Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование структурных основ лигандной специфичности рецепторов цитокининов

ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Исследование структурных основ лигандной специфичности рецепторов цитокининов"

На правах рукописи

ГУ

Стеклов Михаил Юрьевич

ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРНЫХ ОСНОВ ЛИГАНДНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ РЕЦЕПТОРОВ ЦИТОКИНИНОВ

03.01.05-физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 О МАЙ ¿013

Москва-2013

005060166

005060166

Работа выполнена в лаборатории сигнальных систем контроля онтогенеза им. академика М.Х. Чайлахяна Федерального ' государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, г. Москва

Романов Георгий Александрович

Михайлов Сергей Николаевич ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Новикова Галина Викторовна, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, лаборатория молекулярных основ внутриклеточной регуляции, ведущий научный сотрудник

Тараканов Иван Германович, доктор биологических наук, профессор, Российский государственный аграрный университет — Московская сельскохозяйственная академия имени К.А. Тимирязева, кафедра физиологии растений, заведующий кафедрой

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования , . . Санкт-Петербургский государственный университет, Биолого-почвенный факультет

Защита состоится 20 июня 2013 г. в 13 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 002.210.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук по адресу: 127276, Москва, ул. Ботаническая, 35. Факс: (499) 977-80-18, e-mail m-azarkovich@ippras.ru; ifr@ippras.ru

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук. -

Автореферат разослан « мая 2013 г.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор биологических наук, профессор

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ: доктор химических наук, профессор

Ученый секретарь диссертационного совета, . , ,

кандидат биологических наук Азаркович Марина Ивановна

Актуальность проблемы. Открытие рецепторов цитокининов дало мощный импульс к изучению на новом методическом уровне действия данных фитогормонов. В результате был накоплен большой объем новых данных о системе передачи цитокининового сигнала в клетке и о конкретной роли белков-участников рецепции и сигнальной трансдукции в молекулярном механизме действия цитокининов. Также были раскрыты механизмы, с помощью которых данные фитогормоны участвуют в регуляции роста и развития растения, адаптации к различным неблагоприятным внешним воздействиям, взаимодействии с другими сигнальными процессами и т.д. Все последние годы проводилось активное изучение и самих рецепторов, были проанализированы их доменный состав, локализация в клетке, экспрессия в органах и тканях, взаимодействие с лигандами. Наиболее детально были исследованы рецепторы арабидопсиса, которых оказалось три: АНК 2, 3 и 4. Практически все рецепторы цитокининов других видов являются ортологами того или иного рецептора арабидопсиса. Был идентифицирован СНАЗЕ-домен у Ы-конца рецепторов цитокининов, включающий РАБ-субдомен, в составе которого находится сайт связывания цитокининов. Но многие вопросы все еще остаются без ответов. Например, все еще неясны особенности строения цитокинин-связывающих сайтов рецепторов, ответственные за различия в их лигандной специфичности, а также биологическая роль этих различий. Неизвестны закономерности структуры сенсорного модуля, конкретная функциональная роль и способы взаимодействия составляющих его доменов, характер конформационных изменений рецептора, которые происходят при связывании цитокининов и, наоборот, не происходят при связывании рецепторных антагонистов.

Между тем взаимодействие гормона с рецептором является ключевым процессом гормонального сигналинга и включает всю последующую цепь событий, приводящую к ответной реакции клетки на гормон. Поэтому поиск ответов на вышеуказанные вопросы является важной и актуальной научной задачей и может помочь прояснить на молекулярном уровне механизм действия цитокининов и особенности их взаимодействия с рецепторами.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы является изучение особенностей строения сенсорных модулей рецепторов цитокининов и идентификация структурных детерминант, определяющих лигандную специфичность этих модулей на примере рецепторов арабидопсиса и кукурузы.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1) охарактеризовать аминокислотный состав лиганд-связывающих сайтов рецепторов цитокининов методами фотоаффинной и химической модификации отдельных аминокислотных остатков;

2) с помощью биоинформатических подходов изучить особенности строения сенсорного модуля рецепторов цитокининов и выделить консервативные участки, потенциально важные для функционирования рецептора;

3) экспрессировать полноразмерный рецептор АНК2 и провести анализ его лиганд-связывающих свойств;

4) с помощью компьютерного моделирования сенсорных модулей цитокининовых рецепторов арабидопсиса и кукурузы определить аминокислотные остатки, потенциально важные для лигандной специфичности рецепторов;

5) провести направленный мутагенез рецептора гтНК1 и экспериментально оценить роль конкретных аминокислотных остатков в детерминации лигандной специфичности изучаемых рецепторов.

Научная новизна работы. Разработан новый высокоэффективный метод синтеза в-азидо-А^-бензиламинопурина. Методом модификации отдельных аминокислот было установлено, что остаток аспартата играет важную роль в связывании цитокининов рецепторами.

С помощью множественного выравнивания последовательностей аминокислот более чем 100 рецепторов цитокининов обнаружены ранее неизвестные консервативные мотивы сенсорных модулей в прилегающих к ОНАвЕ-доменам областях белка.

Впервые охарактеризована лигандная специфичность полноразмерного рецептора арабидопсиса АНК2.

Впервые построены пространственные модели сенсорных модулей пяти рецепторов цитокининов (АНК2, АНКЗ, гтНК1, 2шНК2, гшНКЗа) на основе структуры модуля рецептора АНК4, взятого в качестве шаблона.

На основе выравнивания и моделирования отмечены 6 аминокислот -потенциальных детерминант лигандной специфичности рецепторов цитокининов из арабидопсиса и кукурузы.

Методом направленного мутагенеза получено более 30 новых форм рецептора кукурузы 2тНК1, имеющих от одной до семи аминокислотных замен в сенсорном модуле, и охарактеризована лигандная специфичность мутантных форм рецептора.

На примере рецептора гшНК1 с помощью направленного мутагенеза удалось впервые существенно изменить профиль лигандной специфичности рецептора и идентифицировать аминокислоты-детерминанты этого профиля.

Прастическая ценность. Разработанный подход к синтезу производных А^-бензиламинопурина открывает новые возможности для получения новых синтетических аналогов цитокининов, что может быть полезно для получения новых лигандов с цитокининовой или антицитокининовой активностью.

Данные по лигандной специфичности мутантных рецепторов гтНК1 показывают возможность направленного изменения аффинности рецептора к различным природным цитокининам, что может быть использовано в научных исследованиях, биотехнологии и агропроизводстве.

Обнаруженные новые консервативные участки сенсорного модуля рецепторов цитокининов могут быть использованы в филогенетических и биоинформатических исследованиях. Эти сведения будут также полезны при изучении механизма функционирования рецепторов и передачи цитокининового сигнала. '

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на 3-ем Международном симпозиуме "Клеточная сигнализация у растений", Казань, 28 июня - 1 июля 2011; 7-ой Международной конференции "Рост, развитие и продуктивность растений", Минск, Беларусь, 26-28 октября 2011; III International Symposium "Intracellular Signaling and Bioactive Molecules Design", Lviv, Ukraine, 17-23 September, 2012; IV Всероссийском симпозиуме «Трансгенные растения: технологии создания, биологические свойства, применение, биобезопасность», Москва, ИФР РАН, 19-23 ноября 2012; Международной конференции "Рецепторы и внутриклеточная сигнализация", г. Пущино, 27-30 мая 2013; Moscow Conference on Computational Molecular Biology (MCCMB'13) Moscow, Russia, July 25-28, 2013.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, включая 3 статьи в зарубежных и отечественном рецензируемых журналах.

Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения и пяти глав: обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, заключение и выводы, а также списка цитируемой литературы. Материалы диссертации изложены на 150 страницах машинописного текста, содержат 4 таблицы и 33 рисунка. Список литературы включает 185 источников, в т.ч. 181 в зарубежных изданиях.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Синтез азидопроизводных цитокининов. Отдельные эксперименты в области органического синтеза были выполнены в лаборатории стереохимии ферментативных реакций Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (зав. лаб. д.х.н. С.Н. Михайлов). Для синтеза 8-азидо-N6-бензиламино-пурина был разработан простой и эффективный двухстадийный метод. 2-азид0-Л^-бензилами110пурин был синтезирован по известной методике (Sakai et al., 2006).

Анализ цитокининовой активности в биотестах. При выполнении биотестов in planta использовали модельные системы на основе проростков арабидопсиса Arabidopsis thaliana, трансформированных геном РARR5:GUS, и проростков амаранта Amaranthus caudatus. Эти системы дают четкую, быструю и специфическую реакцию на воздействие цитокининов, так как основаны на индукции экспрессии цитокинин-зависимых генов (Romanov et al., 2000; 2002).

Модификация отдельных аминокислот в рецепторах цитокининов. В

опытах по модификации отдельных аминокислот использовали аликвоты мембран трансгенных Е. coli, содержащие экспрессированные рецепторы цитокининов АНК4 или ZmHKl. Мембраны (100000 g-осадок) обрабатывали

различными реактивами, селективно взаимодействующими с одной из 20-и белковых аминокислот. Обработку проводили согласно общепринятым методикам (Basle' et al., 2010). Далее обработанные и контрольные мембраны тестировали в опытах по связыванию меченого транс-зеатина (/Z) (Romanov et al., 2005; Lomin et al., 2011).

Компьютерное моделирование сайта связывания цитокининов.

Моделирование проводили с использованием программы Modeller 9.11 (Sali & Blundell, 1993). Молекулярный докинг был выполнен с помощью программы FRED 2.2.5 (ОрелЕуе Scientific Software Inc.). Визуальный анализ пространственных структур был выполнен с помощью программ VIDA 4.2.1 (OpenEye Scientific Software Inc.) и SybylX 2.0 (Tripos). Техническая часть работы была выполнена к. х. н. Д. И. Осолодкиным (Химический факультет МГУ им. М. В. Ломоносова).

Биоинформатический анализ последовательностей белка. Первичные белковые последовательности рецепторов цитокининов были взяты из базы данных Pubmed Protein. Домены были определены с помощью программы SWISS-MODEL Version 8.05 (Arnold et al., 2006; Kiefer et al., 2009). Множественные выравнивания были построены с использованием программы CLUSTAL X 2.0.11 (Larkin et al., 2007). Логосы были построены с помощью приложения WebLogo 3 (Crooks et al., 2004). Топологическая схема сенсорного модуля рецептора АНК4, основанная на кристаллической структуре (3T4L), была построена с помощью программы TopDraw (Bond C.S., 2003).

Сайт-направленный мутагенез. Введение сайт-специфических мутаций в гены рецепторов с использованием ПЦР осуществляли в три стадии по методике С.Н. Ломина (ИФР РАН). На первой стадии проводили ПЦР для создания 2-х фрагментов ДНК с комплементарными концами. В каждой реакции использовался один праймер на конец последовательности и другой - с замененными нуклеотидами в центральной части, причём так, чтобы в конечном продукте была проведена предусмотренная замена одной аминокислоты на другую. В качестве исходной матрицы была использована плазмида с геном рецептора ZmHKl (кДНК) дикого типа. После этого проводили отжиг и ПЦР-реакцию по объединению двух фрагментов в одной последовательности двутяжевой ДНК. При этом синтез ДНК проходил без праймеров, поскольку в данной реакции праймерами являются сами ПЦР-продукты из предыдущей стадии. На третьей стадии проводили амплификацию продукта, образовавшегося на второй стадии. После чего полученный ПЦР-продукт, содержащий необходимую замену, подвергали обработке рестриктазами и встраивали в плазмиду pB7FWG2. Наличие мутаций во всех случаях было подтверждено с помощью секвенирования ДНК.

Получение растительных мембран с рецепторами цитокининов.

Плазмиду pB7FWG2, содержащую ген рецептора (дикого типа или мутантный) под контролем конститутивного промотора 35S CaMV, встраивали в клетки

б

агробактерий (A. tumefaciens), с помощью которых трансформировали листья табака Nicotiana benthamiana для транзиентной экспрессии рецептора. Об уровне экспрессии встроенного гена в листьях судили по наличию флуоресценции «пришитого» к рецептору репортерного белка GFP. Через пять дней после инокуляции агробактерий с плазмидами из листьев выделяли микросомальную фракцию мембран (100000 g-осадок). С ней проводили эксперименты по анализу аффинности рецепторов к различным цитокининам.

Оценка уровня сродства различных цитокининов к рецепторам.

Эксперименты проводили на основе варианта радиолигандного метода с использованием сферопластов Е. coli или фракции мембран растений N. benthamiana, трансформированных генами рецепторов цитокининов. Особенности лиганд-связывающих свойств рецепторов изучали в опытах по конкуренции меченого tZ с различными немечеными цитокининами: tZ, цис-зеатином (cZ), изопентениладенином (iP), Л^-бензиладенином (ВА), тидиазуроном (TD) и дигидрозеатином (DZ).

Математические и статистические методы анализа. Константы диссоциации комплексов гормон-рецептор рассчитывали по Cheng & Prusoff (1973) на основе данных, полученных в конкурентных опытах, с применением опции Pharmacology программы SigmaPlot 9.0. Статистический анализ экспериментальных результатов проводили с помощью программы Microsoft Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Исследование аминокислотного состава лиганд-связывающего сайта рецепторов цитокининов методами химической модификации

В начале нашей работы пространственная структура лиганд-связывающего модуля рецептора не была определена, поэтому для исследования этого модуля мы применили методы химической модификации белка. Одним их таких методов является метод фотоаффинной модификации. Вполне подходящими соединениями для фотоаффинного мечения рецепторов представлялись азидопроизводные цитокинина по второму или восьмому положению аденинового гетероцикла, так как из литературы было известно (Sussman & Kende, 1977; Mornet et al., 1979), что, несмотря на наличие заместителя, они не теряли цитокининовой активности.

Нам удалось синтезировать 2-азидо-Л'6-бензиламинопурин по уже известной методике (Sakai et al., 2006), которая оказалась вполне воспроизводимой. Но в случае в-азидо-Л^-бензиламинопурина ранее применяемый метод включал 5 стадий и был трудоемок и малоэффективен. Причем азидогруппа в нем вводилась уже на второй стадии и поэтому могла подвергаться разрушению под действием света в ходе последующих этапов синтеза. Поэтому мы разработали альтернативный простой и эффективный

двухстадийный способ синтеза в-азидо-Л^-бензиламинопурина (3), представленный на рисунке 1.

Рис. 1. Схема двухстадийного синтеза 8-азидо-Л'6-бензиламинопурина (3). Реактивы и условия: а) Вг2, АсОН, АсОЫа, комн. температура, 24 часа, 59%; Ь) ДМСО, 75°С, 36 часов, 70%.

Суммарный выход азидопроизводного 3 по разработанной нами методике составил 41% против 6% в методе, описанном в литературе, что почти в 7 раз эффективнее. Таким образом, нами были синтезированы 2-азидо-Л'6-бензиламинопурин и, по разработанному методу, 8-азидо-Л'6-бензиламинопурин (3).

