Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ранние эффекты цитокининов в модельной системе проростков амаранта

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гетман, Ирина Анатольевна

Список специальных сокращений

Введение

Литературный обзор

9 I. Цитокинины

1.1. Распространение и содержание цитокининов в растениях

1.2. Биологическая активность

1.3. Основы метаболизма

1.4. Методы идентификации цитокининов

1.5. Амарантовый биотест

1.6. Рецепция цитокининов

1.7. Гены первичного ответа

II. Механизмы внутриклеточной трансдукции сигналов

II. 1. Протеинкиназы и протеинфосфотазы

П.2. Кальциевая сигнальная система

П.З. О-белки

П.4.Фосфолипазы

11.5. Комплексный характер сигнальной трансдукции

Материалы и методы исследований

1. Реактивы

2. Выращивание растений амаранта и получения семян

3. Стандартный тест для определения цитокининовой активности

4. Модифицированный экспресс микротест

5. Проведение ингибиторного анализа

6. Постановка ингибиторно-кинетических опытов

7. Сравнения действия цитокинина и света

8. Оценка жизнеспособности проростков

9. Цитологический анализ с помощью световой микроскопии

10. Ультраструктурный анализ с помощью электронной микроскопии

11. Экстракция и анализ эндогенных цитокининов

12. Изучение активности фосфолипазы Д in vivo

13. Статистическая обработка данных

Результаты и обсуждение

I. Особенности экспериментальной модели

1.1. Дозовая зависимость

• 1.2. Кинетика действия

1.3. Специфичность

1.4. Объем тестируемого образца

1.5. Тканевая и клеточная специфичность ответа на цитокинин

1.6. Модифицированный биотест и его преимущества

II. Модифицированный амарантовый биотест как экспериментальная модель исследования ранних эффектов цитокининов

II. 1. Действие ингибиторов транскрипции и трансляции

11.2. Определение жизнеспособности клеток после воздействия антибиотиков

11.3. Кинетический анализ действия ингибиторов транскрипции и трансляции

11.4. Проверка адекватности кинетического анализа

П.5. Ультраструктурные исследования

III. Влияние различных ингибиторов на эффект цитокининов

III. 1. Ингибиторы синтеза фосфатидных кислот фосфолипазой Д

111.2. Ингибиторы протеинкиназ и (протеин)фосфатаз

111.3. Антагонисты/ингибиторы кальциевого обмена

111.4. Влияние некоторых других соединений!

111.5. Основные итоги кинетико- ингибиторного анализа

IV. Анализ действия мастопарана

V. Сопоставление действия цитокинина и света,

V. 1. Анализ действия 1,10-фенантролина

V.2. Анализ действия 1-бутанола

V.3. Анализ действия 3,3',4'-5-тетрахлоросалициланилида (SACU)

VI. Выявление активности фосфолипазы Д и реакции трансфатидилирования in vivo

Введение Диссертация по биологии, на тему "Ранние эффекты цитокининов в модельной системе проростков амаранта"

Гормональная система регуляции у растений

Фитогормоны, органические вещества небольшого молекулярного веса, образуются в малых количествах в одних частях растений и действуют на другие части как координаторы и регуляторы роста и развития. Эволюционно гормоны появляются у сложных многоклеточных организмов, в том числе у растений, в качестве специализированных регуляторных молекул для осуществления важнейших физиологических программ. С помощью гормонов происходит координация метаболизма и развития различных клеток, тканей и органов, нередко значительно удаленных друг от друга. У многоклеточных растений, при отсутствии нервной системы, особенно важна биохимическая система регуляции, в которой основная функция принадлежит фитогормонам. Известно 5 основных классов фитогормонов, имеющих сходные функции и широко распространенных не только среди высших, но и низших многоклеточных растений. Это ауксины, цитокинины, гиббереллины, абсцизины и этилен. По сравнению с гормонами животных специфичность фитогормонов выражена слабее, а действуют они, как правило, в гораздо более высоких концентрациях. У растений нет специализированных органов (желез), вырабатывающих гормоны. В растительных организмах для включения и выключения морфогенетических и физиологических программ нередко используются одни и те же фитогормоны, но в разных соотношениях.

Деление и растяжение клеток, лежащее в основе всех процессов роста и морфогенеза, находится у растений под контролем ауксинов и цитокининов. Эти же гормоны участвуют в регуляции роста боковых побегов: ауксины из верхушки побега подавляют рост пазушных почек (апикальное доминирование), тогда как цитокинины это доминирование снимают. У черенков и в культуре клеток ауксины вызывают образование корней, в то время как цитокинины способствуют формированию побегов. Ауксины определяют адаптивные изгибы растения в соответствии с направлением света или вектора силы тяжести (фото- и геотропизм).

Цитокинины и гиббереллины способствуют прорастанию семян многих растений и повышают их всхожесть. Цитокинины во многих случаях задерживают старение отдельных органов и растений в целом. Гиббереллины способствуют нормальному росту растения, активируя апикальные и интеркалярные меристемы. Для многих растений гиббереллины являются индукторами или стимуляторами цветения.

Абсцизовая кислота и цитокинины регулируют формирование хлоропластов и транспирацию растений: цитокинины вызывают дифференцировку хлоропластов и открывание устьиц, тогда как абсцизовая кислота подавляет оба процесса. Абсцизовая кислота тормозит рост растений и прорастание семян. Этилен ускоряет созревание плодов, усиливает процессы старения и опадения листьев и плодов. В повышенной концентрации он ингибирует линейный рост осевых органов, вызывает их утолщение и горизонтальную ориентацию.

Теория фитогормонов, разработанная М. X. Чайлахяном еще в 1936-1937 г, послужила основой гормональной концепции цветения растений (в том числе и флоригена), признана во всем мире.

