa3a играет ключевую роль в регуляции концентрации внутриклеточных моновалентных катионов, в поддержании мембранного потенциала, объема клетки, сопряженного транспорта Na+ и аминокислот, глюкозы, нуклеотидов через плазматическую мембрану (Lang et al., 2000; Mongin, Orlov, 2001; Blanco, Mercer, 1998). Неудивительно, что ингибирование данного фермента влияет на целый ряд процессов в клетке. Так, под действием уабаина наблюдается ингибирование Na,K-ATPa3bi, которое приводит к повышению внутриклеточной концентрации Na+, что в свою очередь активирует Ка+/Са2+-обменник и потенциал-активируемые Са2+ каналы (Lang et al., 1998; Lang et al., 1992). При этом возрастает уровень внутриклеточного Са2+, что ведет к увеличению сократимости кардиомиоцитов (Blastem, Lederer, 1999).

За последнее время появилось большое количество работ, свидетельствующих о том, что помимо основной функции Na,K-ATPa3H, связанной с поддержанием неравновесного распределения Na+ и К+, этот фермент выступает в роли рецептора кардиотонических стероидов, способного вызывать изменения функционального состояния клеток. Так, кардиотонические стероиды активируют ряд сигнальных каскадов клетки, в том числе протеинкиназы Ras/Raf/MEK/Erkl/2 (р42/44 МАРК) (Kometiani et al., 1998), увеличивают продукцию активных форм кислорода (Xie et al., 1999), вызывают экспрессию ряда генов (Xie et al., 2002; Taurin et al., 2003), вовлеченных в регуляцию пролиферации клеток и программированной клеточной смерти (апоптоза) (Orlov et al., 2005; Торан и др., 2003). При этом эффект кардиостероидов на кардиомиоциты обусловлен не только ингибированием Na,K-ATPa3bi, но и изменением конформации фермента за счет связывания кардиостероида. Это в свою очередь приводит к взаимодействию Na,K-ATPa3bi с Src-киназой, которая вследствие этого активируется и фосфорилирует рецептор для эпидермального фактора роста, что и приводит к активации протеинкиназного каскада.

На клетках гладкой мускулатуры сосудов (VSMC) был описан эффект уабаина, обеспечивающий защиту от развития апоптоза, вызванного отсутствием ростовых факторов (Orlov et al., 1999). Было установлено, что важную роль в антиапоптотическом действии уабаина играет повышение внутриклеточной концентрации [Na*]„ что ведет к экспрессии генов раннего ответа, которые в свою очередь контролируют экспрессию антиапоптотических генов, включая морталин (Taurin et al., 2002а; Taurin et al., 2002b).

В отличие от VSMC в эпителиальных клетках почек собаки (C7-MDCK) под действием уабаина наблюдается активация сигнального каскада, приводящего к смерти клеток независимо от возрастания внутриклеточного соотношения [Na^/fK"1], (Pchejetski et al., 2003). Помимо клеток линии C7-MDCK, длительное воздействие уабаина приводит к гибели ряда других типов клеток, включая эндотелиальные клетки аорты свиньи (РАЕС), эпителиальные клетки кишечника человека (Сасо-2) (Orlov et al., 2005). До настоящего времени механизм развития смерти клеток, индуцированной уабаином, остается мало изученным. В этой связи целью настоящей работы было исследование механизма смерти эпителиальных клеток, вызванной кардиотоническими стероидами.

Основные задачи исследования:

1. Провести сравнительный анализ действия различных кардиотонических стероидов (КТС) на активность Na,K-ATPa3H и на индукцию сигнала, независящего от [Na+]l и [К+], и приводящего к смерти эпителиальных клеток линии C7-MDCK.

2. Исследовать независимый от Na+, и К+, сигнальный каскад, ведущий к смерти эпителиальных клеток линии C7-MDCK под действием уабаина. 3. Идентифицировать белки, взаимодействие которых с а-субъединицей Na,K-ATPa3bi изменяется при действии КТС.

Научная новизна работы я практическая значимость работы. В нашей работе впервые показано, что два буфаденолида (маринобуфагенин и маринобуфотоксин), как и уабаин, являются сильными ингибиторами Na,K-ATPa3U, но обладают более слабой способностью по сравнению с другими КТС (включая КТС) индуцировать смерть клеток, независящую от соотношения [Na+]/[K+],.

В данной работе мы пытались выяснить, какие сигнальные пути клетки участвуют в передаче вызванного уабаином сигнала смерти. Мы показали, что изменения внутриклеточной концентрации Са2+, уровня активных форм кислорода не играют ключевой роли в развитии клеточной смерти под действием уабаина. С использованием различных активаторов и ингибиторов сигнальных путей мы исследовали, участвует ли в передаче сигнала смерти малый G-белок Ras, протеинкиназы Erk, PI3K, серин-треониновые протеинкиназы и не обнаружили действия ингибиторов названных систем на передачу сигнала, вызванного уабаином. При изучении роли рН среды в развитии сигнала смерти мы впервые установили, что снижение рН среды с 7,36 до 7,03 приводит к полному устранению смерти клеток под действием уабаина. Наши данные позволяют предположить, что этот эффект связан с экспрессией de novo рН,-чувствительных генов, вовлеченных в защиту клеток от смерти, вызванной уабаином.

Методом иммунопреципигации с использованием антител против Na,K-ATPa3u и двух различных детергентов для солюбилизации мембраны мы выявили два набора белов, появление которых в иммунопреципитатах индуцируется уабаином. При обработке клеток Нонидетом Р-40 мы обнаружили белки с молекулярными массами 70, 64, 55, 40, и 35-34 кДа, тогда как в случае их обработки Тритоном Х-100 - белки с молекулярными массами 96-93, 93-90, 48, 40, 39-35 и 35-34 кДа. После разделения белков методом двумерного электрофореза методом масс-спектрометрии было идентифицировано 18 последовательностей, большинство из которых известно благодаря расшифровке генома (гипотетические белки). Кроме того, среди белков, взаимодействующих с №,К-АТФазой были обнаружены рецептор глюкокортикоидов, фосфорилированный белок фосфатазы типа 2С, фосфорилированный белок 1 семейства Src, активатор 1 белка Rae СГРаза, белки САМТА1 и ВС015775 NID, и, наконец, киназа 2, регулируемая сывороткой/глюкокортикоидами. Можно предположить, что, по крайней мере, часть обнаруженных нами белков является участниками сигнального каскада, ведущего к смерти клеток под действием уабаина.

Мы полагаем, что полученные нами данные будут использованы при разработке новых фармакологических подходов, которые могут быть применены для лечения гипертонической болезни, некоторых видов почечной и сердечной недостаточности, а также болезней, связанных с нарушением процессов регуляции клеточной смерти.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на научных семинарах кафедры биохимия биологического факультета МГУ и исследовательского центра медицинского факультета университета Монреаля. Основные результаты диссертационной работы были представлены на 7-ом Ежегодном конгрессе молодых ученых университета Монреаля (Монреаль 2004); на 15-ой Европейской конференции по пгаергензии (Милан, 2005); на 11-ой Международной конференции по АТРазам (Вудс Хол (Woods Hole), США) и конгрессе Канадского гипертонического общества (Монреаль, 2005).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методов, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 198 страницу машинописного текста, 24 таблицы и 56 рисунков. Список литературы включает 240 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Культура клеток. В работе использовали две клеточные линии - эпителиальные клетки почек собаки (C7-MDCK) и эпителиальные клетки кишечника человека (Сасо-2). Клетки рассаживали в чашки Петри, помещали в инкубатор, содержащий COj 5%, и растили в модифицированной среде Дульбекко (DMEM), содержащей 5,5 мМ глюкозы (для C7-MDCK) или 25 мМ глюкозы (для Сасо-2), 10% бычьей сыворотки, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Среда менялась один раз в два дня. Клетки, достигшие конфлюэнтности, использовали в экспериментах.

Морфологические и биохимические методы оценки типа клеточной смерти. Для оценки жизнеспособности клеток была использована фазово-контрастная и флуоресцентная микроскопия. Для определения количества клеток, сохранивших связь с подложкой, мы применяли модифицированный метод определения белка по Лоури (Hartee, 1972). Жизнеспособность клеток определяли по скорости деградации красителя МТТ (3-(4,5-диметилтиозол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромид), который превращается в окрашенный продукт формазан под действием клеточных оксидоредуктаз. В качестве маркера апоптоза мы измеряли активность каспазы-3, терминального фермента

протеолиткческого каскада гибнущей клетки, определяя флуоресценцию продукта ферментативной реакции, субстратом которой является N-anemn-Asp-Glu-Val-Asp-AMC.

Методы изучения ионного гомеостаэа клеток. Активность Na,K-Hacoca измеряли как уабаин-чувствительную компоненту скорости входа i6Rb+. Сродство уабаина к Na,K-АТРазе оценивали путем измерения связывания радиоактивного [3Н]-уабаина. Внутриклеточное содержание К* и Na+ бьшо измерено как равновесное распределение вне- и внутриклеточных ^Rb* и 22Na+ соответственно (Orlov et al., 1996). Значения внутриклеточного рН оценивали путем измерения флуоресценции проникающего в клетку флуоресцентного рН-индикатора BCECF-AM.

Биохимические методы исследования. Для выявления белков, взаимодействующих с Na,K-ATPa30ft, мы был использовали метод иммунопреципитации с антителами против а 1-субъединицы фермента. Концентрацию белка в пробах определяли методом Бредфорда. С использованием методов одномерного и двумерного электрофореза, а также метода Вестерн-блот, мы проводили анализ полученных клеточных лизатов и иммунопреципитатов. Результаты обрабатывали с помощью программ «Onedscan» и «2D-Image». Для идентификации белков и анализа полученных данных использовали метод масс-спектрометрии и программы «Mascot» и «Profound» соответственно. Уровень активных форм кислорода в клетке оценивали путем измерения хемилюминесценции в системах, сопряженных с люцигенином и люминолом (Khand et al., 2002, Li et al., 1998). Синтез РНК и белка измеряли по уровню включения [3Н]-уридина и [3Н]-лейцина соответственно (Andrawis and Abernethy, 1993; Giasson et al., 1997).

Результаты и их обсуждение

1. Сравнительный анализ действия различных кардиотонических стероидов (КТС) как ингибиторов Na,K-ATPa3bi и индукторов смерти эпителиальных клеток линии C7-MDCK, которая не зависит от [Na+]. и [K+Ji

Подобно уабаину, добавление других карденелидов, а также буфадиенолидов буфалина, цинобуфатолина, цинобуфагина и телобуфатоксина к клеткам линии C7-MDCK приводит к падению интенсивности окрашивания клеток МТТ и уменьшению количества клеток, сохранивших связь с подложкой (табл. 1).

Смерть клеток линии C7-MDCK, вызванная КТС, не зависит от ингибирования Na,K-ATPa3bt и от последующего увеличения внутриклеточного соотношения [Na4],/[К*],. В поддержку такого механизма говорят следующие наблюдения. Во-первых, как в среде с уабаином, так и в среде без калия наблюдается резкое ингибирование активности Na,K-АТРазы, а так же 6-ти кратное возрастание содержания внутриклеточного [Na4] (рис. 1). Однако в среде без калия смерть клеток не наступает: инкубация клеток в этой среде не приводит к падению интенсивности окрашивания МТТ, клетки сохраняют связь с подложкой (рис. 1), а также не происходит увеличения активности каспазы-3 по

Таблица 1. Влияние КТС на активность ^К-насоса клеток линии С7-МОСК, связь гкйуг с подложкой и их окрашивание МТТ.

КТС.мкМ Активность 1Ча+,К+-насоса, % Содержание белка в клетках, сохранивших связь с подложкой, % Окрашивание МТТ, %

- (контроль) 100 100 100

Карденвлиды

Уабаин, 1 45,2 ±1,1 32,4 ±2,1 46,3 ±1,5

Дигоксин, 1 57,3 ±0,8 45,0 ± 0,7 58,9 ±3,6

Дигитоксин, 1 33,5 ± 1,0 30,3 ± 3,6 40,1 ± 5,0

Дигоксигенин, 1 33,4 ±0,6 27,3 ± 3,3 43,5 ±0,9

Дигитоксигении, 10 24,1 ± 0,3 20,8 ± 1,1 42,0 ±1,8

Строфантидин, 1 26,0 ± 0,1 23,1 ± 1,7 39,8 ± 2,2

Буфадивнолиды

Буфалин, 1 10,5 ±1,1 10,0 ±6,0 17,3 ± 1,8

Цинобуфагин, 1 10,3 ±0,4 20,3 ±2,8 54,7 ± 1,8

Цинобуфатолин, 1 53,5 ± 1,5 29,5 ± 1,7 51,2 ±4,4

Телобуфатоксин, 1 74,3 ± 18,3 35,6 ±3,0 58,1 ±4,7

Марин обуфагенин, 1 41,9 ±0,4 92,4 ±3,3 91,2 ±11,8

Маринобуфатоксин, 1 51,1 ±2,0 89,6 ±5,1 107,0 ±14,0

сравнению с контрольной средой, содержащей 5 мМ KCl. Во-вторых, при [К"*]0 = 5 мМ, максимальное снижение окрашивания клеток МТТ наблюдается при концентрации уабаина 0,1 мкМ, при которой еще почти не происходит повышения содержания внутриклеточного натрия (рис. 2). И, в-третьих, маринобуфагеиин и маринобуфатоксин вызывают такое же ингибирование Na,K-Hacoca, как и другие тестируемые КТС (табл. 1). При концентрации 3 мкМ маринобуфагеиин обеспечивает 6-ти кратное возрастание содержания внутриклеточного [Na4] Подобный эффект наблюдается в присутствии 1 мкМ уабаина (рис. 2). Однако по сравнению с другими карденелидами и буфадиенолидами, маринобуфагеиин и маринобуфатоксин не вызывают снижения интенсивности окрашивания клеток МТТ, и только незначительная доля клеток теряет связь с подложкой в присутствии двух выше названных стероидов (табл. 1).

(К1..ИМ 90 5 0 » 0 50

□ контрот ■ 1 мкМуабаин

Рисунок 1. Эффект уабаина на вход ,6Ю>+ в клетки линии С7-МОСК (А), содержание в них внутриклеточного (Б), окрашивание клеток МТТ (В) и содержание белка в прикрепленных клетках (Г) в контрольной среде и в среде без калия.

Можно предположить, что действие КТС, которое не зависит от соотношения [Ка^ДК*],, обусловлено наличием другого участка связывания, отличного от а-субъединицы №,К-АТРазы. Однако из результатов анализа связывания уабаина,

представленных в координатах Скэтчарда, видно, что существует только один участок связывания для уабаина, максимальная связывающая способность которого (Втах) составляет ~ 3,5 пмоль/мг белка (рис. 3). Кроме того, связывание [3Н]-уабаина и ингибирование №,К-АТРазы под действием уабаина подавляются при возрастании концентрации внеклеточного [К^о (рис. 3 и табл. 2), что характерно для связывания уабаина с Иа,К-АТРазой (Акега Л а1., 1985; >УаШск (Л а1., 1988; Ш^е1 е1 а1., 1998). Подобный сдвиг в область более высоких концентрации полумаксимальных эффектов уабаина и маринобуфагенина на интенсивность окрашивания МТТ и содержание белка в прикрепленных клетках наблюдается при замене среды без калия на среду, содержащую 5 мМ [К+]0 (табл. 2).

• уабаи О ыяримобуфмшаш

Рисунок 2. Концентрационные зависимости эффектов уабаина и маринобуфагенина на: А - вход в клетки линии С7-МОСК; Б - содержание в них В - окрашивание клеток МТТ; Г - сохранение связи клеток с подложкой (Г).

Таким образом, смерть клеток линии С7-МОСК, вызванная К'ГС, не зависит от ингибирования Ка,К-АТРазы и от последующего увеличения внутриклеточного соотношения рЧа+],/[К+]1. Из наших результатов также следует, что маринобуфагенин является сильными ингибитором Ка,К-АТРазы, но обладает более слабой способностью (по сравнению с другими КТС) индуцировать смерть клеток, независящую от соотношения [Ка+],/[К+]ь

А

Б

Рисунок 3. Зависимость связывания радиоактивного ['Щ-уабаина от общей концентрации уабаина в присутствии К+ ([К+]0 = 5 мМ) н в среде без калия (А), и её анализ в координатах Скэтчарда (Б).

Таблица 2. Полумаксимальный эффект уабаина и маринобуфагенина на вход ^Ю^в клетки линии С7-МОСК, окрашивание их МТТ и сохранение связи клеток с подложкой.

ЮздмкМ

Методы измерения: Уабанн Маринобуфагеннн

[К+]0 = 0 мМ [К+]0 = 5 мМ РЛ„ = 0мМ [К+]0 = 5мМ

Вход "ад- 0,04 0,1 ОД 0,5

Окрашивание клеток МТТ 0,004 0,03 5 >5

Связь клеток с подложкой 0,03 0,3 7 >7

2. Идентификация сигнального каскада, вовлеченного в развитие клеточной смерти, вызванной КТС

2.1. Анализ возможной роль КТС в активации известных сигнальных каскадов

Проанализировав данные других исследователей, посвященные механизму клеточной сигнализации, которая индуцируется КТС и не зависит от соотношения [Na+]1/[K+]„ мы попытались ответить на вопрос: какие из известных сигнальных систем, с помощью которых опосредован эффект уабаина на других типах клеток, участвуют в индукции смерти клеток линии C7-MDCK, вызванной данным стероидом. Для количественной оценки смерти клеток были использованы два метода: окрашивание клеток МТТ и измерение доли клеток, сохранивших связь с подложкой.

Мы показали, что ни один из использованных нами агентов (АТР, ингибитор Са-АТРазы тапсигаргин и ВАВТА-АМ), изменяющих внутриклеточную концентрацию Са2* (Gagnon et al., 1999; Orlov et al., 1999) не повлиял на способность уабаина снижать интенсивность окрашивание клеток МТТ и долю клеток, прикрепленных к подложке (табл. 3).

С использованием различных модуляторов сигнальных путей мы посмотрели роль малого G-белка Ras, протеинкиназы Eric, PI3K, серин-треониновых протеинкиназ в передаче клеточного сигнала, вызванного уабаином. Мы не обнаружили никакого участия

Таблица 3. Эффект уабаина на смерть клеток линии С7-МОСК в присутствии модуляторов концентрации внутриклеточного Са2+.

Среда Добавляемые Окрашивание МТТ, % Содержание белка в

инкубации соединения, мкМ прикрепленных клетках, %

контроль уабаина контроль уабаин

Среда А - (контроль) 100± 7 45 ±4* 100 ±8 21 ±4*

Среда А АТР, 100 97± 11 49 ±7» 92 ±12 23 ±7*

Среда А Тапсигаргин, 0,5 104 ± б 41 ± 3* 90± 6 18 ±2*

Среда без Са2+ - 92±8 36 ±6* 88 ±12 21 ±5«

Среда без Са2+ ВАРТА-АМ, 15 89 ±10 37 ±3* 83 ±7 16 ±2*

названных систем в развитии смерти эпителиальных клеток линии С7-МОСК под действием уабаина (табл. 4).

Уабаин также не влияет на уровень активных форм кислорода, таких как супероксвд анион и перекись водорода, которые были измерены в клетках линии С7-МЛСК после их обработки уабаином с использованием люцигинин- и люминол-зависимой хемилюминесценции. Как Н-ацетицистеин, так и глутатион, не подавляют смерть клеток этой линии, обработанных уабаином, что свидетельствует об отсутствии

Таблица 4. Влияние модуляторов сигнальных путей на вызванное уабаином уменьшение окрашивания клеток линии С7-М15СК под действием МТТ и нарушение их взаимодействия с подложкой.

