Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Рецепция и трансдукция цитокининового сигнала в листьях арабидопсиса и ячменя

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Маслова, Галина Геннадьевна

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Задержка старения срезанных листьев травянистых растений как модельная система для изучения действия цитокинина.

1.2. Характер смены РНК при старении листьев.

1.3. Цитокинины и старение листьев.

1.4. Влияние цитокинина на синтез РНК.

1.5. Белки - посредники ответа на цитокинин.

1.6. Участие протеинкиназ в ответе растительных клеток на цитокинин.

1.7. Роль этилена в регуляции старения листа.

2. Объект и методы исследований.

2.1. Объект исследований.

2.2. Выращивание растений и постановка опытов.

2.3. Выделение хроматина.

2.4. Определение активности связанной с хроматином РНК-полимеразы 1.

2.5. Определение активности связанных с хроматином протеинкиназ.

2.6. Определение функциональной активности цитокинин-связывающих белков из листьев растений АгаЫ<Лор81з ЖаНапа.

2.7. Определение концентрации ДНК в препаратах хроматина.

2.8. Определение концентрации белка в препаратах хроматина.

3. Результаты экспериментов и их обсуждение.

3.1. Действие цитокинина на активность связанной с хроматином РНК-полимеразы I из розеточных листьев растений

АгаЫс1орх1х ЖаНапа разного возраста.

3.2. Действие цитокинина на активность протеинкиназ хроматина из розеточных листьев растений АгаЫс1орх1$ ЖаНапа разного возраста.

3.3. Функциональная активность цитокинин-связывающих белков из листьев растений АгаЫс1ор818 th.alia.na разного возраста.

3.4. Ответ на цитокинин транскрипционной системы листьев этилен-нечувствительных мутантов арабидопсиса ей5 и е1т1.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Рецепция и трансдукция цитокининового сигнала в листьях арабидопсиса и ячменя"

Изучение рецепции и трансдукции цитокининового сигнала представляет значительный интерес ввиду ключевой роли цитокининов в развитии растений (Skoog, Miller, 1957; Mothes, 1964; Кулаева, 1973, 1982, 1995). Эти гормоны вовлечены в регуляцию таких важных физиологических процессов, как деление клеток, рост клеток листа, биогенез хлоропластов, индукция стеблевого морфогенеза, старение листьев, а также в реакции растений на внешние воздействия. Физиологические эффекты цитокининов хорошо охарактеризованы, однако этот класс растительных гормонов изучен недостаточно и механизм их действия до конца не раскрыт. За последние годы достигнуты значительные успехи в изучении этой проблемы. Получены данные о реализации цитокининового сигнала в клетках листьев ячменя и проростков кукурузы через ядерный белок-рецептор, который в комплексе с цитокинином регулирует транскрипцию (Kulaeva et al., 1995, 1998; Каравайко и др., 1995; Бровко и др., 1996). Показано участие протеинкиназ, связанных с хроматином, в ответе листьев на цитокинин (Селиванкина и др., 1988). Установлено, что протеинкиназы бикомпонентной регуляторной системы вовлечены в передачу цитокининового сигнала (Kakimoto, 1996; Brandstatter andKieber, 1998; Imamura et.al., 1998, 1999). Продемонстрировано возможное участие G-белков в ответе растительных клеток на цитокинин (Novikova et.al., 1999). Получены доводы в пользу присутствия в клетках наряду с ядерными мембранных рецепторов цитокининов (Plakidou-Dymock et.al., 1998).

Поскольку изученные до сих пор рецепторы природного цитокинина -транс-ватина., участвующие в регуляции транскрипции, были выделены из однодольных растений (Kulaeva et al., 1995, 1998; Бровко и др., 1996), представлялось актуальным исследовать возможное вовлечение подобных белков в регуляцию транскрипции у двудольных растений, в частности, у Arabidopsis thaliana.

Arabidopsis thaliana имеет огромное преимущество перед другими растениями, связанное с малым размером генома, секвенирование которого будет закончено в 2001 году. Это облегчит в будущем выделение гена рецепторного белка и генов белков-медиаторов цитокининового сигнала. Кроме того, для Arabidopsis thaliana получено огромное число мутантов с измененным ответом на фитогормоны. Это позволит со временем использовать их для изучения взаимодействия цитокининов с другими фитогормонами. В частности, антагонистом цитокининов в регуляции старения листьев является этилен. Поэтому нам представлялось интересным включить в работу этилен-нечувствительные мутанты арабидопсиса eti5 (Harpham et. al., 1991) и etr 1 (Bleecker et al., 1988), у которых можно было ожидать измененную реакцию на цитокинин.

