Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гормонозависимое фосфорилирование белков листьев ячменя

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Гормонозависимое фосфорилирование белков листьев ячменя"

РП ол

1 0 и.м '¡^РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО,ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИИ им. К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи

ПЕРЕВЕРЗЕВА Инна Николаевна

ГОРМОНОЗАВИСИМОЕ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ БЕЛКОВ ЛИСТЬЕВ ЯЧМЕНЯ

03.00.12 — физиология растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1993

Работа выполнена в Институте физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН.

х Научный руководитель — кандидат биологических наук С. Ю. Селиванкина.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, Н. П. Кораблева, кандидат биологических наук Н. И. Тихая.

Ведущее учреждение — Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова, биологический факультет.

Защита состоится с »......... 1993 г. в

« » чйсов на заседании специализированного совета по присуждению ученой степени кандидата биологических наук К.002.45.01 при Институте физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН по адресу: 127276, Москва, Ботаническая ул., д. 35.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН.

Автореферат разослан « » апреля 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета — канд. биол. наук

Л. И. Сергеева

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Одной из актуальных проблем в выяснении молекулярных механизмов действия фитогормонов является поиск и изучение регуляторных систем, участвующих г восприятии, грансдукции и реализации гормональных сигналов. Среди них важную роль играет обратимое фосфорилиройание белков, которое осуществляют протеинкиназы и протеинфосфатазы.

Исследования последних лет показали, что протеинкиназы.(ПКазы) вовлекаются в распространение гормонального сигнала на функционально важные структуры растительной клетки, такие как генетический аппарат (Kulaeva, 1992; Селиванкина и др., 1987; 1988; Ranjeva, Boudet, 1987), трансляционный комплекс (Yakovleva, Kulaeva, 1987) и мембранные .системы (Morre et al., 1984; Селиванкина и др., 1989; Тихая и др., 1989). .

В регуляции важнейших процессов метаболизма животных клеток, таких как экспрессия генов, ионный транспорт,• секреция гормонов, синтез ДНК и пролиферация клеток, участвуют протеинкиназы С-типа, активность которых еависиг от ионоз Caz+ и фосфолипвдоз (Nlshlzuka, 1986; Kikkawa et al., 1989). Протеинкинаэа С (ПКаза С) активируется диацидглицерином (ДАТ)' - вторичным.. посредником фосфатидилинозитной. ' сигнальной системы - и играет существенную роль в трансформации гормональных сигналов в биологические ответы чувствительных клеток (Nlshlzuka, 1984). Помимо этого ПКаза С является молекулярной мишенью форболовых эфиров, вызывающих опуходевое перероадение клеток, и участвует в! патологических реакциях животных клеток (Ashendel, . 1985).. : ■/,'•'• "■' • : ■

Роль ПКаеы С в механизмах трансдукции гормональных сигналов и регуляции разных направлений метаболизма интенсивно изучается в последние годы (Farrago, Nlshlzuka, 1990), ЛКазы С-гйпа, различающиеся по молекулярным массам, субстратной специфичности, чувствительности к активаторам и тканевой локализации, найдены, во многих типах клеток животных, а также у дрожжей и Neurospora crassa (Klkkawa, Nlshlzuka, 1986; Simon et al., 1991, Favre. Turian, 1987).

В связи с этим чрезвычайно важно исследование присутствия ферментов, подобных ПКазе С животных, у растений. В нескольких работах обнаружены Са2+, фосфолипид-зависимые ПКазы растений, сходные с ПХа-80Й С животных, и изучаются их свойства (Schafer et al., 1985; Elliott. Skinner, 1986; Olah, Kiss, 1986). Особый интерес представляет исследование участия ЛКааа С-подобных белков в молекулярных механизмах действия фигогормонов. Показано влияние гибберелловой кислоты на активность Са2+, фосфолипид-эависимой ПКазы клеток клубней картофеля и ее транслокацию в мембрану (Ладыженская и др., 1997). Активация ионами Са2+ и ДАР цитокининвависимого синтеза антовдана в клетках щирицы указывала на возможное участие ПКазы С в ответе растений на цитокинин (Elliott et, 1986). Недавно получены данные об индукции пролиферации клеток эксплантов табака под действием эфира форбола, который в клетках животных непосредственно активирует Шазу С (Wood et al., 1990). В отсутствие эфиров форбола пролиферация клеток табака индуцировалась цитокинином, что позволило .предположить существование общих путей реализации действия эфира форбола и цито-кинина. В связи с этим крайне важной проблемой является изучение возможности регуляции цитокининами активности ПКаза С-подобных Сел-ков растений.

