Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование состояния системы Са2+-обмена в клетках крови облученных сельскохозяйственных животных

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование состояния системы Са2+-обмена в клетках крови облученных сельскохозяйственных животных"

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ 1ШСТИТУ Г СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ РАДИОЛОГИИ И АГРОЭКОЛОГИИ

/Го ОД 2 5 Г£К Ш

На правах рукописи КОБЯЛКО ВЛАДИМИР ОЛЕГ ОВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЕ СОСТОЯНИЯ СИСТЕМЫ Са2+-ОБМЕНА В КЛЕТКАХ КРОВИ ОБЛУЧЕННЫХ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

Специальность 03.00.01 - радиобиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Обнинск - 2000

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском инстн те сельскохозяйственной радиологии и агроэкологии РАСХН

Научные руководители:

аческих наук А.С. Шевченко Доктор Ьиологнческих наук Л.Н. Ульяненко

Официальные оппоненти:

Доктор биологических наук Ю.А. Семин

(МРНЦ, РАМН, г. Обнинск) Доктор ветеринарных наук, профессор Н.Н. Исамов (ВНИИСХРАЭ, г. Обнинск)

Ведущее учреждение: Московский государственный

университет им. М.В. Ломоносова, РАН, г. Москва

Защита диссертации состоится « К /-г 2000 г. в час на заседай! Диссертационного совета по радиобиологии Д 120.81.01 при Всероссийскс научно-исследовательском институте сельскохозяйственной радиологии и агр экологии Российской академии сельскохозяйственных наук по адресу: 24902 Калужская обл., г. Обнинск, ВНИИСХРАЭ, Диссертационный совет Д 120.81.01.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского нау но-исследовательского института сельскохозяйственной радиологии и агроэк логии.

Отзывы на автореферат просим направлять по адресу: 249020, Калужсю обл., г. Обнинск, ВНИИСХРАЭ, Диссертационный совет Д 120.81.01.

Автореферат разослан

» ' 2000 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук,

профессор Н.И. Санжарова

г-.Л/'С 1

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Действие ионизирующей радиации на биологические системы определяется комплексом структурных и функциональных изменений на молекулярно-клеточном уровне. Многочисленными исследованиями показано, что радиочувствительными процессами на уровне клеток являются обмен нуклеиновых кислот, синтез белков, обмен липидов и углеводов, состояние ферментативных систем, проницаемость плазматической мембраны для ионов и другие реакции (Коггл Дж., 1986; Кудряшов Ю.Б., Беренфельд Б.С., 1982; Стрельцова В.Н., 1987). Известно, что физиологическая активность большинства клеток в организме млекопитающих контролируется рядом универсальных регуляторных механизмов, к которым относятся системы циклического адено-зинмонофосфата (цАМФ), внутриклеточного Са2+-обмена, обмена фосфсггиди-линозшюлов, Ыа^^-обмена и др. (Воейков В.А., 1984; Орлов С.Н., 1981; Berridge M.J., 1984; Irvine R.F., 1984). Среди них несомненный интерес представляет система поддержания внутриклеточной концентрации ионов Са2+, поскольку, с одной стороны, кальций в ионизированной форме является универсальным внутриклеточным регулятором. С другой, при различных повреждениях организма Са2+ в зависимости от уровня его накопления в цитоплазме, обусловленного воздействием поражающих факторов, может выступать и в качестве цитотоксического агента (Орлов С.Н., 1987; Rasmussen Н., 1989; Farber J.L., 1981). В связи с этим оценка особенностей функционирования и степени модификации подобных регуляторных систем может быть использована для выяснения молекулярно-клеточных механизмов действия ионизирующих излучений на организм в целом.

В настоящее время разработаны различные методические подходы, позволяющие корректно оценить состояние системы поддержания Са2+-гомеостаза в клетках организма лабораторных животных и человека (Покудин Н.И., 1986; 1987; Tsien R.Y., 1982; Cobbold Р.Н., 1987). Получены данные о модификации системы Са2+-обмена в результате воздействия широкого спектра повреждающих факторов физической и химической природы, а также при развитии ряда заболеваний (Древаль В.И., 1992; Шевченко A.C., 1980; Шевченко A.C., 1990; Carafoli Е., 1987; Färber J.L., 1981; Suko J., 1971). В то же время информация об исследовании показателей системы Са2+-обмена в клетках сельскохозяйственных животных в норме и при облучении практически отсутствует.

Вместе с тем, значение исследований в этой области возросло в связи с возникновением постоянно действующего радиационного фактора, обусловленного масштабным загрязнением ряда регионов Российской Федерации вследствие аварии на Чернобыльской АЭС. Длительное нахождение сельскохозяйственных животных на загрязненных радионуклидами территориях потребовало оценки влияния внешнего и внутреннего облучения на различные системы организма. При этом следует учесть, что закономерности биологического действия ионизирующих излучений на сельскохозяйственных животных действительно детально изучены в целом ряде работ (Пяткин В.К., Баранов А.Е., 1980; Сироткин А.Н., 1987; Исамов H.H., 1989; Киршин В.А., Бударков В.А., 1990; Круглнков Б.П., 1990); предложены различные эффективные методы оценки

физиологического состояния организма при остром облучении в больших дозах. Тогда как для малых доз острого и хронического облучения, которые формируют у животных "скрытые" повреждения органов и тканей, разработанные методы прогнозирования исхода лучевого поражения могут быть недостаточно информативны.

Именно поэтому большой научный и практический интерес представляет разработка методов определения параметров системы Са2+-обмена в клетках крови сельскохозяйственных животных и оценка этих показателей при действии ионизирующего излучения.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось исследование состояния системы Са -обмена в клетках крови интактных и облученных сельскохозяйственных животных.

В соответствии с поставленной целью решались следующие основные задачи:

- Разработать метод определения показателей системы Са2+-обмена в эритроцитах н нейтрофилах периферической крови овец и коров.

- Изучить состояние параметров системы Са2+-обмена в клетках крови овец при внешнем тотальном у-облучении.

- Оценить показатели системы Са2+-обмена в эритроцитах и нейтрофилах овец при действии пролонгированного облучения в малых дозах.

- Исследовать проницаемость плазматической мембраны эритроцитов для Са2+ в клетках крови коров в хозяйствах с радиоактивным загрязнением территории после аварии на ЧАЭС.

Научная новизна. Разработан метод оценки состояния системы обмена в эритроцитах и нейтрофилах коров и овец. Определены начальная скорость накопления и скорость входа 45Са, а также концентрация Са2' в клетках. Показано, что проницаемость мембран клеток интактных жвачных животных для Са2+ ниже, чем у других млекопитающих (человек, лабораторные животные).

Установлено, что внешнее к-°блучение овец в дозах от 30,96 до 154,8 мКл/кг приводит к фазовым изменениям показателей системы Са2+-обмена в радиочувствительных и радиорезистентных клетках крови. Увеличение проницаемости плазматической мембраны и концентрации ионизированного Са2* в цитоплазме эритроцитов и нейтрофилов обнаруживается уже с первых суток после облучения организма.

Отмечено изменение проницаемости плазматических мембран клеток для

Са2+

при пролонгированном облучении овец в дозах 2,58 и 12,9 мКл/кг

Выявлены различия в ответной реакции клеток периферической крови овец при действии острого и пролонгированного у-облучения.

Установлено, что у сельскохозяйственных животных при длительном содержании на загрязненных радионуклидами территориях формируются "скрытые" нарушения, которые проявляются в увеличении проницаемости плазматической мембраны эритроцитов для Са2*.

Теоретическая и практическая значимость. В работе решена важная для сельскохозяйственной радиобиологии научная проблема, связанная с изучением основных параметров системы Са2+-обмена в клетках крови продуктивных

животных, которые характеризуют степень ее нарушения при остром и хроническом облучении в широком диапазоне доз.

Определены основные параметры модификации системы Са2+-обмена при остром (30,96-154,8 мКл/кг) и пролонгированном (2,58 и 12,9 мКл/кг) облучении. Установлена зависимость, в ранние сроки наблюдений, изменений показателей внутриклеточного Са2+-обмена от дозы острого внешнего у-облучения животных.

Показатели системы Са2+-обмена могут быть использованы для исследования физиологического состояния продуктивных животных при ведении животноводства на радиоактивно загрязненных территориях.

Разработанные методы могут бьггь рекомендованы для оценки воздействия различных физических и химических факторов на организм сельскохозяйственных животных, как в научных исследованиях, так и при выполнении учебных программ биологических ВУЗов.

Основные положения выносимые на защиту:

• Система Са2+-обмена в клетках крови овец и коров, по сравнению с лабораторными животными и человеком, характеризуется низкими величинами проницаемости мембран для Са2+.