С первых работ по изучению влияния цитокинина на срезанные листья было известно, что, задерживая старение этих листьев, гормон активирует в них синтез белка и РНК (Richmond, Lang, 1957; Mothes et al., 1959, 1960; Wollgiehn, 1961; Кулаева, Воробьева, 1964). В последующем действие цитокининов на синтез РНК в листьях было изучено более детально (Кулаева 1967, 1973; Селиванкина и др., 1972, 1979, 1980; Романко и др., 1978; Бурханова и др., 1980). В опытах Селиванкиной с сотрудниками (1979) было показано, что, обработав листья цитокинином и выделив из них хроматин, можно обнаружить вызванную гормоном активацию в системе синтеза РНК in vitro, содержащей хроматин и связанную с ним РНК-полимеразу из обработанных листьев. Действие цитокинина было также воспроизведено при добавлении цитокинина в буфер для гомогенизации листьев с последующим выделением хроматина и изучением синтеза РНК in vitro в системе, содержащей хроматин и связанную с ним РНК-полимеразу I

Селиванкина и др., 1979). Прямое добавление цитокинина в среду, содержащую хроматин, не вызывало активацию синтеза РНК in vifro. Для этого были нужны цитокинин-связывающие белки, медиирующие цитокинин-зависимую активацию синтеза РНК.

В связи со сказанным, мы выбрали для характеристики реакции листьев Arabidopsis thaliana на цитокинин его влияние на акивность синтеза РНК in vitro в системе элонгации транскрипции, содержащей хроматин и связанную с ним РНК-полимеразу I, выделенные из обработанных цитокинином листьев. При этом нам представлялось важным изучить реакцию на цитокинин не только у листьев растений арабидопсиса разного возраста, что отражало зависимость реакции от возраста растений, но и при различной продолжительности инкубации листьев на растворе цитокинина. Это позволило анализировать ответ на цитокинин транскрипционной системы листьев в ходе их старения, индуцированного срезанием. Особый интерес представляло изучение свойств цитокинин-связывающих белков из листьев растений арабидопсиса разного возраста в активации синтеза РНК in vitro. Это тоже было включено в нашу работу.

Как упоминалось выше, активация цитокинин-связывающим белком в присутствии цитокинина транскрипции in vitro была хорошо изучена на листьях ячменя с использованием ЦСБ из листьев ячменя и полученной из них транскрипционной системы. Поэтому нам представлялось важным проверить функциональную активность ЦСБ из Arabidopsis thaliana не только в транскрипционной системе из тех же растений, но и в гетерологичной по отношению к белкам из арабидопсиса системе синтеза РНК, содержащей хроматин и РНК-полимеразу I из листьев ячменя.

На основании рассмотренного, цель нашей работы состояла в изучении особенностей ответа на цитокинин транскрипционной системы из 8 листьев Arabidopsis thaliana. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1) изучить систему элонгации транскрипции in vitro, содержащую хроматин и связанную с ним РНК-полимеразу I из розеточных листьев Arabidopsis thaliana в онтогенезе растений;

2) изучить действие цитокинина (6-БАП) на активность связанных с хроматином РНК-полимеразы I и протеинкиназ в листьях растений Arabidopsis thaliana разного возраста;

3) исследовать активность цитокинин-связывающих белков из листьев растений Arabidopsis thaliana разного возраста в гомологичной и гетерологичной транскрипционных системах с использованием хроматина из листьев арабидопсиса и ячменя;

4) изучить влияние цитокинина на транскрипционную систему, содержащую хроматин из этилен-нечувствительных мутантов Arabidopsis thaliana (eti5 и etr-1).

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Маслова, Галина Геннадьевна

ВЫВОДЫ

1. Обнаружены возрастные различия в системе элонгации транскрипции, содержащей хроматин и связанную с ним РНК-полимеразу I из листьев растений Arabidopsis thaliana в онтогенезе растений.

2. Показано, что обработка срезанных листьев цитокинином приводит к активации в них связанной с хроматином РНК-полимеразы I в течение всего изученного периода жизни растений ( от 2 до 9 недель).

3. Наибольшая чувствительность транскрипционной системы к цитокинину при обработке им срезанных листьев обнаружена в молодых растущих листьях 3-х-недельных растений.

4. Обработка цитокинином листьев 5 и 7-недельных растений слабо влияла на активность РНК-полимеразы I и протеинкиназ хроматина, выделенного из листьев, что может быть результатом высокого содержания эндогенных цитокининов в листьях растений этого возраста.

5. Обработка листьев 9-недельных растений Arabidopsis thaliana цитокинином с последующим выделением хроматина показала, что цитокинин вызывает в листьях транзиторную активацию связанных с хроматином протеинкиназ, за которой следует активация РНК-полимеразы I.

6. Активация протеинкиназ и РНК-полимеразы I наблюдалась как при обработке гормоном срезанных листьев, так и при добавлении гормона в буфер для гомогенизации листьев в ходе выделения хроматина

7. Установлено, что ЦСБ 67 кД, выделенные из листьев растений Arabidopsis thaliana разного возраста (3, 7 и 9 недель), различались по способности активировать элонгацию транскрипции in vitro в системе, содержащей хроматин и РНК-полимеразу I из листьев арабидопсиса (гомологичная система) и ячменя (гетерологичная система):

92 а) белок 67 кД из листьев 9-недельных растений в комплексе с цитокинином активировал транскрипцию в гомологичной и гетерологичной системах и это свойство строго зависело от присутствия цитокинина в реакционной среде; б) белок 67 кД из листьев 3-х-недельных растений арабидопсиса активировал синтез РНК in vitro в гомологичной и гетерологичной транскрипционных системах и эта активация существенно усиливалась цитокинином; в) белок 67 кД из листьев 7-недельных растений активировал элонгацию транскрипции in vitro в отсутствие цитокинина в реакционной среде. Листья растений этого возраста отличались максимальным содержанием эндогенных цитокининов, что позволяет обсуждать возможные изменения свойств 67 кД белка в клетках листа под их влиянием.

