Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Са2+-зависимая регуляция Na+, K+-АТР-азы эритроцитов крысы

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Са2+-зависимая регуляция Na+, K+-АТР-азы эритроцитов крысы"

РГБ ОА

] 3 = > РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

институт теоретической и экспериментальной биофизики

На правах рукописи

ПАНШШНА ЕЛЕНА АЛЕКСАНДРОВНА

удк 577.352.4

Са2+-ЗАВИСИМАЯ РЕГУЛЯЦИЯ На+,К+-АТР-азы ЭРИТРОЦИТОВ КРЫСЫ

03.00.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино-1995

Работа выполнена в Институте биофизики клетки РАН

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук, ст.н.с.

ПЕТРУНЯКА В.В.

доктор биологических наук, Новоселов В.И., кандидат биологических наук Щипакина Т.Г.

Ведущая организация: Институт физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского.

Защита диссертации состоится заседании специализированного совета Д 200.22.01 при Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН (142292 Московская обл., г. Пущино, ИТЭБ РАН).

*

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИТЭБ РАН Автореферат разослан "2о« "199У~г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

.А.Нелипович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы.

Одна из существенных функций биологических • мембран обеспечение избирательной проницаемости для веществ, транспортируемых в процессе жизнедеятельности клетки в среду и из среды в клетку. Мембранные белки, осуществляющие транспорт Na+, К+, Са2+ и Н4", сопряженный с гидролизом АТР, участвуют в неравновесном распределении ионов, внутри клетки, . изменение которого приводит к запуску целого ряда биохимических событий. Накопившиеся данные свидетельствуют о существовании быстрых и множественных механизмов регуляции АТР-зависимого транспорта Na+ и К+ с участием вторичных внутриклеточных мессенджеров.

Са2+-АТРаза плазматических мембран играет ведущую роль в поддержании низкой концентрации Са2+ (ГО^М) в цитозоле. Изучение регуляции этого фермента приобрело особенно большое ■ значение в связи с открытием регуляторной функции ионов' Са2+ в клетках. Несмотря на многочисленные попытки изучения влияния ионов Са2+ на регуляцию Na+,K+-Hacoca плазматических мембран, вопрос до сих пор, остается невыясненным. Результаты исследований, свидетельствующих об активации Na+,К+-АТРазы ионами Са2+ в концентрации ниже I цМ, довольно неоднозначны из-за неопределенности условий проведения экспериментов. Противоречивы данные не только об активирующем действии Са2+, но также о регуляции активности Ыа+,К+-АТРазы эндогенными протеинкиназами; окончательно не выяснена природа и механизм действия Са2+-зависимых эндогенных регуляторов.

В то же время, результаты многочисленных исследований гормональной регуляции ионтранспортирующих АТР-аз на интактных клетках плохо согласуются с данными, полученными на выделенных мембранах. Эти несоответствия во многом объясняются неконтролируемым нарушением нативного комплекса эндогенных регуляторов при выделении мембран.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы было выяснение участия эндогенных Са2+-зависимых регуляторов и протеинкиназ в функционировании Ыа+,К+-АТРазы плазматической мембраны эритроцитов крысы.

Для этого в работе были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Отработать методику получения перфорированных мембран эритроцитов, исключающую длительную процедуру получения вывернутых везикул с неконтролируемой отмывкой регуляторов.

2. Оценить влияние ингибитора Ла+,К+-АТРазы уабаина на активность Са2+-АТРазы в присутствии эндогенных регуляторов.

3. Исследовать зависимость активности Ма+,К+-АТРазы от концентрации Са2+ в присутствии и отсутствии эндогенных регуляторов.

4. Изучить влияние Са2+-зависимого эндогенного ингибитора Ма+,К+-АТРазы на чувствительность фермента к уабаину, Ыа+, К+ и фуросемиду.

5. Определить возможное наличие в мембранах эритроцитов Ка+,М^+-АТРазы и уабаин-нечувствительной фуросемид-ингибируемой Ш+-АТРазы.

6. Исследовать действие сАМР на Са2+-зависимую регуляцию Ыа+,К+-АТРазы.

Научная новизна.

Показано, что при измерении активности Ыа+,К+-АТРазы как уабаин-чувствительной компоненты общей АТР-азной активности в присутствии Са2+ и Са2+-зависимых регуляторов вносится существенная ошибка, обусловленная Са2+-зависимым действием уабаина на Са2+-АТРазу. Неспецифическое влияние уабаина на Са2+-АТРазу свидетельствует о невозможности использования уабаина для идентификации активности Ыа+,К+-АТРазы на фоне Са2+-АТРазы. Показаны Са2+-зависимые активация и ингибирование Ыа+,К+-АТРазы, зависимость Са2+ регуляции активности фермента от ионов подавление сАМР Са2+-зависимой активации Ыа+,К+-АТРазы.

Выявлено, что при микромолярных концентрациях Са2+ частично теряется чувствительность Ыа+,К+-АТРазы к уабаину и резко падает ее сродство к К+.

Практическая ценность.