• Внешнее у-облучение овец в дозах 30,96-154,8 мКл/кг приводит к фазовому нарушению функционирования системы поддержания внутриклеточного Са2*-гомеостаза в клетках крови. Нарушение внутриклеточного Са2+-гомеостаза при облучении животных обусловлено увеличением проницаемости плазматической мембраны для ионов Са2+.

• Пролонгированное у-облучение овец в дозах 2,58 и 12,9 мКл/кг характеризуется изменением Са2+-обмена как в радиочувствительных клетках (нейтро-филы), так и в радиорезистентных (эритроциты).

• Длительное содержание сельскохозяйственных животных на радиоактивно загрязненных территориях приводит к изменению проницаемости плазматических мембран для Са2+ в клетках крови и формированию "скрытых" внутриклеточных нарушений.

Апробация диссертации. Основные положения диссертационной работы доложены на межлабораторном научном семинаре ВНИИСХРАЭ 27 июля 2000 г и представлены в материалах П-го и Ш-го Всесоюзного Радиобиологического съезда (1993 г., 1997 г.), П-Обнинского симпозиума по радиоэкологии (1996 г.).

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 9 статей в журналах "Сельскохозяйственная биология", "Радиационная биология. Радиоэкология", "Доклады ВАСХНИЛ", "Доклады РАН", "Физическая медицина" и И тезисов в материалах конференций и симпозиумов в 1993-2000 гг.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материала и методик исследования, результатов собственных исследований, заключения и списка литературы. Работа изложена на 104 машинописных страницах, иллюстрирована 11 таблицами и 12 рисунками. Список литературы содержит 159 источников.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Экспериментальные исследования выполнены на 32 овцах породы прекос в возрасте 1-2-х лет, подобранных по принципу аналогов, а натурные - на 40 коровах черно-пестрой породы.

Овцы содержались на рационах, сбалансированных по основным питательным веществам согласно нормам Всероссийского института животноводства в условиях вивария ВНИИСХРАЭ.

Модельные исследования включали две серии экспериментов. Первая серия была проведена на 20 овцах (5 групп по 4 животных), 16 из которых были подвергнуты внешнему тотальному у-облучению в дозах 30,96 - 154,8 мКл/кг, а остальные являлись контролем.

Вторую серию экспериментов проводили на 12 овцах. Подопытные животные (по 4 головы в группе) были подвергнуты пролонгированному у-облучению в дозах 2,58 мКл/кг (в течение 10 часов непрерывно) и 12,9 мКл/кг (в течение 5 сут, по 10 часов в сут). Группа из 4-х овец являлась контролем в течение всего эксперимента. Обследование животных начинали через сутки после окончания облучения.

Животных подвергали внешнему у-облучению на установке ГУЖ-24 с источником излучения I37Cs с энергией у-квантов 0,67 мэВ. Доза облучения определялась целями исследования. Мощность дозы излучения составляла при острой облучении овец 7,2-10,8 мкА/кг, а в опытах с пролонгированным облучением - 7,17 х 10'2 мкА/кг.

Обследование коров проводили в 3 хозяйствах Новозыбковского района Брянской области с различными плотностями радиоактивного загрязнения пастбищных угодий, сформировавшихся через 10 лет после аварии на ЧАЭС. В колхозе "Новая жизнь" загрязнение пастбищ по U7Cs не превышало 185-555 кБк/м2 (годовая доза облучения животных 1,5-4,5 мГр), в опытном хозяйстве "Боевик" уровни загрязнения колебались от 370 до 740 кБк/м2 (годовая доза облучения животных 3-6 мГрХ а наибольшее загрязнение территории имело опытное хозяйство "Волна революции" (740-1480 кБк/м2) (годовая доза облучения животных 6-12 мГр). Контрольным хозяйством было выбрано ОПХ "Кривское" Боровского района, Калужской области.

В качестве объектов исследования использовали популяции клеток крови: эритроциты и нейтрофилы. Кровь сельскохозяйственных животных отбирали из яремной вены. Антикоагулянтом служил цитрат натрия в конечной концентрации 0,38%. Эритроциты , тромбоциты и лейкоциты осаждали при 2000 g , 15 мин на центрифуге S-70 (ГДР). Плазму и слой клеток, содержащий тромбоциты и лейкоциты, отбирали в отдельные пробирки, а эритроциты промывали 3 раза раствором А (150 мМ NaCl и 5 мМ Na3P04, pH 7,4 при t=4°C) при 2000 g, 5 минут на центрифуге К-80, и хранили на холоду до проведения дальнейших исследований (Сунгуров Ю.А., 1985). Лейкоциты и тромбоциты ресуспендировали в 5 мл раствора В (140 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1 мМ MgCl2, 0,5 мМ СаС12, 10 мМ глюкозы, 1мМ Na2HPO,t и 10 мМ К-2-гидроксиэтилпиперазин-Ы'-2-этановая кислота NaOH, pH 7,4) и наслаивали на 3 мл раствора Фиколл-Пака (Воyum J.,

1986). Разделение клеток проводили на центрифуге S-70 при 500 g, 25 мин. Слой лимфоцитов и тромбоцитов, а также осадок нейтрофилов и эритроцитов подвергали 30-ти секундному гипотоническому лизису в 10 объемах Н2Од при 4°С, с последующим восстановлением осмомолярности раствором В 4-х кратной концентрации. Чистые популяции нейтрофилов и лимфоцитов промывали 2 раза в растворе В, при 100 g, 5 мин, и использовали в дальнейших экспериментах.

Динамику накопления 43Са в эритроцитах и нейтрофилах сельскохозяйственных животных оценивали следующим образом. Эритроциты овец, нагруженные квином-2, который использовали для увеличения концентрации внутриклеточного обмениваемого Caî+ (Покудин Н.И., 1986), помещали в раствор В и осаждали при 2000 g, 5 мин. Осадок ресуспендировали и операцию повторяли 2 раза. Отмытые эритроциты переносили в раствор В, содержащий 74-148 кБк/мл 45СаС12, 1 мМ СаС12 (концентрация СаС12 в ряде экспериментов варьировалась от 0,1 до 5 мМ) и инкубировали при 37°С в течение 240 мин. Часть эритроцитов инкубировали с ингибитором Ca2+-Mg2+-ATOa3Li ортованадатом натрия (Na3V04). Через определенные интервалы времени аликвоты клеток помещали в 2 мл раствора А с 0,1 мМ ЭДТА и избавлялись от 45Са, осаждая клетки при 2000 g, 5 мин. Эту процедуру проводили 3 раза, каждый раз, удаляя надоса-дочную жидкость. К полученной эритроцитарной суспензии добавляли 0,4 мл 0,25% раствора тритона Х-100 и 0,5 мл 10% уксусной кислоты. Образцы центрифугировали при 2500 g, 20 мин и отбирали 0,9 мл над осадочной жидкости для измерений.

Нейтрофилы помещали в раствор Bel мМ СаС12 (конечная концентрация клеток в среде 0,5-1,0 х 106 кл/мл) и инкубировали 20 мин при 37°С. Клетки осаждали при 100 g, 5 мин, ресуспендировали и добавляли 0,5 мл раствора, содержащего 74-148 кБк/мл 45СаС12, различные концентрации Na3V04 (0,5-16 мМ) и инкубировали 240 мин при 37°С. Через определенные интервалы времени реакцию останавливали 1 мл раствора А с 0,1 мМ ЭДТА, осаждая клетки при 100 g, 5 мин. Процедуру повторяли 3 раза, каждый раз, удаляя надосадочную жидкость. Клетки разрушали добавлением 0,4 мл 0,25% раствора тритона Х-100 и 0,5 мл 10% трихлоруксусной кислоты. Образцы центрифугировали при 2500 g, 20 мин и отбирали надосадочную жидкость. Измерение активности образцов проводили на жидкостно-сцинтилляционном счетчике SL-4220 (Intertechnique, Франция).

Общее количество лейкоцитов и нейтрофилов в выделенной суспензии определяли в камере Горяева (Кост Е.А., 1975). Количество эритроцитов рассчитывали по величине гематокрита. Экспериментальный материал был обработан методом вариационной статистики (Корн Г., 1984). Различия значений считали достоверными при Р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

РАЗРАБОТКА МЕТОДА ОЦЕНКИ ПОКАЗАТЕЛЕЙ Са2+-ОБМЕНА В КЛЕТКАХ КРОВИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

Одной из проблем, затрудняющих изучение состояния внутриклеточного Са2+-гомеостаза, является незначительное поступление кальция в клетку, обусловленное, с одной стороны, низкой проницаемостью цитоплазматических мембран для катиона, а с другой, эффективной работой "Са^-насоса", направленной на удаление его из цитоплазмы.