8. В опытах с обработкой срезанных листьев цитокинином показана активация гормоном связанных с хроматином РНК-полимеразы I и протеинкиназ у этилен-нечувствительных мутантов Arabidopsis thaliana (eti5 и etrl-1)

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенная работа позволила выявить существенные изменения в состоянии транскрипционной системы розеточных листьев в онтогенезе растений Arabidopsis thaliana, о чем судили по элонгации транскрипции in vitro в системе, содержащей хроматин и ассоциированную с ним РНК-полимеразу I. В соответствии с изменениями, обнаруженными в транскрипционной системе, следует выделить три состояния листьев растений Arabidopsis thaliana в ходе онтогенеза: 1) растущие листья 3-х-недельных растений, находящихся в стадии розетки; 2) закончившие рост зрелые листья растений в стадии цветения и формирования плодов (5-7 недель); 3) стареющие листья растений со сформированными плодами (9 недель).

Содержание эндогенных цитокининов в розеточных листьях арабидопсиса существенно изменяется в онтогенезе растений. Оно низкое (3 пм/г. сырого веса) в молодых растущих листьях 3-х недельных растений, увеличивается в 3-5 раз во взрослых листьях 5-7 недельных растений и несколько снижается в старых листьях 9-недельных растений (данные Л.А.Яковлевой). К сожалению, мы располагаем сведениями о суммарном содержании транс-зеатина и его рибозида, тогда как функционально активен только транс-зеашп. Тем не менее, сведения о содержании эндогенных цитокининов в листьях помогают понять полученные нами данные об особенностях их транскрипционной системы.

В соответствии с невысоким уровнем цитокининов в листьях 3-х-недельных растений они обладают невысокой активностью связанной с хроматином РНК-полимеразы I, которая резко увеличивается при обработке листьев раствором 6-БАП. Эти листья содержат зеатин-связывающий белок 67 кД, способный в отсутствие цитокинина активировать транскрипцию in vitro, но его действие существенно увеличивается при добавлении трансзеатина в реакционную среду. Можно предположить, что часть молекул 67 кД белка из листьев 3-х-недельных растений насыщена цитокинином или модифицирована под его влиянием в клетках таким образом, что переведена в функционально активное состояние, тогда как другие молекулы белка нуждаются для своей активации в экзогенном цитокинине. Существенно, что транскрипционная система листьев 3-х-недельных растений сохраняет стабильный уровень активности при инкубации срезанных листьев на воде в течение 12 часов и стабильно отвечает активацией на цитокининин при инкубации листьев на его растворе в течение 24 ч. Обращает на себя внимание то обстоятельство, что листья 3-х-недельных растений отличаются высокой активностью связанных с хроматином протеинкиназ, которая сохраняется при инкубации срезанных листьев на воде в течение 3-12 ч. Возможно, это вносит свой вклад в особенности транскрипционной системы листьев этого возраста.

Как упоминалось, в листьях растений 5-7-недельного возраста резко увеличивается содержание эндогенных цитокининов. Этому соответствует высокая транскрипционная активность выделенного из листьев хроматина, с которым ассоциирована РНК-полимераза I, слабый ответ транскрипционной системы на экзогенный цитокинин, нечувствительность к цитокинину связанных с хроматином протеинкиназ, а также то, что 67 кД белок из этих листьев активирует синтез РНК in vitro в отсутствие экзогенного цитокинина и его добавление в реакционную среду не повышает активность белка. Поскольку это характерно только для 67 кД белка из листьев, резко обогащенных цитокининами, возникает предположение, что белок насыщен цитокининами или модифицирован под их воздействием в клетке, что обеспечивает его активность и цитокинин-независимость in vitro. Существенное отличие транскрипционной системы из листьев 5-7-недельных растений от транскрипционной системы из молодых растущих листьев 3-х-недельных растений состоит в ее быстрой инактивации при инкубации срезанных листьев на воде и потере ответа на цитокинин. Важно в будущем проверить, связано ли это с потерей стабильности и деградацией в срезанных листьях 67 кД белка, РНК-полимеразы I или других белковых факторов, обеспечивающих транскрипцию.

Старые листья 9-недельных растений, заканчивающих формирование семян, проявили ряд специфических особенностей транскрипционной системы и ответа на цитокинин. Старение на растении привело к резкому снижению в них активности как связанной с хроматином РНК-полимеразы I, так и протеинкиназ. Инкубация срезанных листьев на растворе цитокинина вызывала волну активации связанных с хроматином протеинкиназ, это действие было транзиторным и после его окончания проявлялась активация цитокинином РНК-полимеразы I с максимумом действия при 24-часовой инкубации листьев на растворе 6-БАП. Нельзя исключить, что эти два проявления действия 6-БАП связаны причинно-следственной связью и активированная гормоном протеинкиназа создает условия для активации РНК-полимеразы I в результате фосфорилирования субъединиц РНК-полимеразы I или рецепторного белка со свойствами трансфактора, или иных компонентов транскрипционного комплекса.