В качестве системы для изучения этого вопроса были выбраны листья ячменя, поскольку ранее было показано присутствие в листьях ячменя ряда ПКаз, активность которых регулировалась цитокининами и другими фитогормонами (Селиванкина и др., 1987, 1988а; 19886). Это представлялось целесообразным еще и потому, что изолированные листья ячменя обладают высокой чувствительностью к экзогенным цитокининам, которые активируют синтез РНК и бедка в их клетках, задерживая старение листьев (Кулаева, 1973; 1982).

Цель и задачи работы. Целью нашей работы было изучение возможного присутствия ПКаз С-гипа в листьях ячменя и влияния, цитокининов и других фитогормонов на их активность.

Перед нами стояли следующие задачи:

1. Исследовать присутствие в Листьях ячменя Ca2f, фосфолипид-эависимой активности ПКаз, .

- б -

2. Изучить влияние эффекторов ПКазы С животных на активность ПКаз листьев ячменя.

3. Исследовать кросс-реактивность ПКаз из листьев ячменя с антителам против ПКаэы С животных.

4. Выяснить влияние цитокининов и других фитогормонов in vitro на ПКаза С-подобную активность листьев ячменя.

Научная новизна и практическая значимость работы. Установлено, -что в цитоэоле листьев ячменя присутствует Саг+, $осфолипид-зависимая ПКаза. Фермент охарактеризован по субстратной специфичности и ряду физико-химических свойств. Доказано, что выделенная ПКаза может быть отнесена к ПКазам С-типа, поскольку она активировалась специфическими активаторами ПКаэы С клеток животных (фосфолипидами, 1,г-зп-диацилглицерином, эфиром форбола) и проявляла кросс-реактивность с моноклональными антителами к ПКаэе С из мозга крысы. Показано присутствие Caz+, фосфолипид-зависимой ПКа8ной активности во фракции мембран, выделенных из листьев ячменя. Обнаружено, что активность ПКазн С-типа листьев ячменя регулируется цитокининами in vitro. Активацию ПКази вызывали физиологически активные природные (транс-зеатин) и синтетические (6-БАП) цитокинины. Неактивные аналоги цитокининов (цис-зеатин, аденин) не влияли на активность ПКазы. Исследование активности ПКазы С-типа ив листьев, предыияубированных с раствором 6-БАП, показало, что цитокинин способствовал сохранению ПКазы С в активной форме, тогда как инкубация листьев на воде приводила к потере ее активности. *

Совокупность полученных данных позволила нам заключить, что в листьях ячменя присутствует ПКаза С-типа, которая может быть одной из возможных молекулярных мишеней действия цитокинина, и предполагать ее участие в ответе на цитокинины листьев ячменя. Существенного влияния АБК и фуэикокцина (ФК) на ПКаза С-подобную активность не обнаружено. Результаты работы вносят свой вклад в понимание механизма действия фитогормонов, которое необходимо для целенаправленного применения регуляторов роста растений при решении задач биотехнологии.

Апробация работы.- Основные результаты работы были представлены на 7-ом конгрессе ФЕС№ (Швеция, 1990), 14-ой международной конфе-

ренции по регуляторам роста растений (Нидерланды, 1991), международном симпозиуме "Физиология и биохимия цйтокининов" (Чехословакия, 1991), международном симпозиуме "Биохимические механизмы регуляции роста и развития растений" (Италия, 1991).-

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ. Структура и объем диссертации. "Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов иследования, наложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованной литературы. Диссертационная работа изложена на 123 страницах машинописного текста, содержит 9 таблиц, 21 рисунок. Список цитируемой литературы включает 237 наименований, из которых 215 на иностранных языках.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Объектом наших исследований были выбраны листья первого яруса 9-10 дневных растений ячменя (Hordeum vulgare L.) сорта Винер, которые высокочувствительна к действию экзогенных цитокининов (Кулаева, 1973). Растения ячменя выращивали в ящиках с' почвой в факторостатных условиях: температура воздуха днем составляла 23°С и ночью 18°С, длина светового дня - 16 часов, освещенность - 50 Вт/мг, влажность воздуха - 70Х.

Из листьев выделяли препарат Саг+, фосфолипид-зависимой ПКаэы, используя ионообменную хроматографию на ДЕАЕ-целлюлозе и аффинную хроматографию на аденинсефароае. Аденинсефарозу синтезировали путем иммобилизации аденина на эпокси-активарованную сефарозу 6В (Pharmacia) (Мошков, 1989). Выделение белков проводили при 4°С.

Для выделения . ПКаэы из цитозоля листья, гомогенизировали в буфере, содержавшем ингибитор протеаз (ФМСФ) и хелаторы металлов (ЕДТА и-ЕГТА). Гомогенат осветляли центрифугированием при 160000 g. Низкомолекулярные соединения из супернатанта удаляли при помощи гельфиль-грации на сефадеюзе Г-50. Полученную фракцию белков последовательно хроматографиров&чи на ДЕАЕ-целлюлозе и аденинсефароае.,

Для очистки ПКазы иа фракции мембран листья гомогенизировали в Саг+-содержащем буфере (1мМ) в отсутствие хелаторов.■Отфильтрованный гомогенат центрифугировали при 4000 g и полученный супернатант при

40000 г. Осадок мембран от последнего центрифугирования ресуспенди-ровали в буфере, содержавшем ЕЭПГА и ETTÁ, и центрифугировали при 100000 g. Надосадочную жидкость использовали для очистки ПНазы по схеме, применявшейся для очистки фермента ив цитоэоля.