По мере открытия и изучения разных аспектов действия фитогормонов стало очевидно, что все эти процессы связаны с изменением экспрессии определенных генов. В ходе эволюции у клеток выработались приспособления, позволяющие преобразовывать и усиливать приходящие из окружающей среды сигналы химической и физической природы и с помощью генетического аппарата реагировать на них, перестраивая свои обмен веществ и структуру. Настоящая работа была нацелена на изучение механизма действия одного наиболее важных гормонов растений - цитокининов.

Литературный обзор

L ЦИТОКИНИНЫ

Цитокинины получили свое название в связи с их способностью стимулировать клеточное деление - цитокинез. Первый цитокинин — кинетин - был открыт в лаборатории Ф. Скуга в связи с разработкой метода тканевых культур растений (Miller et al., 1955). Кинетин был химически идентифицирован как производное аденина: 6-фурфуриламинопурин. После идентификации первого цитокинина были синтезированы многочисленные аналоги, различающиеся строением замещающей группы по N6 атому аденина и также обладающие выраженной способностью стимулировать деление растительных клеток in vitro (Strong, 1958). Первый природный цитокинин из незрелых семян кукурузы {Zea mays) - зеатин - был открыт в 1961/1963 гг. Миллером и Летамом (Miller, 1961; Letham, 1963). Основу молекулы природного цитокинина также составляет аденин, у которого в положении N6 имеется короткая боковая цепь изопреноидного типа. У некоторых растений обнаружены так называемые ароматические цитокинины, замещающая группа которых представляет собой модифицированный остаток бензола (Strnad, 1997). Благодаря относительной легкости химической модификации молекулы цитокининов в настоящее время имеется большое число природных и синтетических аналогов, которые обладают различной биологической активностью.

Помимо цитокининов - производных аденина, синтезированы соединения иной структуры с выраженной цитокининовой активностью. Среди этих соединений высокой активностью обладают производные фенилмочевины (Bruce & Zwar, 1966), такие как тидиазурон или 4-PU (Isogai, 1981).

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Гетман, Ирина Анатольевна

ВЫВОДЫ

1. Предложена модифицированная тест-система с использованием проростков амаранта для изучения ранних эффектов цитокининов, а также для определения цитокининовой активности.

2. Выявлена тканевая и клеточная специфичность ответа семядолей амаранта на цитокинин: способностью к индуцированному накоплению амарантина обладают паренхимные клетки, в отличие от устьичных клеток или клеток сосудов.

3. Впервые получены доказательства необходимости процесса транскрипции при участии ядерной РНК-полимеразы II в период лаг-фазы ответа клеток проростков амаранта на цитокинин.

4. Установлена последовательность событий, необходимых для проявления эффекта цитокининов в модельной сиетеме, а именно: транскрипция—> трансляция—»биосинтез амарантина. Временные интервалы между этими процессами составляют примерно 2 ч.

5. Обнаружен новый класс ингибиторов действия цитокининов -первичные спирты, ингибиторы действия фосфолипазы Д. Среди первичных спиртов разной длины наиболее эффективен 1-бутанол. Вторичные спирты, не взаимодействующие с фосфолипазой Д, мало влияли на действие цитокинина.

6. Ингибиторный эффект 1-бутанола наблюдается в самый ранний период действия цитокинина, предшествующий стадии транскрипции. Этот период соответствует этапу восприятия гормонального сигнала.

7. Прямыми биохимическими методами обнаружена энзиматическая активность фосфолипазы Д в проростках амаранта и образование фосфатидилспирта в модельной тест-системе in vivo в присутствии 1-бутанола.

8. Ингибитор протеинфосфатаз 1/2А окадаевая кислота сильно подавляет эффект цитокинина на ранней стадии его действия, тогда как ингибитор протеинкиназ стауроспорин не оказывал влияния.

9. Полученные данные позволяют предположить участие фосфолипазы Д и, возможно, протеинфосфатазы 1/2А в трансдукции цитокининового сигнала у проростков амаранта.

Благодарности. Приношу искреннюю благодарность научному руководителю д.б.н. Г. А. Романову за помощь и поддержку в работе, к.б.н. B.C. Шевченко за предоставление 3Н-бутанола, к.б.н. Ю. П. Болякиной за обеспечение электронной и световой микроскопии, C.JI. Случевской за помощь при освоении методики работы с проростками амаранта, всему коллективу лаборатории роста и развития им. академика М. X. Чайлахяна и сотрудникам Института физиологии растений за дружеское внимание и помощь, без которых выполнение работы было бы невозможно.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Использованная в нашей работе модельная тест-система базируется на способности молодых этиолированных проростков амаранта (главным образом их семядольных листьев) специфично отвечать на цитокинин быстрым накоплением красного пигмента, содержание которого легко измерить количественно. Как объект, так и регистрируемый процесс являются достаточно типичными для проявления эффекта цитокининов. Семядоли и семядольные листья двудольных растений давно использовались как тест-объекты на цитокинины и для исследования ранних эффектов этих фитогормонов (Yopp et al., 1986; Кулаева, 1973). Наши исследования показали, что семядольные листья амаранта отвечают на цитокинины теми же характерными реакциями, что и другие аналогичные объекты. В присутствии БА в паренхимных клетках наблюдалось быстрое увеличение размеров ядрышек, ядер, клеток; при этом возрастал размер и вес семядолей в целом. Одной из ранних реакций является также увеличение числа рибосом и мобилизация их в состав полисом. Подобные реакции отмечались ранее при использовании семядолей других видов. Преимущество семядолей амаранта заключается в том, что при этом происходит еще и быстрая аккумуляция красного пигмента бетацианина (амарантина), что легко наблюдать визуально. Вообще индукция образования пигментов также является достаточно распространенной реакцией на цитокинины в мире растений. В ряду индуцируемых пигментов находятся хлорофилл и каротиноиды (Parthier, 1979), антоцианы (Deikman & Hammer, 1995) и бетацианины у видов Centrospermae (Mothes et al., 1985). Показано, что биосинтез соединений вторичного обмена, к которым относятся вышеперечисленные пигменты, регулируется главным образом на уровне транскрипции генов (Zryd, 1992). Неудивительно поэтому, что наши исследования подтвердили генный уровень регуляции цитокининами образования бетацианина у амаранта, причем участником этого процесса оказалась ингибируемая а-аманитином РНК-полимераза II, функция которой состоит в транскрипции структурных генов ядра. Как было показано ранее (Гудвин & Мерсер, 1986; Trezzini & Zryd, 1990), путь биосинтеза бетацианинов очень короток и контролируется всего тремя генными локусами. Это дает основание считать нашу модель от момента воздействия цитокинином до конечного физиологического ответа достаточно простой, немногим сложнее обычно используемой трансгенной модели, где репортерный ген соединяется с промотором гормон-чувствительного гена. Простота модели, как уже отмечалось ранее, является важным преимуществом при исследовании первичных процессов, индуцируемых фитогормоном. Сокращение времени тестирования всего до нескольких часов также существенно уменьшает возможность проявления каких-либо вторичных или побочных эффектов, непосредственно не связанных с действием цитокининов.