67 кД белок, выделенный из листьев 9-недельных растений, приобретал активность в транскрипционной системе только в присутствии цитокинина. Он обладал свойствами, соответствующими 67 кД рецептору цитокинина из закончивших рост листьев ячменя. АТаи конкурировали с mpawc-зеатином за связывание с 67 кД белком в системе ELISA (данные Н.Н.Каравайко), демонстрируя высокую аффинность белка к транс-зеатину. В комплексе с трянс-зеатином белок приобретал способность активировать транскрипцию in vitro, т.е. проявлял свойства рецептора цитокинина, образующего гормон-рецепторный комплекс, непосредственно участвующий в регуляции транскрипции.

Таким образом, на листьях старых 9-недельных растений арабидопсиса были полностью подтверждены данные, полученные ранее на листьях ячменя и проростках кукурузы. Это дает нам основание заключить, что у двудольных растений, как и у однодольных, существует 67 кД рецептор цитокинина, способный в комплексе с гормоном регулировать элонгацию транскрипции, направляемую РНК-полимеразой I, что подчеркивает универсальность подобного рецептора цитокинина у растений. На листьях ячменя было показано, что 67 кД рецепторный белок в комплексе с транс-зеатином регулирует также активность РНК-полимеразы II (Kulaeva et al., 1995). Это важно в будущем проверить для 67 кД белка из листьев арабидопсиса. По данным, полученным на животных системах, регуляция элонгации транскрипции играет важную роль в регуляции экспрессии генов (Капе, 1994; O'Brien et al., 1994; Yankulov et al., 1994; Shilatifard, 1998). Поэтому можно ожидать, что 67 кД рецептор цитокинина со свойствами трансфактора играет важную роль в ответе клеток на фитогормон. Обнаруженные в данной работе возрастные особенности функциональной активности 67 кД белка показали, что его свойства (или его состояние в клетках) меняются в онтогенезе. Поскольку 67 кД белки из 3-х и 7-недельных растений сохраняли свои особенности в гетерологичной транскрипционной системе из закончивших рост листьев ячменя, обнаруженные различия не могут зависеть от возрастной специфики транскрипционной системы листьев арабидопсиса, а действительно относятся к изменению функционального состояния 67 кД белка в листьях в онтогенезе. Это открывает новые перспективы в изучении рецептора цитокинина и подчеркивает необходимость их проведения в возрастном аспекте.

Как упоминалось в обзоре литературы, в последние годы показано (Kakimoto, 1996; Brandstatter and Kieber, 1998; Sakakibara, et al., 1998; Imamura et al., 1998, 1999), что одним из первых ответов клеток арабидопсиса и кукурузы на цитокинин является индукция экспрессии генов, кодирующих

90 полипептиды с предсказанными на основании секвенирования генов свойствами "response regulators" бикомпонентной регуляторной системы бактерий. Крайне важно выяснить, участвует ли обнаруженный нами у Arabidopsis thaliana 67 кД рецептор цитокинина со свойствами трансфактора в индукции экспрессии указанных генов.

В обзоре литературы также приводятся данные о вероятном присутствии у арабидопсиса трансмембранного рецептора цитокинина, сопряженного с гетеротримерным G-белком (Plakidou-Dymock et al., 1998). Будущие исследования должны показать, как в клетке согласуется передача цитокининовых сигналов с рецептора на мембране с функцией изученного в нашей работе рецептора с ядерным уровнем действия.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Маслова, Галина Геннадьевна, Москва

1. Ананиев Е., Шакирова Ф.М., Клячко Н.Л., Кулаева О.Н. Влияние цитокинина на образование полисом из предсуществующих мРНК и рибосом // Докл.АН СССР. 1980. Т.255. №2. С. 508-510.

2. Бровко Ф.А., Заграничная Т.К., Бозиее Х.М., Липкин В.М., Каравайко H.H., Селиванкина С.Ю., Кулаева О.Н. Выделение и характеристика цитокинин-связывающего белка из этиолированных проростков кукурузы // Физиология растений. 1996. Т.43. № 4. с. 533-540.

3. Бурханова Э.А., Селиванкина С.Ю., Романко Е.Г., Куроедов B.Ä. Влияние цитокинина на матричную активность хроматина в проростках ржи // Докл.АН СССР. 1975. Т.222. № з. с. 733-735.

4. Бурханова Э.А., Федина А.Б., Дмитриева Г.Н., Кулаева О.Н. Влияниецитокинина на активность РНЕС-полимеразы в ядрах, выделенных изпротопластов // Докл. АН СССР. 1980. Т. 252. № 2. С. 487-491.

5. Бутенко Р.Г., Володарский А.Д. Специфика антигенов в цикле клеточныхпревращений в культуре ткани табака // Физиология растений. 1967. Т. 14. С.965.

6. Дмитриева H.H. Индукция клеточных делений в сердцевинной паренхиме стебля табака. Канд. дисс. М.: 1972.

7. Заграничная Т.К., Бровко Ф.А., Шепеляковская А.О., Бозиев Х.М., Липкин В.М. Моноклональные антитела к цитокинин-связывающему белку 70 кД из этиолированных проростков кукурузы // Физиология растений. 1997. Т.44. №.1. С. 5-10.

8. Заякин В.В., Нам И.Я., О.Н. Кулаева. Влияние цитокинина на протеинкиназную активность, ассоциированную с РНК-полимеразой в семядолях люпина// Физиология растений. 1989. Т.36. Вып. 1.С. 11-17.