Результаты настоящей работы расширяют представления о механизмах регуляции функционирования ионтранспортирующих АТР-аз плазматической мембраны эритроцитов крысы. Они могут быть

использованы для выяснения этиологии целого ряда заболеваний, связанных с нарушением Са2+- и Ыа+/К+-обмена.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 7 научных статей.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы экспериментальных результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы из 140 наименований. Диссертация изложена на 91 странице машинописного текста, включая 10 рисунков и 4 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Для приготовления сред в работе использовали KCl, лимонную кислоту, КН2Р04 и СаСОд марки ос.ч., MgCl2, HCl, HgSO^ - х.ч., молибдат натрия и малахитовый зеленый - ч.д.а., трис, HEP ES, толбутамид, кальмидазолиум (R24571) - "Serva" (ФРГ), сапонин -"Chemapol" (Чехословакия), полимиксин Б - "Sigma" (США), динатриевую соль ATP - "Sigma" (США) и "Reanal" (Венгрия), уабаин, EGTA "Pluka" (ФРГ). Растворы готовили на бидистиллированной воде.

Основным объектом исследования были эритроциты, выделенные из свежей гепаринизированной крови самцов белых беспородных крыс и крыс линии Wistar весом 180-200 г.

Эритроциты получали из крови 3-кратной промывкой переосаждением на центрифуге при 1500g по 10 мин. Промывочная среда содержала 20 мМ трис-НС1-буфер, pH 7,4 (при 20°С), 130 тМ KCl, 0,37 тМ MgClg. Из плотного осадка получали 10%-ную суспензию в среде, содержащей 130 шМ KCl (или KCl + NaCl в зависимости от условий эксперимента), 20 тМ HEPES-трис, pH 7,4, 10 тМ лимонную кислоту, 3 или 8,3 mM MgCl2 (для получения 50 или 370 цМ свободного Mg2"1").

Сапонин в конечной концентрации 0,04% добавляли в суспензию эритроцитов. Мембраны эритроцитов, перфорированных сапонином и отмытых от эндогенных Са2+-зависимых регуляторов, получали осаждением на центрифуге в течение 30 мин при 16000g (4°С) в среде с 2 шМ EGTA. Осадок суспендировали в среде без EGTA, переосаждали и разводили этой средой до объема, равного объему исходной 10%-ной суспензии эритроцитов.

Для измерения АТР-азной активности 100 р.1 полученной суспензии эритроцитов или мембран добавляли к равному объему среды инкубации, содержащей 130 шМ КС1, или 130 mM NaCl, или 130 тМ (КС1+ NaCl) в заданном соотношении, 3 или 8,3 mM MgCl2, 20 тМ HEPES-трис (рН 7,4 при 37°С) и 10 тМ цитрат, 2 mM АТР (натриевую или калиевую соли), 2 шМ EGTA и СаС12 в концентрации, необходимой для получения [Са2+] от 0,1 до 60 цМ, и выдерживали при 37°С 10 мин в термостате с вибратором. Реакцию останавливали добавлением равного объема холодного 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты. После осаждения белка в супернатанте определяли неорганический фосфат по методу (Muszbec L., Szaba'T., Fesus L., 19T7). Активность Ыа+,К+-АТРазы рассчитывали как разность между суммарной АТР-азной активностью (Ка+,К+-АТРазы, Са2+-АТРазы и Мд2+-АТРазы) и активностью уабаин-нечувствительных и/или натрий-независимых АТР-аз (Са2+-АТРазы и Mg2+-ATPa3H). При использовании уабаина (1шМ) учитывали выявленное нами Са2+-зависимое действие его на Са2+-АТРазу. Са2+-АТРазную активность измеряли в безнатриевой среде и рассчитывали ее как разность мевду суммарной активностью Са2+-АТРазы и Ы^+-АТРазы в средах, содержащих 0,1 - 60 |Ш Са2+, и активностью Mg^-АТРазы в среде без Са2+ (с 1 mM EGTA).

Концентрации ионов Са2+ и Mg2* в инкубационных средах рассчитывали с использованием констант стабильности комплексов Са2+, tag2"1" и Н+ с EGTA, цитратом и АТР при 37°0 и ионной силе 0,16 (Durham А.С.Н., 1984). Среды с заданными концентрациями Са2+ (при постоянных заданных концентрациях Mg2"1") получали смешиванием в необходимых пропорциях двух растворов: с максимальной концентрацией ионов Са2+ (60 цМ) и без кальция после доведения рН при 37°С в каждом из них. Это обеспечивало постоянство рН и, таким образом, постоянство констант связывания Са2+ и Jig2"1" с хелаторами при получении малых объемов сред с заданными

концентрациями Са2+, а также способствовало уменьшению ошибок измерений объемов сред и исходных (концентрированных) растворов 0аС12 и ЕСТА.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Оценка метода измерения активности ионтранспортных АТРаз в эритроцитах крысы в присутствии эндогенных регуляторов.

Плазматическая мембрана эритроцитов - это уникальный природный объект исследования ионтранспортных АТРаз. Отсутствие внутриклеточных кальциевых пулов и Са2+/На+-обменника в самой мембране позволяют исследовать Са2+-зависимую регуляцию Ш+,К+-АТРаз на основе практически модельной, но, тем не менее, нативной системы.