Добавляемые соединения, мкМ Окрашивание МТТ, % Доля клеток, сохранивших

связь с подложкой, %

контроль уабаин контроль уабаин

Роль Ras, ERK и PI3K

- (контроль) 100±6 52 ±4 100 ±9 34 ± 5

a-HFP, 50 (ингибитор Ras) 98 ± 7 45 ±4 95 ±6 27 ±3

PD85059,10 (ингибитор Erkl/2) 104±8 46 ± 5 94 ± 8 30 ±5

Генистеин, 100 (ингибитор 105 ±10 40 ±4 96 ± 5 30 ±4

тирозиновых протеинкиназ)

Вортманин, 0.1 (ингибитор PI3K) 96 ±7 43 ±3 107 ±11 28 ±6

Роль серин-треониновых киназ

- (контроль) 100 ± 5 47 ± 3 100±6 32 ±5

4Р-РМА, 0,1 (активатор РКС) 94 ±13 50 ± 7 103 ±7 36 ±6

Кальпостин, 0,15 (ингибитор РКС) 106± 8 44± 8 89 ±4 29 ±5

Форсколин, 10 (активатор аденилат 103 ±4 48 ±2 105 ±7 35 ±3

циклазы)

РольАФК

•(контроль) 100 ± 8 51 ± 6 100 ± 5 21 ±4

N-ацетилцистеин, 10000 91 30 79 ±8 27 ± 3

глутатион, 2000 119± 6 62 ± 5 107 ± 11 18 ± 3

участия активных форм кислорода в сигнальных каскадах, инициированных уабаином (табл. 4). Аналогичная ситуация наблюдалась при изучении роли белков цитоскелета с использованием двух ингибиторов (цитохалазина Б и винбластина), приводящих к разрушению микрофиламентов и необратимому ингибированию полимеризации микротрубочек соответственно (Ог1оу ег а1., 1995) (данные приведены в диссертации).

16-ти часовая инкубация в присутствии 0,5 мкг/мл актиномицина О и циклогексимида приводит к подавлению синтеза РНК и белка в 8 и 2 раза соответственно, причем при данной концентрации оба ингибитора не влияют на жизнеспособность клеток. Но ни актиномицин Э, ни циклогексимид не защищают клетки от развития смерти, вызванной добавлением 3 мкМ уабаина (данные приведены в диссертации) Основываясь на этих результатах можно предположить, что все участвующие белковые интермедиа™ каскада, обеспечивающего развитие клеточной смерти под действием уабаина, по-видимому, уже присутствуют в клетке, и их синтез не требуется.

Таким образом, ни одна из рассмотренных выше сигнальных систем клетки не играет ключевой роли в развитии клеточной смерти под действием уабаина в эпителиальных клетках линии С7-Ш)СК, кроме того, для развития сигнала, по-видимому, не нужно синтезировать новые белки.

2.2. Роль рН в развитии смерти клеток линии С7-МОСК под действием уабаиан

Мы обнаружили, что закисление среды, вызванное отсутствием в буфере ЫаНС03 или увеличением соотношения Нерев/Тпя, защищает клетки линии С7-МЕ)СК от клеточной смерти, индуцированной уабаином (табл. 5). Полное подавление смерти клеток, обработанных уабаином, происходит при снижение рН среды с 7,36 до 7,03, при этом значения внутриклеточного рН составили 7,21 и 6,87 соответственно (рис. 4). Подобное ингибирование сигнала клеточной смерти под действием уабаина было обнаружено при инкубации клеток в присутствии ингибитора №+/Н+-обмена Е1РА (рис. 5), а также при использование >И(С1 для закисления внутриклеточной среды. При этом незначительное закисление среды не влияет ни на связывание [3Н]-уабаина, ни на вход 86М>+ (табл. 6). Это показывает, что протон-чувствительный элемент каскада, обеспечивающего развитие клеточной смерти, действует уже после связывания уабаина с №,К-АТРазой.

Таблица 5. Эффект уабаина на способность клеток линии С7-МЭСК сохранять связь с подложкой в контрольной среде и в среде с низким содержанием №НСОз.

Среда инкубации рНо Доля клеток, потерявших

связь с подложкой, %

контроль уабаин

1. ОМЕМ-подобная среда (контроль) 7,23 ±0,08 4±2 73 ± 12

2. ОМЕМ-подобная среда, обедненная 6,65 ±0,11* 6±2 14 ±4*

ЫаНСОз

3. ЭМЕМ-подобная среда, обогащенная 6,83 ± 0,06* 3 ± 2 23 ±6*

НЕРЕЭ

4, ОМЕМ-подобная среда, содержащая трис и 7,11 ±0,13 7± 4 63 ±8

обедненная КаНСОз-

5. НЕРЕЭ и трис содержащая среда без 7,41 ± 0,09 5±2 82 ± 8

КаНСОз

6. НЕРЕв и трис содержащая среда без 6,72 ±0,13 7±4 16 ±4*

ЫаНСОз

ф контроль 0 уабаин

¿г

7,4 ¿1

7,8 рН.

Рисунок 4. Зависимость влияния уабаина на сохранение связи клеток линии С7-МОСК с подложкой от рН среды.

И, наконец, мы показали, что защитный эффект среды с закисленным рН (рН 6,79) частично уменьшается под действием циклогексимида (ингибитора синтеза белка) и практически полностью исчезает в присутствии актиномицина О (ингибитора синтеза РНК) (рис. 6). Эти данные указывают на то, что механизм защиты клеток от смерти, вызванной уабаином, связан, по-видимому, с экспрессией белков, участвующих в ингибировании сигнала клеточной смерти.

Рисунок 5. Эффект ингибитора Ка+/Н+-обмена (Е1РА) на внутриклеточный рН (А) и жизнеспособность клеток линии С7-МЕ)СК, обработанных уабаином (Б и В).

Таблица 6. Влияние рН среды на связывание [3Н]-уабаина и вход МКЬ+ в клетках линии 1

С7-МОСК.

рНо Связывание [ЛН]- уабаина Вход "ИЬ* нмоль*(мг белка)"1* 5 мин'1

Втах, К,щМ Уабаин- Уабаин-

пмоль* (мг белка/)"' чувствительный нечувствительный

7.29 3,32 ± 0,33 37 ±3 135 ±17 115 ± 15

6.71 2,87 ±0,31 41 ±5 108 ±10 111 ± 9

рН, = 7Ж! рН.«в.79 □ контроль ■ демоАмциююгасаммяа ■ 4,5 ы«Пмл акпмомицик Д

Рисунок 6. Эффект актиномицина D и циклогексимида на синтез РНК, белка и смерть клеток линии C7-MDCK, обработанных уабаином.

Таким образом, полученные нами результаты указывают на существование защитного эффекта среды в диапазоне рН от 7,36 до 7,03 от развития смерти клеток линии C7-MDCK под действием уабаина. По-видимому, подавление клеточной смерти связано с взаимодействием протонов (Н1) с неизвестным внутриклеточным сенсором, который, возможно, в свою очередь активирует синтез белков, участвующих в ингибировании смерти клеток, вызванной уабаином.

3. Выявление и идентификация белков, взаимодействующих с Na,K-ATPa3ott в ответ на действие уабаина.

Используя различные модуляторы сигнальных путей мы изучили роль малого G-белка Ras, протеинкиназы Erk, PI3K, серин-треониновых протеинкинах в передаче клеточного сигнала, вызванного уабаином. Мы исследовали эффект уабаина на концентрацию внутриклеточного [Са2+]„ уровень активных форм кислорода, цитоскелет клетки, но не обнаружили никакого участия названных систем в развитии смерти эпителиальных клеток линии C7-MDCK под действием уабаина. Поскольку смерь клеток

эпителия данной линии не завесит от изменения внутриклеточных концентраций ионов №+, К+ и Са2+, мы предположили, что существует неизвестный белок или белки, взаимодействие которого или которых с Ыа,К-АТРазой индуцируется уабаином, что приводит к активации сигнального каскада, ведущего к смерти клеток.

Для выявления белков, взаимодействие которых с Ыа,К-АТРазой индуцируется уабаином, мы использовали клеточную линии из кишечника человека (Сасо-2), геном которого полностью расшифрован, что облегчает проведение идентификации белков. Как и в клетках линии С7-МОСК, инкубация с уабаином вызывает смерть клеток линии Сасо-2. Для приготовления клеточного лизата мы использовали два для экстрагирования белков клетки два неионных детергента: 0,5% Нонидет Р-40 и 0,5% Тритон Х-100. После обработки детергентом несолюбилизированные мембраны осаждали мембран путем ультрацентрифугирования.

Методом Вестерн-блот мы показали, что при проведении иммунопреципитации с использованием антител против а 1-субъединицы Ка,К-АТРазы, а 1-субъединицы осаждается из клеточного лизата в комплексе с антителами (рис. 7).

12345 1234

Рисунок 7. Детектирование ИаД-АТРазы методом Вестерн-блот в лизатах клеток линии Сасо-2 и иммунопреципитатах, полученных с использованием двух различных детергентов, Нонидета Р-40 (А) и Тритона Х-100 (Б). 1 - клеточный лизат линии Сасо-2; 2 - лизат клеток линии Сасо-2, предварительно обработанных 3 мкМ уабаином; 3 -иммунопреципитат; 4 - иммунопреципитат, приготовленный в присутствии 3 мкМ уабаина; 5 - контрольная проба, полученная в отсутствие антител при проведении иммунопреципитации.

Для проведения сравнительного анализа белкового состава проб, полученных после проведения иммунопреципитации в присутствии и в отсутствие уабаина, мы использовали метод двумерного электрофоретического разделения белков в геле (рис. 9) с последующим проведением сравнительного анализа с использованием программы «20В результате в трех независимых экспериментах для каждого использованного детергента мы обнаружили два набора белков, которые включаются в комплекс с Ыа,К-АТРазой под действием уабаина (табл. 7).

Таблица 7. Результаты анализа белкового состава иммунопреципитатов, полученных с использованием антител против а1-субъединицы !Ча,К-ЛТРазы и двух различных детергентов, методом двумерного электрофореза. (* - белок с одинаковой молекулярной массой, но разной изоэлектрической точкой).

Метод 1 Метод 2

(Нонидет Р-40) (ТритонХ-100)

1Р 1Р+оиа 1Р 1Р+оиа

80 кДа 70 кДа - 96-93 кДа

64 кДа 73-70 кДа

55 кДа 48 кДа

40 кДа 40* кДа

35-34 кДа 39-35 кДа

35-34 кДа

Как видно из табл. 7, в иммунопреципитатах, полученных в присутствии уабаина в двух различных сериях экспериментов, одновременно присутствует только одна группа белков с одинаковой изоэлектрической точкой и с молекулярной массой около 35-34 кДа. Такое различие в обнаруженных наборах белков можно объяснить тем, что в условиях полной солюбилизации Ка,К-АТРазы в случае использования Тритона Х-100 с ферментом остается связанным один тип белков При проведении иммунопреципитации с использованием Нонидета Р-40 сохраняется, по-видимому, другой тип взаимодействий белков с №,К-АТРазой, и поэтому мы видим другой набор белков, препипитирующих совместно с этим ферментом.

Для идентификации выявленных белков, взаимодействующих с 1Ма,К-АТРазой в результате связывания с ней уабаина, мы использовали метод масс-спектрометрии. Было приготовлено 15 образцов гелей с белковыми пятнами, соответствующими белкам, взаимодействующим с Ка,К-АТРазой после обработки клеток уабаином и полученных при использовании Тритона Х-100 в качестве детергента при проведении иммунопреципитации. В результате анализа данных образцов методом масс-спектрометрии было идентифицировано 18 белков. Болыпаая часть этих белков является гипотетическими, поскольку их последовательности известны лишь по результатам

Таблица 8. Характеристика белков, взаимодействующих с №,К-АТРазой под действием уабаина в клетках линии Сасо-2 и идентифицированных методом масс-

спектрометрии.

№ М.м., Ша/р1 Число идентифицированных пептидов и их содержание в % от общего количества последовательности Наличие консервативных доменов

По гелю По базе данных Название белка

] 40,89/4,05,0 42,2/4,72 Глкжокортикоидный рецептор 8 (22 %) Глюкокортикоид ный рецептор

2 40,89/4,05,0 42,4/5,19 Фосфорилиро ванная фосфатаза 16(34%) Бег/Пи-- фосфатазы типа 2С

3 40,0/4,05,0 41,3/4,47 Фосфорированный белок 1 семейства вгс 20 (29 %) Плекстриновый домен, БНЗ-домен

4 73,0/8,510,0 71,0/9,08 Активатор 1 белка Яас йТРаза 19(28%) Домен протенкиназы С, домен ЮювАР

5 74,4/8,510,0 72,0/9,23 Белок САМТА1 25 (28 %) Анкириновые повторы

б 46,4/8,510,0 46,8/9,67 ВС015775 ИГО 4(11 %) Каталитический домен Бег/Пи протеинкиназ

7 42,8/4,06,5 43,9/6,32 Киназа 2, регулируемая сывороткой/ глюкокортикоидами 6 (17 %) Каталитический домен вег/ТЬт протеинкиназ

расшифровки генома. Среди известных белков, взаимодействующих с Ка,К-АТРазой под действием уабаина, обнаружены рецептор глюкокортикоидов, фосфорилированная фосфатазы типа 2С, фосфорилированный белок 1 семейства Src, активатор 1 белка Rac ОТРазы, белки САМТА1 и ВС015775 NID, и, наконец, киназа 2, регулируемая сывороткой/глюкокортикоидами (табл. 8).

Из литературы известно, что Na,K-ATPa3a взаимодействует с рядом белков, некоторые из них относятся к тем же семействам белков и содержат те же консервативные домены, что и обнаруженные нами белки. Так, показана ассоциация Na,K-ATPa3bi с анкирином путем взаимодействия с анкириновыми повторами данного белка цитоскелета (Morrow et al., 1989; Koob et al., 1990). За счет вНЗ-домена осуществляется взаимодействие Na,K-ATPa3bi с Src-киназой (Liu et al., 2002). Таким образом, идентифицированные нами белки представляют большой интерес для дальнейшего изучения их роли в развитии клеточной смерти, вызванной кардиотоническими стероидами.

Выводы

1. 24-ч инкубация клеток эпителия почек собаки (линия C7-MDCK) с кардиотоническими стероидами приводит к смерти клеток за счет взаимодействия стероидов с а-субъединицей Na,K-ATPa3bi, но независимо от ингибирования ионных потоков, осуществляемых этим ферментом.

2. 50% ингибирование Ыа,К-АТРазы наблюдается при одинаковой концентрации маринобуфагенина и уабаина (1 мкМ) в то время как индуцированная маринобуфагенином смерть клеток наблюдается при более высокой концентрации по сравнению с другими кардиотоническими стероидами (ГО50 ~ 0,2 и > 10 мкМ для уабаина и маринобуфагенина соответственно).

3. Добавление к клеткам линии C7-MDCK ингибиторов сигнальных каскадов, воздействующих на белок Ras, тирозиновые протеинкиназы, протеинкиназы Erk, протеинкиназы С, фосфотидилинозитид-3-киназы, внутриклеточную концентрацию Са2+, активные формы кислорода, белки цитоскелета не влияет на развитие клеточной смерти, вызванной уабаином.

4. Снижение рН цитоплазмы клеток линии C7-MDCK с 7,2 до 6,9 полностью предотвращает смерть клеток, вызванную уабаином. Защитное действие кислых рН устраняется в присутствии ингибиторов синтеза РНК и белка.

5. С использованием двумерного электрофореза установлено, что обработка клеток линии Сасо-2 уабаином, приводящая к смерти клеток по механизму, характерному для клеток линии C7-MDCK, приводит к появлению в иммунопреципитатах, осаждаемых антителами против al -субъединицы №,К-АТРазы, 29 новых белков.

6. Для 18 белков, преципитирующих совместно с Ыа,К-АТРазой из лизата клеток линии Сасо-2 после обработки уабаином, проведен масс-спектрометрический анализ продуктов трипсинолиза. С большой долей вероятности 5 из этих 18 белков являются: рецептором глюкокортикоидов, фосфорилированной фосфатазой типа 2С, фосфорилированным белком 1 семейства Src, активатором 1 бежа Rac-GTPa3a, белком САМТА1, содержащим анкириновые повторы. Кроме того, два белка из 18 содержат домены, присутствующие у сериновых(треониновых) протеинкиназ.

Основные публикации по теме диссертации

1. Dolgova N.V, Mast N.V, Akimova О.A, Rubtsov A.M, Lopina O.D (2002) Proteins binding to al pi -isoenzyme of Na,K-ATPase Abstract. Tenth international conference on Na,K-ATPase and related cation pumps, Denmark, p. 50.

2. Taurin S., Akimova О., Tremblay J., Hamet P., and Orlov S.N. (2003) Comparative proteomics of integral and peripheral membrane proteins from human and rat red blood cells (RBC). Abstract. HUPO 2nd Annual&IUBMB XIX World Congress, Montreal (Canada), p.789.

3. Orlov S.N, Akimova O., Taurin S., Lopina О., Tremblay J., Hamet P.. (2004) Cell type-specific impact of cardiotonic steroids (CTS) in apoptosis and necrosis: role of Na+i,independent and -independent signalling. Abstract. 12th International Conference on Second Messengers and phosphoproteins, Montreal (Canada), p 74 .

4. Orlov S.N, Thorin-Trescases N., Pchejetski D., Akimova O., Taurin S., Tremblay J., Thorin E. and Hamet P.. (2004) Na+/K+-Pump as endothelial cell death receptor triggered by ouabain. Abstract. 12th International Conference on Second Messengers and phosphoproteins, Montreal (Canada), p .153.

5. Akimova O.A., Bagrov A.Y., Tremblay J., Hamet P. and Orlov S.N., (2005) Endogenous cardiotonic steroids differentially affect intracellular Na+ and [Na+]/[K+],-independent signaling. Abstract. 15th European Meeting on Hypertension, Milan (Italy), p. 355.

6. Orlov S.N., Akimova O.A., Pchejetski D., and Hamet P. (2005) Modest intracellular acidification suppresses death signaling in ouabain-treated cells. Abstract. 15th European Meeting on Hypertension, Milan (Italy). P- 240.

7. Akimova O.A., Lopina O.D., Hamet P., and Orlov S.N. (2005) Search for intermediates of Na+,K+-ATPase-mediated [Na^pC],-independent death signaling triggered by cardiotonic steroids. Abstract. 11th International ATPase Conference and 59th Annual Meeting and Symposium of the Society of General Physiologists. Woods Hole (USA), p. 65a.

8. Akimova O.A., Bagrov A.Y., Tremblay J., Hamet P. and Orlov S.N.. (2005) Cardiotonic steroids differentially affect Na+,K+-pump activity and Na\K+-ATPase a-subunit-mediated [Na+]/[K+],-independent signaling. Abstract. Canadian Journal of Cardiology, Montreal (Canada), p. 77C.

9. Akimova O.A., Hamet P. and Orlov S.N.. (2005) Search for intermediates of Na+,K+-ATPase-mediated [Na^/pC^i-independent death signaling triggered by cardiotonic steroids. Abstract. Canadian Journal of Cardiology, Montreal (Canada), p. 108C.

10. Akimova O.A., Dolgova N.V., Mast N.V., Rubtsov A.M., Lopina O.D. (2003) Revealing of proteins interacting with Na,K-ATPase. Biochemistry (Moscow), 68: 1271 - 1279.

11. Dolgova N., Mast N., Akimova O., Rubtsov A., and Lopina O. (2003) Proteins binding to alßl isozyme of Na,K-ATPase. Ann. N.Y. Acad. Sei., 98:527 - 529.

12. Akimova O.A., Bagrov A.Y., Lopina O.D., Kamemitsky A.V., Tremblay J., Hamet P. and Orlov S.N. (2005) Cardiotonic steroids differentially affect intracellular Na+ and [Na'fyfK4],-independent signaling in C7-MDCK cells. J. Biol. Chem. 280: 832-839.

13. Akimova O.A., Lopina O.D., Hamet P., Orlov S.N. (2005) Search for intermediates of Na,K-ATPase-mediated [Na^ypC^i-independent death signalling triggered by cardiotonic steroids. Pathophysiology. Pathophysiology, 12:125 -135.

14. Akimova O.A., Pchejetski D., Hamet P. and Orlov S.N. (2005) Modest intracellular acidification suppresses death signaling in ouabain-treated cells. Pflugers Arch. In press.

15. Orlov S.N., Akimova O.A. and Hamet P. (2005). Cardiotonic steroids: novel Mechanisms of Na+,-mediated and -independent sighnaling involved in the regulation of gene expression, proliferation and cell death. Current Hypertension Reviews, 1: 243 - 257.