Щютеитшаэную активность определяли в реакционной смеси объемом 100 мкл, содержавшей 20-100 нг белка, 20 ни {тг-32Р>-АТФ иди {Г-33Р>-АТФ, 50 kW трио-HCl pH 6,5, O.lX-ный тритон Х-100, 10 мКГ NaF, 9 иМ MgClg. Другие компоненты смеси и их концентрации варьиро-. вали в зависимости от экспериментальной эадачи. Концентрацию свободных ионов Caz+ в; реакционной среде контролировали добавлением Са2+/ЕГТА-содержацего буфера. Буфер вклтал ЗГТА в конечной концентрации .1 Ш и разные концентрации CaCl¿, вычисленные при помощи ч компьютерной программ* (Robertson, Potter, 1984).

Анализ фосфорилированных полипептидов проводили методом элект-рофорева а палиакрияамидном геле (ПЛАТ) в присутствии додецилсульфа-та натрия CSDS) (Laerely, 1970) о последующей авторадиографией полученных электрофореграмы.

Для обнаружения кросс-реактиввосги ввделенных на листьев ячменя фракций белков с иоиокловадьнши антителами против каталитической субъединида ЛКазы С ив моага крысы (МсАЬ 1.9) (aibco, США) была ис-польэовава система твердофазного иммунофёрмёнтного анализа (ИФА).

Опыты проводили в 4-5 биологических повторностях о последующей статистической обработкой данных.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Очистка Ca2"*", фосфодшид-зависимой протеинкинааы иэ цитоэоля листьев ячменя, Са2+, фосфолипид-стимулируемая ПКазная активность была обрнаружена во фракциях, которые визировались с ДЕАЕ-целлюлозы при 0,25 М НаС1 (рис.1). Анализ этих фракций в системе ИФА показал присутствие в них белка, который проявлял кросс-реактивность с мо-ноклональным антителам против ПКазы С иэ моэга крысы (МсАЬ 1.9) (рис.1,а). Полуденные фракциидалее хроматографировали на аденинсе-фарозе. Элюцию связавшихся с аденинсефарозой белков проводили 0,25 N NaOH. Ca2*, фосфатвдилсерин-активируемая ПХаэа элюировалась острым симметричным пиком, совпадающим с пиком белка и реагировала с анти-

- в -

10 . . 20 30 Помар фракции

Рид. 1. Фракционирование белков цитоаольной фракции листьев ячменя на ДЕДЕ-целлюлозе при элюции ступенчатым градиентом. . НаС1. а): Определение ПКааы С-типа во фракциях при помощи ИФА с антителами к каталитическему домену ПКаэы С иа мозга крысы (МсАЬ 1.9, разведение 1:4000), Е£3 - ОО^эг, где К -контроль с овальбумином вместо белков фракций. Стрелками -указана концентрация . ИаС1 в молях, б): Протеинкинааная активность фракций, измеренная в присутствии 10~е М Са2+ и 50 шг/ыл ФС (темные столбики) и в отсутствие Са2+ и ФС (свет-• лью столбики). В качестве экзогенного субстрата для определения протеинкиназной активности использовали гистон Н1 (60 мкг/мл). , '

ЗОг-

К о)'

§ @

Ф

ХЭ СП

2 •

ет

0,2

0,1

0,4

■з

а о

0,2

^ -10 -1

10 15 20 к

Номер.фракции

Рис.2. Хроматография белков на аденинсефарозе. ЕЭ - ИФА белков с моноклональными антителами к каталитическому домену ПКа-зы С из мозга крысы (МсАЬ 1.9, разведение 1:200). Контролем в • ИФА (К) был овальбумин. Протеинкиназную активность измеряли с гистоном Ш (50 мкг/мл) в присутствии Са24" (10~6 М ) и «С (50 мкг/мл) (-«-) и в отсутствие Са2+ и ФС (-о-), телами против ПКаэы С из мозга крысы (рис.2). Подданным электрофореза в присутствии полученный препарат фермента содержал полипептиды с мол. массами 76, 65, 46, 36 и 33 кД (рис;3). Полипептиды со. сходными мол. массами обнаружены в препаратах ПКазы С из разных тканей животных и из проростков цирицы (МосЫу-Яозеп, КовМап«!, 1987; £ИШ еЬ а!.,.1988) и могут соответствовать интактному ферменту и его фрагментам, , образование которых связывают с активностью протеи-наз, поскольку ПКаза С высокочувствительна к их действию (ШэМгика, 1986).