Полученные соединения были проверены на способность вытеснять меченый гё из комплекса с рецептором и на наличие физиологической активности в известных количественных тест-системах на цитокинины. В обоих типах тестов оба азидопроизводных продемонстрировали активность, вполне сравнимую с классическим цитокинином ВА. Это дало основание приступить к опытам по фотоаффинной модификации рецепторов посредством УФ-облучения комплексов рецепторов с азидопроизводными ВА. Однако, несмотря на различные вариации экспериментов, добиться заметной пришивки азидопроизводных к рецепторам АНК4 или 2шНК1 не удалось. Это следовало из того, что рецепторы после облучения и отмывки связывали меченый 1Ъ так же интенсивно, как и рецепторы без облучения. В дальнейшем, с помощью пространственного моделирования и докинга были выяснены вероятные причины, из-за которых азидопроизводные ВА не образовывали ковалентных сшивок и не блокировали сайты связывания гормона в рецепторах (см. рис. 6).

Другим методом определения аминокислотного состава активных центров рецепторов был метод модификации отдельных аминокислот. Суть данного метода состоит в том, что белок обрабатывается специальными химическими соединениями, которые вступают в реакцию селективно с одним из 20-и типов аминокислот. Можно ожидать, что при химической модификации какой-либо аминокислоты в составе лиганд-связывающего сайта рецептора будет нарушено гормон-рецепторное взаимодействие, что может быть выявлено в опытах по связыванию меченого лиганда.

В наших опытах с рецепторами АНК4 и 2шНК1 модификация остатков аргинина, лизина и цистеина не привела к каким либо изменениям в связывании лиганда, что свидетельствует об их отсутствии или незначительной роли во взаимодействии с гормоном в связывающем сайте рецептора. Зато

после проведения модификации остатка аспартата наблюдалось дозозависимое подавление связывания (рис. 2).

Контроль Ю-5 ICH 10~? Концентрация EDC. М

Контроль IG'5 ICH IC)"' Концентрация EDC. М.

Рис. 2. Связывание меченого транс-зеалнна (iL*) с мембранами Е. coli, содержащими рецептор АНК4 (слева) и ZmHKl (справа) после проведения модификации аспарагиновой кислоты карбодиимидом EDC. ТВ, NS и SB - тотальное, неспецифическое и специфическое связывание, соответственно.

Таким образом, мы сделали вывод о том, что у рецепторов АНК4 и ZmHKl остаток аспартата выполняет важную функцию в связывании цитокининов. Однако по ходу нашей работы появилась публикация с описанием кристаллической структуры сенсорного модуля рецептора АНК4 в комплексе с различными цитокининами (Hothorn et al., 2011). Это дало возможность визуально определить состав лиганд-связывающего сайта рецептора и характер взаимодействия его аминокислотных остатков (а.о.) с гормоном. Поэтому мы завершили работу по химической модификации рецепторов и переключились на изучение лиганд-связывающего модуля другими методами. Но здесь стоит отметить, что наши данные полностью подтвердились опубликованной кристаллической структурой сенсорного модуля рецептора. Asp262 является определяющей в связывании гормона, образуя две водородные связи с адениновой частью цитокинина, тогда как остатков аргинина, цистеина и лизина в составе лиганд-связывающего сайта рецептора АНК4 нет.

Биоинформатический анализ сенсорного модуля рецепторов цитокининов

В связи с активной работой по секвенированию полных геномов и расшифровкой в последние годы геномов целого ряда растений появилась возможность провести методами биоинформатики сравнительный анализ структуры сенсорных модулей рецепторов цитокининов, на основе аннотированных генов рецепторов. Такой анализ дает возможность выделить основные, наиболее важные черты строения этого модуля рецептора, инвариантные у большинства гомологичных белков из разных видов растений.

Это, в свою очередь, позволяет приблизиться к пониманию основ функционирования сенсорного модуля в процессах восприятия и передачи цитокининового сигнала.

С помощью биоинформатических методов мы сравнили доменный состав сенсорных модулей более 100 рецепторов цитокининов из разных видов растений. Были определены число, размер и положение трансмембранных (ТМ) спиралей, а также средний размер и положение СНАБЕ-домена и получены следующие результаты. Средняя длина восходящих и нисходящих ТМ-спиралей составляет 21 и 22 а.о., соответственно. Между ними находится сенсорный модуль, который включает в себя СНАБЕ-домен и примыкающие к нему фрагменты белка до ТМ-спиралей (линкеры). Длина СНАЗЕ-домена составляет в среднем 220 а.о., а длина линкеров варьируется. Восходящий линкер имеет среднюю длину около 50 а.о., а нисходящий линкер - 10 а.о. (рис.

^\Длина, а.о. Группы"--^ ортологов Восходящая ТМ-спираль Восходящий линкер СНА8Е-домен Нисходящий линкер Нисходящая ТМ-спираль

АНК2 19(19-23) 49 (32-50) 223 (213-227) 11 (7-15) 21 (20-24)

АНКЗ 21 (18-23) 48 (44-50) 225 (213-227) 8 (7-9) 23 (20-23)

АНК4 22 (18-23) 50 (48-52) 215 (204-245) 11 (8-16) 23 (19-24)

Все рец-ры 21 (18-23) 49 (32-52) 220 (204-245) 10 (7-16) 22 (20-24)

ТМ СНАБЕ тм —С

21 а.о. 49а.о. 220а.о. Юа.о. 22а.о.

Рис. 3. Общее строение сенсорного модуля и прилегающих трансмембранных (ТМ) спиралей. Данные в таблице демонстрируют длину в аминокислотных остатках (а.о.) различных участков рецепторов цитокининов отдельно по Группам ортологов и для всех рецепторов вместе. Средние значения выделены жирным шрифтом, а разброс значений указан в скобках. Внизу - схематическое изображение сенсорного модуля со средними длинами его участков.

Для идентификации консервативных участков, потенциально важных для функционирования рецептора, мы провели сравнение аминокислотных последовательностей СНАБЕ-доменов, ТМ-спиралей и линкеров между ними по группам ортологов и для всех рецепторов вместе. У ТМ-спиралей были обнаружены консервативные а.о., при этом число и степень консервативности таких а.о. гораздо больше в нисходящих ТМ-спиралях (табл. 1). У отдельных групп ортологов от трети до половины а.о. этих ТМ-спиралей обладают высокой (80-100%) консервативностью. А для всех рецепторов четко прослеживается мотив - Аххх(8/А)х(0/Ъ)х(Ь/Т)У1х(Ь/Т)Ьх0(¥/Н)1.

Таблица 1. Логосы и консервативные мотивы восходящих и нисходящих трансмембранных (ТМ) доменов. Каждый логос состоит из множества символов, каждый символ соответствует одной позиции а.о. во множественном выравнивании. Высота символа пропорциональна частоте встречаемости данного а.о, а ширина характеризует наличие пропусков при выравнивании: чем их больше, тем символ уже. Последовательности наиболее консервативных а.о. изображены над логосами, а.о. обозначены стандартными однобуквенными символами.

АНК2

Восходящие ТМ-спирали

Нисходящие ТМ-спирали

15 20

АНКЗ

-\VxxxWxxxS-

-РххА1хТ8хСхЬУ1АЬЬххх1

АНК4

—хх\Уххх--

-АхххххххРУ1ххЬУСУ1

1л го

-(1_)хх(\¥)ххххххх(8)-

-Ахххххххх УТххЕхСгхГ

Все рецепторы

Присутствие большого числа консервативных а.о. в нисходящем ТМ-домене подтверждает его важную роль не только в фиксации рецептора в мембране, но и в передаче гормонального сигнала.

Выравнивание аминокислотных последовательностей участков сенсорного модуля, примыкающих к СНА5Е-домену, продемонстрировало неожиданно высокий уровень консервативности (табл. 2). В коротком нисходящим линкере между СНАБЕ-доменом и нисходящей ТМ-спиралью почти половина а.о. оказалась высококонсервативна. Мотивы для групп ортологов еще более консервативны, особенно для АНКЗ. Восходящий линкер между восходящей ТМ-спиралью и СНАБЕ-доменом также оказался очень консервативным, особенно его правая часть, прилегающая к СНА8Е-домену. Данный линкер имеет в своем составе 13 полностью консервативных а.о. из общего числа 49. Это соотношение (26.5%) в 3 раза превосходит таковое для СНА8Е-домена (около 9%). Дополнительно наблюдается еще 15 строго превалирующих а.о. (табл. 2).