9. Земляченко Я.В., Каравайко H.H., Маслова Г.Г., Кулаееа О.Н. Новый подход к изучению зависимости между структурой и функцией цитокининов // ДАН. 1997. Т.353. № 2. С. 261-263.

10. Каравайко H.H., Мошкое И.Е., Селиванкина С.Ю., Новикова Г.В., Кулаееа О.Н. Выделение при помощи антиидиотипических антител белка со свойствами рецептора цитокининов // Докл. АН СССР. 1990. Т. 310. С. 765767.

11. Каравайко H.H., Земляченко Я.В., Селиванкина С.Ю., Кулаееа О.Н. Выделение из цитозоля листьев ячменя зеатин-связывающего белка, участвующего в активации /иранс-зеатином синтеза РНК in vitro II Физиология растений. 1995. Т. 42. № 4. С. 547-554.

12. Клячко Н.Л. Возрастные особенности синтеза белка в листьях // Физиология растений. 1968. Т. 15. Вып. 4. С. 696-703.

13. Клячко Н.Л., Яковлева Л.А., Кулаееа О.Н. Возрастные изменения синтеза белка в семядолях тыквы // Физиология растений. 1971. Т. 18. Вып. 6. С. 1225-1231.

14. Клячко Н.Л., Кулаееа О.Н. Факторы старения и омоложения листьев //

15. Биология развития растений. М.: Наука. 1975. С. 214-227.

16. Клячко Н.Л., Ананиев Е., Кулаееа О.Н. Быстрая ответная реакция белоксинтезирующего аппарата изолированных семядолей тыквы на действиефитогормонов // Докл.АН СССР. 1978. Т.243. № 5. С. 1334-1336.

17. Кулаееа О.Н., Воробьева И.П. К вопросу о механизме действия кинетина насинтез белка// Физиология растений. 1962. Т. 9. Вып. 1. С.106-108.

18. Кулаееа О.Н. Влияние корней на обмен веществ в листьях в связи спроблемой действия кинетина // Физиология растений. 1962. Т.9. Вып. 2.1. С.229-239.

19. Кулаееа О.Н., Свешникова H.H., Клячко Н.Л., Попова Э.А. О восстановлении белково-нуклеинового обмена срезанных листьев в процессе их позеленения под действием кинетина // Докл. АН СССР. 1963. Т. 152. № 6. С. 1475-1478.

20. Кулаева О.Н., Воробьева И.П. К вопросу о влиянии кинетина на белково-нуклеиновый обмен листьев // Биология нуклеинового обмена у растений. М.: Наука, 1964. С. 165-168.

21. Кулаева О.Н., Клячко H.JI. О влиянии кининов на синтез белка в листьях // Докл. АН СССР. 1965. Т. 164. №2.С. 216-218.

22. Кулаева О.Н. Цитокинины и их физиологическое действие // Успехи современной биологии. 1967. Т. 18. № 4. С.28-53.

23. Кулаева О.Н. Гормональная регуляция физиологических процессов у растений на уровне синтеза РНК и белка // XLI Тимирязевское чтение. М.: Наука, 1982.

24. Микулоеич Т.П., Кукина И.М., Волъгин Р., Кулаева О.Н. Действие цитокинина на накопление хлоропластных и цитоплазматических рибосомальных РНК // Докл.АН. СССР. 1977. Т.233. № 3. С. 502-504.

25. Романко Е.Г., Кулаева О.Н., Хеш Х.Я. Влияние цитокинина на физиологическую активность хлоропластов // Биохимия. 1968. Т.ЗЗ. Вып.З. С. 547-552.

26. Романко Е.Г., Селиванкина С.Ю. Влияние цитокинина на синтез нерибосомальной РНК в этиолированных проростках ржи // Физиология растений. 1977. Т. 24. Вып. 5. С.1014-1019.

27. Романко Е.Г., Селиванкина С.Ю., Куроедов В.А. Влияние цитокинина на синтез РНК и на активность связанной с хроматином РНК-полимеразы в срезанных листьях ячменя // Физиология растений. 1978. Т.25. Вып.6. С. 1199-1205.

28. Романко Е.Г., Селиванкина С.Ю., Овчаров А.К, Кулаева О.Н. Активация цитокинин-рецепторным комплексом из листьев ячменя синтеза РНК in vitro // Докл. АН СССР. 1980. Т. 255. № 4. С. 1009-1011.

29. Романко Е.Г., Селиванкина С.Ю., Куроедов В.А., Харченко В.И., Кулаева О.Н. Исследование функциональной активности цитокининсвязывающих белков из листьев ячменя и семядолей тыквы // Докл. АН СССР. 1982а. Т.267. № 4. С. 1022-1024.

30. Романко Е.Г., Селиванкина С.Ю., Овчаров А.К Участие ЦСБ из листьев ячменя в активации цитокинином синтеза РНК в изолированных ядрах и хлоропластах // Физиология растений. 1982 б. Т.29. №.3. С. 524-531.

31. Северин Е.С., Кочеткова М.Н. Роль фосфорилирования в регуляции клеточной активности. М.: Наука. 1985.