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 16.01.2006 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печ.л. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ 019. Тел. 939-3890. Тел /Факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.

j

1- 147Ç

п

/

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Акимова, Ольга Алексеевна

1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. Ка,К-АТРаза: молекулярная структура, механизм 8 функционирования и регуляция

2.1.1. Структурная организация №,К-АТРазы

2.1.2. Механизм функционирования ЫаД-АТРазы

2.1.3.Изоферменты ЫаД-АТРазы и их свойства

2.1.4. Роль Ш,К-АТРазы в функционировании различных 19 тканей

2.1.5. Механизмы регуляции №,К-АТРазы

2.1.5.1. Фосфорилирование №,К-АТРазы протенкиназами

2.1.5.2. Взаимодействие №,К-АТРазы с другими белками

2.2. Кардиотонические стероиды как модуляторы 31 активности ЫаД-АТРазы

2.2.1. Участки связывания КТС на молекуле а-субъединицы 32 Ш,К-АТРазы.

2.2.2. Эндогенные КТС

2.3. Сигнальные каскады, активируемые КТС

2.3.1. Сигнальный каскад, опосредованный повышением 38 внутриклеточных концентраций Са2+ и Ыа+

2.3.2. Сигнальный каскад, независящий от концентрации 39 внутриклеточного Са2+ и опосредованный изменением концентрации внутриклеточного Ма+

2.3.3. Сигнальные каскады, независящие от соотношения 43 внутриклеточных концентраций Ыа+ и К+

2.3.3.1. Усиление пролиферации клеток под действием 43 низких концентрации КТС

2.3.3.2. Смерть эпителиальных и эндотелиальных клеток под 46 действием КТС

3. Материалы и методы

3.1. Культуры клеток

3.1.1. Эпителиальные клетки линии С7-МОСК

3.1.2. Эпителиальные клетки линии Сасо

3.2. Морфологические и биохимические методы оценки 53 типа клеточной смерти

3.2.1. Фазово-контрастная микроскопия

3.2.2. Флуоресцентная микроскопия

3.2.3. Нарушение связи клеток с подложкой

3.2.4. Окрашивание МТТ

3.2.5. Определение активности каспазы

3.3. Методы изучения ионного гомеостаза клеток

3.3.1. Активность ЫаД-насоса

3.3.2. Связывание [3Н]-уабаина

3.3.3. Содержание обмениваемого внутриклеточного натрия

3.3.4. Измерение внутриклеточного рН

3.4. Биохимические методы исследования

3.4.1. Измерение содержания НАБН/ЫАОРН и РАБН2 в 59 клетке

3.4.2. Измерение содержания активных форм кислорода в 60 клетке

3.4.3. Определение синтеза РНК и белка

3.4.4. Иммунопреципитация белков с использованием 62 антител на №,К-АТРазу

3.4.5. Измерение концентрации белка методом Брэдфорда

3.4.6. Одномерный электрофорез в полиакриламидном геле 64 по методу Лэммли

3.4.7. Двумерный электрофорез в полиакриламидном геле

3.4.8. Вестерн-блот

3.4.9. Идентификация белков методом масс-спекгрометрии

3.5. Реактивы

4. Результаты

4.1. Сравнительный анализ действия различных 69 кардиотонических стероидов (КТС) как ингибиторов

Na,K-ATPa3bi и индукторов независимого от [Na+]. и

K+]¡ онкоза эпителиальных клеток линии C7-MDCK

4.2. Идентификация сигнального каскада, вовлеченного в развитии клеточной смерти, вызванной КТС

4.2.1. Роль кальция в развитии смерти клеток под действием 88 уабаина

4.2.2. Роль Ras, PI3K и протеинкиназ в развитии смерти 89 клеток, вызванной уабаином

4.2.3. Роль активных форм кислорода (АФК) в индукции 92 смерти клеток под действием уабаина

4.2.4. Роль белков цитоскелета в индукции смерти клеток под 95 действием уабаина

4.2.5. Установление роли кавеол в индукции клеточной 95 смерти под действием уабаина

4.2.6. Роль экспрессии генов de novo в индукции смерти 97 клеток под действием уабаина

4.2.7. Роль рН в развитии смерти клеток под действием 100 уабаина

4.3. Выявление белков, взаимодействующих с Na,К- 114 АТРазой

4.4. Идентификация белков, взаимодействующих с 145 а-субъединицей Na,K-ATPa3bi в ответ на связывание уабаина

5. Обсуждения результатов

5.1. Сравнительный анализ действия КТС

5.2. Идентификация ^^К^-независимого 155 сигнального каскада, запускаемого КТС и приводящего к смерти эпителиальных клеток

5.2.1. Роль известных сигнальных каскадов, запускаемых 155 КТС

5.2.2. Роль рН 160 5.3. Идентификация белков, взаимодействующих с 162 а-субъединицей Na,K-ATPa3bi

Введение Диссертация по биологии, на тему "Na,K-АТРаза как рецептор сердечных гликозидов: идентификация сигнального каскада, независимого от внутриклеточных концентраций Na+ и K+"

Na,K-ATPa3a (№,К-активируемая, Mg-зависимая аденозинтрифосфогидролаза, КФ 3.6.1.3) была впервые описана Йенсом Скоу в 1957 году (Skou, 1957). Фермент присутствует в плазматической мембране всех клеток животных и осуществляет электрогенный обмен трех ионов внутриклеточного Na+ на два иона внеклеточного К+, используя для транспорта ионов энергию, высвобождающуюся при гидролизе АТР.

Na,K-ATPa3a состоит из полипептидных цепей двух типов, названных а- и Р-субъединицами. а-Субъединица имеет молекулярную массу около 110 кДа, а р-субъединица представляет собой гликопротеид, и в зависимости от степени гликозилирования её молекулярная масса в различных тканях составляет от 40 до 60 кДа. а-Субъединица Na,K-ATPa3bi, содержащая участки связывания АТР, натрия и калия, способна полностью выполнять каталитическую функцию и в процессе каталитического цикла подвергается фосфорилированию-дефосфорилированию. Р-Субъединица является существенным компонентом Na,K-АТРазы, хотя непосредственного участия в катализе эта субъединица не принимает, но влияет на транспортные функции фермента, изменяя сродство к ионам К+. Р-субъединица играет важную роль в поддержании нативной структуры каталитической субъединицы №,К-АТРазы. В составе очищенных препаратов Na,K-ATPa3bi почек кроме а- и р-субъединиц присутствует белковый компонент, ассоциированный с Na-насосом, и который был назван у-субъединицей (Forbush et al., 1978). В препаратах фермента, полученных из других источников, у-субъединица не выявлена, и, по-видимому, её присутствие не является обязательным. В связи с этим принято считать, что Na,K-ATPa3a состоит только из двух типов субъединиц.

Известно, что №,К-АТРаза играет ключевую роль в регуляции концентрации внутриклеточных одновалентных катионов, в поддержании мембранного потенциала, объема клетки, сопряженного транспорта Na+ и

2+ + аминокислот, глюкозы, нуклеотидов и некоторых ионов (например, Са , Н ) через плазматическую мембрану (Lang et al., 2000; Mongin, Orlov, 2001; Blanco, Mercer, 1998). Неудивительно, что ингибирование данного фермента влияет на целый ряд процессов в клетке. Так, например, уабаин и другие кардиотонические стероиды (КТС), ингибирующие Ыа,К-АТРазу путем взаимодействия с её а-субъединицей, приводят к повышению внутриклеточной концентрации Na+, что в свою очередь активирует Ка+/Са2+-обменник и потенциал-активируемые Са2+ каналы (Lang et al.,

Л I

1998; Lang et al., 1992). При этом возрастает уровень внутриклеточного Са , что ведет к увеличению сокращения кардиомиоцитов (Blastein, Lederer, 1999).

За последнее время появилось большое количество работ, свидетельствующих о том, что помимо основной функции Na,K-ATPa3bi, связанной с поддержанием неравновесного распределения Na+ и К+, этот фермент выступает в роли рецептора кардиотонических стероидов, способного вызывать изменения функционального состояния клеток. В настоящее время получены многочисленные данные, показывающие, что кардиотонические стероиды, ингибируя активность Na,K-ATPa3bi, вызывают также активацию некоторых сигнальных каскадов клетки. Среди них сигнальные каскады с участием протеинкиназ Ras/Raf/MEK/Erk 1 /2 (р42/44 МАРК) (Kometiani et al., 1998) и активных форм кислорода (Xie et al., 1999), активация которых в свою очередь влияет на экспрессию ряда генов (Xie et al., 2002; Taurin et al., 2003), включая гены, вовлеченные в регуляцию пролиферации клеток и программированной клеточной смерти (апоптоза) (Orlov et al., 2005; Taurin et al., 2003). Для клеток гладкой мускулатуры сосудов (VSMC) был обнаружен защитный эффект уабаина, предотвращающий развитие апоптоза клеток, вызванного отсутствием ростовых факторов (Orlov et al., 1999). Было установлено, что важную роль в антиапоптотическом действии уабаина играет повышение внутриклеточного содержания [Na+]b что ведет к экспрессии антиапоптотических генов (Taurin et al., 2002а; Taurin et al., 2002b).

Недавно в лаборатории Орлова С.Н. было показано, что, в отличие от VSMC, в эпителиальных клетках почек собаки (C7-MDCK) под действием уабаина наблюдается активация сигнального каскада, приводящего к смерти клеток независимо от возрастания внутриклеточного соотношения [Ма+]/[К+^ (РсЬе]е1з1и е1 а1., 2003). Это позволило предположить, что могут существовать такие КТС, которые эффективно ингибируют Ыа,К-АТРазу, не влияя на жизнеспособность клеток, и наоборот. Помимо клеток линии С7-МОСК, длительное воздействие уабаина приводит к гибели ряда других типов клеток, включая эндотелиальные клетки аорты свиньи (РАЕС) и эпителиальные клетки кишечника человека (Сасо-2) (Ог1оу е1 а1., 2005). Как и в случае С7-МЭСК клеток, смерть клеток линии РАЕК и Сасо-2 не зависит от действия уабаина на внутриклеточное соотношение |ЪГа+]/[К+];. До настоящего времени механизм развития смерти клеток, индуцированный уабаином, остается мало изученным. В первой части работы мы сравнили способность ряда кардиотонических стероидов ингибировать Ка,К-насос, изменять соотношение и [К+]; и включать сигнальный каскад, приводящий к смерти клеток линии С7-МОСК. Во второй части работы мы предприняли попытку идентифицировать сигнальной каскад, запускаемый КТС в клетках линии С7-МБСК и независимый от внутриклеточного соотношения [Ма+];/[К+]].С целью идентификации начальных звеньев этого каскада, мы исследовали влияние КТС на взаимодействие а-субъединицы №,К-АТРазы с другими белками, применив метод иммунопреципитации, двумерного электрофореза и масс-спектрометрии. Эти данные суммированы в заключительной части нашей работы.

2. Обзор литературы

2.1. Na,K-ATPa3a: молекулярная структура, механизм функционирования и регуляция

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Акимова, Ольга Алексеевна

6. Заключение

Начиная с 60-х годов прошлого столетия, уабаин и родственные ему соединения известны как специфические ингибиторы Na,K-ATPa3bi (Na-Hacoca). За последние два десятилетия появилось большое количество работ, показывающих, что уабаин вызывает активацию сигнальных каскадов клетки, в том числе активацию протеинкиназ Ras/Raf/MEK/Erkl/2 (р42/44 МАРК) (Kometiani et al., 1998), продукцию активных форм кислорода (Xie et al., 1999; Liu et al., 2000; Valente et al., 2003), экспрессию ряда генов (Peng et al., 1996; Huang et al., 1997; Qin et al., 1994), в том числе генов, вовлеченных в регуляциюпролиферации клеток. При этом в кардиомиоцитах, где обнаружено большинство этих эффектов, действие уабаина обусловлено как минимум двумя причинами: 1) изменением внутриклеточной концентрации Na+ (что приводит к изменению внутриклеточной концентрации Са2+ и включению ряда Са2+-зависимых каскадов); 2) связыванием с Ыа,К-АТРазой Src-киназы, которая вследствие этого активируется и фосфорилирует рецептор эпидермального фактора роста, что активирует другие каскады. На клетках гладкой мускулатуры сосудов (VSMC) было установлено, что уабаин защищает клетки от развития апоптоза, вызванного удалением ростовых факторов (Orlov et al., 1999). В этом случае эффект уабаина обусловлен исключительно повышением внутриклеточной концентрации Na+, что индуцирует синтез белков de novo (ссылка). В отличие от VSMC, длительное воздействие уабаина приводит к гибели эпителиальных клеток почек линии C7-MDCK, причем в отличие от первых двух типов клеток этот эффект развивается независимо от изменения соотношения внутриклеточного [Na+]j/[K+]j (Pchejetski et al., 2003).

Исследования, проведенные в 80-90 годы прошлого столетия показали, что уабаин и его аналоги, присутствуют не только у растений (карденелиды) и в слизи некоторых беспозвоночных (буфадиенолиды), но и синтезируются у животных в надпочечниках и гипоталамусе и, по-видимому, функцтонируют как гормоны. Присутствие различных видов кардиотонических стероидов в организмах млекопитающих и различные эффекты уабаина на разные типы клеток позволили предположить, что могут существовать кардиотонические стероиды, эффективно

ингибирующие Na,K-ATPa3y, не влияя на жизнеспособность клеток, и наоборот. Подобно уабаину, другие карденолиды, а также буфадиенолиды (буфалин, цинобуфаталин, цинобуфагиин и телобуфатоксин), добавленные к клеткам MDCK, снижают интенсивность окрашивания клеток МТТ и уменьшают количество клеток, сохранивших связь с подложкой. Смерть клеток линии C7-MDCK, вызванная КТС, не зависит от ингибирования Ыа,К-АТРазы и последующего увеличения внутриклеточного соотношения [Na+]¡/[K+]¡. Мы показали, что два буфаденолида: маринобуфагенин и маринобуфатоксин - являются сильными ингибиторами Na,K-ATPa3bi, но по сравнению с другими КТС обладают более слабой способностью индуцировать смерть клеток, независящую от соотношения [Na+]¡/[K+]i.

В данной работе мы постарались выяснить, какие сигнальные пути клетки участвуют в передаче вызванного уабаином сигнала смерти. Мы показали, что изменение внутриклеточной концентрации Са2+, уровня активных форм кислорода не играет ключевой роли в развитие клеточной смерти под действием уабаина. С использованием различных активаторов и ингибиторов сигнальных путей мы исследовали, не участвуют ли в передаче сигнала малый G-белок Ras, протеинкиназы Erk, PI3K, а также серин-треониновые протеинкизы. Однако с использованием этого подхода мы не обнаружили какого-либо участия названных систем в передаче сигнала, вызванного связыванием уабаина с Ыа,К-АТФазой и приводящего к смерти клеток. При изучении роли рН внутриклеточной среды в развитии сигнала смерти мы обнаружили, что снижение рН с 7,36 до 7,03 приводит к полному подавлению смерти клеток, обработанных уабаином. Наши данные позволяют предположить, что этот эффект связан с экспрессией de novo pH¡-чувствительных генов, вовлеченных в защиту клеток от онкоза.

Поскольку подход с использованием ингибиторов сигнальных каскадов не дал информации о механизме развития сигнала, обеспечивающего смерть эпителиальных клеток, а развитие сигнала может быть вызвано лишь с взаимодействием с Иа,К-АТФазой внутриклеточных белков в ответ на связывание с ней уабаина, мы решили найти и идентифицировать эти белки. Методом иммунопреципитации с использованием двух различных детергентов было

выявлено два набора белов, появление которых в иммунопреципитатах индуцируется уабаином. При обработке клеток Нонидетом Р-40 мы обнаружили белки с молекулярными массами 70, 64, 55, 40, и 35-34 кДа, тогда как в случае Тритона Х-100 - 96-93, 73-70, 48, 40, 39-35 и 35-34 кДа. Методом масс-спекгрометрии было идентифицировано 18 белков, полученных методом иммунопреципитации из тритонового лизата, среди которых глюкокортикоидный рецептор, фосфорилированный белок фосфатазы типа 2С, фосфорилированный белок 1 из семейства Src, активатор 1 белка Rae GTPa3bi, белки САМТА1 и ВСО15775 NID, и, наконец, регулируемая сывороткой/глюкокортикоидами киназа 2. Можно предположить, что, по крайней мере, часть обнаруженных нами белков являются участниками сигнального каскада, ведущего к смерти клеток под действием уабаина. Мы планируем проверить это предположение в дальнейшем с использованием современных методов молекулярной биологии и протеомики.

В совокупности полученные нами данные позволяют предположить следующую модель действия кардиотонических стероидов и pH среды на развитие смерти клеток линии C7-MDCK (рис. 56). Согласно этой модели под действием уабаина и маринобуфагенина происходит изменение конформации Na,K-ATPa3bi, что приводит к резкому ингибированию фермента. В отличие от уабаина, маринобуфагенин не оказывает токсического эффекта на клетки и в его присутствии не наблюдается смерти клеток линии C7-MDCK. Одна из гипотез, позволяющая объяснить данное различие в действии двух кардиотонических стероидов на жизнеспособность клеток заключается в существовании двух разных конформационных состояний Na,K-ATPa3bi, одно из которых в случае уабаина ведет к активации сигнала смерти, тогда как переход в другое состояние под действием маринобуфагенина не приводит к смерти клеток. Разными группами исследователей установлено взаимодействие Na,K-ATPa3bi с целым рядом белков. Известны также данные о влияние уабаина на некоторые белок-белковые

взаимодействия фермента. Это предположить, что взаимодействие Na,K-ATPa3bi с

рН среды

белком-партнером определяется конформационным состоянием Na-Hacoca. Методом иммунопреципитации мы выявили набор белков с молекулярными массами 96-93, 73-70, 70, 64, 55, 48, 40, 39-35 и 35-34 кДа, присутствие которых в иммунопреципитатах индуцируется уабаином, среди которых были идентифицированы рецептор глюкокортикоидов, фосфорилированная фосфатазы типа 2С, фосфорилированный белок 1 из семейства Src, активатор 1 белка Rac вТРазы, белки САМТА1 и ВС015775 NID, и, наконец, киназа 2, регулируемая

сывороткой/глюкокортикоидами. Какую роль играют найденные белки в развитии смерти клеток, вызванной уабаином, остается неясным. Остается также неясным и то, сохраняются ли подобные взаимодействия в присутствии маринобуфагенина или существует другой набор белков, взаимодействующих с Ыа,К-АТРазой под действием данного бафадиенолида. Мы надеемся, что эти вопросы станут предметом будущих исследований.

И, наконец, мы получили результаты, указывающие на существование защитного эффекта закисления среды в диапазоне рН от 7,36 до 7,03, от развития смерти клеток линии С7-МОСК под действием уабаина. По-видимому, подавление смерти клеток связано с взаимодействием протонов (Н+) с неизвестным внутриклеточным сенсором. В присутствии ингибиторов синтеза РНК (актиномицина Д) и белка (циклогексамида) защитный эффект среды с закисленным рН частично уменьшается (под действием циклогексимида) или практически полностью исчезает (в присутствии актиномицина Д). Это указывает, что механизм защиты клеток от смерти, вызванной уабаином, связан с экспрессией белков, участвующих в ингибировании сигнала клеточной смерти. Однако для более детального понимания данного защитного механизма предстоит ответить еще на ряд вопросов, например, какова природа внутриклеточного рН-сенсора? Какие белки клетки участвуют в данном защитном механизме? Мы надеемся, что ответы на эти вопросы будут получены в дальнейших экспериментах.

7. Выводы

1. 24-ч инкубация клеток эпителия почек собаки (линия C7-MDCK) с кардиотоническими стероидами приводит к смерти клеток за счет взаимодействия стероидов с а-субъединицей Na,K-ATPa3bi, но независимо от ингибирования ионных потоков, осуществляемых этим ферментом.

2. 50% ингибирование Na,K-ATPa3bi наблюдается при одинаковой концентрации маринобуфагенина и уабаина (1 мкМ) в то время как индуцированная маринобуфагенином смерть клеток наблюдается при более высокой концентрации по сравнению с другими кардиотоническими стероидами (ID50 0,2 и > 10 мкМ для уабаина и маринобуфагенина соответственно).

3. Добавление к клеткам линии C7-MDCK ингибиторов сигнальных каскадов,

воздействующих на белок Ras, тирозиновые протеинкиназы, протеинкиназы Erk,

протеинкиназы С, фосфотидилинозитид-3-киназы, внутриклеточную концентрацию Са активные формы кислорода, белки цитоскелета не влияет на развитие клеточной смерти, вызванной уабаином.