Таблица 2. Логосы линкеров, примыкающих к СНАЗЕ-домену. Положение стержневой спирали (а1) показано зеленой линией под мотивами. А.о.окрашены в зависимости от химических свойств: полярные (в, Б, Т, У, С) - зеленым, нейтральные (0,14) - фиолетовым, основные (К, Я, Н) - синим, кислотные (Б, Е) - красным, гидрофобные (А, V, Ь, I, Р, XV, Р, М) - черным. Остальные пояснения даны в описании к таблице 1.

Исходя из известной ЗО-структуры рецептора АНК4, восходящий линкер почти полностью соответствует длинной а-спирали, предшествующей СНАБЕ-домену (спираль а1, рис. 4). Из пространственной структуры сенсорного модуля очевидно, что данная спираль поддерживает два субдомена, входящих в состав СНАБЕ-домена. Тем не менее, исключительно "поддерживающая" функция не требует такого высокого уровня консервативности, который, вероятнее всего, предполагает более важную роль этой а-спирали в функционировании рецептора. Например, эта спираль (а1) может фиксировать оптимальную конформацию лиганд-связывающего домена (рис. 4, красный цвет) и способствовать конформационным изменениям после его связывания с лигандом. Также спираль а1 вместе со спиралью а2 образует поверхность димеризации модулей, хотя в этом взаимодействии участвуют только С-концевые области а1-спирали. Значительная часть консервативной области а1-спирали рецептора не принимает участия в димеризации, что ставит вопрос о роли консервативных а.о. этой области.

После анализа примерно ста аминокислотных последовательностей различных рецепторов цитокининов мы можем заключить, что не только СНА8Е-домен, а весь сенсорный модуль обладает высокой консервативностью и соответственно очень важен для функционирования рецептора. Этот модуль состоит из -280 а.о. и его можно разделить на несколько структурных участков. Центральным является СНАБЕ-домен (-220 а.о.), в состав которого входят два

12

субдомена РАБ-типа (Нойюгп е1 а1., 2011). Однако проведенный нами детальный анализ структуры сенсорного модуля подтвердил существование только одного канонического РАБ-субдомена, дальнего по отношению к мембране (рис. 4, красный цвет).

Рис. 4. Топологическая схема сенсорного модуля рецептора АНК4, основанная на его кристаллической структуре (РОВ ГО: ЗТ4Ь). Синим показаны а-спирали, формирующие поверхность димеризации. Красным показан лиганд-связывающий РА8-субдомен. Зеленым - верхний участок лиганд-связывающего РАв-субдомена (инсерции длиной ~15 а.о. в парах ортологов АНКг/гтНКЗ и АНКЗ/гтНК2 находятся между аЗ и РЗ). Лиловым показан псевдо РА8-субдомен. а-спирали и Р-листы изображены в виде стрелок и цилиндров, соответственно.

Этот субдомен имеет типичные для РАБ-типа размер (~100 а.о.) и структуру: пять антипараллельных Р-листов, из которых первый и последний соединены а-спиралью. А вот ближний к мембране субдомен (рис. 4, лиловый цвет) значительно короче (~70 а.о.), состоит только из четырех Р-листов, а а-спирали в нем отсутствуют. Это ставит под сомнение его принадлежность к РАБ-типу, поэтому мы дали ему название псевдо-РАБ-субдомен. Со стороны Ы-конца к СНА8Е-домену прилегает восходящий линкер в виде стержневой а-спирали (а1, ~50 а.о.), а со стороны С-конца - короткий линкер (~10 а.о.) (рис. 4). Таким образом, нам удалось впервые обнаружить высококонсервативные участки сенсорного модуля, которые соседствуют с СНАБЕ-доменом и ранее не привлекали внимания исследователей. Дальнейшее детальное изучение этих структур может прояснить механизм функционирования сенсорного модуля в ходе восприятия и передачи цитокининового сигнала.

Экспрессия полноразмерного рецептора АНК2 и исследование его лигандной специфичности

Лиганднзя специфичность - одна из важнейших характеристик рецепторных белков. Она изучается в функциональных тестах после экспрессии индивидуальных рецепторов в соответствующих модельных системах. На данный момент уже экспрессирован целый ряд индивидуальных рецепторов цитокининов и изучена лигандная специфичность рецепторов арабидопсиса и кукурузы. Но в случае рецептора арабидопсиса АНК2 пока удавалось экспрессировать (в бактериях) только его сенсорный модуль, но не целый рецептор, что, вероятнее всего, связано с высоким уровнем токсичности этого белка для Е. coli. Однако для корректного и убедительного сравнения лигандной специфичности рецепторов желательно их тестирование в одинаковых условиях, т.е. при экспрессии полноразмерных белков. Для определения профиля лигандной специфичности полноразмерного рецептора АНК2 была поставлена задача экспрессировать его в растительной тест-системе, ранее разработанной в нашей лаборатории. Рецептор нарабатывался в листьях табака N. benthamiana в условиях транзиентной экспрессии гена АНК2 под конститутивным 35S-np0M0T0p0M. Далее из трансформированных листьев выделяли тотальную фракцию мембран, которую использовали в конкурентных опытах по вытеснению различными лигандами связанного рецептором меченого tZ. В результате этой работы нам впервые удалось определить лигандную специфичность полноразмерного рецептора АНК2 (рис. 7, АНК2 дикий тип). Согласно полученным кривым вытеснения, этот рецептор связывает с наиболее высоким сродством iP и tZ, причем сродство к iP, по-видимому, несколько выше, чем сродство к tZ. Далее по убывающей следует сродство к TD, ВА, а наименьшим и примерно равным сродством к АНК2 обладают cZ и DZ. По сравнению с лигандной специфичностью сенсорного модуля отличие наблюдается только в случае синтетического цитокинина TD. Таким образом, мы уточнили профиль лигандной специфичности полноразмерного рецептора АНК2, который оказался очень сходен с аналогичным профилем его изолированного сенсорного модуля. Это подтверждает высокую стабильность лиганд-связывающих свойств рецепторов цитокининов. В результате этой работы и литературных данных (Romanov et al., 2006; Lomin et al., 2011; Stolz et al., 2011) мы сейчас располагаем надежными данными о лигандной специфичности всех трех полноразмерных рецепторов цитокининов арабидопсиса (АНК 2, 3 и 4) и их ортологов из кукурузы (ZmHK За, 2 и 1).

Молекулярное моделирование рецепторов цитокининов из арабидопсиса и кукурузы: поиск аминокислот, потенциально определяющих лигандную специфичность данных рецепторов

Функциональные свойства рецептора, связанные с узнаванием гормонов и трансдукцией сигнала, определяются в первую очередь его структурой.

Недавно опубликованная кристаллическая структура сенсорного модуля рецептора АНК4 (НоЙюгп е1 а1., 2011) дает возможность моделирования ЗБ-структур других цитокининовых рецепторов с использованием АНК4 в качестве шаблона. У арабидопсиса имеются три изоформы рецепторов цитокининов: АНК 2, 3 и 4, которые различаются между собой по лигандной специфичности. Рецепторы цитокининов кукурузы 2шНК 1, 2 и За являются ортологами рецепторов арабидопсиса АНК 4, 3 и 2. Лигандная специфичность каждой пары рецепторов-ортологов из арабидопсиса и кукурузы имеет много общего (Ьогшп е1 а1., 2011). До настоящего времени обоснования причин различий лигандной специфичности рецепторов цитокининов на структурном уровне не существовало. Для решения этой задачи мы построили модели ЗБ-структуры сенсорных модулей пяти рецепторов арабидопсиса и кукурузы (АНК2, АНКЗ, /лпНК1. 7т11К2, ХтНКЗа) и провели молекулярный докинг шести различных цитокининов (й, сЪ, ¡Р, ВА, ТО, DZ). Это позволило нам сравнить характер взаимодействия этих лигандов с шестью изучаемыми рецепторами для того, чтобы определить а.о. в каждом из СНАБЕ-доменов, участвующие в связывании цитокининов и формировании лигандной специфичности. На полученных моделях хорошо видно большое сходство общей структуры (каркаса) сенсорных модулей изучаемых рецепторов (рис. 5).