Методологические подходы к определению параметров системы Са*-обмена с помощью 45СаС12 в эритроцитах человека и лабораторных животных детально изложены в работах коллектива авторов во главе с Орловым С.Н. и основываются на применении специфических хелаторов Са2* (квина-2, фура-2 и др.), которые, проникая в клетку, увеличивают величину внутриклеточного накопления катиона или использовании ингибиторов Са2+-АТФазы, одним из которых является ортованадат натрия (Ыа3У04). В то же время для сельскохозяйственных животных методы определения основных параметров системы Са2*-обмеиа не разработаны.

На рис. 1,2 представлены данные накопления 45Са в эритроцитах и ней-трофилах сельскохозяйственных животных. Оказалось, что в нативных эритроцитах овец, как и лабораторных животных, без использования специфического хелатора Са2+ - квина-2, или ингибитора Са2+-АТФ-азы - ортоваладата натрия невозможно получить достоверное значение величины накопления изотопа в цитоплазме даже в течение 240 минут инкубации (Покудин Н.И., 1988). Кроме того, определение скорости входа и внутриклеточной концентрации ионизированного Са2+ в эритроцитах сельскохозяйственных животных было сопряжено с радом проблем, обусловленных их видовой принадлежностью, что потребовало поиска отличных, от применяемых для лабораторных животных,

-♦--нативные

25

• • ■ квин-2

--А---ЫаЗУ04

*—квин-2+ИаЗУ04

0 50 100 150 200 250 Время, мин

Рис. 1. Динамика накопления 45Са в эритроцитах овец

концентраций хелатора Са2+ - квина-2 и ингибитора Са2+-АТФазы. В результате было достигнуто отчетливое накопление 45Са в клетках, которое позволило определить основные параметры системы Са2+-обмена (Рис.1).

По кривой, полученной при инкубации эритроцитов с квином-2, мы рассчитывали начальную скорость накопления 43Са, а по кривой при инкубации клеток с ингибитором Са2+-АТФазы -ортованадатом натрия (Ыа3У04) - скорость входа. Обе эти величины мы определяли по формуле (Покудин Н.И., 1986): У=А/(а*ш*1),

где А - активность 45Са (имп/мин) в эритроцитах, через 30-60 мин инкубации; а - специфическая активность среды инкубации (имп/(мин • мМ)); т - количество эритроцитов (л клеток); I - время инкубации, мин.

А по всем трем кривым на участке плато рассчитывали концентрацию ионизированного Са через 120 мин (Рис. 1) по формуле:

[Са2+]1П=115 • А,/(Аз-А2-А,) нм, где А1 - радиоактивность 45Са в эритроцитах предварительно нагруженных квином-2, через 120 мин инкубации; А2 - радиоактивность 43Са в эритроцитах, инкубированных с 4 мМ №3У04, через 120 мин инкубации; А3 - радиоактивность 4 Са в эритроцитах предварительно нагруженных квином-2, инкубированных с 4 мМ Ыа3У04, через 120 мин инкубации.

Время, мин

Рис.2 Динамика накопления "Са в нейтрофилах овец

Использование аналогичных подходов при определении параметров системы Са2+-обмена в нейтрофилах овец показало, что в отличие от эритроцитов, отчетливая динамика накопления 45Са отмечалась в среде без предварительной нагрузки квином-2 (Рис.2). Это позволило рассчитывать как скорость входа 43Са по кривой в нейтрофилах, иикубированных в среде с Ыа3У04, так и начальную

скорость накопления "Са, которая определялась в нативных нейтрофилах, суспендированных в изотонической среде без добавления Ь'азУ04.

Данные скорости входа 45Са и концентрации ионизированного Са2+ в эритроцитах овец и коров представлены в таблице 1. Пассивная проницаемость мембран для Са2+ не различалась для клеток крови овец и коров. Величины начальной скорости накопления 43Са в эритроцитах животных с квином-2, в которых этот показатель состояния системы Са^-обмена является результатом пассивного входа и АТФ-зависимого удаления Са2+ из клеток, так же были сравнимы. В то же время значения величин пассивной проницаемости плазматической мембраны эритроцитов жвачных животных для Са2+ оказались в 2,5-4 раза ниже, по сравнению с результатами определения этих показателей у лабораторных животных и человека (Шевченко А.С.; Кобялко В.О., 1995, 1997), а начальной скорости накопления 45Са ниже на 40-90%. Концентрация ионизированного Са2+ в эритроцитах овец и коров находилась в интервале от 31,0 до 60,0 нМ, а средние величины практически совпадали со значением концентрации ионизированного Са2+ в эритроцитах человека (51,6±5,6 нМ).

Таблица 1. Видовые особенности показателей системы Са2+-обмена в эритроцитах

Вид Начальна! скорость накопления "Са Скорость входа 45 Са, Концешрацш Са2\

мююль/(л клеток • мкиоль/(л клеток • нмоль/я

мин) мин)

Овцы 0,100±0,003 0,28±0,010 51,9±5,б

КРС 0,113±0,007 0,26+0,012 48,4±1,6

Лабораторные 0,190±0,018 0,72±0,030 48,8±4,9

животные

Человек 0,14(Ш),008 1,12±0,140 51,5±5,7

Таким образом, проницаемость мембраны эритроцитов овец и коров для Са2+ оказалась ниже этого показателя для лабораторных животных и человека. В то же время концентрация ионизированного Са2* в цитоплазме (как интегрального показателя внутриклеточного Са2+ обмена) эритроцитов жвачных и других видов млекопитающих не различается. Поэтому можно заключить, что эритроциты жвачных сельскохозяйственных животных характеризуются более низкой активностью АТФ-зависимого "Са2+ -насоса", и именно относительно более низкая мембранная проницаемость обеспечивает поддержание концентрации ионизированного Са2+ в цитоплазме на физиологическом уровне.

ОЦЕНКА ПОКАЗАТЕЛЕЙ СИСТЕМЫ Са2+-ОБМЕНА В ЭРИТРОЦИТАХ И НЕЙТРОФИЛАХ ОВЕЦ ПРИ ТОТАЛЬНОМ ВНЕШНЕМ у-ОБЛУЧЕНИИ

Степень лучевого поражения организма млекопитающих характеризуется уровнем воздействия ионизирующего излучения на клеточные мембраны, которые наряду с ДНК относят к критическим структурам (Кудряшов Ю.Б., 1982;

Бурлакова Е.Б., 1979; Сунгуров А.Ю., 1988). При этом радиоиндуцированные изменения в цитоплазматической мембране определяют модификацию функционирования мембраносвязанных систем регуляции внутриклеточного метаболизма, что приводит к повреждению, а при необратимости вызванных нарушений и к гибели клеток. В этой связи система Са2+-обмена, которая принимает активное участие в регуляции большого числа внутриклеточных процессов, а также способна оказывать цитотоксическое действие, может быть отнесена к числу подобных радиочувствительных систем (Шевченко А.С., 1994).

На рис. 3 представлены результаты определения пассивной проницаемости мембран эритроцитов для кальция у интактных и облученных овец. У ин-тахтных животных скорость входа Са находилась в пределах 0,21-0,23 мкмоль/(л клеток • мин) в течение всего срока наблюдений. В то же время у облученных овец наблюдали зависящее от дозы достоверное увеличение проницаемости плазматической мембраны для Саг+ в первые - третьи сут после воздействия.

• контроль

1 ■—30,96 мКл/кг - -А- -51,6 мКл/гг —х— ] 03,2 мКл/кг

Сроки исследований, сутки Рис. 3. Влияние внешнего тотального у-облучения на проницаемость для Са2+ мембран эритроцитов овец.

Второй пик возрастания проницаемости плазматической мембраны эритроцитов для Са2+ отмечали на 10 сут исследований. Увеличение скорости входа 5Са в клетки составило 21,8; 49; 76 и 58% от уровня исходных значений для доз 30,96; 51,6; 103,2 и 154,8 мКл/кг, соответственно. К исходу 20-30 сут наблюдали снижение скорости входа 45Са до уровня исходных значений. Но у животных, облученных в летальной дозе, проницаемость мембран для Са2+ со храня-

лась увеличенной до момента гибели животных, что свидетельствует о необратимом повреждении клеточных систем при высоких дозах облучения. Наблюдаемое снижение проницаемости мембран для Са2+ на 5-7 сут (по сравнению с результатами 1-3-х сут) может быть связано с энергозависимыми процессами репарации мембраны (Бурлакова Е.Б., Шишкина Л.Н., 1983), которое наиболее отчетливо проявлялось для доз ниже 51,6 мКл/кг.

В таблице 2. представлены данные, характеризующие состояние системы Са2*-обмена в эритроцитах облученных животных, которое определяется входом Са2* через плазматическую мембрану и удалением его из клеток АТФ-заввсимым "Са2+-насосом".