К настоящему времени сведения о регуляции Ма+,К+-АТРазы ограничиваются хорошо установленной ролью Са -зависимого ингибитора кальнактина и сообщениями о действии эндогенных протеинкиназ на активность фермента Эти сведения не могут отражать истинных свойств АТРазы в клетках, так как получены в условиях, искажающих, структуру и состав мембран. Исследования регуляции фермента проводятся либо в детергентных растворах, либо на изолированных везикулах мембран, подвергнутых многочасовым воздействиям сред с низкой ионной силой, с хелаторами двухвалентных катионов и т.д. Такие воздействия, как известно, не только изменяют белковый состав мембраны за счет отмывания белков и белковых регуляторов, но изменяют локализацию и распределение липидов в мембране, также участвующих в обеспечении нормального функционирования АТРаз. Разнообразие условий обработки мембран приводит к тому, что часто даже в одной серии экспериментов абсолютные значения кинетических параметров АТРазы или АТР-зависимого транспорта Са2+ могут варьировать более чем в 10 раз. Все это позволяет считать, что ограниченность сведений о регуляции Са2+- и Ыа+,К+-АТРаз обусловлена недостатками методов исследования.

Учитывая вышесказанное, для оценки роли эндогенных регуляторов в активации и ингибировании Ка+,К+-АТРазы мембран эритроцитов мы исключили длительную процедуру получения вывернутых везикул с неконтролируемой отмывкой регуляторов, использовав сапонин,

-б-

который позволяет обеспечить доступ к внутренней поверхности мембран. Способность сапонина при взаимодействии с холестерином мембраны образовывать в ней поры, проницаемые для белков, позволила, не затрагивая липидное окружение АТРаз, не только контролировать внутренние концентрации ионов и АТР, но и обеспечить отмывку или добавление эндогенных регуляторов, устранить ингибирование АТРаз возникающими при их работе ионными градиентами.

Активность Ыа+,К+-АТРазы в бескальциевой среде.

В перфорированных сапонином эритроцитах в бескальциевой среде активность Na+,K+-АТРазы не проявляется в области 0-3 mM Na+, макси-

0 - - ._,_,_,_,-5_,- мальна при 30-125

5/|2S *5/Н5 &Ао5 П5/б mM Na+ и не зависит от [К+] при

Рис 1. Зависилость активности Na+,К+-АТРази от соотношения ионод No1' и К+ при [Сс£+] = О.

соблюдении суммарной заданной концентрации ионов 130 шМ. Полумаксимальная активация ионами Na+ достигалась при концентрации 15 шМ (Рис.1). Полученная зависимость активности уабаин-чувствительной АТР-азы от концентрации Na+ и К+ при О цМ Са2+ для перфорированных сапонином эритроцитов идентична данным для Ыа+,К+-АТР-азы в отмытых нативных и реконструированных мембранах (Presaley Т.А., 1988) эритроцитов.

Влияние уабаина на активность Са2+-АТРазы.

Уобаш считается специфическим ингибитором Ыа+,К+-АТРазы. Со времен открытия Na+,K+-ATPa3H уабаин используют для идентификации активности этого фермента как маркерного белка плазматических мембран и при исследовании свойств АТР-азы.

л эр-мин

300 200400-

Na/K,n.M

-7В связи с необходимостью идентификации активности Na+,K+-ATPa3H на фоне высокой активности Са2+-АТРазы нами было

9+

проверено действие уабаина на Са" -АТРазу в- присутствии эндогенных Са2+-зависимых регуляторов и обнаружено, что 0.5-1.0 тМ уабаин в безнатриевой среде при концентрации Са2+ до 0.7 цМ активирует Са2+-АТРазу (максимально в 2 раза при 0.2 цМ Са2+), а при концентрации Са2+ от 1.0 до 60 цМ на 20-30% ингибирует Са2+-АТРазу (Рис.2, кривая 2). При этом ингибируемая доля

активности Са2+-АТРазы по абсолютной величине сравнима с активностью Na+,K+-ATPa3H в среде без Са2+. Это осложняло использование уабаина при измерении ктивности Na+,К+-АТРазы. Отмывка мембран средой с EGTA устраняла действие уабаина на Са2+-АТРазу (Рис.2, кривые 3,4) во всем диапазоне концентраций Са. . На основании этих результатов можно сделать вывод, что Рис.2. Влияние уабаина на ашиВностъ Са -АТРазы.

1 - эритроцьш-контролъ, 2 - эритроциты. + 1 тМ уабаин, 3 - лелбраяи-кошролъ, 4 - лелбраны + 1 тМ уабаш

о.

уабаин не влияет непосредственно на Са -АТРазу, а действие его опосредованно каким-то Са2+~зависимым регулятором. Все это позволяет считать, что использованный нами подход для изучения влияния Са2+ на Na+,K+-ATP-a3y без применения уабаина дает возможность получать наиболее достоверные результаты. Учитывая отсутствие активности Na+,K+-ATPa3H при Ша+] < 3 тМ, ее определяли как разность мевду активностью АТР-аз в среде, содержащей и Na+ и К+ (по 65 шМ КС1 и NaCl), и активностью в среде, содержащей 130 mM КС1 и не более 3 тМ Na+.

Действие фуросемида на активность Са2+- и Ыа+,К+-АТРаз.