Рис. 5. Общий вид моделей сенсорных модулей рецепторов цитокининов. Цветовое обозначение: АНК4 (рентгеновская структура ЗТ4Ь, цепь А) окрашен по типу вторичной структуры (красный цвет - а-спирали, голубой - Р-листы, желтый - петли), гтНКЛ окрашен в желтый, АНК2 - зеленый, гтНКЗа

- зелено-голубой, АНКЗ - пурпурный, гтНК2

- фиолетовый цвета.

Особенно близки оказались ортологи в парах 7шНК1/АНК4 и АНИДтНЮа, где в каждой паре гормон-связывающие сайты образованы одинаковыми а.о. (табл. 3).

Таблица 3. Сравнение лиганд-связывающих сайтов цитокининовых рецепторов арабидопсиса и кукурузы.

| АНК4 К/ В1 2 Положение аминокислотных остатков в рецепторах: 4.5 А3 Влияние на

: АН КЗ АНК2 Хт\1К\ 7гаНК2 гтНКЗа лиганд. специфи чность4

; ау200 к Аде -

; А1а202 к Хво +

! А1а204 в Хво ! А1а192 А1а331 А1а115 ау166 А1а340 + +

: МеШб к Аде +

: Уа1241 к Хво +

; Уа1248 в Аде : Уа1251 Уа1388 Уа1158 Туг225

1 Туг250 в Аде : Н1Б253 Шз390 Туг160 Ш$227 Н{б399 + +

Ьеи251 В Аде ! Уа1254 11е391 Ъеи161 Уа1228 11е400 + +

' .\Jet256 В Хво ! \Iet259 Ме1396 МеНбб Ьеи233 Ме1405 +

: Аэр262 к Аде +

; Азп265 к косвенно +

; 11е266 В Хво ! \'а1269 Ие406 Не 176 Уа1243 11е415 + +

1 РЬе281 к Аде +

1 Аг£282 в Аде I Рго285 Ьуэ422 Argl92 Ьуэ259 Ьуз431 -

Ьеи283 к Аде + I

' 1.еи284 в Аде I Ие287 Ьеи424 Ьеи194 Ьеи261 Ьеи433 + 1

1 ТЪг286 в Аде/ Н20 ! ТЬг289 8ег426 8ег196 — 5ег435 -

1 Уа1292 в Аде 1 11е295 Уа1432 Уа1202 11е268 Уа1441 + +

: ТЬг294 к Хво +

; Туг318 к Хво +

1 Ьеи319 к Хво +

Йу320 к Хво + 1

[ ау321 в Хво ! С1у324 А1а461 01у231 Иу297 А1а470 + !

1 А1а322 в Аде : Уа1325 Бег462 Бег471 + +

'В - означает вариабельный, К - консервативный, Аде - означает адениновую часть, Хво - хвостовую, 3+ и - означают, что остаток входит или не входит в сферу радиусом 4.5А вокруг молекулы Л, 4+ означает, что данный остаток может теоретически влиять на лигандную специфичность.

В паре 2шНК1/АНК4 наиболее серьезным различием можно считать пропуск на месте С\у229 в последовательности а вызванное этим

изменение конформации аминокислотного каркаса может приводить к описанным различиям профилей лигандной специфичности этих рецепторов (Ломин и др., 2012). Вторая наблюдаемая замена - ТЬг286Бег - выглядит несущественной. Другое различие между рецепторами - это наличие инсерций длиной около 15 а.о. (между позициями 229 и 230 рецептора АНК4) в парах

ортологов AHK2/ZmHK3a и AHK3/ZmHK2 (Yonekura-Sakakibara et al., 2004). В наших моделях эти инсерции выглядят как петли, но не исключено, что они могут формировать структуру типа ß-шпильки. Однако, несмотря на то, что они находятся вблизи лиганд-связывающего сайта, они не влияют на его конформацию и не могут образовывать контактов с гормоном (рис. 5). Профили лигандной специфичности пары рецепторов AHK2/ZmHK3a и рецептора АНК4 очень сходны. При этом состав связывающих сайтов пары AHK2/ZmHK3a отличается от АНК4 четырьмя а.о.: Tyr250His, Leu251Ile, Gly321Ala и Ala322Ser (табл. 3).

Наиболее существенной представляется замена Gly321Ala, т.к. конформационная подвижность основной цепи глицина ограничивается при введении бокового заместителя (метила в случае аланина). Однако и остальные три замены тоже заслуживают внимания, и скорее всего лигандная специфичность определяется суммарным вкладом от нескольких, возможно, даже всех 4-х отличающихся а.о. Ортологи АНКЗ и ZmHK2 менее сходны и петля, закрывающая гормон-связывающий сайт в ZmHK2 (которая содержит Leu284 в АНК4), на один а.о. меньше, чем в других рецепторах. У этой пары ортологов наблюдается самое большое число замен а.о. относительно рецептора АНК4 (6 и 8 замен у АНКЗ и ZmHK2, соответственно) и это единственная пара, члены которой сильно отличаются друг от друга (4 замены) (табл. 3). В рецепторе ZmHK2 имеются две уникальные особенности: а.о. Ala204, Val248 и Met256, которые консервативны в остальных пяти рецепторах, в ZmHK2 заменены на Gly, Туг и Leu соответственно, а в петле, закрывающей гормон-связывающий сайт, отсутствует Thr286 (табл. 3). Из-за этого форма лиганд-связывающей полости в рецепторе ZmHK2 отличается от соответствующих полостей других обсуждаемых в этой части работы рецепторов тем, что часть лиганд-связывающего кармана удлинилась, что предполагает возможность связывания цитокининов, обладающих более объемными заместителями в N6 -позиции.

Таким образом, на основании молекулярного моделирования можно заключить, что различия в лигандной специфичности шести изучаемых рецепторов цитокининов можно отнести к различиям в аминокислотном составе сайтов связывания. В таблице 3 приведены эти различия: ZmHKl отличается от АНК4 одним а.о. (+ отсутствие аналога Gly229), пара ортологов AHK2/ZmHK3a - четырьмя а.о., а ортологи АНКЗ и ZmHK2 имеют по 6 и 8 замен, соответственно. Среди всех 12 вариабельных а.о. были выделены 6 как наиболее вероятные кандидаты на роль детерминант лигандной специфичности рецепторов (табл. 3, правый столбец). Эти предположения были далее проверены в экспериментах по направленному мутагенезу.

Анализ построенных моделей позволил нам объяснить на молекулярном уровне ряд экспериментальных данных, полученных при исследовании цитокининовых рецепторов арабидопсиса и кукурузы. В их числе получили объяснение причины отсутствия пришивки азидопроизводных цитокининов к рецепторам. Молекулярный докинг показал (рис. 6), что азидо-цитокинины

ориентируются в сайте связывания таким образом, что их азидогруппы во 2-м и 8-м положениях аденинового гетероцикла выходят за границы сайта связывания и рядом с ними нет ни одной Х-Н связи, с которой могут взаимодействовать нитрены, образующиеся при УФ-облучении азидов.

Следовательно, для успешного проведения экспериментов по фотоаффинному мечению необходимо синтезировать производные цитокининов с азидогруппой в хвостовой, а не в адениновой части лиганда.