У овец, облученных в дозах 103,2 и 154,8 мКл/кг, происходило достоверное, по сравнению с контролем, увеличение начальной скорости накопления 45Са в течение всего срока наблюдений. В первые-третьи сутки после воздействия это увеличение составило 1,4; 1,8 раза и 1,5; 1,9 раз от уровня исходных значений (Р<0,05). Со снижением дозы внешнего у-облучения до 51,6 и 30,96 мКл/кг возрастание исследованного показателя в эти сроки не отмечали. Кроме того, наблюдали достоверное снижение начальной скорости накопления на 5-7 сут при дозе облучения 30,96 мКл/кг. Это может быть связано с активацией Са^-АТФазы, которая не повреждается при этом уровне доз облучения и при незначительном нарушении проницаемости мембраны для Са2+ с избытком компенсирует увеличение входа катиона (Древаль В.И., 1992).

Таблица 2. Состояние системы Са^-обмена в эритроцитах после внешнего тотального у-облучения овец

Сроки Начальна! скорость накопления '"Са,

иссл., мкмоль/(л клеток »мин)

сутки контроль 30,96 мКл/кг 51,6 ыКп/кг 103,2,2 иКл/кг 154,8 мКл/кг

до обл. 0,100 ±0,012 0,098 ±0,016 0,100 ±0,03 0,103 ±0,008 0,105 +0,007

1 0,104 ±0,007 0,110 ±0,007 0,115 ±0,006 0,150 ±0,009* 0,185 ±0,012*

3 0,109 ±0,008 0,092 ±0,008 0,120 ±0,009 0,190 ±0,012* 0,230 ±0,017*

5 0,095 ±0,015 0,064 ±0,015* 0,120 ±0,008 0,165+0,012* 0,170 ±0,018*

7 0,097 ±0,009 0,046 ±0,018* 0,200 ±0,015* 0,110 ±0,009 0,160 ±0,018*

10 0,102 ±0,012 0,145 ±0,005* 0,240 ±0,012* 0,180 ±0,002* 0,150 ±0,018*

15 0,107.(0,012 0,150 ±0,017* 0^15 ±0,025* 0,140 ±0,018* 0,138 ±0,012*

20 0,091 ±0,012 0,120 ±0,023 0,160 ±0,012* 0,150 ±0,030* 0,140 ±0,012*

~30 ~ 0,103±0,019 67110+0,009 0,130 ±0,019 01,16510,021* -

*Р50,05 (от уровня исходных значений)

Второй пик увеличения начальной скорости накопления 43Са наблюдали с 10 по 20 сут в период, соответствующий разгару лучевой болезни животных.

При летальной дозе облучения высокий уровень значений показателя сохранялся фактически до гибели животных. А при облучении в дозах 30,96, 51,6, 103,2 мКл/кг максимальное возрастание начальной скорости накопления 45Са в эритроциты овец на 62,9%, 140%, 74,7%, соответственно (Р<0,05) происходило через 10 сут и сохранялось увеличенным до окончания исследований.

Степень нарушения Са-гомеостаза оценивали по изменению концентрации ионизированного Са2+ в эритроцитах облученных животных (Рис. 4).

Первый максимум наблюдали в эритроцитах овец, облученных в дозах 103,2 и 154,8 мКл/кг на 3-5 сут после воздействия (322%, 395%, соответственно). При снижении дозы облучения до 51,6 и 30,96 мКл/кг первая фаза увеличения концентрации ионизированного Са2+ в цитоплазме практически отсутствовала и не превышала 105-110% исходных значений, что объясняется эффективными, зависящими от уровня внутриклеточного АТФ, процессами репарации мембранных повреждений, с одной стороны, и активацией Са2+-АТФ-азы, с другой.

Вторичное повышение концентрации ионизированного Са2+ в цитоплазме эритроцитов обнаруживали с 10 сут при дозах 30,96, 51,6 и 103,2 мКл/кг (на 64%, 141% и 108%, соответственно), а при облучении в дозе 154,8 мКл/кг этот показатель сохранялся увеличенным (около 200% от уровня контроля) до гибели животных на 20-22 сут. Через 25-30 сут после облучения концентрация ионизированного Са2+ понижалась до уровня контроля для доз 30,96 и 51,6 мКл/кг и у выживших животных при дозе облучения 103,2 мКл/кг.

" ■ контроль ■ 30,96 мКл/кг

Сроки исследований, сутки

Рис. 4. Концентрация ионизированного Са!+ в эритроцитах облученных овец

Таким образом, в эритроцитах облученных овец наблюдали повреждение системы Саи-обмена, которое, в первую очередь, выражалось в увеличении проницаемости плазматической мембраны для Ca2* уже через сутки после воздействия. При дозах облучения 30,96 и 51,6 мКл/кг увеличение входа катиона компенсировалось активацией Са2*-АТФазы и не приводило к необратимому накоплению ионизированного Ca2* в цитоплазме. В то же время при дозах 103,2 и 154,8 мКл/кг степень повреждения системы Са2+-обмена была столь высокой, что уже через 3 сут после облучения концентрация ионизированного Ca в эритроцитах достигала таких величин (310-360 нмоль), которые характерны для развития процессов клеточной гибели (Farber J.L., 1981; Шевченко A.C., 1994).

На рис. 5, 6 представлены данные оценки проницаемости для Ca2* и состояния системы Ca -обмена в нейтрофилах овец, облученных в дозах 51,6 и 154,8 мКл/кг. В наших исследованиях мы относили нейтрофилы к более радиочувствительным, чем эритроциты, клеткам, исходя, как из особенностей их структурно-функциональных характеристик, так и из различий времени жизни этих двух типов дифференцированных клеток в периферической крови (эритроциты - 120 сут, нейтрофилы - несколько дней). Это позволяло нам рассматривать нейтрофилы, как модель стволовых клеток-предшественников, которые, в соответствии с принципом Бергонье-Трибондо, более чувствительны к радиационному воздействию.

!

§

s •е-

- •*• -51,8 мКл/лг —■—154,6 мКи/кг * контроль

10 15 20

Сроки исследований, сутки

Рис.5. Изменение пронидаемости мембран нейтрофилов для Са* при внешнем тотальном у-облучении овец

Исследование проницаемости плазматической мембраны нейтрофилов для ионов Са2* показало, что изменение скорости входа Са у облученных животных, также как и в случае эритроцитов, носило фазовый характер (Рис. 5). Примечательно, что уже через 12 час после облучения овец в дозе 154,8 мКл/кг скорость входа *"Са была повышена и к первым суткам достигла 186% от уровня исходных значений (Р<0,05). Вторая фаза увеличения начиналась после 5-х

суг (максимум на 10-и суг - 206% от уровня исходных значений, Р<0,05) и сохранялась до гибели животных на 20-22 суг. У овец, облученных в дозе 51,6 мКл/кг, проницаемость мембраны нейтрофилов для Са2+ изменялась менее значительно. Первую фазу увеличения скорости входа 43Са наблюдали через сутки после облучения (132% от уровня исходных значений, Р<0,05), а вторую через 7 суг -123%

Начальная скорость накопления Са2+ в нейтрофилах животных, облученных в дозе 154,8 мКл/кг, была повышенной в течение первых 5 сут после воздействия (на уровне 260% от уровня исходных значений, Р<0,05, Рис. 6). В последующие сроки исследований этот показатель понижался, оставаясь выше исходных значений вплоть до гибели животных. При облучении овец в дозе 51,6 мКл/кг наблюдали двухфазное изменение начальной скорости накопления Са2+. Максимальное повышение отмечали через сутки после облучения (200% от уровня исходных значений, Р£0,05), а также через 7 сут (162%). К 15 сут величина исследованного показателя состояния системы Са2+-обмена снижалась до уровня исходных значений. Необходимо отметить, что через 12 час после облучения начальная скорость накопления Са2* была снижена в обоих случаях

Сроки «¡следований, сутки

Рж.б. Состояв« сжтемы Са1+-обмеш в нейтрофилах облученных овец

Таким образом, в нейтрофилах овец при облучении в дозах 51,6 и 154,8 мКл/кг, также как и в эритроцитах наблюдали нарушение Са2+-гомеостаза, которое выражалось в увеличении проницаемости мембран клеток для катиона и изменении состояния Са2+-обмена. В то же время в нейтрофилах степень поражения системы Са2+-обмена была выше, чем в относительно радиорезистентных эритроцитах и происходила в более ранние сроки. Облучение овец в дозе 51,6 мКл/кг в эритроцитах не вызывало выраженных 2-х фазных изменений показателей системы Са2+-обмена. А в нейтрофилах такие изменения наблюдали как

для начальной скорости накопления, так и для скорости входа чзСа, которые сопровождались процессами клеточной гибели.

Исходя из приведенных данных можно заключить, что облучение овец в дозах 30,96-154,8 мКл/кг приводило к модификации системы Са^-обмена, которая выражалась в увеличении проницаемости плазматической мембраны и накоплении ионизированного Са2* в цитоплазме, как в эритроцитах, так и в радиочувствительных нейтрофилах. Динамика исследованных показателей носила фазовый характер и отражала развитие симптомов острой лучевой болезни. Первичным механизмом нарушения внутриклеточного Са2+-гомеостаза при облучении животных являлось увеличение проницаемости плазматической мембраны для ионов Са2+.