Известно, что цитокинины могут влиять на содержание отдельных мРНК двояким способом: либо меняя интенсивность транскрипции индивидуальных генов, либо меняя стабильность транскриптов, т.е. скорость их распада (Schmulling et al., 1997). Исследование на листьях арабидопсиса, где цитокинины стимулировали биосинтез антоцианов, показало (Deikman & Hammer, 1995), что из 4-х генов, вовлеченных в процесс образования пигмента, 2 регулируются транскрипционно и 2 -посттранскрипционно. В нашем случае пока нельзя полностью исключать ни ту, ни другую возможность. Тем не менее нам представляется более вероятным действие цитокининов именно на транскрипционном уровне регуляции экспрессии отдельных генов. Это следует, во-первых, из сходства кинетических характеристик нашей модели с аналогичными характеристиками у трансгенных растений табака, у которых встроенный ipt-TQn был поставлен под контроль индуцибельного тетрациклинзависимого промотора (Faiss et al., 1997). На этом объекте действие индуктора реализуется заведомо на уровне транскрипции трансгена. Оказалось, что /р/-транскрипты появлялись в листьях уже через 15 мин после индукции тетрациклином, тогда как соответствующий белок обнаруживался лишь через 4 ч. Это время очень близко времени лаг-периода на нашей модели проростков амаранта. Вторым аргументом является явное качественное сходство характеристик индуцируемых цитокинином ранних процессов у проростков амаранта и у трансгенного арабидопсиса, у которого репортерный ген GUS экспрессировался под контролем промотора цитокинин-зависимого гена ARR5 (Romanov et al., 2002). В последнем случае индукция экспрессии трансгена происходит также именно на уровне транскрипции. Еще одним аргументом являются выявленные нами с помощью электронной микроскопии быстрые изменения ультраструктуры ядра и ядрышка, типичные для активации процессов транскрипции. Важно отметить, что данные изменения подавлялись ингибитором транскрипции актиномицином Д.

Сокращение времени и объема тестирования на модифицированной нами тест-системе позволило провести массовый скрининг различных соединений, в том числе ингибиторов/активаторов различных сигнальных путей, для выявления тех веществ, которые могут специфически влиять на индуцированную цитокинином экспрессию генов. Таким путем нами было обнаружено большое число соединений, с той или иной степенью эффективности подавляющих эффект цитокинина. Однако эти данные еще не давали возможности определить, действуют ли данные вещества на этапе восприятия сигнала или же на этапе ответной реакции. Эти же соображения равно относятся и к аналогичным исследованиям с использованием репортерных генов под контролем гормон-зависимых промоторов. В случае амаранта, где гены, экспрессия которых активируется цитокинином, пока не охарактеризованы, молекулярнобиологические методы слежения за биосинтезом индивидуальных мРНК пока неприменимы. Поэтому мы использовали другие подходы. Один из них, кинетико-ингибиторный, давал возможность определить временные периоды действия ингибиторов, что было возможно осуществить при использовании быстрого 8-часового теста. Благодаря этому подходу удалось установить, что ингибитор фосфолипазы Д (1-бутанол) и ингибитор серин/треониновой протеинфосфатазы (окадаевая кислота) действуют в период, соответствующий или близкий этапу восприятия сигнала цитокинина. Наоборот, ингибитор бактериальных сенсорных гистидин-киназ (SACU), который, как предполагалось, должен влиять на рецептор цитокининов, действовал значительно позднее - на этапе ответной реакции, что свидетельствовало против его взаимодействия исключительно с рецептором цитокининов. Второй подход был основан на сопоставлении действия ингибиторов при индукции образования амарантина цитокинином или светом (подробнее см. раздел IV). Оказалось, что и здесь действие 1-бутанола вполне соответствует ожидаемому для ингибитора сигнальной трансдукции. Все эти результаты позволили нам впервые высказать предположение относительно участия фосфолипазы Д в трансдукции сигнала цитокининов на гены первичного ответа. Это предположение нашло вскоре серьезное подкрепление в работах с трансгенным арабидопсисом, у которого 1-бутанол специфически подавлял биосинтез мРНК цитокинин-зависимых генов (Romanov et al., 2002). Весьма вероятно также участие серин/треониновой протеинфосфатазы типа 1 или 2А в трансдукции сигнала цитокинина. У трансгенного арабидопсиса другой ингибитор аналогичных протеинфосфатаз - каликулин А - эффективно подавлял действие цитокинина на экспрессию генов первичного ответа.