Использованный нами метод очистки позволил значительно обогатить полученную белковую фракцию Са2+, фосфолипид- зависимой ГОазой.

6743—1

зо-

го, 14,4

-76

-65 -46

-36 -33

Рис.3. Электрофорез в ЯБ-ПААГ препарата Са2+, фосфолипид-зависимой протеиякинааы иа цитозоля листьев ячменя. Гель окрашен серебром. Слева указано расположение белков-маркеров, Стрелками указаны мол. массы полипептидов, кД.

Следующая задача состояла в изучении свойств выделенного фермента.

Свойства Са2*, фосфолипид-зависимой протеинкинааы листьев ячменя. Зависимость активности ПКазы, выделенной из цитозоля листьев ячменя, от ионов Са2+ представлена на рис.4а. ПКаза активировалась ионами Са2+ в концентрации 10~4-10~3 М, При добавлений в инкубационную среду фосфатидилсерина (4С) чувствительность ПКазы к Саг+ существенно увеличивалась, и максимальная активность фермента обнаружена при ! 10~6-10~5М Са2+, что. соответствует данным для ПКазы С животных (Така1 е1 а1., 1979)Исследование ряда фосфолипидов показало, что ПКаэа иэ листьев ячменя предпочтительно активируется' 4С (рис.4б). Активность ПКавы могла быть усилена фосфатидилинозитои («И), который однако в меньшей степени активировал фермент в сравнении с $С, а фосфатидная кислота (ФК) не влияла на ПКаэную активность.

Отличительной характеристикой ПКаа С-типа является модуляция их активности ДАТ. Мы установили, что ДАТ (1,2-:5п-дипальмитоилглицерин) в присутствии 10~в М Саг+ в концентрации 0,1-1 мкт/мл повышал активность ПКазы листьев ячменя на 80-90Х (рис. 5а). В наших экспериментах в присутствии 0,1 мкг/мл ДАТ и 10~6 М Саг+ ПКазная . активность возрастала в г раза при концентрации <ХС 10 мкт/мл по сравнению с

.. ЕГТА .

-9 -7 -5 1е(СаС1^], м

Концентрация фосфолипида, мкг/мл

-40й

Рис.4. Влияние ионов Са2+ (а) и фосфолипидоэ (б) на активность ПКазы, выделенной из цитозоля листьев ячменя, а): Протеинки-наэная активность в присутствий 50 мкг/мл 4С (-•-) и в его отсутствие (~о-). Контролем служила инкубационная среда без Са2+ и «С, содержавшая 1 мМ ЕГТА. б): Влияние ФС (1), р (2) и ФК (3) на протеинкинаяную активность в присутствии 10"а М Са2+

160 г

120

¥5.

3

80

40

а)

120

60

40

[*1 1*1 >1

б)

Г.

1+

0,1 1 4 10 15 Концентрация ДАТ, мкг/мл

10 25 50

Концентрация ФС, икг/мл

рис.5. Действие ДАР на протеинкиназную активность выделенного из листьев ячменя препарата ПКаэы. а) - в присутствии 10"° М Са2+, б) - в присутствии 10"6 М Саг, 0,1 мкг/мл ЛАГ и разных концентраций ФС (темные столбики) няи то же, но в отсутствие ДАТ (светлые столбики).,

- -

контролем без ФС, тогда как в отсутствие ДАР подобная активация фермента наблюдалась лишь при 60 маУмя «С (рис. 56). Ш установили, что аффект ДАТ на активацию фермента в присутствии ФС зависел от концентрации последнего. Так, при наличии в инкубационной среде ФС в концентрациях 10 н 25 мкг/ма, ДАТ значительно активировал ПКазу, тогда как при 50 ыкг/мл ФС влияние ДАТ бьио менее заметно (рис.бб). Полученные наш результаты согласуются с данными о том, что ДАТ способен повышать сродство ПКаэы С клеток животных к ФС (К1эМпЫо е1 а1., 1980).

Характерным свойством ПКаэы С животных является активация зфира-ми форбола. Мы обнаружили, что физиологически .активный в животных клетках эфир форбола (ОДА) в концентрациях 10-е - Ю-7 М активировал фермент. Существенно, что неактивный аналог эфиров форбола (ФДЦ) влияния на ПКазную активность не оказывал (Таблица 1).

Таблица 1. Влияние эфиров форбола на активность протеинкинаэы из цитозоля листьев ячменя

Концентрация,1 М \ 1 Включение Э2Р в бедок, 1 имп/мин на 10 мкг белка 1 1 ■Активация, X

«МА: 0 - 3952 + 135 100

Ю'э 3022+168 76

Ю-0 5142 +105 130

• 10-7 12280 + 177 310

10_б 4119 +99 104

ВД: о 3952 +135 100

10-10 3679+129 94 '

10"9 4456 + 98 112

Ю-0 3828 + 155 97

10-7 4657 + 146 118

В описанных выше экспериментах по изучение каталитических свойств ПКазы акцепторами фосфата в реакции фосфорилирования были эндогенные белки препарата выделенного фермента.