ИССЛЕДОВАНИЕ ПОКАЗАТЕЛЕЙ СИСТЕМЫ Са2+-ОБМЕНА В ЭРИТРОЦИТАХ И НЕЙТРОФИЛАХ ПРИ ПРОЛОНГИРОВАННОМ ОБЛУЧЕНИИ ОВЕЦ

Известно, что хроническое облучение в малых дозах характеризуется целым рядом нарушений функциональных показателей мембран клеток, выражающихся в снижении мембранного потенциала, нарушении потоков ионов, изменении экспрессии рецепторов (Баджинян С.А, 1989, Бурлакова Е.Б., 1999). В то же время поддержание Са2+-гомеостаза в клетках осуществляется за счет низкой проницаемости плазматических мембран для Са2+ и в результате работы мембраносвязанного "Са2+-насоса". При остром облучении овец в дозах от 30,96 до 154,8 мКл/кг происходит нарушение системы Са2+-обмена, как в ра-диорезистенгных эритроцитах, так и радиочувствительных нейтрофилах. Со снижением дозы облучения доля ранних изменений исследованных показателей уменьшается и только в более поздние сроки после облучения происходит достоверное увеличение проницаемости мембран для Са2+, которое сопровождается его внутриклеточным накоплением. Поэтому представляло интерес оценить показатели системы Са2+-обмена в эритроцитах и нейтрофилах сельскохозяйственных животных в модельных экспериментах с пролонгированным облучением в дозах 2,58 и 12,9 мКл/кг.

Через сутки после облучения животных в дозе 2,58 мКл/кг в эритроцитах не наблюдали изменений проницаемости мембраны клеток для Са2\ а ее увеличение происходило лишь через 5 сут (на 42% от уровня контроля, таблица 3). В то же время при облучении животных в дозе 12,9 мКл/кг возрастание скорости входа 43Са в эритроциты отмечали уже в первые сутки после окончания пролонгированного воздействия ионизирующего излучения (5 сут по 10 час) на 60% от уровня контроля и оно сохранялось выше контрольных значений в последующие 15 сут. Возможно, что наблюдаемое увеличение этого показателя, в эти сроки, связано с условиями проведения эксперимента. Восстановление величины скорости входа Ч5Са в эритроциты облученных овец до уровня контроля происходило через 60 сут после воздействия.

Начальная скорость накопления 43Са в нейтрофилах практически не изменялась у овец, облученных в дозе 12,9 мКл/кг (Таблица 4). Наблюдалось возрастание (на 87% от уровня исходных значений) через 5 сут после воздействия.

У животных, облученных в дозе 2,58 мКл/кг, напротив, на протяжении практически всего срока наблюдений, отмечали тенденцию к снижению начальной скорости накопления 45Са на 30-60%, которая восстанавливалась через 60 сут после воздействия. В то же время пассивная проницаемость для Са2+ мембраны нейтрофилов облученных овец достоверно снижалась в 2,5-3 раза через сутки после облучения, а в последующие 5 сут характеризовалась увеличением скорости входа 45Са на 20-40% у животных, облученных в дозе 2,58 мКл/кг и на 5564% в дозе 12,9 мКл/кг. Через 60 сут после начала эксперимента величина скорости входа 45Са в обеих группах восстанавливалась до уровня контрольных значений.

Таблица 3. Проницаемость плазматических мембран эритроцитов овец для Са2+ при пролонгированном облучения в малых дозах

Сроки исслед., сутки Скорость входа "Са, нкмоль/(л клеток • шш)

контроль 2,58 мКл/кг 12,9 мКл/кг

до облучения 0,17010,005 0,16810,008 0,17210,009

1 0,16510,008 0,15210,007 0,27210,022*

5 0,17210,009 0,24010,025* 0,21410,042

10 0,16710,005 0,22410,017* 0,243+0,027*

15 0,173Ю,009 0,25110,021* 0,235+0,015*

60 0,16610,011 0,17610,023 0,17810,021

*Р<0,05

Таблица 4. Показатели системы Са1+-обмена в нейтрофилах овец при пролонгированном облучении в малых дозах

Сроки исследований, сутки Начальная скорость накопления "Са, фмоль/(клетку • нин) Скорость входа °Са, фмоль/(клетку • шш)

2,58 мКл/кг 12,9 мКл/кг 2,58 иКл/кг 12,9 мКл/кг

до облучения 29,9+6,5 29,9+6,5 155,0132,3 155,0132,3

1 18,815,2 35,515,2 38,5+4,2* 75,3116,0*

5 22,9+9,2 56,0118,5* 185,5112,9* 255,0125,0*

10 17,7+4,6 30,2+3,0 217,0+12,7* 232,0+16,2*

15 37,213,4 37,4±4,3 198,0+56,2 209,0+18,3

60 31,415,2 33,514,4 138,4116,2 144,6117,3

♦Р<;0,05

Таким образом, при пролонгированном действии малых доз ионизирующего излучения в эритроцитах и нейтрофилах овец наблюдалось нарушение системы Са1+-обмена, которое выражалось в увеличении проницаемости плазматических мембран клеток для Сан через 5-10 суток после начала облучения. В то же время величина накопления Са в нейтрофилах практически не изменялась, что свидетельствует об эффективности работы Са2+-АТФазы, которая компенсирует изменение интенсивности поступления катиона в клетку. Это позволяет предположить уменьшение роли непосредственного повреждающего

действия малых доз ионизирующего излучения на систему Са2+-обмена и о возрастании роли ее опосредованного влияния на внутриклеточный метаболизм через модификацию Са2+-зависимых регуляторных функций (Древаль В.И., 1994, Бурлакова Е.Б., 1999, Эйдус Л.Х., 1999). Действительно, наблюдаемое изменение циркуляции Са2+ через плазматическую мембрану, скомпенсированное работой "Са2+-насоса", не создает цитотоксических концентраций катиона в клетках, как в случае больших доз острого у-облучения, но может приводить к увеличению локальных примембранных его концентраций, что, в свою очередь, через систему Са^-зависимых протеинкиназ может существенно изменять внутриклеточный метаболизм и реализовываться, в случае продолжительного характера воздействий, в развитии патологических нарушений в клетке и организме в целом (Rasmussen Н., 1989).

ОЦЕНКА ПРОНИЦАЕМОСТИ ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ ДЛЯ Ca2f В ЭРИТРОЦИТАХ КОРОВ ПРИ ДЛИТЕЛЬНОМ СОДЕРЖАНИИ НА РАДИОАКТИВНО ЗАГРЯЗНЕННЫХ ТЕРРИТОРИЯХ

Известно, что хроническое воздействие относительно малых доз внутреннего и внешнего облучения модифицирует внутриклеточные процессы, что в конечном итоге приводит к формированию патологических изменений в организме (Бурлакова Е.Б., 1996; 1999). В отдаленный период (десять лет) после аварии на ЧАЭС у обследованного поголовья КРС отмечали активацию пере-кисного окисления липидов, нарушение костно-мозгового кроветворения, снижение иммунного и гормонального статуса животных (Исамов Н.Н., 1997; Белов А.Д., 1997; Мирзоев Э.Б., Кобялко В.О., 1999). В то же время данные по исследованию внутриклеточного Са2*-обмена практически отсутствуют. В связи с этим, изучение показателей системы Са2+-обмена в клетках крови коров в хозяйствах с различным уровнем радиоактивного загрязнения территории может быть весьма актуальным.

В таблице 5 представлены данные оценки проницаемости плазматической мембраны эритроцитов для Са2* у коров из обследованных трех хозяйств Новозыбковского района Брянской области через 10 лет после аварии на ЧАЭС. Достоверное изменение этого показателя состояния системы Са2<-обмена в на-тивных эритроцитах было обнаружено нами только у животных хозяйства "Боевик". Подтверждением факта отсутствия возможных изменений, обусловленных действием ионизирующей радиации, являются данные таблицы 6, из которых видно, что у коров, обследованных в течение 5 лет после аварии на ЧАЭС, наблюдалось постепенное восстановление основных параметров системы поддержания Са2+-гомеостаза. В то же время, использование дополнительной нагрузки мембран эритроцитов, при помещении их в гипертоническую среду, выявило прямо пропорциональную зависимость увеличения проницаемости мембран для Са2+ у животных, содержавшихся на территориях с различной плотностью радиоактивного загрязнения.

Таблица 5. Проницаемость мембран эритроцитов для Са2+ у коров при длительном содержании на радиоактивно загрязненных территориях после аварии на ЧАЭС (Новозыбковский район, Брянской области, 1996 г.)