Пока конкретные формы участия фосфолипазы Д и, вероятно, серин/треониновой протеинфосфатазы в молекулярном механизме трансдукции цитокининового сигнала остаются неизвестными. У растений фосфолипаза Д участвует в ответе на различные виды стресса (Chapman, 1998; Wang, 2001), а также при трансдукции сигнала абсцизовой кислоты (Ritchie & Gilroy) и Nod-фактора (Munnik, 2001). Поэтому в принципе представляется вполне правдоподобным, что фосфолипаза Д может участвовать и в ответе клеток на цитокинины.

Как стало известно в самое последнее время (обзоры см. Schmulling, 2001; Hutchison & Kieber, 2002; Романов, 2002), рецепторы цитокининов представляют собой крупные интегральные трансмембранные белки, обладающие гистидинкиназной активностью. Передача сигнала с такого рецептора осуществляется, как полагают, за счет переброски "активного" фосфата с активированного рецептора через белки-трансмиттеры на так называемые белки - регуляторы ответа. Эти последние белки находятся в ядре и, по всей видимости, выполняют функции регуляторов экспрессии генов. Обнаруженные нами вероятные элементы цепи сигнальной трансдукции могут участвовать в качестве необходимых дополнительных факторов на том или ином этапе "линейной" передачи "активного" фосфата от мембранного рецептора до ядерных регуляторов транскрипции. Например, активность фосфолипазы Д может быть необходима на стадии рецепции гормона мембранным рецептором, которая, очевидно, связана с изменением его конформации и перемещением в плазмалемме. Другой возможностью является параллельный или разветвленный путь передачи сигнала цитокининов, при котором выявленные компоненты могут участвовать в каком-либо альтернативном пути передачи данного сигнала. В частности, передача сигнала от сенсорной гистидинкиназы на серин/треониновые ферменты фосфорного обмена не кажется чем-то необычным. Так, у арабидопсиса рецептор этилена ETR1, представляющий собой сенсорную гистидинкиназу, передает сигнал этилена на белок CTR1, представляющий собой серин/треониновую протеинкиназу (обзор см.

Романов, 2002). Параллельная передача сигнала разными путями существенно повышает надежность и специфичность доставки данного сигнала до эффекторных структур клетки. Кроме того, появляются новые возможности для трансмиссии данного сигнала на различные внутриклеточные мишени. Для цитокининов, как уже отмечалось выше, характерна множественность ранних внутриклеточных реакций, многие из которых протекают независимо одна от другой. К ним относятся быстрые мембранные эффекты, активация транскрипции РНК-полимеразой II отдельных структурных генов, активация транскрипции РНК-полимеразой I рибосомальных генов, повышение/снижение стабильности отдельных мРНК, сборка полисом и активация аппарата трансляции. Поэтому представляется естественным, что сигнал цитокининов мог бы доходить до различных мишеней по разным схемам, в том числе и при участии компонентов сигнальной трансдукции, обнаруженных в нашей работе.

Дальнейшие исследования, без сомнения, позволят дать ответы на те вопросы молекулярного механизма действия цитокининов, которые остаются пока неясными.

Процессы и компоненты, лежащие в основе действия цитокинина на 8 ч. модели проростков амаранта

РНК-полимераза П ФоеФо-| Полисомы липаза Д I

Оксигсназы

Измеряемое кол-во пигмента Восприятие сигнала Транскрипция

Трансляция Накопление пигмента 1

8 Часы

Ф I414

1-бушнол I ЭГТА актином.Д, окадаевая к-та

Ф 14

ГА3 БАСи фенантролин циклогексимид

Ингибиторы

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гетман, Ирина Анатольевна, Москва

1. Джексон У. (1965) Ботаническая гистохимия. Изд-во «Мир», Москва, стр. 337. (Nachlas et al., 1957).

2. Дерфлинг (1985) Гормоны растений. Системный подход. Изд-во «Мир», Москва, с.304

3. Гудвин Т. & Мерсер Э.(1986) Введение в биохимию растений, т.2. Изд-во «Мир», Москва с. 392

4. Иванов В.Б.(1966) Влияние хлорамфеникола на образование утолщений на корнях, вызванных а- нафтилуксусной кислотой (НУК), 6-бензиламинопурином и колхицином. Докл. АН,167, 5: 1184.

5. Клячко H.JI. (1985) Постранскрипционная регуляция синтеза белка фитогормонами. Автореферат диссертации доктора наук, Москва, 47 с.

6. Кулаева О.Н. (1973) Цитокинины, их структура и функции Москва, Изд-во «Наука» 263 с.

7. Курсанов A.JL, Кулаева О.Н., Коновалов Ю.Б. (1966) О возможности использования кининов для активации созревания и прорастания семян. Агрохимия 4: 107-114.

8. Мазин В.В. (1983) Определение амарантина в семядолях щирицы тест на определения цитокининов. Рост растений и природные регуляторы Сводный указатель отечественной и зарубежной литературы. Москва с.24-28

9. Мазин В.В., Шашкова М.С., Андреев Л.Н., Комизерко Е.И., Жлоба Н.М, Кефели В.И. (1976) Специфичность влиянмя кинетина на образования амарантина у щирицы (Amaranthus coudatus L.) и рост каллуса семядоли сои (Glycine sojal) Докл. АН 231, 2: 506-509

10. Марзлаф У., Хуан Р. (1987) Трансляция РНК в изолированных ядрах. В книге «Транскрипция и трансляция». Из-во « Мир», с. 119-123.