- аэ -

Предпочтительными экзогенными субстратами ПКазы С животных являются основные белки, в частности, гистон Н1 (ШзМгика, 1986). В наших опытах гнстон Н1 также фосфорклировался выделенным ив листьев ячменя препаратом фермента, при этом эндогенные полипептида-фракции не фосфорилировалисъ (рис.6). ДАТ в концентрации 0,1 мкг/мл вначи-гельно усиливал фосфорилирование гистона Н1 (рис.7).

а б* в а б в

>Н1

Рис.б.

Рис.7.

Рис.6. Радиоавтограф электрофореза в БОЗ-ПААГ белков, фосфори-лированных ПКазой цитозоля листьев ячменя, а, б - эндогенных полипептидов препарата ПКазы в присутствии 10 мкМ Са2+ (б) и в отсутствие Са2+ (а) , в - гистона Н1 в присутствии 10 мкМ Са2"!

Рис.7. Радиоавтограф электрофореза в ЭОЗ-ПААГ гистона Н1, фос-форилировашого препаратом ПКазы из цитоэоля листьев ячменя, а - в отсутствие ПКазы; б - в присутствии ПКазы (100 нг) и Са2+ (10~6 М); в - в присутствии ПКазы (100 нг), Са2+ (10-еМ), ДАТ (0,1 мкг/мл). Слева указано расположение белков-маркеров, кД. Справа - расположение гистона Н1.

Наличие иммунологического сходства ПКаэы из цитозоля листьев ячменя с ПКаэой С животных, наряду со сходством в способах регуляции их активности, свидетельствовало о принадлежности изучаемого фермента из листьев ячменя к ПКазаы С-типа.

, Изучение присутствия Ca24', фоефолипид-зависимой протеинкиназной активности во фракции мембран листьев ячменя. В покоящихся клетках животных ПКага С локализована в цитозоле. При воадействии на клетку внешних сигналов (гормонов, нейромедиаторов и др.) фермент трансло-цируетоя в мембрану, где активируется фосфолипидами и ДАТ (Kraft, Andersen, 1983). Полагают, что связывание ПКавы С о мембраной индуцируется ионами Ca24", внутриклеточная концентрация которых увеличивается под действием внешних сигналов (Wolf et al., 1985). В свяаи с втим важно бьио изучить возможность присутствия ПКаза С-подобного фермента и во фракции мембран листьев ячменя.

Использованная нами схема солюбилизации мембраносвязанного фермента и его очистка позволили получить препарат ПКаэы, которая активировалась ионами Саг+ (10~6 М) и ДАТ (0,1-15 мкг/мл) (Таблица 2). Экзогенными субстратами БКаэы были гистоны, выделенные иа хроматина листьев ячменя (Таблица 3).

Таблица 2. Действие диацилглицерина на протеинкинаау иа мембранной фракции листьев ячменя в присутствии 10~е M Саг+

Концентрация ДАР, I Включение 32Р в белок, мкг/мл 1 , имп/мин на мкг белка* '__1__

0 25510 + 154'

0,1 48520 + 106

.1,0 35530 + 230

5,0 зто + 320

10,0 36920 + 198

16,0 27955 + 145

"Реакцию проводили без добавления экзогенного субстрата.

Таблица 3. Фоо$орилирование гистонов протеинкиназой ив фракции мембран листьев ячменя

Количество, гистонов в ! реакционной среде, мкг/мл I

Включение 32Р в белок, имп/мин на 10 мкг белка

О 60 100 200

9144 + 102 10637 + 93 17427 + 120 17450 + 84

Присутствие ПКаз, близких по ряду свойств ПКазам С-типа, в ци-тозоле и в связи с мембранами, возможно, отражает внутриклеточную компартментацио ПКазы.. Однако решение проблемы локализации ПКаэы С в клетках листьев ячменя требует дальнейших исследований.

Влияние фитогормонов in vitro на Са2"*". фосфодипид-зависимую протеинкиназу листьев ячменя. Наша очередная задача состояла в изучении способности фитогормонов регулировать активность ПКаэы С-типа листьев ячменя in vitro. В опытах использовали препарат ПКазы, выделенный из цитозоля листьев ячменя. При введении в инкубационную среду 6-БАП в концентрациях 1О~0-1О~4 М не было обнаружено заметного влияния цитокинина на ПКазную активность изучаемого фермента. Если же в среде.инкубации присутствовали эффекторы ПКаэы С, т.е. Са2+, ФС и ДАТ, то добавление 6-БАП вызывало существенную активацию фермента (рис.8). Величина этой активации зависела от концентрации цитокинина и описывалась характерной для его гормональных эффектов кривой с максимумом действия при концентрации 6-БАП 10"б-10"5 М. Важно, что аденин, который' можно рассматривать в качестве неактивного аналога цитокининов пуринового ряда, в аналогичных условиях опыта подобным эффектом не обладал. В присутствии 6-БАП наблюдалось усиление фосфо-рилирования нескольких Подилептидов фракции гистонов листьев ячменя и полипептидов препарата ПКазы (рис.9). Полученные данные свидетельствовали о регуляторном действии синтетического аналога цитокининов пуринового ряда (6-ВАЛ) на ПКазу с-тила листьев ячменя.