Хозяйство Плотность загрязнения территории, (шСз) Кбк/м2 Скорость входа 15 Са в эритроциты, ккмоль/(шш • л клеток) нативные гипертонически сжатые

"Новая жизнь" 185-555 0,144+0,010 0,184±0,010

"Боевик" 370-740 0,170±0,011*л 0,194±0,040

"Волна революции" 740-1480 0,157±0,025 0,220±0,035*А

"Кривское" Калужская обл. Контроль 0,156±0,004 0,182±0,007

Примечание: *Р<0,05 (относительно контроля)

Л Р<0,05 (относительно хозяйства "Новая Жизнь")

Таблица 6. Динамика состояния системы Са2+-обмена в эритроцитах КРС, подвергшегося радиационному воздействию после аварии на ЧАЭС

Сроки исследования после аварии, годы Доза облучения, сГр** (расчетная) Скорость входа 43 Са, мкмоль/(тш • л клеток) Концентрация свободного Са2+, нмоль/л

1 29 0,232±0,032* -

1,5 35 0,290±0,042* 61,2±7,7*

2 39 0,186+0,013* 52,3±4,4*

3 47 0,157+0,017 32,1±3,5

5 52 0,148±0,022 -

контроль 0 0,156±0,004 35,0±4,8

Примечание: *Р<0,05 (относительно контроля)

**Дозы облучения представляют собой суммарные средние дозы внутреннего и внешнего облучения (рассчитаны специалистами физико-химического отдела ВНИИСХРАЭ)

Таким образом, при длительном содержании сельскохозяйственных животных на территориях, загрязненных радионуклидами после аварии на ЧАЭС,

первоначальное увеличение показателей системы Са*-обмена возвращалось к уровню контрольных значений. В то же время у животных сформировались "скрытые" повреждения мембран эритроцитов, которые выявлялись при дополнительной нагрузке систем поддержания внутриклеточного гомеостаза. Вероятно, что при скрытом течении процессов, обусловленных хроническим действием радиации, возможные отдаленные эффекты облучения на фоне клинического благополучия сельскохозяйственных животных обусловлены компенсаторными и приспособительными реакциями организма, которые возвращают к уровню физиологической нормы значения исследуемых показателей.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Модификация внутриклеточного метаболизма при действии различных эффекторов, осуществляется при участии мембран освязанной системы Ca*-обмена (Rasmussen H., 1989). Регуляторные функции этой системы определяются изменением концентрации ионизированного Ca2* в клетке (Vorreal M.L., 1989). В то же время, при различных патологических состояниях организма отмечается нарушение внутриклеточного Са2+-обмена, которое приводит к цито-токсическому накоплению катионов в цитоплазме. Необратимое повышение внутриклеточной концентрации ионизированного Ca2* оказывает повреждающее действие на клеточные структуры и, в конце концов, инициирует процесс гибели клетки (Farber J.L*, 1981).

Известно что, лучевое повреждение организма сопровождается интенсивной клеточной гибелью в радиочувствительных органах и различными нарушениями метаболических реакций не только в радиочувствительных, но и относительно радиорезистентных клетках (Кудряшов Ю.Б., 1987; Кузин AM., 1986; Фоменко B.C., 1982; Хансон К.П., 1985). При этом плазматическая мембрана, наряду с ДНК, рассматривается в качестве основной мишени действия ионизирующего излучения (Рыскулова С.Т., 1986; Сунгуров А.Ю., 1988; Patrie G., 1977). Следует отмстить, что основные компоненты системы внутриклеточного Са2+-обмена локализованы в мембранных структурах клетки (Carafoli Е., 1987; Schatzmann H.J., 1983). Поэтому повреждения, возникающие в мембранах при облучении (Войцицкий В.М., 1988, Древаль В.И., 1997), могут приводить к модификации системы Са2,-обмсна в клетках, изменять ее регуляторные функции и, вследствие этого, нарушать внутриклеточный метаболизм.

Результаты собственных исследований, полученные на основе разработанных нами методик, показали, что у сельскохозяйственных животных нарушается Са2+-гомеостаз в клетках периферической крови как в модельных экспериментах с внешним тотальным и пролонгированным 7-06лучением в больших и малых дозах, так и при действии хронического облучения на радиоактивно загрязненных территориях.

Радиационно индуцированная модификация внутриклеточного Са21-обмена выявлялась как в радиочувствительных нейтрофилах, так и относительно радиорезистентных эритроцитах и была наиболее выражена в течение 15-20 сут после облучения в летальных и сублетальных дозах. Наблюдаемая закономерность носила фазовый характер с максимальными величинами изменения

исследованных показателей системы Са^-обмена на 1-3 и 10-15 сут. Более того, концентрация ионизированного Са2+ в цитоплазме и скорость входа 43Са в эритроцитах овец, облученных в дозах свыше 30,96 мКл/кг, возрастали в первые сутки после воздействия и эти изменения линейно зависели от дозы облучения. В эти же сроки отмечали аналогичные изменения проницаемости мембраны для Ca2t в более радиочувствительных, по сравнению с эритроцитами, нейтрофилах периферической крови жвачных животных

Нарушение Са^-гомеостаза в клетках крови овец, облученных в интервале доз от 30,96 до 154,8 мКл/кг, сопровождалось гибелью животных в процессе развития лучевой болезни различной степени тяжести. В то же время развитие феномена клеточной гибели зависит от степени необратимости модификации внутриклеточного Са2+-гомеостаза которая, как известно, определяется эффективностью Са2+-транспортирующих систем, обеспечивающих удаление ионов Са2+ из цитоплазмы (Габай В.Л., 1990; Lockshin R.A., 1981). Более того, при облучении клеток в дозах до 7 Гр отсутствует заметное повреждение Са2+-транспортирующих АТФ-аз (Древалъ В.И., 1992; Землянская С.Т., 1988). Исходя из этого можно предположить, что наблюдаемое нами увеличение проницаемости мембран в эритроцитах и нейтрофилах облученных животных приводит к значительному повышению концентрации ионизированного Са2+ в цитоплазме, которое, вероятно, инициирует развитие процесса гибели клеток.

Основными пулами внутриклеточного накопления Са2+ являются цитоплазма, эндоплазматический ретикулум и митохондрии (Орлов С.Н., 1980; Carafoli Е., 1985; Dicullescu I., 1978). При избыточном поступлении ионов Са2+ через каналы поврежденной мембраны заметное увеличение Са2+ наблюдается главным образом в цитоплазме и митохондриях (Ручко М.В., 1990; Kale R.K., 1987; Naccache Н., 1985). При этом повышение концентрации ионизированного Са2+ в цитоплазме активирует Са2+-транспортирующие АТФазы и поэтому носит обратимый характер, а накопление Са2+ в митохондриях вызывает прямое повреждение этих органелл (Bonventre J.V., 1988; Fleckenstcin-Grun G., 1991). В эритроцитах млекопитающих отсутствуют внутриклеточные органеллы и внутриклеточный Са2+ -гомеостаз обеспечивается низкой проницаемостью мембраны для Са2+ и функционированием Ca2+-Mg2+-ATOa3bi (Sarcadi В., 1981; Schatzmann H.J., 1983). Напротив, в более радиочувствительных нейтрофилах присутствуют основные внутриклеточные органеллы (митоходрии, эндоплазматический ретикулум и др.) (Simchowitz L., 1988; Naccache Н., 1985). Поэтому можно предположить, что Са2+-перегрузка митохондрий определяет гибель таких радиочувствительных клеток, как нейтрофилы.

Повышенная проницаемость мембраны клеток для Са2+ при остром облучении в дозах свыше 30,96 мКл/кг, обусловленная ее непосредственным повреждением, зависит от дозы и сохраняется на этом уровне в течение нескольких суток после облучения организма. Вместе с тем одним из критериев выживаемости клеток в начальный период после облучения организма является их способность к удалению избыточных количеств Са2\ поступающего через поврежденную плазматическую мембрану (Шевченко А.С., 1994). Процесс удаления Са2+ из клеток является АТФ зависимым (Дворецкий А.И., 1987). Но известно, что в первые 7 суток облучения животных в летальных дозах отмечается резкое снижение внутриклеточного уровня АТФ, особенно в радиочувстви-

тельных органах и клетках (Романцев Е.В., 1984). Следовательно, именно в таких клетках, как нентрофилы, могут реализоваться условия накопления "цитотокснческих" количеств Са2+, запускающих механизмы Са2+-зависимой клеточной гибели, а в относительно радиорезистентных эритроцитах те же процессы могут привести к существенным нарушениям внутриклеточного метаболизма.