Влияние замен вариабельных аминокислот гормон-связывающего сайта на лигандную специфичность рецептора

На основе молекулярного моделирования мы сделали предположение о том, что лигандная специфичность рецепторов определяется композицией вариабельных а.о. в сайте связывания гормона. Для 6 рецепторов арабидопсиса и кукурузы, составляющих 3 пары ортологов, были определены конкретные а.о. лиганд-связывающего сайта, которые могли быть ответственны за их лигандную специфичность. В дальнейшей работе мы решили провести анализ функции этих а.о. путем замены их в отдельно взятом рецепторе на а.о. представителей других групп ортологов, отличающихся по лиганд-связывающим свойствам от изучаемого белка. Главной задачей этой части работы было изменить профиль лигандной специфичности одного рецептора на профиль другого с помощью сайт-направленного мутагенеза. В качестве исходного рецептора был выбран белок кукурузы 2шНК1, гомолог рецептора АНК4 арабидопсиса, но отличающийся от последнего, в частности, более низким сродством к tZ и более высоким сродством к ВА. Таким образом, по своей лигандной специфичности 7тНК1 оригинален и не похож ни на один из 5-и остальных рецепторов. Мутагенез был направлен на замену вариабельных аминокислот на соответствующие, т.е. находящиеся в том же месте у АНК4 и в парах АНКЗ/7тНК2 или АНК2/7тНКЗа. Для экспрессии полученных генов мутантных рецепторов мы воспользовались ранее разработанной в нашей

Рис. 6. Комплекс рецептора АНК4 с азидопроизводными IV6-бензиламинопурина. Молекула ¡Р показана желтым; молекулы 2- и 8-азидо-А^-бензиламинопуринов -соответственно бежевым и темно-серым.

лаборатории модельной системой на основе растений табака N. ЬешИатгапа. Рецептор нарабатывался в листьях табака в условиях транзиентной экспрессии соответствующего гена под конститутивным 358-промотором в течение пяти суток после агробактериальной трансформации. Далее выделяли мембраны и лиганд-связывающие свойства рецептора изучали в опытах по конкуренции различных немеченых лигандов с меченым гормоном за сайты связывания (специфическое связывание). В общей сложности было получено 33 мутантных рецептора, из них 15 одиночных, 4 двойных, 6 тройных, 3 четверных, 4 пятерных и 1 семирной.

Для того, чтобы превратить рецептор 2тНК1 в пару ортологов АНК2/2тНКЗа, мы получили 17 различных мутантов (табл. 4).

Таблица 4. Мутации, направленные на изменение профиля лигандной специфичности рецептора 7шНК1 на профиль пары ортологов АНК2/2шНКЗа.

Мутации Ад рецептор-цитокинин (нМ):

а сЪ ¡Р ВА ТО Ш

2тНК1 (дикий тип) 5,62 4,97 0,39 0,77 29,6 67,2

гтНК1—>АНК2/гтНКЗа

У160Н (Мб') 5,63 | 15,2 | 0,50 | 1,68 | 12,6 | 103

Я192К(М15) Связывание отсутствует

1Л6ЩМ5) 6,44 19,6 0,97 2,85 17,4 89,6

А2328 (МЗ) 20,7 98,1 2,08 10,0 78,0 675

0231А (М16) Связывание отсутствует

У160Н+Н198Я(М6) 16,8 | 37,1 | 1,36 | 2,62 | 16,8 | 337

0231А+А2328 (М20) Связывание отсутствует

У160Н+Ы611 (М19) 5,97 34,4 0,76 3,75 6,44 67,8

У160Н+Ы611+ А2325 (М21) 3,28 42,6 0,64 7,63 8,68 97,9

1Л61Ж3231А+А2325 (М22) Связывание отсутствует

У160Н+С231А+А232Б (М32) Связывание отсутствует

У160Н+Ы 611+0231А (М23) Связывание отсутствует

У160Н+А162У+С231А+А232Б (М24) Связывание отсутствует

У160Н+1Л611+С231А+А2325 (М27) Связывание отсутствует

Р114У+У160Н+1Л611+С231А+А2328 (М35) Связывание отсутствует

V1460+У160Н+1Л 611+С231А+А232Б (М36) Связывание отсутствует

V1460+У160Н+1Л 611+И163 5+Ы189Б+С231А +А2328 (М48) Связывание отсутствует

На рисунке 7 представлены кривые конкуренции рецепторов 2тНК1 и АНК2 дикого типа и мутантной изоформы М21. Результаты показывают, что тройной мутант М21, содержащий замены Туг160№з+Ьеи161Уа1+ А1а2328ег, существенно отличается по профилю лигандной специфичности от исходного рецептора 2тНК1 и близок по этой характеристике к рецептору АНК2. У полученного мутанта по сравнению с рецептором дикого типа существенно уменьшилось сродство к сЪ и ВА, а к ТБ аффинность слегка увеличилась. И ряд аффинности изменился с iP>BA>tZ=cZ>TI)>DZ у нормального рецептора на íP>tZ>BA>JD>cZ>DZ, что соответствует паре ортологов АНК2/7тНКЗа.

Интересно отметить, что мутация 01у231А1а всегда приводила к блокированию связывания гормона, независимо от дополнительных мутаций (табл. 4).

Рис. 7. Кривые вытеснения различными цитокининами меченого транс-з&глта из комплекса с мутантными рецепторами ZmHKl (изоформы М21 и М46) и рецепторами ZmHKl и АНК2 дикого типа.

Замена профиля лигандной специфичности рецептора ZmHKl на профиль АНК4 представлялась относительно простой задачей, так как эти рецепторы различаются всего одним а.о. в лиганд-связывающем сайте: вместо ожидаемого Glyl40 в рецепторе ZmHKl стоит пропуск (табл. 5). Однако введение глицина после Argl39 в рецепторе ZmHKl (M12b) не привело к какому-либо эффекту. Введение замены Serl96Thr к уже имеющейся (М18) также не повлияло на

лигандную специфичность, как и введение других дополнительных замен (М31).

Поэтому, скорее всего, различия лигандной специфичности рецептора АНК4 и гшНК1 определяются вкладами не столько вариабельными а.о. собственно лиганд-связывающего сайта, сколько соседствующими с ними а.о.

Таблица 5. Мутации, направленные на изменение профиля лигандной специфичности рецептора гтНК1 на профиль лигандной специфичности рецептора АНК4 и пары ортологов АНКЗ/гшНК2.

Мутации Ад рецептор-цитокинин (иМ):