4. Снижение рН цитоплазмы клеток линии C7-MDCK с 7,2 до 6,9 полностью предотвращает смерть клеток, вызванную уабаином. Защитное действие кислых рН устраняется в присутствии ингибиторов синтеза РНК и белка.

5. С использованием двумерного электрофореза установлено, что обработка клеток линии Сасо-2 уабаином, приводящая к смерти клеток по механизму, характерному для клеток линии C7-MDCK, приводит к появлению в иммунопреципитатах, осаждаемых антителами против al-субъединицы Na,K-ATPa3bi, 29 новых белков.

6. Для 18 белков, преципитирующих совместно с Ыа,К-АТРазой из лизата клеток линии Сасо-2 после обработки уабаином, проведен масс-спектрометрический анализ продуктов трипсинолиза. С большой долей вероятности 5 из этих 18 белков являются: рецептором глюкокортикоидов, фосфорилированной фосфатазой типа 2С, фосфорилированным белком 1 семейства Src, активатором 1 белка Rac-GTPa3a, белком САМТА1, содержащим анкириновые повторы. Кроме того, два белка из 18 содержат домены, присутствующие у сериновых(треониновых) протеинкиназ.

8. Список литературы

1. Батрукова М.А., Бетин В.Д., Рубцов A.M., Лопина О.Д. (2000) Анкирин: строение, свойства и функции. Биохимия, 65,469-484.

2. Батрукова М.А., Бетин В.Л., Рубцов A.M., Лопина О.Д. (2000) Анкирин: строение, свойства и функции. Биохимия, 65,469-484.

3. Владимирова Н.В., Сауткина Е.Н., Овчинникова Т.В., Патапенко Н.А. (2002) Взаимодействие тубултина и Na,K-ATPa3bi в нейронах ствола мозга. Биохимия, 67, 601-608.

4. Долгова Н.В. Кандидатская диссертация, 2005.

5. Лопина О.Д. (1998) Ка,К-зависимая аденозинтрифосфотаза: молекулярные механизмы регуляции активности. М., (докторская диссертация).

6. Лопина О.Д. (1999) Na,K-ATPa3a: структура, механизм и регуляция активности. Биол. мембраны, 16, 584-603.

7. Практикум по биохимии: учебное пособие под редакцией. Северина С.Е, Соловьевой Г.А. (1989). М., Изд. МГУ, 84.

8. Abramowitz, J., Dai, С., Hirschi, К.К., Dmitrieva, R.I., Doris, P.A., Liu, L. et al. (2003) Ouabain- and marinobufagenin-induced proliferation of human umbilical vein smooth muscle cells and a rat vascular smooth muscle cell line, A7r5. Circulation, 108, 1049-1054.

9. Aizman, O., Uhlen, P., Lai, M., Brismar, H., Aperia, A. (2001) Ouabain, a steroid hormone that signals with slow calcium oscillations. Proc Natl Acad Sci USA, 98, 13420-13424.

10. Akera, Т., Ng, Y.-C., Shien, I.-S., Bero, E., Brody, Т. M., and Braselton, W. E. (1985) Effects of K+ on the interaction between cardiac glycosides and Na,K-ATPase. Eur.J.Pharmacol 111, 147-157.

11.Albers R.W., Fahn S., Koval G.J. (1963) The role of sodium ions in the activation of Electrophorus electric organ adenosine triphosphatase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 50,474-481.

12. Anderson, R.G. (1998) The caveolae membrane system. Annu Rev Biochem, 67, 199225.

13. Andrawis, N.S. and Abernethy, D.R. (1993) Effect of calcium antogonistis on RNA synthesis of NIH 3T3 cells. Am. J. Med. Sci., 306, 137 - 40.

14. Arguello J.M., Peluffo R.D., Feng J., Lingrel J.B., Berlin J.R. (1996) Substitution of glutamic 779 with alanine in the Na,K-ATPase alpha subunit removes voltage dependence of ion transport. J. Biol. Chem., 271,24611-24616.

15. Arguello, J.M., and Lingrel, J.B. (1995) Substitutions of Serine 775 in the a subunit of the Na,K-ATPase selectively disrupt K+ high affinity activation without affecting Na+ interaction. J. Biol. Chem., 270, 22764-22771.

16.Arystarkhova E., Sweadner K. J. (1997) Tissue-specific expression of the Na,K-ATPase P-subunit. The presence of P3 in lung and liver addresses the problem of the missing subunit. J. Biol. Chem., 272, 22405-22408.

17. Arystarkhova, E., Gasparian, M., Modyanov, N.N., and Sweadner, K.J. (1992) Na,K-ATPase extracellular surface probed with a monoclonal antibody that enchances ouabain binding. J. Biol. Chem., 267, 13694-13701.

18. Arystarkhova, E., Wetzel, R.K., Asinovski, N.K., and Sweadner, K.J. (1999) The y subunit modulates Na+ and K+ affinity of renal Na,K-ATPase. J. Biol. Chem., 274, 33183-33185.

19.Askari, A. (2000) Significance of protein-protein interactions to Na+ /K+ -ATPase functions. In: Ncf-iC-ATPase and Related ATPase K. Taniguchi and S. Kaya, Eds., Excerpta Medica Internat. Congress Series 1207, Elsevier, Amsterdam.

20.Aydemir-Koksoy, A., Abramowitz, J., and Allen, J.C. (2001) Ouabain induced signaling and vascular smooth muscle cell proliferation. J. Biol. Chem. 276: 4660546611.

21.Bagrov AY, Fedorova OV, Dmitrieva RI, Howald WN, Hunter AP, Kuznetsova EA et al. (1998) Characterization of a urinary bufodielnolide Na,K-ATPase inhibitor in patients after acute myocardial infarction. Hypertension, 31, 1097-1103.

22.Bagrov, A. Y., Roukoyatkina, N. I., Dmitrieva, R. I., Pinaev, A. G., and Fedorova, O. V. (1995) Effects of two endogenous Na+,K(+)-ATPase inhibitors, marinobufagenin and ouabain, on isolated rat aorta. Eur.J.Pharmacol. 274, 151-158

23.Bagrov, A.Y., Fedorova, O.V. (1998) Effects of two putative endogenous digitalislike factors, marinobufagenin and ouabain, on the Na+,K+-pump in human mesenteric arteries. J Hypertens, 16, 1953-1958.

24.Beauge L.A., and Glynn I.M. (1979) Occlusion of K ions in the unphosphorylated sodium pump. Nature., 280, 510-2.

25.Beggah A.T., Beguin P., Jaunin P., Peitsch M.C., Geering K. (1993) Hydrophobic C-terminal amino acids in the beta-subunit are involved in assambly with the alpha-subunit of Na,K-ATPase. Biochemistry, 32, 14117-14124.

26.Beggah, A.T., Jaunin, P., and Geering, K. (1997) Role of glycosylation and disulfide bond formation in the P subunit in the folding and functional expression of Na,K-ATPase. J. Biol Chem., 272, 10318-10326.

27. Beguin P., Wang X., Firsov D., Puoti A., Clayes D., Horisberger J.D., Geering K. (1997) The gamma subunit is a specific component of Na, K-ATPase and modulates its transport function. EMBOJ., 16,4250-4260.

28. Beguin, P., Beggah, A.T., Chibalin, A.V., Burgener-Kairuz, P., Jassier, F. Methews, P.M., Rossier, B.C. Cottecchia, S., Geering, K. (1994) Phosphorylation of the Na,K-ATPase a-subunit by protein kinase A and C in vitro and in intact cells. J. Biol. Chem. 269,24437-24445.

29. Bennett MR, Evan GI, Schwartz SM. (1995) Apoptosis of rat vascular smooth muscle cells is regulated by p53-dependent and -independent pathways. Circ Res., 77, 266273.

30. Bennett MR, Macdonald K, Chan S-W, Luzio JP, Simari R, Weissberg P. (1998) Cell surface trafficking of Fas: a rapid mechanism of p53-mediated apoptosis. Science, 282,290-293.

31.Berridge, M. V. and Tan, A. S. (1993) Characterization of the cellular reduction of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT): subcellular

localization, substrate dependence, and involvement of mitochondrial electron transport in MTT reduction. Arch.Biochem.Biophys. 303,474-482.

32.Bertorello, A.M., Aperia, A., Walaas, S.I., Nairn, A.C., Greengard, P. (1991) Phosphorylation of the catalytic subunit of Na+,K(+)-ATPase inhibits the activity of the enzyme. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 11359-11362.

33. Blanco G., Koster J., Sanchez G., Mercer R.W. (1995) Kinetic properties of the a2pl and a2p2 isozymes of the Na,K-ATPase. Biochemistry, 34,319-325.

34. Blanco G., Mercer R.W. (1998) Izozymes of Na,K-ATPase: heterogeneity in structure, diversity in function. Am. J. Physiol., 275, F633-650.

35.Blaustein M.P., and Lederer W.J. (1999) Sodium/calcium exchange: its physiological implications. Physiol Rev., 79,763-854.

36.Blostein, R., Zhang, R., Gottardi, C.J., and Caplan, M.J. (1993) Functional properties of an H,K-ATPase/Na,K-ATPase chimera. J. Biol. Chem., 268, 10654-10658.

37.Bortner C.D., Cidlowski J.A. (1998) A necessary role for cell shrinkage in apoptosis. Biochem Pharmacol, 56:1549-1559.

38.Bortner CD, Cidlowski JA. (1996) Absence of volume regulatory mechanisms contributes to the rapid activation of apoptosis in thymocytes. Am J Physiol, 271, C950-C961.

39.Bourcier N., Grygorczyk R., Gekle M., Berthiaume Y., Orlov S.N. (2002) Purinergic-induced ion current in monolayers of C7-MDCK cells: role of basolateral and apical ion transporters. JMembr Biol., 186, 131-43.

40.Canessa, C.M., Horisberger, J.D., Louvard, D., and Rossier, B.C. (1992) Mutation of cysteine in the first transmembrane segment of Na,K-ATPase alpha subunit confers ouabain resistance. EMBOJ., 11, 1681-1687.

41.Cantiello HF. (1995) Actin filaments stimulate the Na+-K+-ATPase. Am J Physiol, 269, F637-F643.

42. Carini R, Autelli R, Bellomo G, Albono E. (1999) Alteration of cell volume regulation in the development of hepatocyte necrosis. Exp Cell Res, 248,280-293.

43.Cayanis E., Russo J.J., Wu Y.S., Edelman I.S. (1992) Serum independence of low K+ induction of Na,K-ATPase: possible role of c-fos. J Membr Biol., 125, 163-70.

44. Champagne, M.-J., Dumas, P., Orlov, S. N., Bennett, M. R., Hamet, P., and Tremblay, J. (1999) Protection against necrosis but not apoptosis by heat-stress proteins in vascular smooth muscle cells: evidence for distinct modes of cell death. Hypertension 33, 906-913.

45.Chibalin A.V., Ogimoto G., Pedemonte C.H., Pressley T.A., Katz A.I., feraille E., Berggren P.O., Bertorello A.M. (1999) Dopamine-induced endocytosis of Na+,K+-ATPase is initiated by phosphorylation of Ser-18 in the rat alpha subunit and Is responsible for the decreased activity in epithelial cells. J Biol Chem., 21 A, 1920-7.

46. Chibalin, A.V., Vasilets, L.A., Hennekes, H., Pralong, D., Geering, K. (1992) Phosphorylation of Na,K-ATPase a-subunits in microsomes and in homogenate of Xenopus oocytes resulting from the stimulation protein kinase A and protein kinase C. J. Biol. Chem. 267,22378-22384.

47. Chow, D.C., and Forte, J.G. (1995) Functional significance of the psubunit for heterodimeric P-type of ATPase. J. Exp. Biol., 198, 1-17.

48. Chueh, S-C., Guh, J-H., Chen, J., Lai, M-K., Teng, C-M. (2001) Dual effect of ouabain on the regulation of proliferation and apoptosis in human prostatic smooth muscle cells. J Urol, 166,47-353.

49. Cohen G.M., Sun X.M., Snowden R.T., Dinsdale D., Skilleter D.N. (1992) Key morphological features of apoptosis may occur in the absence of internucleosomal DNA fragmentation. Biochem J., 286, 331-4.

50. Contreras, R.G., Lazaro, A., Mujica, A., Gonzalez-Mariscal, L., Valdes, J., Garcia-Villegas, M.R. et al. (1995) Ouabain resistance of the epithelial cell line (Ma 104) is not due to lack of affinity of its pumps for the drug. J Membr Biol, 145,295-300.

51. Contreras, R.G., Shoshani, L., Flores-Maldonado, C., Lazaro, A., Cereijido, M. (1999) Relationship between Na+,K+-ATPase and cell attachment. J Cell Sci, 112, 4223-4232.

52. Cornelius, F., Logvinenko, N. (1996) Functional regulation of reconstituted Na,K-ATPase by protein kinase A phosphorylation. FEBS lett., 380, 277-280.

53.Cranbert G., Beguin P., Uidry M., Monnet-Tschudi F., Horisberger J.D., Garty H., Geering K. (2003) FXYD7, the first brain- and isoform-specific regulator of Na,K-

ATPase: biosynthesis and function of its posttranslational modifications. Ann N Y AcadSci., 986, 444-8.

54. Daniel, D., Susal, C., Kopp, B., Opelz, G., and Terness, P. (2003) Apoptosis-mediated selective killing of malignant cells by cardiac steroids: maintenance of cytotoxicity and loss of cardiac activity of chemically modified derivatives. Int.Immunopharmacol. 3, 1791-1801.

55.Devarajan, P., Scaramuzzino, D.A., Morrow, J.S. (1994) Ankyrin binds to two distinct cytoplasmic domains of Na,K-ATPase a subunit. Proc Natl Acad Sci USA, 91,2965-2969.

56.Dmitrieva RI, Doris PA. (2004) Ouabain is a potent promoter of growth and activator of ERK1/2 in ouabain-resistant rat renal epithelial cells. J Biol Chem, 278, 2816028166.

57.Efwndiev R., Bertorello A.M., Pressley T.A., Rousselot M., Feraille E., Pedemonte C.H. (2000) Simultaneous phosphorylation of Serll and Serl8 in the alpha-subunit promotes the recruitment of Na(+),K(+)-ATPase molecules to the plasma membrane. Biochemistry., 39, 9884-92.

58.Elsasser A., Suzuki K., Schaper J. (2000) Unresolved issues regarding the role of apoptosis in the pathogenesis of ischemic injury and heart failure. J Mol Cell Cardiol., 32, 711-24.

59. Evan GI, Zornig M (1996) Cell cycle: on target with myc. Curr Biol, 6, 1553-1556.

60. Evan GI, Zornig M (1996) Cell cycle: on target with myc. Curr Biol, 6,1553-1556.

61.Ewart H.S., and Klip A. (1995) Hormonal regulation of the Na(+)-K(+)-ATPase: mechanisms underlying rapid and sustained changes in pump activity. Am J Physiol., 269,295-311.

62.FaIciola, J., Volet, B., Anner, R.M., Moosmayer, M., Lacotte, D., Anner, B.M. (1994) Role of cell membrane Na,K-ATPase for survival of human lymphocytes in vivo. BiosciRep, 14, 189-204.

63.Fedorova, O.V., Talan, M.I., Agalkova, N.I., Lakatta, E.G., Bagrov, A.Y. (2002) Endogenous ligand of aj sodium pump, marinobufagenin, is a novel mediator of sodium chloride-dependent hypertension. Circulation, 105, 1122-1127.

64.Feng, J., and Lingrel, J.B. (1994) Analysis of amino acid residues in the H5-H6 transmembrane and extracellular domains of Na,K-ATPase alpha subunit identifies threonine 797 as a determinant of ouabain sensitivity. Biochemistry, 33,4218-4224.

65.Feng, J., Orlowski, J., Lingrel, J.B. (1993) Identification of a functional thyroid hormone response elements in upstream flanking region of the human Na,K-ATPase pl gen. Nucleic. Acids Res., 21,2619-2626.

66.Feraille E., and Doucet A. (2001) Sodium-potassium-adenosinetriphosphatase-dependent sodium transport in the kidney: hormonal control. Physiol Rev., 81, 345418.

67.Feraille E., Carranza M.L., Gonin S., Beguin P., Pedemonte C., Rousselot M., Caverzasio J., Geering K., martin P.Y., Favre H. (1999) Insulin-induced stimulation of Na+,K(+)-ATPase activity in kidney proximal tubule cells depends on phosphorylation of the alpha-subunit at Tyr-10. MolBiol Cell., 10, 2847-59.

68.Feraille E., Carranza M.L., Rousselot M., Favre H. (1997) Modulation of Na+,K(+)-ATPase activity by a tyrosine phosphorylation process in rat proximal convoluted tubule. J Physiol., 498,99-108.

69.Ferrandi, M., Salardi, S., Tripodi, G. et al. (1999) Evidence for an interaction between adducin and Na+ K+ - ATPase: Relation to genetic hypertension. Am. J. Physiol. 277: H1338-H1349.

70. Feschenko, M.S., Sweadner, K.J. (1994) Conformation-dependent phosphorylation of Na,K-ATPase by protein kinase A and protein kinase C. J. Biol.Chem., 269, 3043630444.

71.Fisone, G., Cheng, S., Nairn, A., Czernik, A., Bergman, T., Jornvall, H., Aperia, A., Greengard, P. (1994) Identification of the phosphorylation site for cAMP-dependent protein kinase on Na,K-ATPase and effects of site directed mutagenesis. J. Biol. Chem. 269,9368-9373.

72.Forbush B., Kaplan J.H., Hoffman J.F. (1978) Characterization of a new photoaffinity derivative of ouabain: labeling of the large polypeptide and of a proteolipid component of the Na,K-ATPase. Biochemistry, 17, 3667-3676.

73.Fozzard, H.A., Sheets, M.F. (1985) Cellular mechanism of action of cardiac glycosides. J Am Coll Cardiol. 5:1 OA-15 A.

74.Fukasawa K, Rulong S, Resau J, Pinta da Silva P, Woude GF (1995) Overexpression of mos oncogene product in Swiss 3T3 cells induces apoptosis preferentually during S-phase. Oncogene, 10, 1-8.

75.Fukasawa K, Rulong S, Resau J, Pinta da Silva P, Woude GF (1995) Overexpression of mos oncogene product in Swiss 3T3 cells induces apoptosis preferentually during S-phase. Oncogene, 10, 1-8.

76. Gagnon, F., Dulin, N.O., Tremblay, J., Hamet, P., Orlov, S.N. (1999) ATP-induced inhibition of Na+, K+, CI- cotransport in Madin-Darby canine kidney cells: lack of involvement of known purinoceptor-coupled signaling pathways. J Membr Biol. 167,: 193-204.

77. Geering K„ Beggah A., Good P., Girardet S., Roy S., Schaer D., Jaunin P. (1996) Oligomerization and maturation of Na,K-ATPase: functional interaction of the cytoplasmic NH2 terminus of the beta subunit with the alpha subunit. J. Cell Biol., 133, 1193-1204.

78. Gekle, M., Wunsch, S., Oberleithner, H., and Silbernagl, S. (1994) Characterization of two MDCK-cell subtypes as a model system to study principal cell and intercalated cell properties. Pfluegers Arch., 428, 157-162.

79.Giasson, E., Servant, M.J. and Meloche, S. (1997) Cyclic AMP-mediated inhibition of angiotensin II - induced protein synthesis is associated with suppression of tyrosine phosphorylation signalin in vascular smooth muscle cells. J. Biol. Chem., 272, 26879 -86.

80. Gloor S., Antonicek H., Sweadner K.J., Pagliusi S., Frank R., Moos M., Schachner M. (1990) The adhesion molecule on glia (AMOG) is a homologue of the P-subunit of the Na,K-ATPase. J. Cell. Biol., 110, 165-174.

81. Gomez-Sanchez, E.P., Gomez-Sanches, C.E., Fort, C. (1994) Immunization of Dahl SS/jr rats with an ouabain conjugate mitigates hypertension. Am J Hyper tens, 7, 591596.

82.Gorina S., Pavletich N.P. (1996) Structure of the p53 tumor suppressor bound to the ankyrin and SH3 domains of 53BP2. Science, 274, N5289, 1001-1005.

83. Goto, A., Ishiguro, T., Yamada, K., Ishii, M., Yoshioka, M., Eguchi, C. et al. (1990) Isolation of an urinary digitalis-like factor indistinguishable from digoxin. Biochem Biophys Res Commun, 173, 1093-1101.