Фуроселид и его производные широко используются в качестве ингибиторов системы облегченной диффузии (симпорта) одновалентных ионов и хлорных каналов. Мы исследовали влияние фуросе^тда на Са2+- и На+,К+-АТРазу в перфорированных эритроцитах крысы в условиях, сохраняющих эндогенные Са2+-зависимые регуляторы АТР-аз. Было установлено, что действие фуросемида на активность Са2+-АТРазы сходно с действием уабаина в среде без натрия (в отсутствие активности Ыа+,К+-АТРазы) и этот эффект зависит от Са2+. Ыа+,К+-АТРаза в бескальциевой среде активировалась фуросемидом при концентрациях Na+ ниже насыщающих (30 тМ; максимальная активация при концентрации Na+ ниже 5 тМ). Более

того, фуросемид вызывал появление уабаинзависимой АТР-азной активности даже при концентрации Na+ от 0.5 до 3 тМ, когда активность Na+,K+-ATPa3H практически не выявлялась (Рис.3, кривые 2,3). При 3 mM Na+ повышение концентрации фуросемида от 50 цМ до 1 тМ активировало Na+,К+~АТРазу до максимума, достигаемого без фуросемида при [Na+] = 30 mM. Показанное действие фуросемида на Na+,K+- АТР-

Рис.З. Зависилостъ активности. Na?,Кг-АТРазы эритроцитов от действия 1 тШ фуроселида при IСа1 = 0. 1 - контроль, 2 - в присутствии 100 \Ш фуроселида, 3-в присутствии 1 тЫ фуроселида

азу может свидетельствовать о повышении сродства фермента к Na+.

Влияние Са2+ и Mg2"1" на активность Na+,K+-ATPa3H в эритроцитах и их тенях.

Для того, чтобы подтвердить существование в мембране эритроцитов АТР-зависимого NaVMg2* транспорта (Luedi . Н., Sctiatzmann H.J., 1987; Frenkel E.J. et al., 1989; Gunter T. et al., 1990), мы проверили влияние ионов Mg2"1" на активность предполагаемой Ыа+-АТРазы. Активность фермента исследовали в присутствии 10 цМ Са2+ и заданных концентраций свободного магния - от 50 до 600 |iM и рассчитывали как разность между АТР-азной активностью в среде с 130 mM NaCl (или 65 mtí NaCl + 65 тМ КС1) и активностью в среде с 130 mM КС1. Было показано, что предполагаемая Иа^-АТРаза является К+-зависимой, так как не проявляет активности в среде только с NaCl; не зависит от концентрации свободного Mg2"1"; на 50% ингибируется 1 mM фуросемидом. Такие результаты указывают на то, что в эритроцитах, по-видимому, не существует Na+,Mg2'b-ATPa3H, и что сами ионы líg2"1" на активность Na+,K+-ATPa3H не влияют.

Однако действие Са на активность Na+,К+-АТРазы существенно зависело от наличия в среде ионов Mg2'!' При определении зависимости активности Na+,K+- АТР-азы от концентрации Са2+ в присутствии 50 |iM свободного Mg2"1" было выявлено только ингибирование

Na+,К+-АТРазы при концентрации Са2+ 0.3-0.4 |iM с полумаксимальным ингибиро-ингибированием при 0.7 )Ш ló"7 ¿ i ' 5 ' ?' i ' в и полным - выше 1 цМ Са2+

(Рис.4, кривая 1). При Рис.4. Зависилостъ активности Naf,K+-ATFasu от концентрации Са?'+ в перфорированных сапонинол эритроцитах (1,2) и 3 лелйратх, отлашх средой о EGTA (3). 1 - 50 \Ш Jíg2*, 2,3 ~ 370 pjf

[Mg2"1"] = 370 рМ, что примерно соответствует его внутриклеточной концентрации, повышение концентрации Са2+ в интервале 0.3-0.7 цМ вызывало активацию Na+ ,К+-АТРазы (максимальную при 0.5-0.7 |jlM), а

ваше 2 [Ш - небольшое подавление (относительно активности в среде

Оез Са2+) (Рис.4, кривая 2). Необходимо отметить, что степень активации Ыа+,К+-АТРазы эритроцитов, полученных в разные дни у разных животных одного пола и возраста, варьировала в широких пределах - от 27 до 337%, в то время как ингибирование было относительно постоянным (Рис.5). Отмывка мембран эритроцитов средой, содержащей 2 шМ ЕйТА, полностью снимала действие Са2+ на

Na+ ,К+-АТРазу при 370 (JJi Mg2"*" |птоСР;/Члэр-мин

500

400

300-

200

WO-

Ca, М

С JO"'

40

Выявленное в наших экспериментах ингибирующее действие Са2+ на Na+,K+-АТРазу при низкой концентрации Mg2"1" (50 |лМ) оказалось гораздо более выраженным и наблюдалось при более низких концентрациях Са2+, чем ранее было показано для интакт-ных эритроцитов в присутствии ионофора А23187 (Brown A.M., Lew V.L., 1983a) и для плазматичес-

Рис.5 Прилеры активации Na* ,К+-АТРазы. ионали Ca. .полученные Оля эритроцитов разных крыс в разные дни. ] = 370 pJf.