/г сЪ ¡Р ВА ТО г>г

гтНЮ (дикий тип) 5,62 4,97 0,39 0,77 29,6 67,2

гтНК1-*АНК4

N1895 (М26) 0,31 0,26 0,06 0,07 3,75 4.33

вар1400 (М12Ь) 4,55 6,64 0,53 0,81 25,6 69,4

вар 14СЮ + 8196Т (М18) 10,1 13,2 0,86 1,78 81,1 210

вар 14(Ю+У 146Б+Ы189Б (М31) 1,86 2,12 0,14 0,41 14,5 24,3

гтНК1->АНКЗ/гтНК2

Ь161У(М1) 14,5 | 34,1 | 1,48 | 5,70 | 20,5 | 136

У158У (М7) Связывание отсутствует

А232У (М10) 3,88 5,84 0,34 0,43 4,73 56,3

8196Т (М17) 0,94 1,01 0,20 0,31 5,63 14,1

А2321 (М4) 11,7 38,3 1,44 3,33 11,2 503

У2021 (М2) 11,1 8,34 1,31 2,84 41,3 298

ОарМОЭ (М8) 8,63 15,2 0,77 2,42 95,1 177

8ег1960ар (М9) 5,28 10,8 0,36 0,75 29,1 97,3

У160Н+Ь161У+А232У (М28) Связывание отсутствует

У160Н+Ь161У+1176У+А232V (М40) Связывание отсутствует

У160Н+Ы 61У+1176 У+У2021+А232У (МЗ 8) 13,5 297 2,43 49,2 10,4 892

У160Н+Ы 61У+1176У+У2021+А2321 (М46) 24,2 556 4,59 56,2 15,7 872

Пара ортологов АНКЗ и 2тНК2 отличается от других рецепторов: в ней наблюдается самое высокое количество замен относительно АНК4 и это единственная пара, члены которой сильно отличаются друг относительно друга (табл. 3). Из-за таких различий эти рецепторы рассмотрены по отдельности, а не как единая группа. Введение одиночных замен вариабельных а.о. слабо повлияло на профиль лигандной специфичности (табл. 5), поэтому было решено перейти к получению множественных мутантов, как в случае сдвига в направлении АНК2/гтНКЗа (табл. 4). Однако полученный мутантный рецептор гтНК1 (М28, табл. 5), содержащий три аминокислотных замены Туг 1 бОЬПз+Ьси 161 Уа1+А1а232Уа1, был лишен способности связывать меченый й. После введения четвертой мутации Пе176Уа1 (М40) связывание также отсутствовало, но добавление пятой замены Уа120211е (М38) привело к восстановлению способности рецептора связывать меченый гормон. Это показывает, что (негативный) вклад от одних мутаций может быть компенсирован (позитивным) вкладом от других. Полученный мутантный рецептор (М38), содержащий пять замененных а.о. (Туг160Шз+Ьеи161Уа1+

11е176Уа1+Уа120211е+А1а232Уа1), обладал существенно измененным профилем лигандной специфичности. По сравнению с исходным гшНК1 у него уменьшилось примерно на 2 порядка сродство к сЪ, ВА и ¡Р, и на порядок - к ЪХ, а к ТБ аффинность немного увеличилась (табл. 5). При этом профиль лигандной специфичности изоформы М38 больше соответствовал профилю пары АНКг/гшНКЗа, а не АНКЗ/2тНК2, как предполагалось. Второй пятерной мутант (М46, рис. 7), полученный для сдвига профиля лигандной специфичности от 2тНК1 к АНКЗ/2тНК2 и содержащий замены Туг160Ш5+1,еи161Уа1+11е176Уа1+Уа120211е+А1а23211е, показал аналогичные результаты: уменьшенная аффинность к сЪ и В А примерно на 2 порядка и на порядок — к ВХ, несколько увеличенное сродство к ТО, при этом профиль лигандной специфичности изменен и соответствует профилю АНК2/2тНКЗа (табл. 5). По всей видимости, для преобразования лиганд-связывающих характеристик рецептора гшНК1 в направлении АНКЗ или 2тНК2 следует вводить дополнительные аминокислотные замены из числа оставшихся вариабельных а.о. (табл. 3).

Основываясь на данных, полученных в экспериментах по сайт-направленному мутагенезу, можно заключить, что одиночные и двойные мутации вариабельных аминокислот сайта связывания гормона могут приводить к заметным изменениям в аффинности отдельных лигандов, но, как правило, не приводят к изменению профиля лигандной специфичности.

Наибольший интерес вызвали три мутантных рецептора, содержащие три (М21) и пять (М38, М46) замен а.о., они обладали профилем лигандной специфичности, сильно приближенным к профилю пары АНК2/2тНКЗа. С учетом того, что введение одиночных замен (11е176Уа1 и Уа1202Пе) не влияло на лигандную специфичность, можно сделать вывод, что определяющие а.о. для перемены профиля лигандной специфичности от рецептора 2тНК1 к паре АНК2/2шНКЗа находятся в 2тНК1на позициях 160,161 и 232.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Рецепторы являются ключевыми белками, определяющими чувствительность клетки к гормонам, поэтому установление структурно-функциональных характеристик рецепторов имеет первостепенное значение в исследовании гормонального сигналинга. В работе были использованы различные подходы для изучения особенностей строения сенсорных модулей рецепторов цитокининов. Наибольший успех принесли методы биоинформатики, которые позволили выявить ряд новых черт строения этих модулей. На основе анализа последовательностей более 100 рецепторов цитокининов разных видов растений предложена общая схема строения сенсорного модуля с прилегающими трансмембранными спиралями. Обнаружены новые консенсусные мотивы, которые могут иметь важное значение для функционирования рецепторов. В частности, установлена высокая консервативность стержневой а-спирали на Ы-конце сенсорного модуля, которая участвует как в процессе димеризации модулей, так и, видимо, в

передаче сигнала от сенсорного к каталитическому модулю рецептора. Другие выявленные консервативные мотивы на С-конце модуля, по всей видимости, также необходимы для внутрибелковой трансдукции цитокининового сигнала. Важной функциональной характеристикой рецепторов является их лигандная специфичность, выражающаяся в высоком сродстве к определенным природным лигандам, которые благодаря этому выполняют функцию гормонов. Различные изоформы рецепторов цитокининов даже одного растения различаются по лигандной специфичности, что, очевидно, имеет определенный биологический смысл. Мы попытались идентифицировать структурные детерминанты лигандной специфичности на примере цитокининовых рецепторов арабидопсиса и кукурузы. Предварительно был экспрессирован и охарактеризован полноразмерный рецептор АНК2, что позволило завершить исследование лигандной специфичности полного набора рецепторов цитокининов арабидопсиса. На первом этапе исследования было проведено моделирование пространственной структуры пяти рецепторов цитокининов арабидопсиса и кукурузы, с использованием известной структуры рецептора АНК4 как шаблона. В сочетании с биоинформатическими данными это дало возможность определить в лиганд-связывающих сайтах рецепторов 12 вариабельных а.о. - потенциальных детерминант лигандной специфичности. Среди этих 12 а.о. были отобраны 6 наиболее вероятных кандидатов, роль которых была исследована экспериментально. Для этого в рецепторе гшНК1 проводили точечные замены вариабельных а.о. на а.о. других рецепторов, отличающихся по лиганд-связывающим свойствам. Всего с помощью направленного мутагенеза было получено 33 новые изоформы рецептора, из них 15 одиночных мутантов, 4 двойных, 6 тройных, 3 четверных, 4 пятерных и 1 семерной. У многих мутантных изоформ изменилось сродство к отдельным цитокининам, а у одного тройного и двух пятерных мутантов удалось впервые существенно изменить профиль лигандной специфичности, приблизив его к профилю рецепторов АНК2/гшНКЗ. Таким образом, была экспериментально подтверждена важная роль отобранных путем моделирования вариабельных а.о. (№№ 160, 161 и 232 белка 2шНК1) в придании рецептору необходимых свойств лигандной специфичности. Работа показала, что профиль лигандной специфичности является стабильной характеристикой рецепторов цитокининов, он сохраняется у ортологов из эволюционно далеких видов и устойчив к большинству одиночных замен вариабельных а.о. лиганд-связывающего сайта. А для перемены профиля лигандной специфичности рецептора цитокининов необходимы множественные замены определенных вариабельных а.о. в связывающем сайте одного рецептора на соответствующие а.о. другого.

выводы

1) Разработан новый метод синтеза 8-азидо-Л'6-бензиламинопурина, физиологически активного цитокинина. Выяснена вероятная причина отсутствия пришивки 2- и 8-азидопроизводных цитокининов к лиганд-связывающему сайту цитокининового рецептора.

2) Методом модификации отдельных аминокислот установлено, что остаток аспартата, в отличие от остатков аргинина, цистеина и лизина, играет важную роль в связывании цитокининов рецептором.

3) Впервые охарактеризована лигандная специфичность полноразмерного цитокининового рецептора АНК2 из арабидопсиса.