Эти факты не противоречат общепринятым представлениями о ведущей роли повреждений ДНК в процессе гибели радиочувствительных клеток в облученном организме. Действительно, установлено, что репарация радиационных разрывов ДНК является метаболически зависимым процессом (Жестянников В Д., 1979), как и восстановление внутриклеточного Са2+-гомеостаза в облученных клетках, хотя временные характеристики повреждения и репарации существенно разнятся для ДНК и мембран, как основных мишеней действия ионизирующих излучений. В самом деле, увеличение проницаемости мембраны (в частности и для Са2+) становится выраженным к концу первых суток после облучения организма, когда репарация разрывов ДНК для выживших клеток фактически завершена (Fornace AJ., 1980; Woods W.G., 1981). В первые часы после облучения организма (период активной репарации ДНК) отсутствует заметное истощение макроэргических соединений в клетках и вполне вероятно, что даже при нарушении проницаемости мембраны сохраняется энергетическая обеспеченность для поддержания внутриклеточного Са2+-гомеостаза. В более поздний период, за счет нарушения Са2+-гомеосгаза в облученных клетках создаются условия дня реализации механизма цитотоксического действия ионов Са2* и ситуация дополнительно усугубляется процессом уменьшения внутриклеточного пула АТФ в облученном организме.

Наблюдаемая нами вторая фаза нарушения Са2+-гомеостаза при внешнем тотальном у-облучении в дозах до 155 мКл/кг может являться причиной отдаленных цитотокснческих эффектов. Так, активация Са2+-зависимых ферментов деградации после первичного повышения концентрации ионизированного Са2* в цитоплазме облученных клеток может инициировать вторичное повреждение мембраны и внутриклеточных ор-ганелл. Характерно, что в этот период изменения проницаемости мембраны клеток для Са2+ не зависят от дозы облучения организма, тогда как в первые сутки после облучения такая зависимость носит линейный характер.

Изменение Са2+-гомеостаза при пролонгированном облучении животных в относительно малых дозах (2,58 и 12,9 мКл/кг) характеризовалось отсутствием увеличения пассивной проницаемости плазматической мембраны эритроцитов для Ca2t и ее снижением в нейтрофилах в ранние сроки после воздействия. Напротив, увеличение как начальной скорости накопления, так и скорости входа 45Са в обоих типах клеток происходило через 5-10 суток после облучения и не сопровождалось развитием процесса клеточной гибели.

Можно предположить, что в отличие от действия больших доз радиации при пролонгированном воздействии низкой интенсивности возрастает роль модификации регуляторных свойств системы Са2*-обмена на внутриклеточный метаболизм. При этом увеличивается опосредованное влияние на систему Са2*-обмена вторичных эффекторов, образующихся в оргшизме при облучении

(Эйдус Л.Х., 1994). Это предположение подтверждают данные об ингибирую-щем действии плазмы крови облученных крыс на Са2+-АТФазу выделенных ти-моцитов (Древаль В.И., 1994).

В то же время, длительное увеличение концентрации внутриклеточного ионизированного Са2+, характерное д ля эффектов облучения в больших дозах, приводящих к гибели клеток, отсутствует в случае малых доз воздействия. Наблюдаемые нами пролонгированные изменения проницаемости плазматической мембраны для Са2* в эритроцитах и нейтрофилах запускают иной механизм продолжительной активации внутриклеточного метаболизма. В этом случае, увеличение концентрации ионизированного Са2+ в локальном примембранном пространстве, а не в цшшоле, возникающее в результате возрастания входа катионов через Са2+-селективные каналы, активирует ассоциированную с мембраной протеинкиназу С, которая фосфорилирует ряд метаболически активных белков-ферментов (Расмусен Г., 1989). При этом фаза увеличения концентрации цитазольного Са2+ кратковременна и приводит к перемещению протеинкиназы С из цитозоля в плазматическую мембрану. Поэтому, при действии малых доз пролонгированного облучения изменение проницаемости мембраны для Са2+ в активно метаболизирующих клетках, таких как нейтрофилы, может инициировать фазу продолжительного фосфорилирования цитозольного протеинкиназно-го комплекса и существенно изменить течение внутриклеточных реакций (Каяпшмеп Н., 1989). Действительно, модификация Са +-обмена, обнаруженная нами в эритроцитах и нейтрофилах облученных овец, сопровождается значительными изменениями внутриклеточного метаболизма (Смирнов Н.А., 1989). Так, активность ферментов у облученных животных максимально возрастает на 7-10 сутки. Отмечается увеличение содержания в нейтрофилах лип идо в и суммарного уровня катионных белков. В эритроцитах происходит снижение мембранного потенциала уже через 3-6 часов и сохраняется в течение длительного срока наблюдений. Изменяются потоки ионов калия из эритроцитов, с последующим восстановлением в более поздние сроки. Следовательно, облучение в малых дозах приводит к модификации системы Са2+-обмена как в относительно радиорезистентных эритроцитах, так и в более радиочувствительных нейтрофилах. Возрастает значение опосредованных факторов модификации системы Са2+-обмена, а также роль изменений ее функционирования на уровне регуляции внутриклеточного метаболизма. При этом наблюдаемое увеличение пассивной проницаемости мембраны для Са24 через 5-15 суток после облучения сопровождается целым рядом функциональных изменений и может быть пусковым механизмом внутриклеточных нарушений в клетках крови животных.

Исследование проницаемости плазматической мембраны эритроцитов для Са2* у коров, длительно содержащихся на радиоактивно загрязненных территориях, продемонстрировало восстановление основных параметров системы поддержания Са2+-гомеостаза уже через 5 лет после аварии на ЧАЭС. Но, с другой стороны, изменения проницаемости плазматической мембраны эритроцитов для Са * у животных, представляющих второе поколение коров и обследованных через 10 лет после аварии на ЧАЭС, приобрели скрытый характер. При этом, чем выше была плотность радиоактивного загрязнения территории, тем более значимы были повреждения проницаемости клеточных мембран.

Причиной обнаруженных мембранных дефектов в эритроцитах могут быть определенные изменения в структуре генома клеток-предшественников костномозгового кроветворения, которые формируются в отдаленный период после облучения в малых дозах (Шевченко АС., Кобяпко В.О., 1993). Подтверждением этого является тот факт, что скрытые патологические изменения проницаемости плазматической мембраны для ионов Са24 у животных из загрязненных хозяйств Брянской области прослеживаются и у потомства (5-7 поколение) КРС, подвергнутого радиационному воздействию во время испытаний ядерного оружия на Семипалатинском полигоне (Мнрзоев Э.Б., 1999). Кроме того, при обследовании людей, представляющих первое-второе поколение жителей, проживающих на загрязненных в результате испытаний ядерного оружия, территориях Алтайского края, получены аналогичные результаты (Шевченко АС., 1995).

Во многих исследованиях показана ключевая роль нарушения концентрации внутриклеточного [Ca24]i в патогенезе различных болезней, включая сердечно-сосудистые патологии (Flecknstein А, 1987; Jenning? R.B., 1975; Puschett J.B., 1987; Rosier F., 1986), нарушение гормонального статуса, миопа-тии (Mechler F., 1989), а также дегенеративные изменения в иммунной системе (Борткевич Л.Г., 1989; Бурлакова Е.Б., 1996). Поэтому обнаруженное нами нарушение проницаемости клеточных мембран для Са24 при воздействии ионизирующего излучения можно рассматривать в качестве дополнительного фактора риска развития различных патологий, как на клеточном, органном, так и на уровне целостного организма.

Таким образом, подводя итог проведенным экспериментальным исследованиям и опираясь на литературные данные, можно заключить, что летальные дозы облучения организма овец инициировали необратимые нарушения в системе поддержания Са2+-гомеостаза как в радиорезистентных эритроцитах, так и в относительно радиочувствительных нейтрофилах. Эти нарушения проявлялись в увеличении проницаемости плазматической мембраны для Са24 и достижении цитотоксической концентрации ионизированного Са2' в цитоплазме.

Степень радиочувствительности была связана с возможностями системы Са24-обмена удалять цитотоксические количества Са24 из цитоплазмы.

Са2+-перегрузка митохондрий и истощение пула АТФ - определяли более раннюю гибель активно метаболизирующих клеток, что подтверждается клини-ко-гематологическими данными.

Снижение дозы облучения приводило к развитию неспецифических изменений системы Са24-обмена и возрастанию роли регуляторных функций ионизированного Са2+ для внутриклеточного метаболизма. Малые дозы облучения инициировали пролонгированную модификацию проницаемости плазматической мембраны для Са24, увеличивая концентрацию Са24 в примембранном пространстве и через протеинкиназу С создавали условия для развития стойких изменений внутриклеточных процессов.

Эти изменения, по нашему мнению, у обследованных сельскохозяйственных животных при длительном содержании на загрязненных радионуклидами территориях, приводили к формированию "скрытых" патологических изменений в проницаемости плазматической мембраны эритроцитов для Са24 и сохранялись в ряду поколений.