11. Медведев С.С. (1996) Физиологические основы полярности растений Изд-во «Кольна», С.-Петербург

12. Медведев С.С. (1998) Электрофизиология растений. Изд-во С.-Петербургского университета, с. 182

13. Романов Г.А. (1985) Стероид-рецепторные комплексы и механизм регуляции транскрипции эукариотического генома. Биополимеры и клетка, 1: 213-218

14. Романов Г.А. (1989) Гормон-связывающие белки растений и проблема рецепции фитогормонов. Физиология растений, 36: 166-177

15. Романов Г.А. (1990) Модель гормонально организуемого пролиферативного роста: аналогии с ростом растений. Онтогенез, 23: 228-236

16. Романов Г.А. (1992) Цитокинины и тРНК: новый взгляд на старую проблему. Физиология растений, 37: 1196-1210

17. Романов Г.А.(2002) Рецепторы фитогормонов. Физиология растений 49,4: 1-11

18. Полевой В.В. Фитогормоны (1982) Изд-во С.-Петербургского университета, с.249

19. Тарчевский И.А. (2002) Сигнальные системы клеток растений. Изд-во «Наука» Москва

20. Хохлова В.А. (1977) Действие цитокинина на формирование пластид в семядолях тыквы на свету и в темноте. Физиология растений, 24, 6: 1189-1193

21. Хохлова В.А., Каравайко H.H., Подергана Т.А., Кулаева О.Н. (1978) Антагонизм в действии абсцизовой кислоты и цитокинина на структуру и биохимическую дифференциацию хлоропластов в изолированных семядолях тыквы. Физиология растений 20: 1033-1039

22. Хохлова В.А, Д. Нойман, Фофанова Т. А., Сердюк JI.C., Клячко Н.Л., Кулаева О.Н. (1981) Вызванное абсцизовой кислотой накопление РНК в ядрышках изолированных семядолей тыквы. Докл. АН, 256, 3: 765 -768

23. Свешникова И.Н., Хохлова В.А. (1969) Цитологическое изучение действия 6-бензиламинопурина и кинетина на изолированные семядоли льна. Физиология растений, 16,4: 687 693

24. Хрянин В.Н. (2002) Роль фитогормонов в дифференциации пола у растений. Физиология растений, 49: 608-614

25. Чайлахян М.Х. (1988) Регуляция цветения высших растений. Изд-во Наука, Москва, с. 351-374

26. Чайлахян М.Х., Хрянин В.Н. (1982) Пол растений и его гормональная регуляция. Изд-во Наука, Москва, 173 с.

27. Чайлахян М.Х. (1984) Регуляция цветения высших растений. Гормональная регуляция онтогенеза растений. Изд-во Наука, Москва, с. 9-28.

28. Auer C.A. (2002) Discoveries and dilemmas concerning cytokinin metabolism. J. Plant Growth Regul., 21: 24-31

29. Bamberger E. & Mayer A.M. (1960) Effect of kinetin on formation of red pigment in seedlings of Amaranthus retroflexus. Science, 131: 1094-1095

30. Bassil N.V., Mok D.W.S. & Mok M.S. (1993) Partial purification of a cis, trans-isomerase of zeatin from immature seed of Phaseolus vulgaris L. Plant Physiol., 102: 867-872

31. Biddington N.L. & Thomas T.H. (1973) A modified Amaranthus betacyanin bioassay for the rapid determination of cytokinins in plant extract Planta, 111: 183-186

32. Blackman P.G. & Davies W.J. (1984) Age-related change in stomatal response to cytokinins and abscisic acid. Annals Bot., 54: 121-125

33. Bonetta D. & McCourt P. (1998) Genetic analysis of ABA signal transduction pathways. Trends Plant Sci., 3: 231-235

34. Bruce M.I. & Zwar J.A. (1966) Cytokinin activity of some substituted urea and thiourea. Proc. Royal Soc. London, B. 165: 245-265

35. Burrows W. & Carr D. (1969) Effects of flooding the root system of sunflower plants on the cytokinin content in the xylem sap. Physiol. Plantarum, 22: 1105

36. Clapham (1995) Calcium signaling. Cell 80: 259-268.

37. Chapman K.D. (1998) Phospholipase activity during plant growth and development and in response to environmental stress. Trends Plant Sci., 11: 419-426.

38. Chvojka et al. (1962) The influence of stimulating doses of 6-Benzylaminopurine on awakening apple buds and on their consumption of oxygen. Biologia plantarum (Praha), 4, 3: 203-206.

39. Clement J.S. & Mabry T.J. (1996) Pigment evolution in the Caryophyllales: a systematic overview. Bot. Acta, 109: 360-367.

40. Crowell D. & Amasino R. (1994) Cytokinins and plant gene regulation .- In Cytokinins : Chemistry, Activity and Function (D.W.S. Mok and C. Mok eds) p.233-242 CRC Press, Boca Raton FL. ISBN 0-8493-6252-0.

41. D'Agostino, I.B. & Kieber J.J. (1999) Phosphorepay signal transduction: he emerging family of plant response regulators. Trends Biochem.Sci., 24: 452456

42. D'Agostino, I.B., Deruere J. & Kieber J.J. (2000) Characterization of the response of the Arabidopsis response regulator gene family to cytokinin. Plant Physiol., 124: 1706-1717

43. Deikman J. and Hammer PE (1995) Induction of anthocyanin accumulation by cytokinins in Arabidopsis tralianana. Plant Physiol., 108: 47-57.