84. Goto, A., Yamada, K. (1998) Ouabain-like factor. Curr Opin Nephrol Hypert, 7,189196.

85.Grinstein S, Rotin D, Mason MJ (1989) Na+/H+ exchange and growth factor-induced cytosolic pH changes. Role in cellular proliferation. Biochim Biophys Acta, 988, 7397.

86.Gruber, K.A., Whitaker, J.M., Buckalew, V.M. (1980) Endogenous digitalis-like substance in plasma of volume-expanded dogs. Nature, 287, 743-745.

87. Haas, M., Askari, A., and Xie, Z. (2000) Involvement of Src and epidermal growth factor receptor in the signal transducing function of Na+ /K+ -ATPase. J. Biol. Chem. 275: 27832-27837.

88. Haas, M., Wang, H., Tian, J., and Xie, Z. (2002) Src-mediated interceptor cross-talk between the Na+ -K+ -ATPase and the EGF receptor relays the signal from ouabain to mitogen-activated protein kinases. J. Biol. Chem. 277: 18694-18702.

89.Hamlyn J.M., Lu Z.R., Manunta P., Ludens J.H., Kimura K., Shah J.R., Laredo J., Hamilton J.P., Hamilton M.J. Hamilton B.P. (1998) Observations on the nature, biosynthesis, secretion and significance of endogenous ouabain. Clin Exp Hypertens., 20, 523-33.

90.Hamlyn, J.M., Ringel, R., Schueffer, J., Levinson, P.D., Hamilton, B.P., Kowarski, A.A. et al. (1982) A circulating inhibitor of (Na++K+)ATPase associated with essential hypertension. Nature, 300, 650-652.

91.Harris, C. and Fliegel, L. (1999) Amiloride and the Na(+)/H(+) exchanger protein: mechanism and significance of inhibition of the Na(+)/H(+) exchanger (review). Int.J.Mol.Med. 3,315-321.

92. Harris, R.C., Savin, V.J., Lechene, C. (1987) Rat renal proximal tubular cells (RPTC) increase net ionic content following return to isotonicity from hypotonisity. Kidney. Int. 31,435a.

93.Hartee, E. I. (1972) Determination of protein: A modification of the Lowry method that gives a linear photometric response. Anal. Biochem., 48,422-427.

94.Hasler U., Wang X., Crambert G., Beguin P., Jassier F., Horisberger J-D., Geering K. (1998) Role of f3-subunit domains in the assembly, stable expression, intracellular routing, and functional properties of Na,K-ATPase. J. Biol. Chem., 273, 3082630835.

95. Huang L., Li H., Xie Z. (1997) Ouabain-induced hypertrophy in cultured cardiac myocytes is accompanied by changes in expression of several late response genes. J Mol Cell Cardiol, 29,429-37.

96.Huang, B.S., Huang, X., Harmsen, E., Leenen, F.H. (1994) Chronic central versus peripheral ouabain, blood pressure, and sympathetic activity in rats. Hypertension, 23, 1087-1090.

97.1saev NK, Stelmashook EV, Halle A, Harms C, Lautenschlager M, Weih M et al. (2000) Inhibition of Na+,K+-ATPase activity in cultured cerebellar granule cells prevents the onset of apoptosis induced by low potassium. Neurosci Lett, 283, 41-44.

98.Isobe, I., Yanagisawa, K., Michikawa, M. (2001) 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) causes Akt phosphorylation and morphological changes in intracellular organellae in cultured rat astrocytes. J Neurochem. 77, 27480.

99. Joannidis M, Cantley LG, Spokes K, Stuart-Tilley AK, Alper SL, Epstein FH. (1997) Modulation of c-fos and egr-1 expression in the isolated perfused kidney by agents that alter tubular work. Kidney Int, 52, 130-139.

100. Joannidis M., Cantley L.G., Spokes K., Stuart-Tilley A.K., Alper S.L., Epstein F.H. (1997) Modulation of c-fos and egr-1 expression in the isolated perfused kidney by agents that alter tubular work. Kidney Int., 52,130-9.

101. Jorgensen, P.L. (1982) Mechanism of the (Na++K+)-ATPase. Protein structure and conformation of the pure (Na++K+)-ATPase. Biochim. Biophys. Acta, 694,27-68.

102. Kaul SC, Reddel RR, Mitsui Y, Wadhwa R. (2001) An N-terminal region of mot-2 binds to p53 in vitro. Neoplasia, 3, 110-114.

103. Kawamura, A., Guo, J., Itagaki, Y., Bell, C., Wang, Y., Haupert, J. et al. (1999) On the structure of endogenous ouabain. Proc Natl Acad Sci USA, 96, 6654-6659.

104. Kawazoe, N., Watabe, M., Masuda, Y., Nakajo, S., and Nakaya, K. (1999) Tiaml is involved in the regulation of bufalin-induced apoptosis in human leukemia cells. Oncogene 18,2413-2421.

105. Kerr J.K., Wyllie A.H., Currie A.R. (1972) Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer., 26, 23957.

106. Khand, F.D., Gordge, M.P., Robertson, W.G., Noronha-Dutra, A.A., and Hothersall J.S. (2002) Mitochondrial superoxide production during oxalate-mediated oxidative stress in renal epithelial cells. Free Radical Biology & Medicine, 32, 1339 -1350.

107. Kimura, K., Manunta, P., Hamilton, B.P., Hamlyn, J.M. (2000) Diferent effects of in vivo ouabain and digoxin on renal artery function and blood pressure in the rat. Hypertens Res, 23, S67-S76.

108. Kirley T.L. (1989) Determination of three disulfide bonds and one free sulfhydryl in the beta subunit of (Na,K)-ATPase. J. Biol. Chem., 264, N13, 7185-7192.

109. Kometiani, P., Li, J., Gnudi, L., Kahn, B.B., Askari, A., Xie, Z. (1998) Multiple signal transduction pathways link Na+/K+-ATPase to growth-related genes in cardiac myocytes: the roles of ras and mitogen-activated protein kinases. J Biol Chem, 273, 15249-15256.

110. Komiyama, Y., Dong, X.H., Nishimura, N., Masaki, H., Yoshika, M., Masuda, M., Takahashi, H. (2005) A novel endogenous digitalis, telocinobufagin, exhibits elevated plasma levels in patients with terminal renal failure. Cliri Biochem. 38, 3645.

111. Koob R, Kraemer D, Trippe G, Aebi U, Drenckhahn D. (1990) Association of kidney and parotid Na+,K+-ATPase with actin and analogs of spectrin and ankyrin. Eur J Cell Biol, 53, 93-100.

112. Koster, J.C., Blanco, G., Mercer, R.W. (1995) A cytoplasmic region of the Na,K-ATPase alpha-subunit is necessary for specific alpha/alpha association. J. Biol. Chem., 270,14332-14339.

113. Kraemer DM, Strizek B, Meyer HE, Marcus K, Drenckhahn D. (2003) Kidney Na+,K+-ATPase is associated with moesin. Eur J Cell Biol, 82, 87-92.

114. Kraemer, D., Koob, R., Friedrichs, B., Drenckhahn, D. (1990) Two novel peripheral membrane proteins, pasin 1 and pasin 2, associated with Na+,K+-ATPase in various cells and tissues. J Cell Biol, 111, 2375-2383.

115. Krenn L, Kopp B. (1998) Bufadienolides from animal and plant sources. Phytochemistry, 48, 1-29.

116. Kroemer G, El-Deiry WS, Golstein P, Peter ME, Vaux D, Vandenabeele P, Zhivolovsky B, Blagosklonny MV, Malorni W, Knight RA, Piacentini M, Nagata S, and Melino G. (2005) Classification of cell death: recommendations of the nomenclature committee on cell death. Cell Death and Differentiation, 12, 14631467.

117. Kurihara K., Nakanishi N., Ueha T. (2000) Regulation of Na(+)-K(+)-ATPase by cAMP-dependent protein kinase anchored on membrane via its anchoring protein. Am J Physiol Cell Physiol., 279, C1516-27.

118. Kuster B., Shainskaya A., Pu H.X., Goldshleger R., Blostein R., Mann M., Karlish S.J. (2000) A new variant of the gamma subunit of renal Na,K-ATPase. Identification by mass spectrometry, antibody binding, and expression in cultured cells. J. Biol. Chem., 275, N24, 18441-18446.

119. Kutzweiler, T.A., Arguello, J.M., and Lingrel, J.B. (1996) Asp804 and Asp808 in the transmembrane domain of the Na,K-ATPase a subunit are cation coordinating residues. J. Biol. Chem., 271, 29682-29687.

120. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227, N259, 680-685.

121. Lang F., Busch G.L., Ritter M., Volkl H. (1998) Functional significance of cell volume regulatory mechanisms. Physiol /?ev.,78(l), 247-306.

122. Lang F., Ritter M., Gamper N., Huber S., Fillon S., Tanneur V., Lepple-Wienhues A., Szabo I., and Gulbins E. (2000) Cell volume in the regulation of cell proliferation and apoptotic cell death. Cell Physiol Biochem.,lQ, 417-28.

123. Lang F., Ritter M., Woll E., Bichler I., Haussinger D., Offner F., and Grunicke H.

(1992) Altered cell volume regulation in ras oncogene expressing NIH fibroblasts. Pflugers Arch, 420,424-7.

124. Lavoie L., Levenson R., Martin-Vasallo P., Klip A. (1997) The molar ratios of a and p subunits of the Na+-K+-ATPase differ in distinct subcellular membranes from rat skeletal muscle. Biochemistry, 36, 7726-7732.

125. Ledbetter, M.L., Young, G.J., Wright, E.R. (1986) Cooperation between epithelial cells demonstrated by potassium transfer. Am J Physiol, 250, C306-C313.

126. Lee, K., Jung, J., Kim, M., Guidotti, G. (2001) Interaction of the a subunit of Na,K-ATPase with cofilin. Biochem J, 353,377-385.

127. Lemas, M.V., Hamrick, M., Takeyasu, K., Fambrough, D.M. (1994) 26 Amino acids of an extracellular domain of Na,K-ATPase a-subunit are sufficient for assembly with the Na,K-ATPase p-subunit. J. Biol. Chem., 269, 8255-8259.

128. Li K.X., and Sperelakis N. (1993) Isoproterenol- and insulin-induced hyperpolarization in rat skeletal muscle. J Cell Physiol., 157, 631-6.

129. Li, Y., Zhu, H., Kuppusamy, P., Roubaud, V., Zweier, J.L., and Trush, M.A. (1998) Validation of lucigenin (Bis-N-methylacridinium) as a chemilumigenic probe for detecting anion radical production by enzymatic and cellular systems. J. Biol. Chem., 273, 2015-2023.

130. Lichtstein, D., Gati, I., Samuelov, S., Berson, D., Rozenman, Y., Landau, L. et al.

(1993) Identification of digitalis-like compounds in human cataractous lenses. Eur J Biochem, 216, 261-268.

131. Lingrel J.B. (1992) Na,K-ATPase: isoform structure, function and expression. J. Bioenerg. Biomembr., 24, 263-270.

132. Lingrel, J.B., Croyle, M.L., Woo, A.L., Arguello, J.M. (1998) Ligand binding sites of Na,K-ATPase. Acta. Physiol. Scand. Suppl., 643, 69-77.

133. Liu J, Kesiry R, Periyasamy SM, Malhotra D, Xie Z, Shapiro JI. (2004) Ouabain-induced endocytosis of plasmalemmal Na/K-ATPase in LLC-PK1 cells by clathrin-dependent mechanism. Kidney Int, 66,227-241.

134. Liu, J., Tian, J., Haas, M., Shapiro, J.I., Askari, A., Xie, Z.(2000) Ouabain interaction with cardiac Na+/K+-ATPase initiates signal cascade independent of changes in intracellular Na+ and Ca2+ concentrations. J Biol Chem, 275,27838-27844.

135. Liu, L., Mohammadi, K., Aynafshar, B., Wang, H., Li, D., Liu, J., Ivanov, A.V., Xie, Z., Askari. A. (2003) Role of caveolae in signal-transducting function of cardiac Na+/K+-ATPase. Am J Physiol, 284, C1550-C1560.

136. Liu, P., Rudick, M., and Anderson, R.G. (2002) Multiple functions of caveolin-1. J. Biol. Chem. 277:41295-41298.

137. Liu, Y., Peterson, D.A., Kimura, H., Schubert, D. (1997) Mechanism of cellular 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) reduction. J Neurochem. 69, 581-93.

138. Lutsenko, S., Anderko, R., Kaplan, J.H. (1995) Membrane disposition of the M5-M6 hairpin of Na+,K(+)-ATPase alpha subunit is ligand dependent. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92,7936-7940.

139. Lux S.E, John K.M, Bennett V. (1990) Analysis of cDNA for human erythrocyte ankyrin indicates a repeated structure with homology to tissue-differentiation and cell-cycle control proteins. Nature, 344, N6261,36-42.

140. Mahmmoud Y.A., Vorum H., Cornelius F. (2000) Identification of a phospholemman-like protein from shark rectal glands. Evidence for indirect regulation of Na,K-ATPase by protein kinase c via a novel member of the FXYDY family. J. Biol. Chem., 275, N46, 35969-35977.

141. Maingret F, Patel AJ, Lesage F, Lazdunski M, Honoré E (1999) Mechano- and acid stimulation, two interactive modes of activation of the TREK-1 potassium channels. J Biol Chem., 274,26691-26696.

142. Majno, G., Joris, I. (1995) Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. Am J Pathol, 146, 3-15.

143. Malik N„ Canfield V.A., Beckers M-C., Gros P., Levenson R (1996) Identification of the mammalian Na,K-ATPase p3-subunit. J. Biol. Chem., 271,22754-22758.

144. Manunta, P., Barlassina, C., and Bianchi, G. (1998) Adducin in essential hypertension. FEBS Lett. 430: 41-44.

145. Martin-Vasallo P., Dackowski W., Emanuel J.R., Levenson R. (1989) Identification of putative isoform of the Na,K-ATPase P-subunit. J. Biol. Chem., 264, 4613-4618.

146. Matsui, H., and Schwartz, A. (1968) Mechanism of cardiac glycoside inhibition of the (Na+-K+)-dependent ATPase from cardiac tissue. Biochim. Biophys. Acta., 151, 655-663.

147. Maxient, J.-M., Leliévre, L., and Berrebi-Betrand, I. (1998) Mechanism underlying the strong positive inotropic effects ofLND-623: specific inhibition ofNa, K-ATPase isoforms and exclusion of cellular sites of contractile control. Cardiovasc.Drugs Ther. 12,585-594.

148. McDonough A.A. and farley R.A. (1993) Regulation of Na,K-ATPase activity. Curr Opin Nephrol Hypertens., 2, 725-34.

149. Mercer R.W. (1993) The structure of Na,K-ATPase. Int. Rev. Cytol., 13, 7C, 139168.

150. Miakawa-Naito A, Uhlén P, Lai M, Aizman O, Mikoshiba K, Brismar H et al. (2003) Cell signaling microdomain with Na,K-ATPase and inositol 1,4,5-triphosphate receptor generates calcium oscillations. J Biol Chem, 278, 50355-50361.

151. Miller R.P., Farley R.A. (1990) Beta-subunit of (Na+ + K+)-ATPase contains three disulfide bonds. Biochemistry, 29, 1524-1532.

152. Mobasheri A., Avila J., Cozar-Castellano I., Brownleader M.D., Trevan M., Francis M.J., Lamb J.F., Martin-Vasallo P. (2000) Na+, K+-ATPase isozyme diversity; comparative biochemistry and physiological implications of novel functional interactions. Biosci Rep., 20, N2, 51-91.

153. Mohammadi, K., Kometiani, P., Xie, Z., Askari, A.(2001) Role of protein kinase C in the signal pathways that link Na+/K+-ATPase to ERK1/2. J Biol Chem, 276, 42050-42056.

154. Mongin A.A., Orlov S.N. (2001) Mechanisms of cell volume regulation and possible nature of the cell volume sensor. Pathophysiology, 8(2):77-88.

155. Morrow JS, Cianci CD, Ardito T, Mann AS, Kashgarin M. (1989) Ankyrin links to the alpha subunit of Na,K-ATPase in Madin -Darby canine kidney cells and in intact renal tubule cells. J Cell Biol, 108,455-465.

156. Muller-Ehmsen J., Juwadi P., Thompson C.B., Tumyan L., Croyle M., Lingrel J.B., Schwinger R.H., McDonouogh A.A., Farley R.A. (2001) Ouabain and substrate affinities of human Na(+)-K(+)-ATPase alpha(l)beta(l), alpha(2)beta(l), and alpha(3)beta(l) when expressed separately in yeast cells. Am J Physiol Cell Physiol., 281, 1355-64.

157. Munzer, J.S., Daly, S.E. Jewell-Motz, E.A., Lingrel, J.B., and Blostein, R. (1994) Tissue- and isoform-specific kinetic behavior of the Na,K-ATPase. J. Biol. Chem., 269, 16668-16676.

158. Murtazina D.A. Petukhov S.P., Rubtsov A.M., Storey K.B., Lopina O.D. (2001) Phosphorylation of the alpha-subunit of Na,K-ATPase from duck salt glands by cAMP-dependent protein kinase inhibits the enzyme activity. Biochemistry (Mosc)., 66, 865-74.

159. Nakagawa Y, Petricoin EF, Akai H, Grimley PM, Rupp B, Larner AC.( 1992a) Interferon-alpha-induced gene expression: evidence for a selective effect on activation of the ISGF3 transcription complex. Virology, 190, 210-220.

160. Nakagawa Y, Rivera V, Larner AC. (1992b) A role for Na/K-ATPase in the control of human c-fos and c-jun transcription. J Biol Chem, 267, 8785-8788.

161. Nelson, W.J., Veshnock, P. (1987) Ankyrin binding to (Na+K)-ATPase and implications for the organization of membrane domains in polarized cells. Nature 328, 533-537.

162. Numazawa S, Inoue N, Nakuta H, Sugiyama T, Fujino E, Shinoki M et al. (1996) A cardiac steroid bufalin-induced differentiation of THP- cells. Involvement of Na+,K+-ATPase inhibition in the early changes on proto-oncogene expression. Biochem Pharmacol, 52, 321-329.

163. Orlov S.N., Akimova O.A., Hamet P. (2005). Cardiotonic steroids: novel mechanisms of Na+-mediated and -independent signaling involved in regulation of gene expression, proliferation and cell death. Current Hypertension Reviews. In press.

164. Orlov S.N., Dam T.V., Tremblay. J., Hamet. P. (1996) Apoptosis in cultured vascular smooth muscle cells. Role of cell volume decrease. Biochem Biophys Res Commun-, 221:708-715.

165. Orlov S.N., Taurin S., Thorin-Trescases N., Dulin N.O., Tremblay J., Hamet P. (2000) Inversion of the intracellular Na+/K+ ratio blocks apoptosis in vascular smooth muscle cells by induction ofRNA synthesis. Hypertension; 35:1062-1068.

166. Orlov S.N., Taurin S., Tremblay J., Hamet P. (2001) Inhibition of Na+,K+ pump affects nucleic acid synthesis and smooth muscle cell proliferation via elevation of the [Na+];/[K+]i ratio: possible implication in vascular remodeling. J Hyper tens', 19:15591565.

167. Orlov S.N., Thorin-Trescases N., Kotelevtsev S.V., Tremblay J., Hamet P. (1999) Inversion of the intracellular Na+/K+ ratio blocks apoptosis in vascular smooth muscle at a site upstream of caspase-3. J Biol Chem; 274:16545-16552.

168. Orlov, S. N., Pchejetski, D., Taurin, S., Thorin-Trescases, N., Maximov, G. V., Pshezhetsky, A. V., Rubin, A. B., and Hamet, P. (2004) Apoptosis in serum-deprived vascular smooth muscle cells: evidence for cell volume-independent mechanism. Apoptosis 9,55-66.

169. Orlov, S.N., Adarichev, V.A., Devlin, A.M., Maximova, N.V., Sun, Y.L., Tremblay, J., Dominiczak, A.F., Postnov, Y.V., and Hamet P. (2000) Increased Na+/H+ exchanger isoform 1 activity in spontaneously hypertensive rats: lack of mutations within the coding region of NHE1. Biochim. Biophys. Acta, 1500, 169 -180.