32. Селиванкина С.Ю., Куроедов В.А., Кулаева О.Н. Динамика действия цитокинина на включение метки в РНК срезанных листьев ячменя // Физиология растений. 1972. Т. 19. Вып.З. С. 508-516.

33. Селиванкина С.Ю., Романко Е.Г., Куроедов В.А., Оманн Э. Влияние цитокининов на синтез РНК в этиолированных проростках ржи // Физиология растений. 1976. Т. 23. Вып.5. С. 1011-1017.

34. Селиванкина С.Ю., Романко Е.Г., Куроедов В.А., Кулаева О.Н. Повышение активности связанной с хроматином РНК-полимеразы под действием цитокинина при его добавлении в ходе выделения хроматина // Физиология растений. 1979. Т. 26. Вып. 1. С. 41-47.

35. Селиванкина С.Ю., Романко Е.Г., Кулаева О.Н. Внехроматиновые факторы регуляции активности РНК-полимеразы в листьях ячменя разного возраста // Физиология растений. 1980. Т. 27. Вып. 3. С. 560-566.

36. Abeles F.B., Morgan P.W., Saltweit М.Е. Ethylene in Plant Biology. New York:Academic Press. 1992.

37. Armstrong D. J. Cytokinin oxidase and the regulation of cytokinin degradation // Cytokinins Chemistry, Activity and Function /Eds. Mok D.W.S., Mok M.C. Boca Raton: CRC Press. 1994. P. 139-155.

38. Bate N. J., Rothstein S.J., Thompson J.E. Expression of nuclear and chloroplast photosynthesis-specific genes during leaf senescence // J. Exp. Botany. 1991. V. 42. P. 801-811.

39. Becker V., Apel K. Differences in gene expression between natural and artifically induced leaf senescence // Planta. 1993. V. 189. P.74-79.

40. Binns A.N. Cytokinin accumulation and action: biochemical, genetic and molecular approaches // Ann. Rev. Physiol. Plant. Mol. Biol. 1994. V.45. P. 173-196.

41. Bleecker A.B., Estelle M.A., Somerville C., Kende H. Insensitivity to ehylene conferred by a dominant mutation in Arabidopsis thaliana II Science. 1988. V.241. P.1086-1088.

42. Bleecker A.B., Patterson S.E. Last exit: senescence, abscission and meristem arrest in Arabidopsis II Plant Cell. 1997. V. 9. P. 1169-1179.

43. Brandstatter L, Kieber J.J. Two genes with similarity to bacterial response regulators are rapidly and specifically induced by cytokinin in Arabidopsis 11 Plant Cell. 1998. V. 10. P. 1009-1020.

44. Bradford MM A rapid and senstive method of the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Analitical Biochemistry. 1976. V.72. P. 248-254.

45. Brady C.J. Nucleic acid and protein synthesis // Senescence and Aging in Plants / Eds. Nooden L.D., Leopold A.C. Academic Press, San Diego, CA. 1988. P. 147179.

46. Buchanan-Wollaston V. Isolation of cDNA clones for genes that are expressed during leaf senescence in Brassica napus II Plant Physiology. 1994. V.105. P. 839846.

47. Buchanan-Wollaston V. The molecular biology of leaf senescence // J.Exp.Botany. 1997. V.48.N. 307. P. 181-199.

48. Chen Q.G., Bleecker A.B. Analysis of ethylene signal transduction kineticsassociated with seedling-growth response and chitinase induction in wild-type andmutant Arabidopsis II Plant Physiology. 1995. V. 108. P. 597-607.

49. Chen C., Melitz D., Pets chow B., Eckert R.L. Isolation of cytokinin-binding proteinfrom plant tissues by affinity chromatography // Eur. J.Biochem. 1980. V.108.1. P.379-387.

50. Cohen Ph. Hormones, second messengers and the reversible phosphorylation of proteins // BioEssay. 1985. V.2. N.2. P.63.

51. Crowell D.N., Amasino R.M. Cytokinins and plant gene regulation // Cytokinins: Chemistry, Activity and Function / Eds. Mok D.W.S., Mok M.C. Boca Raton: CRC Press. 1994. P. 233-242.

52. Datta H., Roia S.Y. Regulation of enzymes in isolated plant nuclei // BioEssay. 1986. V.5.N.3. P 120.

53. Erion J.L., Fox J.E. Purification and properties of a protein which binds cytokininactive 6-substitutedpurines //Plant Physiology. 1981. V.67. P. 156-162.

54. Fox J.E., Erion J.L. Cytokinin-binding proteins in higher plants // Plant Growth

55. Regulation / Ed. Pilet P.E. Berlin: Springer-Verlag. 1977. P. 139-146.

56. Gan S., Amasino R.M. Inhibition of leaf senescence by autoregulated production ofcytokinin // Science. 1995. V.270. P. 1986-1988.

57. Grierson D., Kader A. Fruit ripening and quality // The tomato crop: a scientific basis for improvement / Eds. Atherton J., Rudich J. London: Chapman and Hall. 1986. P.241-280.

58. Hare P., van Staden J. The molecular basis of cytokinin action // Plant Growth Regul. 1997. V.23. P.41-78.

59. Klyachko N.L., Ananiev E., Kulaeva O.N. Effect of 6-benzylaminopurine and abscisic acid on protein synthesis in isolated pumpkin cotyledons // Physiologie Vegetale. 1979. V.17. N.3. P. 607-617.