•ких. мембран некоторых типов клеток, полученных при неконтролируемых, но, по-видимому, достаточно высоких концентрациях Са2+ (Зкои J.S., 1957; У1п£з1; Б.И., 1988). Почти такая же высокая чувствительность к ингибирущему действию Са2+ (полумаксимальное ингибирование при 1 цМ Са2+) была показана для На+,К+-АТРазы мембран эритроцитов яри добавлении к ним очищенного белкового Са2+-зависимого ингибитора кальнашина, выделенного из цитоплазмы эритроцитов Б.И., 1988). Это свидетельствует о

полной сохранности эндогенных Са2+-зависимых регуляторов в мембранах перфорированных сапонином эритроцитов и о высокой степени приближения к нативным условиям регуляции Ка+,К+-АТРазы в избранной нами экспериментальной модели.

Наблюдавшаяся активация Ш+,К+-АТРазы ионами Са2+ в присутствии 370 цМ качественно близка к той, которая

наблюдалась ранее в мембранах синаптосом мозга крыс в отсутствие

Ca2+-Mg2+-EGTA-6y®epa (Powis D.A. et al., 1983) и в замкнутых тенях эритроцитов (Fostnov Yu. V. et al., 1977; Орлов С. H., Шевченко А. С., 1978). В этих исследованиях не поддерживались точно заданные концентрации Са2+ с внутренней стороны мембран из-за отсутствия кальциевого буфера (Powis D.A. et al., 1983) и неконтролируемого снижения концентрации свободного кальция внутри замкнутых теней эритроцитов, вследствие работы Са2+-насоса (Postnov Yu. V. et al., 1977; Орлов С. Н., Шевченко А. С., 1978). Однако область концентраций Са2+, максимально активирующих Ыа+,К+-АТРазу (0.4-0.5 цМ) совпала с полученными нами данными (Рис.4). Активация Ыа+,К+-АТРазы наблюдалась также в эритроцитах под действием разбавленной сыворотки крови (Chlpperiield A.R.,

1983), в гепатоцитах под действием вазопрессина, ангиотензина II и норадреналина (Wong Sh.M.E., Chase H.S., Jr., 1988; Berthon В. et al., 1983; Capiod Th. et al., 1985; Lynch C.J. et al., 1986; Lynch C.J. et al., 1987), в лимфоцитах - под действием лектинов-митогенов (Averdunk R., Laul P.К., 1975; Гуковская А.С.,

о .

1984), агентов, повышающих концентрацию Са в цитозоле.

Поскольку активация и ингибирование Na+,K+-ATPa3H ионами Са2+

полностью устранялись после отмывки мембран средой с EGTA, то можно считать, что в бескальциевой среде от мембран отмываются по крайней мере два регулятора Na+,К+-АТРазы - известный ингибитор кальнактин (Ylngat D.R., 1988) и неизвестный активатор. Существенные различия в действии активатора в эритроцитах, полученных от разных животных в разные дни, говорят о том, что его количество и/или активирующая способность модулируются дополнительными факторами. Отсутствие активации фермента при низкой концентрации Mg2"1" дает возможность предположить, что действие активатора может регулироваться системой фосфорилирования-дефосфорилирования белков, ферменты которой (протеинкиназы, протеинфосфатазы и нуклеотидциклазы) обычно активируются достаточно высокими концентрациями Mg2"1" (Nestler Е. I., GreengardP., 1984; Clari G. et al., 1987). Кроме того, возможно, что ионы Mg2* сами могут модулировать связывание активатора с мембраной или ферментом.

Учитывая относительно слабое действие ингибитора кальнактина при выраженном эффекте активатора в присутствии высокой концентрации fig2"1" (Рис.5), можно предполагать, что существуют конкурентные взаимодействия между двумя Са2+-зависимыми регуляторами за места связывания с Иа+,К+-АТРазой. При этом

активатор- имеет более высокое сродство к Са , а действие ингибитора в его присутствии (или в присутствии Mg24") существенно подавляется.

Влияние Са2+-зависимого эндогенного ингибитора Na+,К+-АТРазы на чувствительность фермента к уабаину, Na+, К+ и фуросемиду. Ыа+-АТРаза.

Известный теперь ингибитор Ыа+,К+-АГРазы - кальнактин - не был в свое время исследован в отношении его влияния на сродство АТР-азы к Na+, К+ и уабаину, что является необходимым при оценке его эффективности в условиях in vivo. В работах по исследованию действия этого ингибитора для идентификации активности Ыа+,К+-АТРазы использовали уабаин (Yingst D. R., 1988), хотя не было изучено действие кальнактина на чувствительность фермента к уабаину и не учитывалось влияние уабаина на Са2+-АТРазу. Поэтому все это могло способствовать искажению истинных свойств кальнактина. С другой стороны, в наших экспериментах измерение активности' На+,К+-АТРазы как Ка+-зависимой компоненты общей АТР-азной активности могло быть артефактным, если бы в эритроцитах существовала так называемая Na+-ATPa3a (Proverbio F. et al., 1982; Marín R. et al., 1985; Proverbio Y. et al., 1991), обнаруженная в Сазолатеральных мембранах эпителиальных клеток нефронов крысы и морской свинки. Фуросемид в концентрации 1-2 тМ был предложен для ее идентификации. Активность этого фермента наблюдалась только в присутствии микромолярных концентраций Са2+ (25-28 |Ш), не подавлялась уабаияом и полностью ингибировалась 1 тМ фуросемидом и этакриновой кислотой.

Поэтому мы исследовали влияние эндогенного Са2+-зависимого ингибитора на сродство Ш+,К+-АТРазы к Na+, К+ и уабаину, а также проверили возможность существования в эритроцитах Ка+-АТРазы.