170. Orlov, S.N., Dulin, N.O., Gagnon, F., Gekle, M., Douglas, J.G., Schwartz, J.H., Hamet, P. (1999) Purinergic modulation of Na(+),K(+),C1(-) cotransport and MAP kinases is limited to Cll-MDCK cells resembling intercalated cells from collecting ducts.JMembrBiol. 172,225-34.

171. Orlov, S.N., Taurin, S., Tremblay, J., Hamet, P. (2001) Inhibition of Na+,K+ pump affects nucleic acid synthesis and smooth muscle cell proliferation via elevation of the [Na+]/[K+]i ratio: possible implication in vascular remodeling. JHypertens, 19, 15591565.

172. Orlov, S.N., Thorin-Trescases, N., Kotelevtsev, S.V., Tremblay, J., Hamet, P. (1999) Inversion of the intracellular Na+/K+ ratio blocks apoptosis in vascular smooth muscle at a site upstream of caspase-3. J Biol Chem, 274, 6545-16552.

173. Orlov, S.N., Thorin-Trescases, N., Pchejetski, D., Taurin, S., Farhat, N., Tremblay, J., Thorin, E., and Hamet, P. (2004) Na/K-pump and endothelial cell survival: [Na+]i/[K+]i-independent necrosis triggered by ouabain, and protection against apoptosis mediated by elevation of [Na+]i. PJluegers Arch., 448, 335 - 345.

174. Orlov, S.N., Tremblay, J., and Hamet, P. (1996) Bumethanide-sensitive ion fluxes in vascular smooth muscle cells: lack of functional Na+,K+,2C1- cotransport. J. Membr. Biol., 153,125 - 135.

175. Orlov, S.N., Tremblay, J., Hamet, P. (1995) Altered beta-adrenergic regulation of Na-K-Cl cotransport in cultured smooth muscle cells from the aorta of spontaneously hypertensive rats. Role of the cytoskeleton network. Am J Hypertens, 8, 739-747.

176. Otto E., Kunimoto M., McLaughlin T., Bennett V. (1991) Isolation and characterization of cDNAs encoding human brain ankyrins reveal a family of alternatively spliced genes. J. Cell. Biol., 114, N2,241-253.

177. Palasis, M., Kuntzweiler, T.A., Arguello, J.M., and Lingrel, J.B. (1996) Ouabain interactions with the H6-H6 hairpin of the Na,K-ATPase reveal a possible inhibition mechanism via the cation binding domain. J. Biol. Chem., 271, 14176-14182.

178. Pamnani, M., Huot, S., Buggy, J., Clough, D., Haddy, F. (1981) Demonstration of a humoral inhibitor of the Na+-K+ pump in some models of experimental hypertension. Hypertension, 3, 96-101.

179. Pchejetski, D., Taurin, S., der Sarkissian, S., Lopina, O.D., Pchezhetsky, A.V., Tremblay, J., DeBlois, D., Hamet, P., and Orlov, S.N. (2003) Inhibition of Na,K-ATPase by ouabain triggers epithelial cell death independently of inversion of the [Na+]i/[K+]i ratio. Biochem. Biophys. Res. Commun, 301, 735 - 744.

180. Pedemonte C.H., Pressley T.A., Lokhandwala M.F., Cinelli A.R. (1997) Regulation of Na,K-ATPase transport activity by protein kinase C. J Membr Biol., 155, 219-27.

181. Pedersen, P.A., Nielsen, J.M., Rasmussen, J.H., and Jorgensen, P.L. (1998) Contribution to Ti+, K+, and Na+ binding of Asn776, Ser775, Thr774, Thr772, and

Thr771 in cytoplasmic part of fifth transmembrane segment in alpha-subunit of renal Na,K-ATPase. Biochemestry, 37, 17818-17827.

182. Peng L., Martin-Vasallo P., Sweadner K.J. (1997) Isoforms of Na,.K-ATPAse a and P subunits in the rat cerebellum and in granule cell cultures. J. Membr. Biol., 155, 219-227.

183. Peng, M., Huang, L., Xie, Z., Huang, W-H., Askari, A.(1996) Partial inhibition of Na+/K+-ATPase by ouabain induces the Ca2+-dependent expression of early-response genes in cardiac myocytes. J Biol Chem, 271, 10372-10378.

184. Pontiggia L., Winterhalter K., Gloor S.M. (1998) Inhibition of Na,K-ATPase activity by cGMP is isoform-specific in brain endothelial cells. FEBS Lett., 436, 46670.

185. Post R.L., Sen A.K., Rosenthal A.S. (1965) A phosphorylated intermediate in adenosine triphosphate dependent sodium and potassium transport across kidney membranes. J. Biol. Chem., 240, 1437-1445.

186. Post, R.L., Hegyvary, C., and Kume, S. (1972) Activation by adenosine triphosphate in the phosphorylation kinetics of sodium and potassium ion transport adenosine triphosphatase. J. Biol. Chem., 247, 6530-6540.

187. Price, E.M., and Lingrel, J.B. (1988) Structure-function relationships in the Na,K-ATPase alpha-subunit: site-directed mutagenesis of glutamine-111 to arginine and asparagine-122 to aspartic acid generates a ouabain-resistence enzyme. Biochemistry, 27, 8400-8408.

188. Price, E.M., Rice, D.A., and Lingrel, J.B. (1989) Site-directed mutagenesis of a conserved, extracellular aspartic acid residue affects the ouabain sensitivity of sheep Na,K-ATPase. J. Biol. Chem., 264,21902-21906.

189. Qiu, L.Y., Koenderink, J.B., Swarts, H.G.P., Willems, P.H.G.M., Pont, J.J.H.H.M. (2003) Phe783, Thr797, and Asp804 in transmembrane hairpin M5-M6 of Na,K-ATPase play a key role in ouabain binding. J. Biol. Chem., 278,47240-47244.

190. Rajan S, Wischmeter E, Liu GX, Preisig-Muller R, Daut J, Karschin A, Derst C (2000) TASK-3, a novel tandem pore domain acid-sensitive K+ channel. An extracellular histidine as pH sensor. J Biol Chem, 275, 16650-16657.

191. Rajasekaran, S.A., Gopal, J., Wills, D., Espineda, C., Twiss, J.K., Rajasekaran, A.K. (2004) Na,K-ATPase betal-subunit increases the translation efficiency of the alpha 1-subunit in MSV-MDCK cells. Mol Biol Cell., 15(7), 3224-32.

192. Raymond, M.-A., Mollica, L., Vigneault, N., Désormeaux, A., Chan, J. S. D., Filep, J. G., and Hébert, M.-J. (2003) Blockade of the apoptotic machinery by cyclosporin A redirects cell death toward necrosis in arterial endothelial cells: regulation by reactive oxygen species and cathepsin D. FASEB J. 17, 515-517.

193. Razani, B., Woodman, S.E. and Lisanti, M.P. (2002) Caveolae: From cell biology to animal physiology. Pharmacol. Rev. 54: 431-467.

194. Reichert M, Steinbach JP, Supra P, Weller M (2002) Modulation of growth and radiochemosensitivity of human malignant glioma cells by acidosis. Cancer, 95, 1113-1119.

195. Renner, E.L., Lake, J.R., Pérsico, M., Scharschmidt, B.F. (1989) Na+-H+ exchange activity in rat hepatocytes: role in regulation of intracellular pH. Am J Physiol. 256, G44-52.

196. Reshkin SJ, Bellizzi A, Caldeira S, Albarini V, Malanchi I, Poignee M, Alluni-Fabbroni M, Casavola V, Tommasino M (2000) Na exchanger-dependent intracellular alkalinization is an early event in malignant transformation and plays an essential role in the development of subsequent transformation-associated phenotypes. FASEB J, 14,2185-2197.

197. Sarvazyan, N.A., Modynov, N. N., Askari, A. (1995) Intersubunit and intrasubunit contact regions of Na+/K+-ATPase revealed by controlled proteolysis and chemical cross-linking. J. Biol. Chem. 270,26528-26532.

198. Saunders, R., Scheiner-Bobis, G. (2004) Ouabain stimulates endothelin release and expression in human endothelial cells without inhibiting the sodium pump. Eur J Biochem, 111, 1054-1062.

199. Schatzmann HJ. (1953) Herzglykoside ais Hennstoffe fur den aktiven Kalium- und Natriumtransport durch die erythrocytenmembran. Helv Physiol Pharmacol Acta, 11, 346-354.

200. Schneider, R., Wray, V., Nimtz, M., Lehmann, W-D., Kirch, U., Antoloic, R. et al. (1998) Bovine adrenals contain, in addition to ouabain, a second inhibitor of the sodium pump. J Biol Chem, 273,784-792.

201. Schoner, W. (2002) Endogenous cardiac glycosides, a new class of steroid hormones. Eur JBiochem, 269, 2440-2448.

202. Schultheis, P.J., and Lingrel, J.B. (1993) Substitution of transmembrane residues with hydrogen-bonding potential in the alpha subunit of Na,K-ATPase reveals alteration in ouabain sensitivity. Biochemistry, 32, 544-550.

203. Schultheis, P.J., Wallick, E.T., and Lingrell, J.B. (1993) Kinetic analysis of ouabain binding to native and mutated forms of Na,K-ATPase and identification of a new region involved in cardiac glycoside interactions. J. Biol. Chem., 268, 2268622694.

204. Schwartz, A. (1976) Is the cell membrane Na+, K+ -ATPase enzyme system the pharmacological receptor for digitalis? Circ Res., 39:1-7.

205. Shamraj, O.I., and Lingrel, J.B. (1994) A putative fourth Na,K-ATPase a subunit gene is expressed in testis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 12952-12956. r

206. Shan X., Luo H., Chen H., Daloze P., St-Louis G., Wu J. (1993) The effect of rapamycin on c-jun expression in human lymphocytes. Clin Immunol Immunopathoi, 69,314-7.

207. Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O. and Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal. Chem., 68, 850-858, 1996.

208. Shull G.E., Greeb J., Lingrel J.B. (1986) Molecular cloning of three distinct forms of the (Na+K)-ATPase a-subunit from rat brain. Biochemistry, 25, 8125-8132.

209. Shull G.E., Schwarts A., Lingrel J.B. (1985) Amino-acid sequence of the catalytic subunit of the (Na++K+)ATPase deduced from a complementary DNA. Nature, 316, 691-695.

210. Skou J. C (1957) The influence of some cations on an adenosine triphosphatase from priferal nerves. Biochim. Biophys. Acta, 23, 394-401.

211. Skou J.C., and Esmann M. (1992) The Na,K-ATPase. J Bioenerg Biomembr., 24, 249-61.

212. Skou JC. (1960) Further investigation on a Mg 2+ + Na+-activated adenosinetriphosphatase possibly related to the active transport of Na+ and K+ across the nerve cell membrane. Biochim Biophys Acta, 42, 6-23.

213. Stewart D.J., and Sen A.K. (1981) Role of cyclic GMP in cholinergic activation of Na-K pump in duck salt gland. Am J Physiol., 240, 207-14.

214. Sun X.M., MacFarlane M., Zhuang J,m Wolf B.B., Green D.R., Cohen G.M. (1999) Distinct caspase cascades are initiated in receptor-mediated and chemical-induced apoptosis. J Biol Chem., 274, 5053-60.

215. Sweadner K.J., Real E. (2000) The FXYD gene family of small ion transport regulators or channels: cDNA sequence, protein signature sequence, and expression. Genomics., 68, 41-56.

216. Szent-Gyorgyi A. (1953) Chemical physiology of contraction in body and heart. New York, Academic Press. 86-91

217. Taurin S, Dulin NO, Pchejetski D, Grygorczyk R, Tremblay J, Hamet P et al. (2002) c-Fos expression in ouabain-treated vascular smooth muscle cells from rat aorta: evidence for an intracellular-sodium-mediated, calcium-independent mechanism. J Physiol, 543, 835-847.

218. Taurin S, Hamet P, Orlov SN. (2003) Na/K pump and intracellular monovalent cations: novel mechanism of excitation-transcription coupling involved in inhibition of apoptosis. Mo I Biol, 37, 371-381.

219. Taurin, S., Seyrantepe, V., Orlov, S.N., Tremblay, T.L., Thibault, P., Bennett, M.R., Hamet, P., Pshezhetsky, A.V. (2002) Proteome analysis and functional expression identify mortalin as an antiapoptotic gene induced by elevation of [Na+]i/[K+]i ratio in cultured vascular smooth muscle cells. Circ Res., 91, 915-22.

220. Therien A.G., and Blostein R. (2000) Mexanisms of sodium pump regulation. Am J Physiol Cell Physiol., 279, C541-66.

221. Thevananther S., Kolli A.H., Devarajan P. (1998) Identification of a novel ankyrin isoform (AnkG190) in kidney and lung that associates with the plasma membrane and binds alpha-Na, K-ATPase J. Biol. Chem., 273, 23952-23958.

222. Thomas, J.A., Buchsbaum, R.N., Zimniak, A., Racker, E. (1979) Intracellular pH measurements in Ehrlich ascites tumor cells utilizing spectroscopic probes generated in situ. Biochemistry, 18, 2210-8.

223. Thomas, S.M. and Brugge, J.S. (1997) Cellular functions regulated by Src family kinases. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 13: 513-609.

224. Trevisi L, Visentin B, Cusinato F, Pighin I, Luciani S. (2004) Antiapoptotic effect of ouabain on human umbilical endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun, 321, 716-721.

225. Vachon, P.H., Beaulieu, J.F. (1992) Transient mosaic patterns of morphological and functional differentiation in the Caco-2 cell line. Gastroenterology. 103, 414-23.

226. Valente, R.C., Capella, L.S., Monteiro, R.Q., Rumjanek, V.M., Lopes, A.G., Capella, M.A. (2003) Mechanisms of ouabain toxicity. FASEB J., 17, 1700-2.

227. Wadhwa R, Yaguchi T, Hasan MK, Mitsui Y, Reddel RR, Kaul SC. (2002) Hsp70 family member, mot-2/mthsp7-/GSP75, binds to the cytoplasmic sequestration domain of the p53 protein. Exp Cell Res, 274, 246-253.

228. Wallick, E. T. and Schwartz, A. (1988) Interaction of cardiac glycosides with Na+,K+-ATPase. Methods Enzymol. 156,201-213.

229. Wang S.G., and Farley R.A. (1998) Valine 904, tyrosine 898, and cysteine 908 in Na,K-ATPase alpha subunits are important for assembly with beta subunits. J Biol Chem., 273, 29400-5.

230. Wang, H., Haas, M., Liang, M., Cai, T., Tian, J., Li, S., Xie, Z. (2004) Ouabain assembles signaling cascade through the caveolar Na+,K+-ATPase. J Biol Chem, 279, 17250-17259.

231. Wood EH, Moe GK. (1938) Studies on the effect of digitalis glycosides on potassium ion loss from the heart of the heart lung preparation. Am J Physiol, 123, 219-220.

232. Xie Z, Askari A. (2002) Na+/K+-ATPase as a signal transducer. Eur J Biochem, 269,2434-2439.

233. Xie, Z., Cai, T. (2003) Na+-K+-ATPase-mediated signal transduction: from protein interaction to cellular function. Mol Intervent, 3, 157-168.

234. Xie, Z., Kometiani, P., Liu, J., Li, J., Shapiro, J.I., Askari, A. (1999) Intracellular reactive oxygen species mediate the linkage of Na+/K+-ATPase to hypertrophy and its marker genes in cardiac myocytes. J Biol Chem., 274, 19323-8.

235. Xiong Z-G, Zhu X-M, Chu X-P, Minami M, Hey J, Wei W-L, MacDonald JF, Wemmie JA, Price MP, Welsh MJ, Simon RP (2004) Neuroprotection in ishemia: blocking calcium-permeable acid-sensitive ion channels. Cell, 118,687-698.

236. Xu, W., Harrison, S.C., and Eck, M.J. (1997) Three-dimensional structure of the tyrosine kinase c-Src. Nature 385: 595-602.

237. Young, M.A., Gonfloni, S., Superti-Furga, G., Roux, B., and Kuriyan, J. (2001) Dynamic coupling between the SH2 and SH3 domains of c-Src and Hck underlies their inactivation by C-terminal tyrosine phosphorylation. Cell 105: 115-126.

238. Yudowski G.A., Efendiev R., Pedemonte R., Katz A.I., Berggren P.O., Bertorello A.M. (2000) Phosphoinositide-3 kinase binds to a proline-rich motif in the Na+, K+-ATPase alpha subunit and regulates its trafficking. Proc Natl Acad Sci USA., 97, 6556-61.

239. Zhang, Z., Devarajan, P., Dorfman, A.L., Morrow, J.S. (1998) Structure of the ankyrin-binding domain of a-Na-K-ATPase. J Biol Chem, 273, 18681-18684.

240. Zhou X, Jiang G, Zhao A, Bondeva T, Hirzel P, Balla T. (2001) Inhibition of Na,K-ATPase activates PI3 kinase and inhibits apoptosis in LLC-PK1 cells. Biochem Biophys Res Commun, 285, 46-51.

В заключении я хотела бы искренне поблагодарить своих научных руководителей Сергея Николаевича Орлова и Ольгу Дмитриевну Лопину за возможность работать в их лабораториях, за неоценимую помощь в работе, за приобретенные знания, которым я научилась за время совместной работы, и теплое отношение ко мне.

Я благодарна Натальи Владимировне Мает, Натальи Валерьевне Долговой и Себастьяну Торан за те ценные советы и помощь в обсуждении полученных результатов.

Я также хотела бы поблагодарить своих родителей, которые поддерживали меня все это время, и без помощи которых данная работа не была бы завершена.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Акимова, Ольга Алексеевна, Москва

1. Снижение рН цитоплазмы клеток линии C7-MDCK с 7,2 до 6,9 полностью предотвращает смерть клеток, вызванную уабаином. Защитное действие кислых рН устраняется в присутствии ингибиторов синтеза РНК и белка.

2. Батрукова М.А., Бетин В.Д., Рубцов A.M., Лопина О.Д. (2000) Анкирин: строение, свойства и функции. Биохимия, 65,469-484.

3. Батрукова М.А., Бетин В.Л., Рубцов A.M., Лопина О.Д. (2000) Анкирин: строение, свойства и функции. Биохимия, 65,469-484.

4. Владимирова Н.В., Сауткина Е.Н., Овчинникова Т.В., Патапенко Н.А. (2002) Взаимодействие тубултина и Na,K-ATPa3bi в нейронах ствола мозга. Биохимия, 67, 601-608.

5. Долгова Н.В. Кандидатская диссертация, 2005.

6. Лопина О.Д. (1998) Ка,К-зависимая аденозинтрифосфотаза: молекулярные механизмы регуляции активности. М., (докторская диссертация).

7. Лопина О.Д. (1999) Na,K-ATPa3a: структура, механизм и регуляция активности. Биол. мембраны, 16, 584-603.

8. Практикум по биохимии: учебное пособие под редакцией. Северина С.Е, Соловьевой Г.А. (1989). М., Изд. МГУ, 84.

9. Aizman, O., Uhlen, P., Lai, M., Brismar, H., Aperia, A. (2001) Ouabain, a steroid hormone that signals with slow calcium oscillations. Proc Natl Acad Sci USA, 98, 13420-13424.

10. Akera, Т., Ng, Y.-C., Shien, I.-S., Bero, E., Brody, Т. M., and Braselton, W. E. (1985) Effects of K+ on the interaction between cardiac glycosides and Na,K-ATPase. Eur.J.Pharmacol 111, 147-157.

11. Albers R.W., Fahn S., Koval G.J. (1963) The role of sodium ions in the activation of Electrophorus electric organ adenosine triphosphatase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 50,474-481.

12. Anderson, R.G. (1998) The caveolae membrane system. Annu Rev Biochem, 67, 199225.

13. Andrawis, N.S. and Abernethy, D.R. (1993) Effect of calcium antogonistis on RNA synthesis of NIH 3T3 cells. Am. J. Med. Sci., 306, 137 40.

14. Arguello J.M., Peluffo R.D., Feng J., Lingrel J.B., Berlin J.R. (1996) Substitution of glutamic 779 with alanine in the Na,K-ATPase alpha subunit removes voltage dependence of ion transport. J. Biol. Chem., 271,24611-24616.

15. Arguello, J.M., and Lingrel, J.B. (1995) Substitutions of Serine 775 in the a subunit of the Na,K-ATPase selectively disrupt K+ high affinity activation without affecting Na+ interaction. J. Biol. Chem., 270, 22764-22771.