60. Kulaeva O.N. Cytokinins action on enzyme activities in plants // Plant Growth Substances. Springer-Verlag. 1980. P.l 19-128.

61. Kulaeva O.N. Cytokinin action on transcription and translation in plants // Metabolism and Molecular Activities of Cytokinins / Eds. Cuern J. and Peaud-Lenoel B. Heidelberg: Springer-Verlag. 1981. P. 218-227.

62. Kulaeva O.N. The possible role of protein kinases in the plant cell response to phytohormones // Plant Growth Substances 1988 / Ed. Pharis R. Springerverlag, Berlin, 1990. P. 547-551.

63. Kulaeva O.N., Corse J., Selivankina S.Y. Effects of trans- and cw-zeatin and optical isomers of synthetic cytokinins on protein kinase activity in vitro II J. Plant Growth Regul. 1995. V. 14. P. 41-47.

64. Kulaeva O.N., Karavaiko N.N., Selivankina S.Yu., Zemlyachenko Ya.V., Shipilova S.V. Receptor of trans-zeatin involved in transcription activation by cytokinin // FEBS Letters. 1995. V. 366. P. 26-28.

65. Kulaeva O.N., Karavaiko N.N., Selivankina S.Yu., Moshkov I.E., Novikova G.V., Zemlyachenko Ya.V., Shipilova S.V., Orudgev E.M. Cytokinin signaling system from a whole plant to the molecular level // Plant Growth Regul. 1996. V. 18. P. 29-37.

66. Kulaeva O.N., Zagranichnaya T.K, Brovko F.A., Karavaiko N.N., Selivankina S.Yu., Zemlyachenko Ya.V., Hall M. A., Lipkin V.M., Boziev Kh.M. A new family of cytokinin receptors from Cereales // FEBS Letters. 1998. V. 423. P. 239-242.

67. MalikN.S.A. Senescence in oat leaves: changes in translatable RNAs // Physiologia Plantarum. 1987. V. 70. P. 438-446.

68. Marx J.L. Making antibodies without the antigenes // Science. 1985. V.288. N. 4696. P. 162-165.

69. Mattoo A.K., Aharoni N. Ethylene and plant senescence // Senescence and Aging in Plants / Eds. Nooden L.D., Leopold A.C. Academic Press, San Diego, CA. 1988. P. 241-280.

70. Mikulovich T.P., Wollgiehn R., Khokhlova V.A., Kulaeva O.N. Synthesis of plastid and cytoplasmic ribosomal RNAs in isolated pumpkin cotyledons // Biochem. Physiol. Pflanz. 1978. V. 172. P. 101-110.

71. Mok D.W.S., Martin R.G. Cytokinin metabolic enzymes // Cytokinins Chemistry, Activity and Function / Eds. Mok D.W.S., Mok M.C. Boca Raton: CRC Press. 1994. P. 129-139.

72. Momotani E., Tsuji H. Isolation and characterisation of cytokinin-binding protein from the water soluble fraction of tobacco leaves // Plant Cell Physiology. 1992. V.33.N4. P. 407-412.

73. Mothes K., Engelbrecht L., Kulajewa O. Uber die Wirkung des Kinetins auf StickstoffVerteilung und Eiweissynthese in isolierten Blattern II Flora. 1959. V.147. P.445-464.

74. Mothes K. Uber das Altern der Blatter und die Möglichkeit ihrer Wiederverjungung II Naturwissenschaften. 1960. V. 15 P. 337-351. Mothes K. The role of kinetin in plant regulation II Colloq. internat. centre nat. rech, scient. V.123. P.131.

75. Nam H.G. The molecular genetic analysis of leaf senescence // Curr. Opin. Biotech. 1997. V.8. P.200-207.

76. Nooden L.D., Guiamet J.J. Genetic control of senescence and aging in plants // Handbook of the Biology of Aging / Eds. Schneider E.L., Rowe J.W. Academic Press. Orlando, FL. 1996. P. 94-118.

77. Nooden L.D., Guiamet J.J., John I. Senescence mechanisms // Physiologia Plantarum. 1997. V. 101. P. 746-753.

78. Novikova G. V., Moshkov IE., Smith A.R., Kulaeva O.N., Hall M.A. The effect of ethylene and cytokinin on guanosine-5'-triphosphate binding and protein phosphorylation in leaves of Arabidopsis thaliana II Planta. 1999. V. 208. P. 239246.

79. Oh S.A., Lee S.Y., ChungI.K., Lee C.H., Nam H.G. A senescence-accociated geneof Arabidopsis thaliana is distinctively regulated during natiral and artificallyinduced leaf senescence //Plant Mol. Biol. 1996. V. 30. P. 739-754.

80. Ooms G. Phenotypic changes in T-eyMransformed potato plants are consistentwith enhanced sensitivity of specific cell types to normal regulation by rootderived cytokinin // Plant Mol. Biol. 1991. V. 17. P. 727-743.

81. Osborne D. Effect of kinetin on protein and nucleic acid metabolism in Xanthiumleaves during senescence // Plant Physiology. 1962. V.37. P. 595.