- -

Рис.8. Влияние 6-ВАЛ на активность ПКазы С-типа из цитозоля листьев ячменя в присутствии 1СГ6 М Са2+, 50 мкг/мл ФС и 0,1 мкг/мл ДАТ (1) и в их отсутствие (2), а также адейина в присутствии указанных концентраций Са2+, ФС и ДАГ (3). Реакцию проводили с гистоном Н1 (60 мкг/мл) в качестве экзогенного субстрата.

Важно бьшо изучить также влияние на 1Жаза С-подобную активность природного цитокинина - зеатина. Для проверки специфичности действия гормона использовали цис- и транс-формы зеатина, из которых транс-форма обладает физиологической активностью, а цис-форма - неактивна, что было показано в биотесте на задержку пожелтения срезанных листьев ячменя. Наши эксперименты покёзади, что транс-зеатин способен стимулировать ПКаэную активность более чем в 2 раза в концентрациях 1СГ8-1СГ7 М (рис.10). Цис-зеатин таким эффектом не обла-

80

®

60

3 40

со 20 н о о

я -

сч

С)

19 22

Мол. ыесоы полипеатидов, кД

Рис.9. Влияние 6-БАП на активность ПКазы С-типа цитозоля листьев ячменя. , Реакционная среда содержала: а - 50 мкг/мл гистонов, выделенных из хроматина листьев ячменя, 10"6 М Ca2f, 50 мкг/мл «С, 0,1 мкг/мл ДАТ и 10~7 М 6-ВАЛ. б - то же, но без добавления 6-БАП. Представлены денситограммы радиоавтографов. Стрелками указаны мол. массы полипептидов, кД. с - степень фосфорилирования полипептидов в отсутствие (EZ3) и в присутствии (ОВ) 6-БАП.

дал. Существенно, что влияние транс-эеатина на ПКазную активность осуществлялось, как и в случае б-БАП, лишь в присутствии активаторов ПКаэы С.

Поскольку в нескольких работах был обнаружен антагонизм в действии цитокинина и АБК на уровне регуляции активности ПКаз растений (Селиванкина и др., 1987; Уакоу1еуа, Ки1ае7а, 1987), представлялось важным проверить чувствительность к АБК ПКаэы С-типа листьев ячменя.

Рис. 10. Влияние веатина на активность ПКазы С-типаЧга цитозоля листьев ячменя. Реакционная среда содержала: транс-аеатин и Ю-6 М Са2+, 50 ыкг/мл ФС, 0,1 мкг/ыл ДАТ, 50 мкг/ил гистона Н1; -о- - цис-веатин и указанные концентрации Саг+, ФС, ДАТ, гистона Н1; -»-- транс-эеатин в отсутствие Са2+, ФС и ДАТ, Ьв (2, М) - логарифм концентрации веатина в молях.

Как показывает рис. 11а, добавление в реакционную среду АБК не оказывало значительного влияния на ПКааную активность ни в отсутствие, ни в присутствии Са2+, $С и ДАТ.

Некоторые эффекты цитокинина может имитировать фузикокцин (Ку-лаева, 1982). В частности, было обнаружено влияние цитокинина и фу-эикокцина In vitro на активность ПКазы, ассоциированной с РНК-поли-меразой 1 (Селиванкина и др., 1088), а также регуляция этими фито-гормонами ПКаз микросшальной фракции корней проростков ячменя (Селиванкина и др., 1989; Тихая и др., 1989). В связи с этим важно было выяснить-, регулируется ли активность выделенной нами ПКазы фуэикок-цином. Результаты этих опытов представлены на рис.116, который показывает, что фузикокцин (ЯК) In vitro в исследованных концентрациях не вызывал значительных изменений активности выделенного нами фермента ни при наличии, в среде фосфорилирования специфических активаторов ПКазы С, ни в их отсутствие. Это позволяет думать, что, по-видимому, ПКавы С-типа не являются мишенями фузикокцина. Этот вывод согласуется о имеющимися в литературе данными о том, что действие фузикокцина реализуется через активацию иных систем, локализованных в плазмалемме, но не ПКазы С (Meyer et al., 1S90).