16. Arystarkhova E., Sweadner K. J. (1997) Tissue-specific expression of the Na,K-ATPase P-subunit. The presence of P3 in lung and liver addresses the problem of the missing subunit. J. Biol. Chem., 272, 22405-22408.

17. Arystarkhova, E., Gasparian, M., Modyanov, N.N., and Sweadner, K.J. (1992) Na,K-ATPase extracellular surface probed with a monoclonal antibody that enchances ouabain binding. J. Biol. Chem., 267, 13694-13701.

18. Arystarkhova, E., Wetzel, R.K., Asinovski, N.K., and Sweadner, K.J. (1999) The y subunit modulates Na+ and K+ affinity of renal Na,K-ATPase. J. Biol. Chem., 274, 33183-33185.

19. Askari, A. (2000) Significance of protein-protein interactions to Na+ /K+ -ATPase functions. In: Ncf-iC-ATPase and Related ATPase , K. Taniguchi and S. Kaya, Eds., Excerpta Medica Internat. Congress Series 1207, Elsevier, Amsterdam.

20. Aydemir-Koksoy, A., Abramowitz, J., and Allen, J.C. (2001) Ouabain induced signaling and vascular smooth muscle cell proliferation. J. Biol. Chem. 276: 4660546611.

21. Bagrov AY, Fedorova OV, Dmitrieva RI, Howald WN, Hunter AP, Kuznetsova EA et al. (1998) Characterization of a urinary bufodielnolide Na,K-ATPase inhibitor in patients after acute myocardial infarction. Hypertension, 31, 1097-1103.

22. Bagrov, A. Y., Roukoyatkina, N. I., Dmitrieva, R. I., Pinaev, A. G., and Fedorova, O. V. (1995) Effects of two endogenous Na+,K(+)-ATPase inhibitors, marinobufagenin and ouabain, on isolated rat aorta. Eur.J.Pharmacol. 274, 151-158

23. Bagrov, A.Y., Fedorova, O.V. (1998) Effects of two putative endogenous digitalislike factors, marinobufagenin and ouabain, on the Na+,K+-pump in human mesenteric arteries. J Hypertens, 16, 1953-1958.

24. Beauge L.A., and Glynn I.M. (1979) Occlusion of K ions in the unphosphorylated sodium pump. Nature., 280, 510-2.

25. Beggah A.T., Beguin P., Jaunin P., Peitsch M.C., Geering K. (1993) Hydrophobic C-terminal amino acids in the beta-subunit are involved in assambly with the alpha-subunit of Na,K-ATPase. Biochemistry, 32, 14117-14124.

26. Beggah, A.T., Jaunin, P., and Geering, K. (1997) Role of glycosylation and disulfide bond formation in the P subunit in the folding and functional expression of Na,K-ATPase. J. Biol Chem., 272, 10318-10326.

27. Beguin P., Wang X., Firsov D., Puoti A., Clayes D., Horisberger J.D., Geering K. (1997) The gamma subunit is a specific component of Na, K-ATPase and modulates its transport function. EMBOJ., 16,4250-4260.

28. Bennett MR, Evan GI, Schwartz SM. (1995) Apoptosis of rat vascular smooth muscle cells is regulated by p53-dependent and -independent pathways. Circ Res., 77, 266273.

29. Bennett MR, Macdonald K, Chan S-W, Luzio JP, Simari R, Weissberg P. (1998) Cell surface trafficking of Fas: a rapid mechanism of p53-mediated apoptosis. Science, 282,290-293.

30. Bertorello, A.M., Aperia, A., Walaas, S.I., Nairn, A.C., Greengard, P. (1991) Phosphorylation of the catalytic subunit of Na+,K(+)-ATPase inhibits the activity of the enzyme. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 11359-11362.

31. Blanco G., Koster J., Sanchez G., Mercer R.W. (1995) Kinetic properties of the a2pl and a2p2 isozymes of the Na,K-ATPase. Biochemistry, 34,319-325.

32. Blanco G., Mercer R.W. (1998) Izozymes of Na,K-ATPase: heterogeneity in structure, diversity in function. Am. J. Physiol., 275, F633-650.

33. Blaustein M.P., and Lederer W.J. (1999) Sodium/calcium exchange: its physiological implications. Physiol Rev., 79,763-854.

34. Blostein, R., Zhang, R., Gottardi, C.J., and Caplan, M.J. (1993) Functional properties of an H,K-ATPase/Na,K-ATPase chimera. J. Biol. Chem., 268, 10654-10658.

35. Bortner C.D., Cidlowski J.A. (1998) A necessary role for cell shrinkage in apoptosis. Biochem Pharmacol, 56:1549-1559.

36. Bortner CD, Cidlowski JA. (1996) Absence of volume regulatory mechanisms contributes to the rapid activation of apoptosis in thymocytes. Am J Physiol, 271, C950-C961.

37. Bourcier N., Grygorczyk R., Gekle M., Berthiaume Y., Orlov S.N. (2002) Purinergic-induced ion current in monolayers of C7-MDCK cells: role of basolateral and apical ion transporters. JMembr Biol., 186, 131-43.

38. Canessa, C.M., Horisberger, J.D., Louvard, D., and Rossier, B.C. (1992) Mutation of cysteine in the first transmembrane segment of Na,K-ATPase alpha subunit confers ouabain resistance. EMBOJ., 11, 1681-1687.

39. Cantiello HF. (1995) Actin filaments stimulate the Na+-K+-ATPase. Am J Physiol, 269, F637-F643.

40. Carini R, Autelli R, Bellomo G, Albono E. (1999) Alteration of cell volume regulation in the development of hepatocyte necrosis. Exp Cell Res, 248,280-293.

41. Cayanis E., Russo J.J., Wu Y.S., Edelman I.S. (1992) Serum independence of low K+ induction of Na,K-ATPase: possible role of c-fos. J Membr Biol., 125, 163-70.

42. Chow, D.C., and Forte, J.G. (1995) Functional significance of the psubunit for heterodimeric P-type of ATPase. J. Exp. Biol., 198, 1-17.

43. Chueh, S-C., Guh, J-H., Chen, J., Lai, M-K., Teng, C-M. (2001) Dual effect of ouabain on the regulation of proliferation and apoptosis in human prostatic smooth muscle cells. J Urol, 166,47-353.

44. Cohen G.M., Sun X.M., Snowden R.T., Dinsdale D., Skilleter D.N. (1992) Key morphological features of apoptosis may occur in the absence of internucleosomal DNA fragmentation. Biochem J., 286, 331-4.

45. Contreras, R.G., Lazaro, A., Mujica, A., Gonzalez-Mariscal, L., Valdes, J., Garcia-Villegas, M.R. et al. (1995) Ouabain resistance of the epithelial cell line (Ma 104) is not due to lack of affinity of its pumps for the drug. J Membr Biol, 145,295-300.

46. Contreras, R.G., Shoshani, L., Flores-Maldonado, C., Lazaro, A., Cereijido, M. (1999) Relationship between Na+,K+-ATPase and cell attachment. J Cell Sci, 112, 4223-4232.

47. Cornelius, F., Logvinenko, N. (1996) Functional regulation of reconstituted Na,K-ATPase by protein kinase A phosphorylation. FEBS lett., 380, 277-280.

48. Devarajan, P., Scaramuzzino, D.A., Morrow, J.S. (1994) Ankyrin binds to two distinct cytoplasmic domains of Na,K-ATPase a subunit. Proc Natl Acad Sci USA, 91,2965-2969.

49. Dmitrieva RI, Doris PA. (2004) Ouabain is a potent promoter of growth and activator of ERK1/2 in ouabain-resistant rat renal epithelial cells. J Biol Chem, 278, 2816028166.

50. Elsasser A., Suzuki K., Schaper J. (2000) Unresolved issues regarding the role of apoptosis in the pathogenesis of ischemic injury and heart failure. J Mol Cell Cardiol., 32, 711-24.

51. Evan GI, Zornig M (1996) Cell cycle: on target with myc. Curr Biol, 6, 1553-1556.

52. Evan GI, Zornig M (1996) Cell cycle: on target with myc. Curr Biol, 6,1553-1556.

53. Ewart H.S., and Klip A. (1995) Hormonal regulation of the Na(+)-K(+)-ATPase: mechanisms underlying rapid and sustained changes in pump activity. Am J Physiol., 269,295-311.

54. FaIciola, J., Volet, B., Anner, R.M., Moosmayer, M., Lacotte, D., Anner, B.M. (1994) Role of cell membrane Na,K-ATPase for survival of human lymphocytes in vivo. BiosciRep, 14, 189-204.

55. Fedorova, O.V., Talan, M.I., Agalkova, N.I., Lakatta, E.G., Bagrov, A.Y. (2002) Endogenous ligand of aj sodium pump, marinobufagenin, is a novel mediator of sodium chloride-dependent hypertension. Circulation, 105, 1122-1127.

56. Feng, J., and Lingrel, J.B. (1994) Analysis of amino acid residues in the H5-H6 transmembrane and extracellular domains of Na,K-ATPase alpha subunit identifies threonine 797 as a determinant of ouabain sensitivity. Biochemistry, 33,4218-4224.

57. Feng, J., Orlowski, J., Lingrel, J.B. (1993) Identification of a functional thyroid hormone response elements in upstream flanking region of the human Na,K-ATPase pl gen. Nucleic. Acids Res., 21,2619-2626.

58. Feraille E., and Doucet A. (2001) Sodium-potassium-adenosinetriphosphatase-dependent sodium transport in the kidney: hormonal control. Physiol Rev., 81, 345418.

59. Feraille E., Carranza M.L., Rousselot M., Favre H. (1997) Modulation of Na+,K(+)-ATPase activity by a tyrosine phosphorylation process in rat proximal convoluted tubule. J Physiol., 498,99-108.

60. Ferrandi, M., Salardi, S., Tripodi, G. et al. (1999) Evidence for an interaction between adducin and Na+ ,K+ ATPase: Relation to genetic hypertension. Am. J. Physiol. 277: H1338-H1349.

61. Feschenko, M.S., Sweadner, K.J. (1994) Conformation-dependent phosphorylation of Na,K-ATPase by protein kinase A and protein kinase C. J. Biol.Chem., 269, 3043630444.

62. Forbush B., Kaplan J.H., Hoffman J.F. (1978) Characterization of a new photoaffinity derivative of ouabain: labeling of the large polypeptide and of a proteolipid component of the Na,K-ATPase. Biochemistry, 17, 3667-3676.

63. Fozzard, H.A., Sheets, M.F. (1985) Cellular mechanism of action of cardiac glycosides. J Am Coll Cardiol. 5:1 OA-15 A.

64. Fukasawa K, Rulong S, Resau J, Pinta da Silva P, Woude GF (1995) Overexpression of mos oncogene product in Swiss 3T3 cells induces apoptosis preferentually during S-phase. Oncogene, 10, 1-8.

65. Fukasawa K, Rulong S, Resau J, Pinta da Silva P, Woude GF (1995) Overexpression of mos oncogene product in Swiss 3T3 cells induces apoptosis preferentually during S-phase. Oncogene, 10, 1-8.

66. Gekle, M., Wunsch, S., Oberleithner, H., and Silbernagl, S. (1994) Characterization of two MDCK-cell subtypes as a model system to study principal cell and intercalated cell properties. Pfluegers Arch., 428, 157-162.

67. Gloor S., Antonicek H., Sweadner K.J., Pagliusi S., Frank R., Moos M., Schachner M. (1990) The adhesion molecule on glia (AMOG) is a homologue of the P-subunit of the Na,K-ATPase. J. Cell. Biol., 110, 165-174.

68. Gomez-Sanchez, E.P., Gomez-Sanches, C.E., Fort, C. (1994) Immunization of Dahl SS/jr rats with an ouabain conjugate mitigates hypertension. Am J Hyper tens, 7, 591596.

69. Gorina S., Pavletich N.P. (1996) Structure of the p53 tumor suppressor bound to the ankyrin and SH3 domains of 53BP2. Science, 274, N5289, 1001-1005.

70. Goto, A., Ishiguro, T., Yamada, K., Ishii, M., Yoshioka, M., Eguchi, C. et al. (1990) Isolation of an urinary digitalis-like factor indistinguishable from digoxin. Biochem Biophys Res Commun, 173, 1093-1101.

71. Goto, A., Yamada, K. (1998) Ouabain-like factor. Curr Opin Nephrol Hypert, 7,189196.

72. Grinstein S, Rotin D, Mason MJ (1989) Na+/H+ exchange and growth factor-induced cytosolic pH changes. Role in cellular proliferation. Biochim Biophys Acta, 988, 7397.

73. Gruber, K.A., Whitaker, J.M., Buckalew, V.M. (1980) Endogenous digitalis-like substance in plasma of volume-expanded dogs. Nature, 287, 743-745.

74. Haas, M., Askari, A., and Xie, Z. (2000) Involvement of Src and epidermal growth factor receptor in the signal transducing function of Na+ /K+ -ATPase. J. Biol. Chem. 275: 27832-27837.

75. Haas, M., Wang, H., Tian, J., and Xie, Z. (2002) Src-mediated interceptor cross-talk between the Na+ -K+ -ATPase and the EGF receptor relays the signal from ouabain to mitogen-activated protein kinases. J. Biol. Chem. 277: 18694-18702.

76. Hamlyn, J.M., Ringel, R., Schueffer, J., Levinson, P.D., Hamilton, B.P., Kowarski, A.A. et al. (1982) A circulating inhibitor of (Na++K+)ATPase associated with essential hypertension. Nature, 300, 650-652.

77. Harris, C. and Fliegel, L. (1999) Amiloride and the Na(+)/H(+) exchanger protein: mechanism and significance of inhibition of the Na(+)/H(+) exchanger (review). Int.J.Mol.Med. 3,315-321.

78. Harris, R.C., Savin, V.J., Lechene, C. (1987) Rat renal proximal tubular cells (RPTC) increase net ionic content following return to isotonicity from hypotonisity. Kidney. Int. 31,435a.

79. Hartee, E. I. (1972) Determination of protein: A modification of the Lowry method that gives a linear photometric response. Anal. Biochem., 48,422-427.

80. Hasler U., Wang X., Crambert G., Beguin P., Jassier F., Horisberger J-D., Geering K. (1998) Role of f3-subunit domains in the assembly, stable expression, intracellular routing, and functional properties of Na,K-ATPase. J. Biol. Chem., 273, 3082630835.

81. Huang L., Li H., Xie Z. (1997) Ouabain-induced hypertrophy in cultured cardiac myocytes is accompanied by changes in expression of several late response genes. J Mol Cell Cardiol, 29,429-37.

82. Isobe, I., Yanagisawa, K., Michikawa, M. (2001) 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) causes Akt phosphorylation and morphological changes in intracellular organellae in cultured rat astrocytes. J Neurochem. 77, 27480.

83. Joannidis M, Cantley LG, Spokes K, Stuart-Tilley AK, Alper SL, Epstein FH. (1997) Modulation of c-fos and egr-1 expression in the isolated perfused kidney by agents that alter tubular work. Kidney Int, 52, 130-139.

84. Joannidis M., Cantley L.G., Spokes K., Stuart-Tilley A.K., Alper S.L., Epstein F.H. (1997) Modulation of c-fos and egr-1 expression in the isolated perfused kidney by agents that alter tubular work. Kidney Int., 52,130-9.

85. Jorgensen, P.L. (1982) Mechanism of the (Na++K+)-ATPase. Protein structure and conformation of the pure (Na++K+)-ATPase. Biochim. Biophys. Acta, 694,27-68.

86. Kaul SC, Reddel RR, Mitsui Y, Wadhwa R. (2001) An N-terminal region of mot-2 binds to p53 in vitro. Neoplasia, 3, 110-114.

87. Kawamura, A., Guo, J., Itagaki, Y., Bell, C., Wang, Y., Haupert, J. et al. (1999) On the structure of endogenous ouabain. Proc Natl Acad Sci USA, 96, 6654-6659.

88. Kawazoe, N., Watabe, M., Masuda, Y., Nakajo, S., and Nakaya, K. (1999) Tiaml is involved in the regulation of bufalin-induced apoptosis in human leukemia cells. Oncogene 18,2413-2421.

89. Kerr J.K., Wyllie A.H., Currie A.R. (1972) Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer., 26, 23957.

90. Khand, F.D., Gordge, M.P., Robertson, W.G., Noronha-Dutra, A.A., and Hothersall J.S. (2002) Mitochondrial superoxide production during oxalate-mediated oxidative stress in renal epithelial cells. Free Radical Biology & Medicine, 32, 1339 -1350.

91. Kimura, K., Manunta, P., Hamilton, B.P., Hamlyn, J.M. (2000) Diferent effects of in vivo ouabain and digoxin on renal artery function and blood pressure in the rat. Hypertens Res, 23, S67-S76.

92. Kirley T.L. (1989) Determination of three disulfide bonds and one free sulfhydryl in the beta subunit of (Na,K)-ATPase. J. Biol. Chem., 264, N13, 7185-7192.

93. Komiyama, Y., Dong, X.H., Nishimura, N., Masaki, H., Yoshika, M., Masuda, M., Takahashi, H. (2005) A novel endogenous digitalis, telocinobufagin, exhibits elevated plasma levels in patients with terminal renal failure. Cliri Biochem. 38, 3645.

94. Koob R, Kraemer D, Trippe G, Aebi U, Drenckhahn D. (1990) Association of kidney and parotid Na+,K+-ATPase with actin and analogs of spectrin and ankyrin. Eur J Cell Biol, 53, 93-100.

95. Koster, J.C., Blanco, G., Mercer, R.W. (1995) A cytoplasmic region of the Na,K-ATPase alpha-subunit is necessary for specific alpha/alpha association. J. Biol. Chem., 270,14332-14339.

96. Kraemer DM, Strizek B, Meyer HE, Marcus K, Drenckhahn D. (2003) Kidney Na+,K+-ATPase is associated with moesin. Eur J Cell Biol, 82, 87-92.

97. Kraemer, D., Koob, R., Friedrichs, B., Drenckhahn, D. (1990) Two novel peripheral membrane proteins, pasin 1 and pasin 2, associated with Na+,K+-ATPase in various cells and tissues. J Cell Biol, 111, 2375-2383.

98. Krenn L, Kopp B. (1998) Bufadienolides from animal and plant sources. Phytochemistry, 48, 1-29.

99. Kurihara K., Nakanishi N., Ueha T. (2000) Regulation of Na(+)-K(+)-ATPase by cAMP-dependent protein kinase anchored on membrane via its anchoring protein. Am J Physiol Cell Physiol., 279, C1516-27.

100. Kutzweiler, T.A., Arguello, J.M., and Lingrel, J.B. (1996) Asp804 and Asp808 in the transmembrane domain of the Na,K-ATPase a subunit are cation coordinating residues. J. Biol. Chem., 271, 29682-29687.

101. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227, N259, 680-685.

102. Lang F., Busch G.L., Ritter M., Volkl H. (1998) Functional significance of cell volume regulatory mechanisms. Physiol /?ev.,78(l), 247-306.

103. Lang F., Ritter M., Gamper N., Huber S., Fillon S., Tanneur V., Lepple-Wienhues A., Szabo I., and Gulbins E. (2000) Cell volume in the regulation of cell proliferation and apoptotic cell death. Cell Physiol Biochem.,lQ, 417-28.

104. Lang F., Ritter M., Woll E., Bichler I., Haussinger D., Offner F., and Grunicke H.1992) Altered cell volume regulation in ras oncogene expressing NIH fibroblasts. Pflugers Arch, 420,424-7.

105. Lavoie L., Levenson R., Martin-Vasallo P., Klip A. (1997) The molar ratios of a and p subunits of the Na+-K+-ATPase differ in distinct subcellular membranes from rat skeletal muscle. Biochemistry, 36, 7726-7732.

106. Ledbetter, M.L., Young, G.J., Wright, E.R. (1986) Cooperation between epithelial cells demonstrated by potassium transfer. Am J Physiol, 250, C306-C313.

107. Lee, K., Jung, J., Kim, M., Guidotti, G. (2001) Interaction of the a subunit of Na,K-ATPase with cofilin. Biochem J, 353,377-385.

108. Lemas, M.V., Hamrick, M., Takeyasu, K., Fambrough, D.M. (1994) 26 Amino acids of an extracellular domain of Na,K-ATPase a-subunit are sufficient for assembly with the Na,K-ATPase p-subunit. J. Biol. Chem., 269, 8255-8259.