44. Dichtl B., Stevens A. & Tollervey D. (1997) Lithium toxicity in yeast due to the inhibition of RNA processing enzymes. The EMBO Journal 16, 23: 7184-7195

45. Dominov J., Stenzler L., Lee S., Schwarz J., Leisner S. & Howell S. (1992)Cytokinins and auxins control the expression of gene in Nicotiniana plumbaginifolia cells by feedback regulation Plant Cell 4: 451- 461

46. Downes B. & Dring N. (1998) Crowell cytokinin regulates the expression of a soybean {3- expansin gene by a post- transcriptional mechanism. Plant Molecular Biology, 37: 437-444

47. Ella K., Meier K., Kumar A., Zhang Y. & Meier G. (1997).Utilization of alcohols by plant and mammalian phospholipase D. Biochem. Mol. Biol., 41: 715-724

48. Elliott D. & Koltunow A. (1983) Cycloheximide inhibition of cytokinin-dependent protein synthesis: correlation with betacyanin synthesis. Plant Physiology, 10:145-51

49. Elliott D. (1979) Ionic regulation from cytokinin-dependent betacyanin synthesis in Amaranthus seedlings. Plant Physiology, 63: 264-268

50. Elliott D. (1983) Inhibition of citokinin-regulated responses by calmodulin -binding compounds. Plant Physiol 72: 215-218

51. Elliott D.& YuguangY. (1989) Cytokinin and fusicoccin effect on calcium transport in Amaranthus protoplasts. Plant Sci. 65: 243-252

52. Faiss M., Zalubilova J., Stranad M. & Schmulling T. (1997) Conditional transgenic expression of the ipt gene indicates a function for cytokinins in paracrine signaling in whole tobacco plants. Planta J.12: 401-415

53. Feierabend I. (1981) Influence of cytokinin on plastid biogenesis in rye leaves. In: Metabolism and molecular activities of cytokinins Ed: Guern I., Peaud Lenoel C.,Heideiberg; N.Y.Springer-Veralag, p. 252-260

54. Gan S. & Amasino R.M. (1995) Inhibition of leaf senescence by autoregulated production of cytokinin. Science, 270: 1986-1988

55. Gersani M. & Kende H. (1982) Studies on cytokinin-stimulated translocation in isolated bean leaves. J. Plant Growth Regul.l, 2:161171

56. Gilman G.G. (1987). G- proteins: Transducers of reseptor-generated signal, Annu. Rev. Biochem., 56: 615-645

57. Girod P.A. & Zryd J. P. (1991) Biogenesis of betalains: purification and partial characterization of DOPA 4, 5-dioxygenase from Amanita. Phytochemistry, 30: 169-174.

58. Gillaspy G. & Gruissem W. (1995) Plant inositol monophoshatase is a lithium-sensitive enzyme encoded by a multigene femily Plant Cell, 7,21752185

59. Goodwin T.W. & Mercer H.I. (1983) Introduction to Plant Biochemistry, V.2. Pergamon Press, Oxford e.a.

60. Haberer G. & Kieber J. (2002) Cytokinins. New insights into a classicphytohormone. Plant Physiology, 128: 354-362

61. Hardie D.G. (1999) Plant protein serine/ threonine kinases classification and functions. Annu. Rev. Plant Physiol. And Plant Mol.Biol., 50: 97-131

62. Hempel J. & Bohm H. (1997) Betaxanthin pattern of hairy roots from Beta vulgaris var. lutea and its alteration by feeding of amino acids. Phytochemistry, 44: 847-852

63. Heuer S. & Strack D. (1992) Synthesis of betanin from betanidin and UDP-glucose by a protein preparation from cell suspension cultures of Dorotheanhus bellidiformis (Burm.F.) N.E. Br. Planta, 186: 626-628

64. Heuer S. et al. (1996) Partial purification and characterization of UDP-glucosebetanidin 5-O-and 6-O-glucosyltransferases from cell suspensioncultures of Doroltheanthus bellidiformis (Burm.F.) N.E. Br. Planta, 199: 244-250

65. Hinz U.G. et al. (1997) The gene coding from the DOPA dioxygenaseinvolved in betalanin biosynthesis in Amanita muscaria and its regulation. Mol.Gen. Genet., 256: 106

66. Holland M.A. (1997) Occam's razor applied to hormonology. Are cytokinins produced by plants? Plant Physiol., 115: 865-868

67. Hunter Tpny (1995) Protein kinases and pohosphatases: the yin and yang of protein phosphorylation and signaling. Cell., 80: 225-236

68. Hutchison C.E. & Kieber, J.J. (2002) Cytokinin signaling in Arabidopsis. The Plant Cell, Supplement pp. 47-59

69. Hwang I. & Sheen J. (2001) Two-component circuitry in Arabidopsis thaliana cytokinin signal transduction. Nature, 41: 86-389

70. Joy R.W. et al. (1995) Cloning and characterization of polyphenol oxidasecDNAs of Phytolacca americane. Plant physiol., 107: 1083-1089

71. KaimW. & Rail J. (1996) Kupfer-ein "modernes" Bioelement.Angew.Chem., 108: 47-64; Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 35: 43-60

72. Kakimoto T. (2001) Identification of plant cytokinin biosynthetic enzymes as dimethylallyl diphosphate: ATP/ADP isopentenyltransferases. Plant Cell Physiol. 42: 677- 685

73. Kakimoto T. (2003) Perception and signal transduction of cytokinins. Annu. Rev. Plant Biol. 54: 605-627

74. Kawasaki T., Henwes A., Ono E., Hatakeyama S., Iwano M., Satoh H., & Shimamoto K. (1999). The small GTP- binding protein rac is a regulator of cell death in plants. Ibid. 96, 19: 10922-10926

75. Kinsman L.T., Pinfield N.J. & Stobart A.K. (1975) A gibberellin bioassay based on betacyanin production in Amaranthus caudatus seedlings. Planta, 127: 149-152