Таким образом, полученные результаты указывали на регуляцию активности ПКазы С-типа цитозоля листьев ячменя цитокининами in vitro. Одним И8 физиологических эффектов действия цитокининов на чувствительные к ним объекты является задержка пожелтения срезанных листьев (Кулаева, 1982). В связи с этим представляло интерес ивучение активности ПКазы С-типа, выделенной из изолированных листьев ячменя, обработанных цитокинином. Для этого листья первого яруса 9-ти дневных растений ячменя инкубировали 72 часа на воде или растворе 6-БАП (10~5 М). Затем из листьев обоих вариантов выделяли цитозольную ПКа-зу С. Во фракции белков, выделенной из листьев, предынкубирсванных на воде, мы не обнаружили ПКазы, чувствительной к ионами Са2+, ФС и ДАТ. Тогда как.ПКаза из листьев, обработанных цитокинином, активировалась ионами Са2+, 4С и ДАТ в 2 раза, как это характерно для ПКазы С-типа (Таблица 4).

«л

20 Г

3

-20

-40 60

* 40

■9

20

-20

а)

-9 „Л...

-8 I_

-7 -6 ■ '

-5 -4

1 | -7 I / •

-9 ст*"* -6 -5 ■. -4 .

Рис.11. Влияние АБК (а) и ФК (б) на активность ПКдзы С-типа из цитоэоля листьев ячменя в присутствии Ю-6 М Саг+, 50 мкг/мл ФС, ОД мкг/мл ДАТ и 50 мкг/мл гистона Н1 (-•-) и в отсутствие Са2\ ФС и ДАТ (—о—).

о

- 21 -

Таблица 4. Влияние обработки срезанных листьев ячменя

6-БАП (10"® М) на активность протеинкиназы С-типа. (Цифры в скобках обозначают X активации)

Добавки в реакцион-1 Включение 32Р в белок, имп/мин на мкг белка

ную среду 1.

1 1 Вода 1 i 6-БАП

Контроль* . 4258 + 110 (100) 5150 + 127 (100)

+ Са. ОС, ДАТ 4371 + 95 (105) 8796 + 140 (202)

^Контролем служила реакционная среда без указанных добавок.,, Реакцию проводили в присутствии гисгона Н1 (50 мкг/мл). Концентрация добавок составляла: 10~6 М Саг+. 50 мкт/мл <СС и 0,1 мкг/мл ДАТ.

Можно предположить, что усиление активности прогеаз, характерное для стареющих листьев, могло приводить к нарушению интактности фермента, его протесиштической деградации или к переходу ПКазы С в нечувствительную к ее активаторам М-кинаау, которая образуется из каталитического домена ПКазы С под действием протеаз (ШэМгика, 1986). Цитокйнин, задерживая старение листьев, возможно, способствовал сохранению интактности ПКазы С либо активировал синтез фермента. Нельзя исключить, что все перечисленные факторы внесли свой вклад в полученные результаты. .

Таким образом, результаты этих экспериментов показали, что под действием цитокинина в срезанных листьях ячменя, наряду с установленными ранее процессами усиления синтеза РНК и белка (Кулаева, 1982), происходит ивменение активности ПКазы С-типа, что свидетельствует о возможном участии ПКазы С-типа в механизме действия цитокинина на листья ячменя.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ •

Обратимое-фосфорилирование белков является одним из универсальных способов регуляции метаболических процессов в клетках растений и животных. В регуляции важнейших направлений метаболизма животных клеток участвуют ПКазы С-типа ШэМгика, 1986).

Проделанная работа показывает, что в листьях ячменя присутствует ПКаза, по ряду изученных свойств сходная с ПКаеами С-типа животных. ПКаза С-подобный фермент обнаружен нами в цитоплазме клеток лиотьев ячменя. При выделении ПКазы, в условиях повышенной концентрации Са2+, фермент был обнаружен и во фракции мембран.

ПКаза С играет важную роль в передаче действия внешних сигналов, таких как гормоны, нейромедиаторы, релизинг-факгоры, на внутренние структуры клеток животных (Klkkawa et al., 1989). Мы исследовали возможность вовлечения ПКаза С-подобного белка листьев ячменя в механизм действия фигогормонов. Срезанные листья ячменя являются удобной и испытанной тест-системой для изучения действия цитокини-нов, которые задерживают старение листьев, активируя синтеэ РНК и белка в их клетках (Кулаева, 1982). В наших опытах при обработке ци-токинином срезанных листьев ячменя, наблюдалось изменение активности ПКазы С-типа. Мы обнаружили также, что цитокинин активирует ПКазу С из листьев ячменя in vitro. Существенно, что активацию ПКазы вызывали физиологически активные природные (транс-эеатин) и синтетические (6-ВАП) цитокинины, тогда как их неактивные аналоги (цис-веатин, аденин) не оказывали влияния на ПКазнун активность. Наши данные, на-, ряду с имеющимися в литературе данными о влиянии эффекторов ПКазы С животных на цитокинин- зависимые процессы растительных клеток (Elliott. 1986; Wood et al., 1990), свидетельствуют,о вероятном участии ПКаза С-годобных белков растений в механизмах действия цито-кининов.