При исследовании сродства Ыа+,К+-АТРазы к ионам натрия и калия в присутствии 10 цМ Са2+ было обнаружено, что сродство фермента к К+ резко снижалось. В этих условиях величина полумаксимальной активации для К+ возрастала до 42 тМ (Рис.6, кривая 2), в то время как в бескальциевой среде она составляла менее 1 шМ (Pressley Т.А., 1988). Полумаксимальная активация ионами натрия в присутствии 10 цМ Са достигалась при 15 тМ (Рис.б). Такое же значение было получено нами в экспериментах с

бескальциевой средой при идентичном соотношении концентраций Na+ и К+.

При микромолярных концентрациях Са2+ в перфорированных сапонином эритроцитах 1 шМ уабаин ингибировал

J/_ ^^WK.mM лишь 65% активнос-

° V12S 20/< 10 50/JOO 65/65 6VS0 IC0/30 <25/5 Na"1" К"^"—АТРЭЗЫ

(Таблица 1). При

Рис.6. Зависилостъ активности Sa+,К+-АТРаэы от Na/K-соотношения в эритроцитах (1,2) и лелбрашх, отлитых средой с EGTA (3,4). [Са2*1 = 0 (1,3) и 10 \iM (2,4).

2+

Таблица 1. Влияние микромолярных концентраций Са на ингибирование Ш+,К+-АТРазы уабаином и фуросемидом.

Процент ингибирования

[Са2+], Перфорированные эритроциты Мембраны, отмытые с EGTA

цМ

+1 тМ уабаин +1 тМ фуросемид +1 тМ уабаин и 1 тМ фуросемид +1 гпМ уабаин

1.0 100 33.3 100 100

5.0 91.2 23.0 100 100

10.0 65.0 100 100

60.0 65.0 100 100

[Са2+] < 1 [Ш уабаин в этой концентрации полностью подавлял активность На+,К+-АТРазы. При [Са2+] = 5-60 цМ ингибирование снижалось от 90 до 65%. При одновременном использовании уабаина и фуросемида 1 гпМ фуросемид при [Са2+] = 5-60 цМ ингибировал рОши-нечувствительну» составляющую активности Ма+.К+-АТ?азы.

jnmoiPi/Uap-i

После отмывки мембран средой с 2 mM EGTA активность Na+,K+-ATPa3H и ее чувствительность к уабаину уже не зависели от присутствия Са : полумаксимальная активация для ионов калия составляла менее 1 mM, а уабаин полностью ингибировал активность фермента (Рис.б, Таблица 1). Действие самого фуросемида слабо зависело от Са2+. При [Са2+] = 0.1-5.0 цМ наблюдалось частичное ингибирование активности Na+,K+-ATPa3H от 17 до 40%, максимальное при 0.7 |Ш Са в области наблюдаемой нами Са -зависимой

Полученные . данные показали, что эндогенный ингибитор, скорее всего - калъ-нактин, в присутствии микромолярных концентраций Са2+ резко снижает сродство Ыа+,К+-АТРазы к К+ (величина полумаксимальной активации для ионов калия возрастает от 0.5 до 42 mM). Это говорит о Рис.7. Действие фуроселида на активность Na+,К+-АТРазы эритроцитов при концентрациях Са?+ = 0.1-5.0 1 - контроль, 2 - + 1 тМ фуроселид.

том, что в условиях in vivo, где активирующая фермент концентрация К+ с внешней стороны составляет 5 mM, ингибитор может практически полностью подавлять активность Ыа+,К+-АТРазы и приводить к выравниванию градиентов Na+ и К+ через плазматическую мембрану. Из Рис.6 видно, что ингибирование в области 5 шМ К+ составляет около 95%. Снижение сродства к К+ в присутствии Са2+ и эндогенного ингибитора хорошо коррелирует со снижением сродства к уабаину, который, как известно, взаимодействует с К+-связывающим участком молекулы фермента. Последний результат позволяет объяснить некоторые расховдения с данными (Yingst D.R., 1988) о степени ингибирования Иа+,К+-АТРазы кальнактином, так как авторы использовали уабаин для идентификации активности фермента,, не проверив эффект кальнактина на сродство к уабаину. •

активации фермента (Рис.7, кривая 2).

Показанное нами снижение сродства Na+,K+-ATPa3H к уабаину и К+ в присутствии микромолярных концентраций Са2+ и эндогенного ингибитора может, вероятно, внести коррективы в интерпретацию данных о существовании так называемой На+-АТРазы (Proverbio Р. et al., 1982; Marín R. et al., 1985; Proverbio F. et al., 1991). Активность этого фермента выявлялась только при изоляции мембран в присутствии микромолярннх концентраций Са2+ и устранялась при отмывке мембран средой с EDTA. Этот фермент был нечувствителен к уабаину, но полностью ингибировался 1 гаМ фуросемидом или этакриновой кислотой. В наших экспериментах на эритроцитах остаточная активность Ыа+,К+-АТРазы также полностью подавлялась 1 шМ фуросемидом в присутствии 10 цМ Са и 1 тМ уабаина. В итоге полученные нами характеристики этой остаточной активности Иа+,К+-АТРазы совпали с описанными свойствами Иа+-АТРазы. Такое совпадение ставит под сомнение существование Na+-ATPa3U. Полученные результаты свидетельствуют о том, что эндогенные Са2+-зависимые регуляторы могут не только изменять активность Na+,K+-ATPa3H, но также модулировать ее чувствительность к сердечным гликозидам и диуретикам типа фуросемида.