76. Kishima Y.et al. (1992) Comparative analysis of petal proteins in red and white lines from near-isogenic Portulace sp." Jewel" plants. Euphytica, 61: 67-71

77. Klyachko N., Ananiev E., Kulaeva O.N. (1979) Effect of 6-benzylamino-purine and abscisic acid on protein synthesis in isolated pumpkin cotyledons. Physiol. Veget., 17: 607-617

78. Kochhar V., Kochhar S. & Mohr H. (1981) Action of light and kinetin on betalain synthesis in seedlings of Amaranthus caudatus: a two-factor analysis. Ber. Deutsch. Bot. Ges. 94: 27-34

79. Koehler K.H. (1972) Phytochemistry, 11: 127-131

80. Kohler K.H & Conrad K. (1966) Ein quantitaver phytokinintest. Biol. Rundschau, 4: 36-37

81. Kohler K.H. & Conrad K. (1968) Zur Spezifität des Amaranthus-Cytokinintest. III. Benzimidazolderivate und andere Verbindungen. Flora (Abt. A) 159: 293-298

82. Koshimizu K. & Iwamura H. (1986) Cytokinins. In: Chemistry of Plant Hormones (N. Takahashi, ed.), CRC Press, Boca Raton, Florida, pp. 153199

83. Kuraishi S. & Okumura F. (1956) The effect of kinetin on leaf growth. Bot. Mag. 69: 300

84. Kubota Satoshi et al. (1999) An enhanced Amaranthus betacyanin bioassay for detection of cytokinins. Plant Physiology 155,1: 133-135

85. Ma H. (1994) GTP-binding proteins in plants: new members of an old family. Plant Mol. Biol., 26: 1611-1636

86. Machady G., Liu C., Beecher C. (1998) Involvement of protein kinase and G proteins in the signal transduction of benzophenanthridine alkaloid biosynthesis.

87. Phytochemistry, 48, 1: 93-102

88. MacKintosh C. & MacKintosh R.W. (1994) Inhibitors of protein kinases and phosphatases. Special issue TIBS: 444-448

89. Mahonen A.P., Bonke M., Kaupinnen L., Riikonen M., Benfey P.M., Helariutta Y. (2000) A novel two-component hybrid molecule regulates vascular morphogenesis of the Arabidopsis root. Genes Dev. 14: 2938-2943

90. Miller C.O. (1961) A kinetin-like compound in maize. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 47: 170

91. Miller C.O., Skoog F., Saltza M.N., Strong F.M. (1955) Kinetin, a cell division factor from deoxyribonucleic acid. J. Am. Chem. Soc., 77: 13921395

92. Miller C.O. (1963) Kinetin and kinetin-like compounds. In: Moderne der Pfalanzenalyse -springer-verlag, Berlin, 6.

93. Millner P. A. & Causier B.E. (1996) G-protein coupled receptors in plant cells. Journal of Experimental Botany 47, 301: 983-992

94. Mothes K. (1960) The role of kinetin in plant regulation. Collogues internationaux

95. Centre national recherché seientifigue, 123: 131 -140

96. Mothes K., Schutte HR. & Luckner M.(eds) (1985) Biochemistry of Alkaloids.

97. Berlin: VEB Deutscher Verlag der Wissenschaften, p. 253-271

98. Mueller L.A. et al. (1996) Characterization of tyrosinase from Amanita muscaria involved in betalain biosynthesis. Phytochemistry, 42: 567-569

99. Mueller L.A. et al. (1997) Biochemical complementation of the betalain biosynthetic pathway in Portulaca grandiflora by a fungal 3,4-dihydroxyphenylanine dioxygenase. Planta 203: 260-263

100. Munnik T., Arisz S. A., Truus de Vrije, & Musgrave A. (1995) G protein activation stimulates phospholipase D signaling in plants. The Plant Cell, 7: 2197-2210

101. Munnik T. (2001) Phosphatidic acid: an emerging plant lipid second messenger. Trends Plant Sci. 6: 227-233

102. Obrucheva N.V. & Antipova O.V. (2003) Germination of horse chestnut seeds-cell growth and hormonal regulation. Seed technology 25, 2 :126-137

103. Parthier B. (1979) The role of phytohormones (cytokinins) in chloroplast development. Biochem. Physiol Pflanzen 174: 173-214

104. Pappan K., Zheng S., & Wang X. (1997) Identification and characterization of a novel plant phospholipase D that requires polyphosphoinositides and submicromolar calcium for activity in Arabidopsis. J. Biological Chemistry, 272(11): 7048-7054

105. Piatelli M., Giuduchi de Nicoia M. & Castrogiovanni V. (1971) The effect of kinetin on amaranthin synthesis in Amaranthus tricolor in darness. Phytochemistry, 10: 289-293

106. Plakidou-Dymock S. & Hooley R. (1998) A higher plant seven transmembrane receptor homologue that influences a sensitivity to cytokinins. Cur. Biol., 8: 315-324

107. Ritchie S. & Gilroy S. (1998) Abscisic acid signal transduction in the barley aleurone is mediated by phospholipase D activity. Proc. Nat. Acad. Sci., 95: 2697-2702

108. Ritchie S., Swanson S. & Gilroy S. (2002) From common signalling components to cell specific responses: insights from cereal aleurone. Physiol. Plant., 115: 342-351

109. Rodriguez P.L. (1998) Protein phosphatase 2C (PP2C) function in higher plants. Plant Mol. Biol, 38, 6: 919-927

110. Rodriguez P.L. & Serrano R. (1999) PAP phosphatase, an enzyme conserved throughout evolution: its role in lithium and sodium toxicities. In: Plant Responses to Environmental Stress (edited by M.F. Smallwood ) Bios scientific publishers .pp. 173-177