В опытах с абсцивовой кислотой и фузикокцином мы не обнаружили их существенного влияния на активность ПКазы С In vitro. Возможно, действие этих регуляторов реализуется через пути отличнде от таковых, для цитокининов.

Полученные результаты, вместе с данными других авторов (Elliott, 1986; Ладыженская и др., 198?; Wood et al., 1990), откры-; вают перспективу дальнейшего изучения участия ПКаза С-подобных белков в механизмах действия фитогормонов.

- 83 -ВЫВОДЫ

1. В цитоволе листьев ячменя обнаружена Са2+\ фосфолипид-зависимая ПКаза и предложена процедура ее очистки. Фермент охарактеризован по субстратной специфичности и ряду физико-химических свойств.

2. Выделенная ПКаза может быть отнесена к ПКазам С-типа по следующим критериям: 1) активация микромолярными концентрациями ионов Са2+, 2) активация фосфатидилсерином, 3) повышение под действием фосфа-тидилсерина чувствительности прогеинкинаэы к ионам Са2+, 4) активация 1,2-БП-диацилглицерином, 5) активация эфиром форбола и отсутствие действия его неактивного аналога, 6) кросс-реактивность с моноклоиальньми антителами к ПКазе С животных.

3. Показано присутствие Са2+, фосфолипцд-зависимой ПКазной активности во фракции мембран, выделенных из листьев ячменя.

4. Обнаружено, что активность ПКазы С-типа листьев ячменя регулируется цитокининами In vitro. Активацию ПКазы вызывали физиологически активные природные (транс-зеатин) и синтетические (6-БАП) цитокинины. Активация подчиняется концентрационной зависимости, характерной для гормональных эффектов. Неактивные аналоги цитокининов (цис-зеатин, аденин) не оказывали влияния на активность ПКазы.

6. Существенного влияния абсцизовой кислоты и фузикокцина In vitro на активность ПКазы С-типа листьев ячменя не обнаружено.

8. Показано, что цигокинин, задерживая старение срезанных листьев ячменя, способствовал сохранению активности ПНазы С, тогда как инкубация срезанных листьев на воде приводила к потере ее активности.

7. Полученные данные указывают на присутствие в листьях ячменя про-теинкиназы С-типа, позволяют обсуждать ее в качестве одной из возможных молекулярных мишеней действия цитокинина и предполагать ее участие в трансдукции сигнала цитокинина в клетках листьев ячменя. •

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Selivankma S.Yu., Moshkov I.E., Novikova G. V., Pereverzeva

l.N. Does protein kinase C-like protein from barley leaves

participate in the cytokinin actlon?//Physiologia"plantarum. 1990. V. 79. N 2. Part 2. P. 198.

й.Селиванкина С.Ю., Новикова Г.В., Переверзева И.Н. и др. Присутствие в листьях ячменя регулируемой цитокинином протеинкиназы С-типаУ/Физиология растений. 1990. Т. 37. Вып. б. С. 864-872.

3. Перевереева И.Н., Селиванкина С.Ю. Участие протеинкинавы С-типа в реакции листьев ячменя на цитокинин//Докл. АН СССР. 1991. Т. 321. N 2. С. 425-428.

4. Pereverzeva I.N., Selivanklna S.Yu., Karavaiko N.N..Kulaeva O.N. Partial purification of protein kinase C-type enzyme from barley leaves and its possible participation in cytokinin action//14th International Conference of Plant Growth Substances: Abstracts. Amsterdam, 1991. P.45.

5. Kulaeva O.N., Novikova G. V., Sellvankina S.Yu., Karavaiko N.N., Moshkov I.E., Pereverzeva I.N. Protein kinases and cytokinin binding proteins in barley leaf response to cytokinin// International Symposium on Biochemical mechanisms Involved in Growth Regulation: Abstracts. Milan, 1991. P.15-16.

6. Pereverzeva I.N., Selivanklna S.Yu., Novikova G.V., Kulaeva

0.N. Suggested participation of protein kinase C-type enzyme from barley leaves in cytokinin action//International Symposium on Biochemical mechanisms Involved in Growth Regulation: .Abstracts. Milan, 1991. P.38b.

7. Selivanklna S.Yu., Novikova G.V., Pereverzeva I.N., Moshkov

1.E., Kulaeva O.N. Possible involvement of protein kinase C-type enzyme frorn barley leaves in cytokinin action//Proc. Int.Sym. Physiology and Biochemistry of. Cytokinins in Plants.01992. SAB Academic Publishing:The Hague, The Nehterlands. P. 173-175.