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод определения основных показателей системы Са2+-обмена (начальная скорость накопления, скорость входа и концентрация ионизированного Са2+) в клетках крови сельскохозяйственных животных, позволяющий корректно оценить изменение состояния внутриклеточного Са2+-обмена в норме и при облучении организма.

2. Установлены различия в проницаемости цитоплазматических мембран клеток крови жвачных сельскохозяйственных и лабораторных животных для Са2+. Проницаемость мембран эритроцитов овец и коров для Са2+ была ниже по сравнению с величиной этого показателя в эритроцитах лабораторных животных и человека.

3. Облучение овец в дозах 30,96-154,8 мКл/кг инициировало фазовое изменение показателей системы Са2+-обмена в эритроцитах и нейтрофилах, которое выражалось в нарушении внутриклеточного Саг+-гомеостаза в латентный период (1-5-е сутки) и в период разгара (10-15-е сут) острой лучевой болезни. При этом облучение овец в летальной дозе сопровождалось достоверным увеличением проницаемости мембран клеток для Са2* и последующим накоплением ионов Са2+ в цитоплазме практически во все сроки наблюдений.

4. Пролонгированное облучение овец в дозах 2,58 и 12,9 мКл/кг приводило к изменению Са^-обмена в эритроцитах и нейтрофилах. В эритроцитах, характеризующихся большей радиорезистентностью, чем нейтрофилы не наблюдалось изменений проницаемости плазматической мембраны в ранние сроки после облучения. Тогда как в более радиочувствительных клетках (нейтрофилы) происходило снижение скорости входа 45Са. Одновременно и в нейтрофилах, и в эритроцитах овец отмечали значительное увеличение показателей Са2+-обмена через 5-10 суток после облучения.

5. Длительное нахождение сельскохозяйственных животных на территориях, загрязненных радионуклидами вследствие аварии на Чернобыльской АЭС, приводило к модификации системы Са2+-обмена в эритроцитах периферической крови. Инкубация эритроцитов в гипертонической среде выявила "скрытые" повреждения проницаемости мембран эритроцитов для Са2+.

6. Выявленные в экспериментальных исследованиях с острым и хроническим облучением изменения внутриклеточного Са2+-обмена коррелируют с физиологическим состоянием сельскохозяйственных животных и отражают степень развития радиационных процессов в организме. Это может быть использовано для эффективной оценки степени воздействия как ионизирующих излучений, так и нерадиационных факторов.

Список работ, оггубликованиьп по материалам диссертации:

1. Шевченко АС., Кобюто В.О. Изменение концентрации ионизированного Са1+ в эритроцитах облученных овец.// Доклады ВАСХНИЛ. 1990. №7. С.51-54.

2. Шевченко А.С., Кобжлко В.О., Лукошова Т.Н., Шевченко Т.С., Коноплева И.В. Содержание иымунореактивного кальмодулина в клетках крови облученных животных.// Радиобиолопа. 1991. Т.ЗО. вып.1. С.142-144.

3. Шевченко A.C., Кобялко В.О., Шевченко Т.С., Каплян М.А. Влияние лазерного облучения на вход 45Са и характеристики связывания 1-ашшшо-8-сульфоната в фибробластах китайского хомячка.// Физическая медицина. 1993. Т.З. №1-2. С.24-28.

4. Шевченко A.C., Кобялко В.О., Шевченко Т.С., Лазарев Н.М., Асташева Н.П., Алексахин P.M. Модификация Ca2*-обмена в клетках крови коров с радиационным повреждением щитовидной железы после авapira на Чернобыльской АЭС Л Радиобиологая. 1993. Т.ЗЗ. Ш. С.775-782.

5. Шевченко A.C., Кобялко В.О., Шевченко Т.С., Алексахин P.M. Закономерности модификации внутриклеточного Са2*-гомеостаза при остром и хроническом облучении организма^ 2-ой Радиобиологический съезд (Киев, 20-25 сентября 1993 года). Тезисы докладов. Пущино. 1993. Т.З. C.U38-1139.

6. Шевченко A.C., Кобялко В.О., Лазарев Н.М., Алексахин P.M. Изменение проницаемости плазматической мембраны клеток крови у животных после радиойодного облучения. //Доклады РАН. 1994. Т.ЗЗ. №2. С.283-286.

7. Shevchencko A.S., Kobyaiko V.O. Indices of intracellular Ca2* homeostasis for farm animals by acute and chronic irradiation of organism./ 2nd International Conference "RADIOBIOLOGICAL CONSEQUENCES OF NUCLEAR ACCIDENTS" 25-26 Octorber 1994. Abstracts. Moscow. 1994. P.240.

8. Shevchencko A.S., Kobyaiko V.O., Sarapultsev I.A. Assessment of cAMP/Ca2* dependent regulation of cellular metabolism and some indices of hormonal status by cows in the late time after the CNPP accident./ 2nd International Conference "RADIOBIOLOGICAL CONSEQUENCES OF NUCLEAR ACCIDENTS" 25-26 Octorber 1994. Abstracts. Moscow. 1994. P.241.

9. Шевченко A.C., Кобялко B.O., Шевченко T.C., Орлов С.Н. Транспорт Ca2* в нейтрофилах и эритроцитах человека в гипотонической и гипертонической среде.// Биологические мембраны. 1995. Т. 12. №3. С.254-259.

10. Шевченко A.C., Кобялко В.О., Шевченко Т.С., Ерусованник В.И., Котелевцев C.B. Оценка мембранных характеристик клеток крови у жителей районов Алтайского края, подвергшихся воздействию ядерных испытаний. // Вестник научной программы "Семипалатинский полигон. Алтай". 1995. №2. С.72-80.

11. Шевченко A.C., Кобялко В.О., Мирзоев Э.Б., Шевченко Т.С. Модификация мембранных показателей у сельскохозяйственных животных в районах Алтайского края, подвергшихся радиационным воздействиям после испытаний ядерного оружия на Семипалатинском полигоне./ II Обнинский симпозиум по радиоэкологии. Тезисы рефератов. Обнинск. 1996. С.278-280.

12. Кобялко В.О., Шевченко A.C. Модификация системы Ca2*-обмена в клетках крови облученных в малых дозах сельскохозяйственных животных./ Там же. С.276-277.

13. Шевченко A.C., Габай В Л., Кобялко В.О., Макарова Ю.М., Шевченко Т.С. Увеличение проницаемости плазматической мембраны для Ca2* при радиаци-онно-индуцированном апоптозе тимоцитов.// Радиационная биология. Радиоэкология. 1997. Т.37. вып.2. С.220-227.

14. Шевченко A.C., Кобялко В.О., Шевченко Т.С. Нарушение проницаемости плазматической мембраны для Ca2* при радиационно-индуцированном апоптозе тимоцитов./ 3 съезд по радиационным исследованиям. Москва. 14-17 октября 1997. Тезисы докладов. Пущино. 1997. Т.З. С. 142-143.

15. Шевченко A.C., Кобялхо В.О., Мирзоев Э.Б., Шевченко Т.С. Сравнительная оценка мембранных показателей у сельскохозяйственных животных из Брянской области и юго-западных районов Алтайского края./ Там же. Т.З. С.204.

16. Кобялко В.О., Шевченко A.C. Об особенностях Са2*-обмена в эритроцитах жвачных.// Сельскохозяйственная биология. 1998. №6. С.21-25.

17.Мирзоев Э.Б., Кобялко В.О. Оценка перекислого окисления липидов и проницаемости плазматической мембраны для Са2* в клетках крови облученных сельскохозяйственных животных./Доклады международной научно практической конференции. «Эколого-генетические проблемы животноводства и экологически безопасные технологии производства продуктов питания. Дуброви-цы. 199*. С.33-34.

18. Мирзосв Э.Б., Кобялко В.О, Шевченко Т.С. Оценка перекисного окисления липидов и проницаемости плазматической мембраны для Са2* в эритроцитах крови крупного рогатого скота при длительном нахождении на радиоактивно загрязненных территориях./ "Проблемы противолучевой защиты". 16-17 ноября. Тезисы докладов. Москва. 1998. С.120.

19.Кобялко В.О., Мирзоев Э.Б. Оценка показателей системы Са2* -обмена в эритроцитах овец при тотальном внешнем у-облучении./ "Биосфера и человече-ство":Материалы конференции, посвященной 100-летию со дня рождения Н.В. Тимофеева-Ресовского. 20-21 сентября. Обнинск. 2000.С.223-226.

20.Мирзосв Э.Б., Кобялко В.О., Коноплева И.В., Шевченко Т.С., Губина О.А. Оценка проницаемости плазматической мембраны для ионов Са2* и активности аденилатциклазы в клетках крови овец, облученных в малых дозах./ Там

же. С.230-233.

Типография ВНИ ИСХРАЭ, г. Обнинск. Тираж 80. Пл.-1 Подписано к печати 23.10.2000 г.