111. Romanov G.A., Kieber J.J., Schmulling T. Rapid cytokinin-response assay in Arabidopsis indicates a role for phosholipase D in cytokinins signaling FEBS Lett. 515:39-43

112. Romeis T., Piedras P., Jones J. (2000) Resístanse gene-dependent activation of calcium dependent protein kinase in the plant defense response. Plant Cell, 12,5:803-816

113. Silver D.L., Pinaev A. & de Bruijn F.J. (1996) Posttranscriptional regulation of the Sesbania rostrata early nodulin gene SrEnod2 by cytokinins. Plant Physiol. 112: 559-567

114. Skoog F. (1994) A personal history of cytokinin and plant hormone research. In: D.W.S. Mok & M.C. Mok (eds.): Cytokinins. Chemistry, Activity, and Function. Pp. 1-14. CRC Press, Boca Raton e. a.

115. Staford H.A. (1994) Anthocyanins and betalains: evolution of the mutually exclusive pathways. Plant Sct.101: 91-98

116. Steiner U. et al. (1999) Tyrosinase involved in betalain biosynthesis of higher plants. Planta 208: 114-124

117. Stobart A.K., Pinfield N.J., Kinsman L.T. Planta. (1970) v.94, p. 33-46

118. Strack D. et al. (2003) Recent advances in betalain research. Phytochemistry 62: 247-269

119. Strong F.M. (1958) Kinetin and kinins. In: Topics in Microbial Chemistry, N.-Y., pp. 98-157

120. Strnad M. (1997) The aromatic cytokinins. Physiol. Plantarum, 101: 674-688

121. Schafer S., Krolzik S., Romanov G., Schmulling T. (2000) Cytokinin-regulated transcripts in tobacco cell culture. Plant Growth Regulation 32, 23: 307-313

122. Schmulling T., Schafer S., Romanov G. (1997) Cytokinins as regulators of gene expression. Physiol. Plantarum, 100: 505-519

123. Schmulling T. (2001) CREam of cytokinin signalling: receptor identified. -Trends Plant Sci., 6: 281-284

124. Schmulling T., Werner T., Riefler M., Krupkova E., Bartrina I. (2003) Structure and function of cytokinin oxidase/dehydrogenase genes. J Plant Res., 116: 241-252

125. Schliemann W. at al. (1996) Betacyanins from plants and cell cultures of Phytolacca americane. Phytochemistry 42: 585-588

126. Schliemann W. at al. (1999) The decisive step in betaxanthin biosynthesis is a spontaneous reaction. Plant Physiol.l 19: 1217-1232

127. Smith R. D. & Walker J. C. (1996) Plant protein phoshatases. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 47: 101-25

128. Stephenson K.,Yamaguchi Y. & Hoch A.(2000) The mechanism of action of inhibitors of bacterial two-component signal transduction systems. Biological Chemistry 275, 49: 38900-38904

129. Stock A.M., Robinson V.L., Goudreau P.N. (2000) Two component signal transduchion. Annu. Rev. Biochem., 69: 183-215

130. Takei K., Sakakibara H., Taniguchi M., Sugiayama T. (2001) Identification of genes encoding adenylate isopentenyltransferase, a cytokinin biosynthesis enzyme, in Arabidopsis traliana. J. Biol. Chem., 276: 26405-26410

131. Terradas F. & Wyler H. (1991) The secodopas, natural pigments in Hygrocybe conica and Amanita muscaria. Phytochemistry 30: 3251- 3253

132. Thimann K.V. (1977) Hormone action in the whole of plants. Amherst: Univ.Massachusets press, p.447

133. Thomas T.H., Hare P.D., van Staden J. (1997) Phytochrome and cytokinin response. Plant Growth Regul., 23: 105-122

134. Trezzini G. P. & Zryd J.P. (1990) Portulaca grandiflora: a model system from the study of the biochemistry and genetics of betalain synthesis. Acta Horticult 280: 581-585

135. Uegushi C., Koizumi H. Suzuki T., Mizuno T. (2001) Novel family of sensor histidine kinase genes in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol., 42: 231235

136. Van Hoof C, Goris J. & Merleve W. (1996) Protein Phosphorylation Weinheim: VCH: 329-366

137. Van der Luit A., Titus P., van Doom A., Musgrave A., Felix G., Boiler T., & Munnik T. (2000) Elicitation of suspension-cultured tomato cells triggersthe formation of phosphatidic acid and diacylglycerol pyrophosphate. Plant Physiology, 123: 1507-1515

138. Wang X. (2000) Involvement of pospholipase D in wound- induced accumulation of jasmonic acid in Arabidopsis. Plant Cell 12, 11: 2237- 2246

139. Wang X. (2000) Multiple forms of phospholipase D in plants: the gene family, catalytic and regulatory properties, and cellular functions Progr. Lipid Res. 39,2: 109-149

140. Wang X. (2001) Plant phospholipases. Annu Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 52:211-231

141. Wang X., Wang C., Sang Y„ Qin C. & Welti R. (2002) Networking of phospholipases in plant signal transduction. Physiol. Plant., 115: 331-335

142. Wyler U. et al.( 1984) Cyclodopa glucoside (2S)- 5-(p-D-glucopyranosyloxy)-6-hydroxyindoline-2-carboxylic acid) and its occurrence in red beet. Helv.Chim.Acta 67: 1348-1355

143. Yopp J., Aung L., Steffens G. (1986) Bioassays and other special techniques for plant hormones and plant growth regulators. Published by Plant Growth Regulator Society of America p.64-84

144. Yu, C.H., Liu, S.Y. & Panagia, V. (1996) The transphosphatidylation activity of phospholipase D. Mol. Cell. Biochem., 157: 101-105