109. Li K.X., and Sperelakis N. (1993) Isoproterenol- and insulin-induced hyperpolarization in rat skeletal muscle. J Cell Physiol., 157, 631-6.

110. Lichtstein, D., Gati, I., Samuelov, S., Berson, D., Rozenman, Y., Landau, L. et al.1993) Identification of digitalis-like compounds in human cataractous lenses. Eur J Biochem, 216, 261-268.

111. Lingrel J.B. (1992) Na,K-ATPase: isoform structure, function and expression. J. Bioenerg. Biomembr., 24, 263-270.

112. Lingrel, J.B., Croyle, M.L., Woo, A.L., Arguello, J.M. (1998) Ligand binding sites of Na,K-ATPase. Acta. Physiol. Scand. Suppl., 643, 69-77.

113. Liu J, Kesiry R, Periyasamy SM, Malhotra D, Xie Z, Shapiro JI. (2004) Ouabain-induced endocytosis of plasmalemmal Na/K-ATPase in LLC-PK1 cells by clathrin-dependent mechanism. Kidney Int, 66,227-241.

114. Liu, J., Tian, J., Haas, M., Shapiro, J.I., Askari, A., Xie, Z.(2000) Ouabain interaction with cardiac Na+/K+-ATPase initiates signal cascade independent of changes in intracellular Na+ and Ca2+ concentrations. J Biol Chem, 275,27838-27844.

115. Liu, L., Mohammadi, K., Aynafshar, B., Wang, H., Li, D., Liu, J., Ivanov, A.V., Xie, Z., Askari. A. (2003) Role of caveolae in signal-transducting function of cardiac Na+/K+-ATPase. Am J Physiol, 284, C1550-C1560.

116. Liu, P., Rudick, M., and Anderson, R.G. (2002) Multiple functions of caveolin-1. J. Biol. Chem. 277:41295-41298.

117. Liu, Y., Peterson, D.A., Kimura, H., Schubert, D. (1997) Mechanism of cellular 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) reduction. J Neurochem. 69, 581-93.

118. Lutsenko, S., Anderko, R., Kaplan, J.H. (1995) Membrane disposition of the M5-M6 hairpin of Na+,K(+)-ATPase alpha subunit is ligand dependent. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92,7936-7940.

119. Lux S.E, John K.M, Bennett V. (1990) Analysis of cDNA for human erythrocyte ankyrin indicates a repeated structure with homology to tissue-differentiation and cell-cycle control proteins. Nature, 344, N6261,36-42.

120. Maingret F, Patel AJ, Lesage F, Lazdunski M, Honoré E (1999) Mechano- and acid stimulation, two interactive modes of activation of the TREK-1 potassium channels. J Biol Chem., 274,26691-26696.

121. Majno, G., Joris, I. (1995) Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. Am J Pathol, 146, 3-15.

122. Malik N„ Canfield V.A., Beckers M-C., Gros P., Levenson R (1996) Identification of the mammalian Na,K-ATPase p3-subunit. J. Biol. Chem., 271,22754-22758.

123. Manunta, P., Barlassina, C., and Bianchi, G. (1998) Adducin in essential hypertension. FEBS Lett. 430: 41-44.

124. Martin-Vasallo P., Dackowski W., Emanuel J.R., Levenson R. (1989) Identification of putative isoform of the Na,K-ATPase P-subunit. J. Biol. Chem., 264, 4613-4618.

125. Matsui, H., and Schwartz, A. (1968) Mechanism of cardiac glycoside inhibition of the (Na+-K+)-dependent ATPase from cardiac tissue. Biochim. Biophys. Acta., 151, 655-663.

126. McDonough A.A. and farley R.A. (1993) Regulation of Na,K-ATPase activity. Curr Opin Nephrol Hypertens., 2, 725-34.

127. Mercer R.W. (1993) The structure of Na,K-ATPase. Int. Rev. Cytol., 13, 7C, 139168.

128. Miakawa-Naito A, Uhlén P, Lai M, Aizman O, Mikoshiba K, Brismar H et al. (2003) Cell signaling microdomain with Na,K-ATPase and inositol 1,4,5-triphosphate receptor generates calcium oscillations. J Biol Chem, 278, 50355-50361.

129. Miller R.P., Farley R.A. (1990) Beta-subunit of (Na+ + K+)-ATPase contains three disulfide bonds. Biochemistry, 29, 1524-1532.

130. Mohammadi, K., Kometiani, P., Xie, Z., Askari, A.(2001) Role of protein kinase C in the signal pathways that link Na+/K+-ATPase to ERK1/2. J Biol Chem, 276, 42050-42056.

131. Mongin A.A., Orlov S.N. (2001) Mechanisms of cell volume regulation and possible nature of the cell volume sensor. Pathophysiology, 8(2):77-88.

132. Morrow JS, Cianci CD, Ardito T, Mann AS, Kashgarin M. (1989) Ankyrin links to the alpha subunit of Na,K-ATPase in Madin -Darby canine kidney cells and in intact renal tubule cells. J Cell Biol, 108,455-465.

133. Munzer, J.S., Daly, S.E. Jewell-Motz, E.A., Lingrel, J.B., and Blostein, R. (1994) Tissue- and isoform-specific kinetic behavior of the Na,K-ATPase. J. Biol. Chem., 269, 16668-16676.

134. Murtazina D.A. Petukhov S.P., Rubtsov A.M., Storey K.B., Lopina O.D. (2001) Phosphorylation of the alpha-subunit of Na,K-ATPase from duck salt glands by cAMP-dependent protein kinase inhibits the enzyme activity. Biochemistry (Mosc)., 66, 865-74.

135. Nakagawa Y, Petricoin EF, Akai H, Grimley PM, Rupp B, Larner AC.( 1992a) , Interferon-alpha-induced gene expression: evidence for a selective effect on activation of the ISGF3 transcription complex. Virology, 190, 210-220.

136. Nakagawa Y, Rivera V, Larner AC. (1992b) A role for Na/K-ATPase in the control of human c-fos and c-jun transcription. J Biol Chem, 267, 8785-8788.

137. Nelson, W.J., Veshnock, P. (1987) Ankyrin binding to (Na+K)-ATPase and implications for the organization of membrane domains in polarized cells. Nature 328, 533-537.

138. Orlov S.N., Akimova O.A., Hamet P. (2005). Cardiotonic steroids: novel mechanisms of Na+-mediated and -independent signaling involved in regulation of gene expression, proliferation and cell death. Current Hypertension Reviews. In press.

139. Orlov S.N., Dam T.V., Tremblay. J., Hamet. P. (1996) Apoptosis in cultured vascular smooth muscle cells. Role of cell volume decrease. Biochem Biophys Res Commun-, 221:708-715.

140. Orlov S.N., Taurin S., Thorin-Trescases N., Dulin N.O., Tremblay J., Hamet P. (2000) Inversion of the intracellular Na+/K+ ratio blocks apoptosis in vascular smooth muscle cells by induction ofRNA synthesis. Hypertension; 35:1062-1068.

141. Orlov S.N., Thorin-Trescases N., Kotelevtsev S.V., Tremblay J., Hamet P. (1999) Inversion of the intracellular Na+/K+ ratio blocks apoptosis in vascular smooth muscle at a site upstream of caspase-3. J Biol Chem; 274:16545-16552.

142. Orlov, S.N., Thorin-Trescases, N., Kotelevtsev, S.V., Tremblay, J., Hamet, P. (1999) Inversion of the intracellular Na+/K+ ratio blocks apoptosis in vascular smooth muscle at a site upstream of caspase-3. J Biol Chem, 274, 6545-16552.

143. Orlov, S.N., Tremblay, J., and Hamet, P. (1996) Bumethanide-sensitive ion fluxes in vascular smooth muscle cells: lack of functional Na+,K+,2C1- cotransport. J. Membr. Biol., 153,125 135.

144. Orlov, S.N., Tremblay, J., Hamet, P. (1995) Altered beta-adrenergic regulation of Na-K-Cl cotransport in cultured smooth muscle cells from the aorta of spontaneously hypertensive rats. Role of the cytoskeleton network. Am J Hypertens, 8, 739-747.

145. Otto E., Kunimoto M., McLaughlin T., Bennett V. (1991) Isolation and characterization of cDNAs encoding human brain ankyrins reveal a family of alternatively spliced genes. J. Cell. Biol., 114, N2,241-253.

146. Palasis, M., Kuntzweiler, T.A., Arguello, J.M., and Lingrel, J.B. (1996) Ouabain interactions with the H6-H6 hairpin of the Na,K-ATPase reveal a possible inhibition mechanism via the cation binding domain. J. Biol. Chem., 271, 14176-14182.

147. Pamnani, M., Huot, S., Buggy, J., Clough, D., Haddy, F. (1981) Demonstration of a humoral inhibitor of the Na+-K+ pump in some models of experimental hypertension. Hypertension, 3, 96-101.

148. Pedemonte C.H., Pressley T.A., Lokhandwala M.F., Cinelli A.R. (1997) Regulation of Na,K-ATPase transport activity by protein kinase C. J Membr Biol., 155, 219-27.

149. Peng L., Martin-Vasallo P., Sweadner K.J. (1997) Isoforms of Na,.K-ATPAse a and P subunits in the rat cerebellum and in granule cell cultures. J. Membr. Biol., 155, 219-227.

150. Peng, M., Huang, L., Xie, Z., Huang, W-H., Askari, A.(1996) Partial inhibition of Na+/K+-ATPase by ouabain induces the Ca2+-dependent expression of early-response genes in cardiac myocytes. J Biol Chem, 271, 10372-10378.

151. Pontiggia L., Winterhalter K., Gloor S.M. (1998) Inhibition of Na,K-ATPase activity by cGMP is isoform-specific in brain endothelial cells. FEBS Lett., 436, 46670.

152. Post R.L., Sen A.K., Rosenthal A.S. (1965) A phosphorylated intermediate in adenosine triphosphate dependent sodium and potassium transport across kidney membranes. J. Biol. Chem., 240, 1437-1445.

153. Post, R.L., Hegyvary, C., and Kume, S. (1972) Activation by adenosine triphosphate in the phosphorylation kinetics of sodium and potassium ion transport adenosine triphosphatase. J. Biol. Chem., 247, 6530-6540.

154. Price, E.M., Rice, D.A., and Lingrel, J.B. (1989) Site-directed mutagenesis of a conserved, extracellular aspartic acid residue affects the ouabain sensitivity of sheep Na,K-ATPase. J. Biol. Chem., 264,21902-21906.

155. Qiu, L.Y., Koenderink, J.B., Swarts, H.G.P., Willems, P.H.G.M., Pont, J.J.H.H.M. (2003) Phe783, Thr797, and Asp804 in transmembrane hairpin M5-M6 of Na,K-ATPase play a key role in ouabain binding. J. Biol. Chem., 278,47240-47244.

156. Rajan S, Wischmeter E, Liu GX, Preisig-Muller R, Daut J, Karschin A, Derst C (2000) TASK-3, a novel tandem pore domain acid-sensitive K+ channel. An extracellular histidine as pH sensor. J Biol Chem, 275, 16650-16657.

157. Rajasekaran, S.A., Gopal, J., Wills, D., Espineda, C., Twiss, J.K., Rajasekaran, A.K. (2004) Na,K-ATPase betal-subunit increases the translation efficiency of the alpha 1-subunit in MSV-MDCK cells. Mol Biol Cell., 15(7), 3224-32.

158. Razani, B., Woodman, S.E. and Lisanti, M.P. (2002) Caveolae: From cell biology to animal physiology. Pharmacol. Rev. 54: 431-467.

159. Reichert M, Steinbach JP, Supra P, Weller M (2002) Modulation of growth and radiochemosensitivity of human malignant glioma cells by acidosis. Cancer, 95, 1113-1119.

160. Renner, E.L., Lake, J.R., Pérsico, M., Scharschmidt, B.F. (1989) Na+-H+ exchange activity in rat hepatocytes: role in regulation of intracellular pH. Am J Physiol. 256, G44-52.

161. Sarvazyan, N.A., Modynov, N. N., Askari, A. (1995) Intersubunit and intrasubunit contact regions of Na+/K+-ATPase revealed by controlled proteolysis and chemical cross-linking. J. Biol. Chem. 270,26528-26532.

162. Saunders, R., Scheiner-Bobis, G. (2004) Ouabain stimulates endothelin release and expression in human endothelial cells without inhibiting the sodium pump. Eur J Biochem, 111, 1054-1062.

163. Schatzmann HJ. (1953) Herzglykoside ais Hennstoffe fur den aktiven Kalium- und Natriumtransport durch die erythrocytenmembran. Helv Physiol Pharmacol Acta, 11, 346-354.

164. Schneider, R., Wray, V., Nimtz, M., Lehmann, W-D., Kirch, U., Antoloic, R. et al. (1998) Bovine adrenals contain, in addition to ouabain, a second inhibitor of the sodium pump. J Biol Chem, 273,784-792.

165. Schoner, W. (2002) Endogenous cardiac glycosides, a new class of steroid hormones. Eur JBiochem, 269, 2440-2448.

166. Schultheis, P.J., and Lingrel, J.B. (1993) Substitution of transmembrane residues with hydrogen-bonding potential in the alpha subunit of Na,K-ATPase reveals alteration in ouabain sensitivity. Biochemistry, 32, 544-550.

167. Schultheis, P.J., Wallick, E.T., and Lingrell, J.B. (1993) Kinetic analysis of ouabain binding to native and mutated forms of Na,K-ATPase and identification of a new region involved in cardiac glycoside interactions. J. Biol. Chem., 268, 2268622694.

168. Schwartz, A. (1976) Is the cell membrane Na+, K+ -ATPase enzyme system the pharmacological receptor for digitalis? Circ Res., 39:1-7.

169. Shamraj, O.I., and Lingrel, J.B. (1994) A putative fourth Na,K-ATPase a subunit gene is expressed in testis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 12952-12956. r

170. Shan X., Luo H., Chen H., Daloze P., St-Louis G., Wu J. (1993) The effect of rapamycin on c-jun expression in human lymphocytes. Clin Immunol Immunopathoi, 69,314-7.

171. Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O. and Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal. Chem., 68, 850-858, 1996.

172. Shull G.E., Greeb J., Lingrel J.B. (1986) Molecular cloning of three distinct forms of the (Na+K)-ATPase a-subunit from rat brain. Biochemistry, 25, 8125-8132.

173. Shull G.E., Schwarts A., Lingrel J.B. (1985) Amino-acid sequence of the catalytic subunit of the (Na++K+)ATPase deduced from a complementary DNA. Nature, 316, 691-695.

174. Skou J. C (1957) The influence of some cations on an adenosine triphosphatase from priferal nerves. Biochim. Biophys. Acta, 23, 394-401.

175. Skou J.C., and Esmann M. (1992) The Na,K-ATPase. J Bioenerg Biomembr., 24, 249-61.

176. Skou JC. (1960) Further investigation on a Mg 2+ + Na+-activated adenosinetriphosphatase possibly related to the active transport of Na+ and K+ across the nerve cell membrane. Biochim Biophys Acta, 42, 6-23.

177. Stewart D.J., and Sen A.K. (1981) Role of cyclic GMP in cholinergic activation of Na-K pump in duck salt gland. Am J Physiol., 240, 207-14.

178. Sun X.M., MacFarlane M., Zhuang J,m Wolf B.B., Green D.R., Cohen G.M. (1999) Distinct caspase cascades are initiated in receptor-mediated and chemical-induced apoptosis. J Biol Chem., 274, 5053-60.

179. Sweadner K.J., Real E. (2000) The FXYD gene family of small ion transport regulators or channels: cDNA sequence, protein signature sequence, and expression. Genomics., 68, 41-56.

180. Szent-Gyorgyi A. (1953) Chemical physiology of contraction in body and heart. New York, Academic Press. 86-91

181. Taurin S, Hamet P, Orlov SN. (2003) Na/K pump and intracellular monovalent cations: novel mechanism of excitation-transcription coupling involved in inhibition of apoptosis. Mo I Biol, 37, 371-381.

182. Therien A.G., and Blostein R. (2000) Mexanisms of sodium pump regulation. Am J Physiol Cell Physiol., 279, C541-66.

183. Thevananther S., Kolli A.H., Devarajan P. (1998) Identification of a novel ankyrin isoform (AnkG190) in kidney and lung that associates with the plasma membrane and binds alpha-Na, K-ATPase J. Biol. Chem., 273, 23952-23958.

184. Thomas, J.A., Buchsbaum, R.N., Zimniak, A., Racker, E. (1979) Intracellular pH measurements in Ehrlich ascites tumor cells utilizing spectroscopic probes generated in situ. Biochemistry, 18, 2210-8.

185. Thomas, S.M. and Brugge, J.S. (1997) Cellular functions regulated by Src family kinases. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 13: 513-609.

186. Trevisi L, Visentin B, Cusinato F, Pighin I, Luciani S. (2004) Antiapoptotic effect of ouabain on human umbilical endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun, 321, 716-721.

187. Vachon, P.H., Beaulieu, J.F. (1992) Transient mosaic patterns of morphological and functional differentiation in the Caco-2 cell line. Gastroenterology. 103, 414-23.

188. Valente, R.C., Capella, L.S., Monteiro, R.Q., Rumjanek, V.M., Lopes, A.G., Capella, M.A. (2003) Mechanisms of ouabain toxicity. FASEB J., 17, 1700-2.

189. Wadhwa R, Yaguchi T, Hasan MK, Mitsui Y, Reddel RR, Kaul SC. (2002) Hsp70 family member, mot-2/mthsp7-/GSP75, binds to the cytoplasmic sequestration domain of the p53 protein. Exp Cell Res, 274, 246-253.

190. Wallick, E. T. and Schwartz, A. (1988) Interaction of cardiac glycosides with Na+,K+-ATPase. Methods Enzymol. 156,201-213.

191. Wang S.G., and Farley R.A. (1998) Valine 904, tyrosine 898, and cysteine 908 in Na,K-ATPase alpha subunits are important for assembly with beta subunits. J Biol Chem., 273, 29400-5.

192. Wang, H., Haas, M., Liang, M., Cai, T., Tian, J., Li, S., Xie, Z. (2004) Ouabain assembles signaling cascade through the caveolar Na+,K+-ATPase. J Biol Chem, 279, 17250-17259.

193. Wood EH, Moe GK. (1938) Studies on the effect of digitalis glycosides on potassium ion loss from the heart of the heart lung preparation. Am J Physiol, 123, 219-220.

194. Xie Z, Askari A. (2002) Na+/K+-ATPase as a signal transducer. Eur J Biochem, 269,2434-2439.

195. Xie, Z., Cai, T. (2003) Na+-K+-ATPase-mediated signal transduction: from protein interaction to cellular function. Mol Intervent, 3, 157-168.

196. Xie, Z., Kometiani, P., Liu, J., Li, J., Shapiro, J.I., Askari, A. (1999) Intracellular reactive oxygen species mediate the linkage of Na+/K+-ATPase to hypertrophy and its marker genes in cardiac myocytes. J Biol Chem., 274, 19323-8.

197. Xiong Z-G, Zhu X-M, Chu X-P, Minami M, Hey J, Wei W-L, MacDonald JF, Wemmie JA, Price MP, Welsh MJ, Simon RP (2004) Neuroprotection in ishemia: blocking calcium-permeable acid-sensitive ion channels. Cell, 118,687-698.

198. Xu, W., Harrison, S.C., and Eck, M.J. (1997) Three-dimensional structure of the tyrosine kinase c-Src. Nature 385: 595-602.

199. Young, M.A., Gonfloni, S., Superti-Furga, G., Roux, B., and Kuriyan, J. (2001) Dynamic coupling between the SH2 and SH3 domains of c-Src and Hck underlies their inactivation by C-terminal tyrosine phosphorylation. Cell 105: 115-126.

200. Yudowski G.A., Efendiev R., Pedemonte R., Katz A.I., Berggren P.O., Bertorello A.M. (2000) Phosphoinositide-3 kinase binds to a proline-rich motif in the Na+, K+-ATPase alpha subunit and regulates its trafficking. Proc Natl Acad Sci USA., 97, 6556-61.

201. Zhang, Z., Devarajan, P., Dorfman, A.L., Morrow, J.S. (1998) Structure of the ankyrin-binding domain of a-Na-K-ATPase. J Biol Chem, 273, 18681-18684.