Влияние сАМР на Са2+-зависимую регуляцию Na+,K+-ATPa3H.

При исследовании действия сАМР-зависимой протеинкиназн А на активность Ыа+,К+-АТРазы было показано, что сАМР в концентрации 10 цМ подавлял активность фермента в перфорированных эритроцитах до 40% в бескальциевой среде, снимал Са -зависимую активацию при 0.5-0.7 |iM Са и мог восстановить Са -зависимое ингибирование почти до 100% при 1-2 рМ Са2+ (Рис.8). Однако, как и при активации Na+, К+-АТРазы 0.5-0. Y llM Са2+, мы наблюдали индивидуальные различия в степени подавления Са -зависимой активации фермента, что указывает на существование других факторов, участвующих в регуляции Na+,K+-ATPa3a.

Но, тем не менее, в 10% экспериментов наблюдалась активация Na+ ,К+-АТРазы в присутствии 10 |iM сАМР. Известно, что Ыа+,К+-АТРаза может фосфорилироваться не только протеинкиназой А, но и протеинкиназой С. По-видимому, активность фермента и его доступность для того или иного агента зависят не только от наличия эндогенной регуляции, но и от его состояния фосфорилированного или дефосфорилированного - в момент забора крови. Вполне возможно, что у протеинкиназ С и А одни и те же

ртоЕР^лэр-мин

^imoíí^/иэр-МИН

500 400

200 400-

0+4V

W"7

n-6

Flic. 8. Дьистбь¡в с AMP на Ca"-эависилую активацию Na+ ,К+-АТРазы эритроцитов. Сплошная линия контроль, штриховая - в присутствии Ю |JJ сАМР. а-в - варианты для разных образцов в разные сезоны.

места фосфоршшрования Na+,K+-ATPa3H (Ser- и Thr- остатки), но расположенные в разных участках молекулы фермента, и, вследствие этого, различное действие. Поэтому первоочередность действия той или иной протеинкиназы и предопределяет дальнейший статус Na+,К+-АТРазы в условиях in vitro независимо от экстраклеточных добавок.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе был предложен и использован метод измерения активности ионтранспортирующих АТР-аз, позволяющий исследовать механизмы регуляции активности Ыа+,К+-АТРазы мембран эритроцитов крысы в условиях, возможно максимально приближенных к нативным.

Проведено детальное исследование действия физиологических концентраций ионов Са2+ на активность На+,К+-АТРазы

плазмзтических мембран эритроцитов. Впервые было показано, что в активации иа+,К+-АТРазы участвует Са2+-зависимый белок-активатор, проявляющий свое действие при весьма низких концентрациях Са (< 1 цМ). При более высоких концентрациях ионов Са2+(> 1 цМ) в процесс регуляции фермента включается ингибитор Na+,K+-ATPa3H -кальнактин, существенно снижающий сродство фермента к К+ и уабаину.

Физиологические концентрации Mg2"*" (300-500 цМ) являются необходимым условием для функционирования белка-активатора. Снижение концентрации магния до 50 цМ устраняет действие активатора и выявляет эффект ингибитора фермента даже при низких концентрациях Са2+ (< 1 |iM). Высказано предположение, что регуляция активности Na+,К+-АТРазы Са2+-зависимыми факторами модулируется системой фосфорилирования-дефосфорилирования, чувствительной к ионам магния.

Тщательные исследования регуляции активности Ыа+,К+-АТРазы позволили сделать ряд существенных выводов методического характера, которые необходимо учитывать при постановке экспериментов с АТР-азами: 1) Сравнение свойств Na+,K+-ATPa3bi, проявляющихся в присутствии микромолярных концентраций Са2+, со свойствами описанной ранее Иа+-АТРазы показало их идентичность. На этом основании сделано заключение, что существование последней может быть артефактом. 2) Было обнаружено, что уабаин в условиях, сохраняющих внутриклеточные регуляторные факторы, может влиять на активность Са2+-АТРазы, что осложняет использование его для идентификации Na+,К+-АТРазы в присутствии микромолярных концентраций Са2+.

Было изучено действие диуретика фуросемида на активность Na+,K+- и Са2+-АТРаз. Фуросемид значительно повышал сродство Na+,К+-АТРазы к Na+ в бескальциевой среде, тогда как в присутствии Са2+ фуросемид практически не оказывал на него влияния. Эффект же фуросемида на Са2+-АТРазу не отличался от эффекта уабаина и так же зависел от Са2+.

■ВЫВОДЫ

1. Разработан метод измерения активности ион-транспортных АТР-аз эритроцитов, позволяющий сохранить эндогенную Са2+- зависимую регуляцию ферментов. Метод основан на перфорировании

эритроцитов сапонином в среде с заданными параметрами (рН, концентрации ATP, EGTA, Са2+, Mg2"1", К+, Na+ и т.д.) при использовании двойного буфера (цитрат-EGTA) для поддержания концентраций ионов Са2+ в широком диапазоне. .