82. Park J-H., Oh S.A., Kim Y.H., Woo H.R., Nam H.G. Differential expression of senescence-associated mRNAs during leaf senescence induced by different senescence-inducing factors in Arabidopsis II Plant. Mol. Biol. 1998. V. 37. P. 445-454.

83. Picton S., Barton S.L., Bouzauen M., Hamilton A.J., Grierson D. Altered fruit ripening and leaf senescence in tomatoes expressing an antisense ethylene-forming enzyme transgene // Plant J. 1993. Y.3. P. 469-481.

84. Polya G.M., Bowman J.A. Ligand specifity of a high affinity cytokinin-binding protein//Plant Physiology. 1979. V.64. P.387-392.

85. Plakidou-Dymock S., Dymock D., Hooley R. A higher plant seven transmembrane receptor that influences sensitivity to cytokinins // Curr.Biol. 1998. V.8. P. 315324.

86. Polya G.M., Davis A.W. Properties of high-affinity cytokinin-binding proteins from wheat germ // Planta. 1978. V.139. P. 139-147.

87. Quirino B.F., Noh Y-S., Himelblau E., Amasino R.M. Molecular aspects of leaf senescence // Trends Plant Sci. 2000. V.5. N.7. P. 278-282.

88. Sakakibara H., Suzuki M, Takei K., Deji A., Taniguchi M., Sugiyama T. A response regulator homolog possibly involved in nitrogen signal transduction mediated by cytokinin in maize // Plant J. 1998. Y. 14. P. 337-344.

89. Shilatifard A. Factors regulating the transcriptional elongation activity of RNA polymerase II // The FASEB J. 1998. V.12. P. 1437-1446.

90. Serve B.T., Axelos M., Peaud-Lenoel C. Cytokinin modulate the expression of genes encoding the protein of the light-harvesting chlorophyll a/b complex // Plant Mol. Biol. 1985. V. 5. P. 155-163.

91. Smart CM. Gene expression during leaf senescence // New Phytology. 1994. V. 126. P. 419-448.

92. Smart C.M., Scofield S.R., Bevan M.W., Greaves J.A., Blair B.G., Schuch W. The timing of maize leaf senescence and characterization of senescence-related cDNA // Physiologia Plantarum. 1995. V. 93. P. 673-682.

93. Srivastava B.I.S. Effect of kinetin on the ecteola cellulosa elution profile and other properties of RNA from the excised first leaves of barley // Arch.Biochem. Biophys. 1965. V.l 10. P. 97.

94. Srivastava B.I.S., Arglebe C. Studies on ribosomes from barley leaves. Changes during senescence // Plant Physiology. 1967. V.42. P. 1497.

95. Sugiura M., Umemura K., Oota Y. The effect of kinetin on protein level of tobacco leaf disks // Physiologia Plantarum. 1962. V.l 5. P. 457.

96. Takegami E.N., Yoshida K. Isolation and purification of cytokinin-binding protein from tobacco leaves by affinity column chromatography // Biochem. Biophys. Res. Com. 1975. V.67. N.2. P. 782-789.

97. Taran V.Ya., Romanov G.A., Venis M.A. Soluble zeatin-binding proteins from maize shoots // Physiology and Biochemistry Cytokinins in Plants / Eds. Kaminek M., Mok D.W.S., Zazimalova E. The Hague: SPB Academic Publishing. 1992. P.165-167.

98. Teramoto H., Toyama T., Takeba G., Tsuji H. Changes in expression of two cytokinin-repressed genes, CR9 and CR20, in relation to aging, greening and wounding in cucumber// Planta. 1995. V.196. P. 387-395.

99. Thomas H., Ougham H.J., Davies T.G.E. Leaf senescence in a non-yellowing mutant of Festuca pratensis transcripts and translation products // Journal of Plant Physiology. 1992. Y.139. P. 403-412.

100. Trewawas S. Post-translational modification of proteins by phosphorylation // Ann.Rev.Plant Physiology. 1976. Y.27. P. 349.

101. Van Loon L.C., Trewawas A.J., Chapman K. Phosphorylation of chromatin-associated proteins in Lemna and Hordeum II Plant Physiology. 1975. V.55. N.2. P.288.

102. Van Staden J., Cook E.L., Nooden L.D. Cytokinins and senescence // Senescence and Aging in Plants / Eds. Nooden L.D., Leopold A.C. San Diego:Academic Press. 1988. P. 281-328.

103. Venis M. Hormone binding sites in plants. New York: Longman. 1985.110

104. Yankulov K., Blau J., Purton T., Roberts S., Bentley DL. Transcription elongation by RNA polymerase II is stimulated by transactivators // Cell. 1994. Y.77. P.749-759.

105. Zacarias L., Reid M.S. Role of growth regulators in the senescence of Arabidopsis thaliana leaves // Physiol.Plant. 1990. V.80. P. 549-554.

106. Zarembinski T.I., Theologis A. Ethylene biosynthesis and action: a case of conservation // Plant Molecular Biology. 1994. V.26. P. 1579-1597.

107. Я благодарю научного сотрудника Наталью Константиновну Зубкову за большую помощь в подготовке и проведении экпериментов, а также доброжелательное отношение и внимание.

108. Я благодарю всех сотрудников лаборатории экспрессии генома растений за помощь при выполнении работы, постоянное внимание, замечания и советы, во многом послужившие улучшению работы, доброе отношение и поддержку.