2. Показано, что специфический ингибитор Ыа+,К+-АТРазы уабаш оказывает влияние на активность Са2+-АТРазы, а именно: при [Са2+] < 0.7 (iM уабаин активирует Са2+-АТРазу, а при [Са2+] > 0.7 цМ - ингибирует ее. Выявлено, что влияние уабаина опосредовано Са2+-зависимыми белками-регуляторами. Влияние уабаина на активность Са2+-АТРазы свидетельствует о некорректности использования уабаина для идентификации Ыа+,К+-АТРазы в присутствии микромолярных концентраций Са2+ на фоне Са2+-АТРазы.

о.

3. В эритроцитах кроме известного Са -зависимого ингибитора -кальнактина - существует Са2+-зависимый активатор Na+,K+-ATP-азы. Эти регуляторы обладают различиями в сродстве к Са2+ и к На+,К+-АТРазе, что позволяет набдюдать эффект активатора при концентрации Са 0.4-0.7 рМ и конкуренцию с ним ингибитора при более высоких концентрациях Са2+.

4. Активирующее действие ионов Са2+ существенно зависит от присутствия ионов Mg2"1". Активация Ыа+,К+-АТРазы наблюдается при физиологических концентрациях ионов Mg2"1" - 370 цМ. Снижение концентрации Mg2"1" устраняет действие активатора и многократно усиливает эффект ингибитора.

5. При микромолярных концентрациях Са2+ эндогенный ингибитор, возможно кальнактин, существенно снижает сродство Ыа+,К+-АТРазы к К+ и уабаину, более чем в 100 раз увеличивая величину полумаксимальной активации фермента для ионов калия и на треть снижая ингибирумцее действие уабаина. Выявленные свойства уабаин-нечувствительной компоненты активности Ыа+,К+-АТРазы в присутствии микромолярных концентраций Са2+ и эндогенного ингибитора совпадают со свойствами описанной ранее На+-АТРазы, что ставит под сомнение существование последней.

6. Показано, что фуросемид, предлагаемый ранее для идентификации Na+-ATPa3H, активирует Na+,K+-ATPa3y в бескальциевой среде и вызывает значительное проявление ее активности при концентрации Na+ до 3 тМ, когда активность фермента практически не выявляется. Это может свидетельствовать скорее всего о повышении сродства Ыа+,К+-АТРазы к ионам Na+.

-197. Поскольку изменение концентрации от 50 до 600 |Ш не оказывает влияния на Ка+-зависимую АТР-азную активность, то не подтверждается существование в эритроцитах Ш+Л^-АТРазы.

8. При действии 10 цМ сАМР наблюдается подавление активности фермента в перфорированных эритроцитах до 40% в бескальциевой среде, снижение Са -зависимой активации при 0.5-0.7 рМ Са2+. и восстановление Са2+-зависимого ингибирования почти до 100% при 1-2 рМ Са2+.

9. Действие фуросемида на активность Са2+-АТРазы сходно с действием уабаина в среде без натрия (т.е. в отсутствие активности №+,К+-АТРазы) и этот эффект так же зависит от

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Петруняка В.В., Панкшкина Е.А., Северина Е.П. Активация и ингибирование Ыа+,К+-АТРазы мембран эритроцитов эндогенными Са2+-зависимыми регуляторами. Ca -зависимое действие уабаина на Са2+-АТРазу. // Биологические мембраны, 1990, т.7, N4, стр.352-358.

2. V.V.PetrunyaKa, E.A.Panyushkina, Е.Р.Severine and. S.N.Orlov.

The ATPase activity of saponin-treated rat erythrocytes: regulation by monovalent cations, calcium, ouabain, and furosemide. // Biochlmica et Biophysica Acta, 1990, 1030, 279-288.

3. Панюшкина Е.А., Петруняка B.B., Северина Е.П., Орлов С.Н. Влияние фуросемида на активность Иа+,К+-АТРазы и Са2+-АТРазы мембран эритроцитов крысы. // Цитология, 1990, т.32, N9, стр.943-944.

4. Петруняка В.В., Панкшкина Е.А., Северина Е.П. Ингибирование и активация Na+ ,К+-АТРазы мембран эритроцитов крысы Ca , Mg24" и сАМР-зависимыми эндогенными регуляторами. // Цитология, 1990, Т.32, N9, стр.945-946.

5. Петруняка В.В., Панюшкина Е.А. Оценка роли эндогенных Са2+-зависимых регуляторов и протеинкиназ в активации и ингибировании ионтранспортных АТРаз. // Цитология, 1991,

т.33, N11, стр.49-54.

6. Петруняка В.В., Панюшкина Е.А. Взаимодействие Са2+ и протеинкиназ в регуляции ионтранспортируицих АТР-аз

плазматических мембран. // Биологические мембраны, 1991, т.8, N11, стр.1138-1139.

7. Панюшкина Е.А., Петруняка В.В. Эндогенный Са2+-зависимый ингибитор Ма+,К+-АТРазы эритроцитов изменяет чувствительность фермента к уабаину, калию и фуросемиду. // Биологические мембраны, 1994, т.11, N1, стр.Т-11.

22.II.94 г. Зак.бЗбОР. ТирЛбО экз. Уч.-изд.л. 1.0 Отпечатано на ротапринте в ОБТИ Щ РАН