4) С помощью сравнения первичных структур сенсорных модулей более 100 рецепторов цитокининов разных видов растений обнаружены новые консервативные структурные мотивы. Наиболее консервативной частью сенсорного модуля рецептора оказалась стержневая а-спираль, примыкающая к Ы-концу СНАБЕ-домена.

5) Построены пространственные модели сенсорного модуля пяти рецепторов цитокининов арабидопсиса и кукурузы (АНК2, АНКЗ, 2шНК1, гтНК2 и 7тНКЗа) на основе структуры рецептора АНК4 как шаблона. Пептидный остов домена рецептора, формирующий сайт связывания цитокинина, оказался сходен у всех шести изученных рецепторов.

6) С помощью анализа структур лиганд-связывающих сайтов цитокининовых рецепторов арабидопсиса и кукурузы идентифицированы вариабельные аминокислоты, которые могут играть определяющую роль в лигандной специфичности изучаемых рецепторов.

7) С помощью направленного мутагенеза получены новые изоформы рецептора гтНК1 с одиночными или множественными заменами аминокислот. Среди них тройные (У160Н+Ь161У+А2328) или пятерные (У 160Н+Ь161У+1176 У+У2021+А232V; У160Н+Ы61У+Н76У+У2021+А2321) мутанты обладали профилем лигандной специфичности, приближенным к профилю рецепторов АНК2/гшНКЗ.

8) На основе анализа свойств мутантных рецепторов установлено, что аминокислотные остатки, важные для сдвига профиля лигандной специфичности рецептора гшНК1 к профилю пары АНК2/гшНКЗ, находятся в сенсорном модуле на позициях 160,161 и 232.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1) Steklov M.Yu., Tararov V.I., Romanov G.A., Mikhailov S.N. Facile synthesis of 8-azido-6-benzylaminopurine. Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, 2011, V. 30, N7-8, p. 503-511.

2) Ломин C.H., Кривошеев Д.М., Стеклов М.Ю.. Осолодкин Д.И., Романов Г.А. Свойства рецепторов и особенности сигналинга цитокининов. Acta Naturae, 2012, Т. 4, №3(14), с. 34-48.

3) Steklov M.Yu., Lomin S.N., Osolodkin D. I., Romanov G.A. Structural basis for cytokinin receptor signaling: an evolutionary approach. Plant Cell Reports, 2013, DOI 10.1007/s00299-013-1408-3. Published online 23 March 2013.

4) Стеклов М.Ю., Ломин C.H., Осолодкин Д.И., Романов Г.А. Новые структурные мотивы лиганд-связывающего модуля рецепторов цитокининов. Материалы Международной конференции "Рецепторы и внутриклеточная сигнализация", г. Пущино, 27-30 мая 2013 (принято в печать).

5) Кривошеев Д.М., Стеклов М.Ю.. Ломин СН., Романов Г.А. Исследование лиганд-связывающих свойств индивидуальных цитокининовых рецепторов арабидопсиса и кукурузы, локализованных в растительных мембранах. Материалы Международной конференции "Рецепторы и внутриклеточная сигнализация", г. Пущино, 27-30 мая 2013 (принято в печать).

Тезисы

6) Романов Г.А., Ломин С.Н., Кривошеев Д.М., Стеклов М.Ю.. Гетман И.А., Болякина Ю.П. Аппарат рецепции цитокининов арабидопсиса: основные свойства и следствия. Тезисы 3-го Международного симпозиума "Клеточная сигнализация у растений", Казань, 28 июня -1 июля 2011, с. 154-155.

7) Стеклов М.Ю., Тараров В.И., Романов Г.А., Михайлов С.Н. Упрощенный синтез реакционно-способного производного цитокинина - 8-азидо-Л'6-бензиладенина. Тезисы 7-ой Международной конференции «Рост, развитие и продуктивность растений», Минск, Беларусь, 26-28 октября 2011, с. 193.

8) Стеклов М.Ю., Тараров В.И., Романов Г.А., Михайлов С.Н. Синтез азидопроизводных аденина, как потенциальных реагентов для фотоафинной модификации. Материалы Международной конференции "Биология - наука XXI века", Москва, 24 мая 2012, с. 896-897.

9) Steklov M.Yu., Osolodkin D.I., Krivosheev D.M., Lomin S.N., Mikhailov S.N., Palyulin V.A., Zefirov N.S., Romanov G.A. Explanation of the ligand-binding preferences of six different cytokinin receptors from arabidopsis and maize based on

structural peculiarities of their CHASE domains. Abstracts 3 International Symposium "Intracellular Signaling and Bioactive Molecules Design", Lviv, Ukraine, 17-23 September, 2012, p. 54.

10) Ломин C.H., Стеклов М.Ю.. Кривошеев Д.М., Осолодкин Д.И., Романов Г.А. Использование направленного точечного мутагенеза для выявления аминокислот, обуславливающих лигандную специфичность рецепторов цитокининов. IV Всероссийский симпозиум «Трансгенные растения: технологии создания, биологические свойства, применение, биобезопасность», Москва, ИФР РАН, 19-23 ноября 2012, с. 68.

11) Steklov M.Yu., Lomin S.N., Osolodkin D.I., Romanov G.A. "Computational prediction of amino acid residues essential for ligand-binding selectivity of cytokinin receptors". Moscow Conference on Computational Molecular Biology (MCCMB'13) Moscow, Russia, July 25-28,2013 (accepted).

12) Steklov M.Yu., Lomin S.N., Osolodkin D.I., Romanov G.A. "New structural motifs in the ligand-binding module of cytokinin receptors". Moscow Conference on Computational Molecular Biology (MCCMB'13) Moscow, Russia, July 25-28, 2013 (accepted).

Подписано в печать: 16.05.2013

Заказ № 8490 Тираж -150 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Стеклов, Михаил Юрьевич, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук

на правах рукописи

04201357661

Стеклов Михаил Юрьевич

Исследование структурных основ лнгандной специфичности рецепторов цитокининов

03.01.05-физиология и биохимия растений

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Г.А. Романов

Научный консультант: доктор химических наук, профессор С.Н. Михайлов

Москва - 2013

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ.......................................................................5

ПРЕДИСЛОВИЕ...............................................................................................................7

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...................................................................................................10

1. Методы изучения активного сайта рецептора...................................................................10

1.1. Фотоаффшшая модификация.....................................................................................10

1.2. Химическая модификация боковых групп аминокислот...........................................14

2. История открытия и особенности строения агонистов и антагонистов рецепторов цитокининов.............................................................................................................................20

3. Идентификация индивидуальных рецепторов цитокининов...........................................24

4. Доменный состав рецепторов цитокининов......................................................................27

5. Система передачи цитокининового сигнала и участвующие в ней белки.....................29

6. Локализация рецепторов цитокининов..............................................................................38

7. Особенности лигандной специфичности рецепторов цитокининов...............................40

8. История изучения и особенности третичной структуры рецептора АНК4....................43

9. Точечные мутации в рецепторах цитокининов и их влияние на передачу сигнала......48

10. Молекулярные аспекты действия цитокининов.............................................................52

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ...........................................................................................59

1. Реактивы и материалы.........................................................................................................59

1.2 Синтез азидопроизводных цитокининов.........................................................................59

1.3 Фотоаффинная модификация рецепторов цитокининов................................................63

1.4 Модификация отдельных амвинокислот в рецепторах цитокининов...........................64

2. Модельные системы.............................................................................................................64

2. 1 Модельные системы на основе Е. coli.............................................................................64

2.2 Модельные системы на основе трансгенного арабидопсиса.........................................65

2.3 Модельная система на основе амаранта..........................................................................67

3. Сайт-специфичный мутагенез методом ПЦР....................................................................67

4. Получение химически-компетентных клеток Е. coli........................................................71

5. Химическая трансформация Е. coli....................................................................................71

6. Выделение плазмид из Е. coli.............................................................................................72

7. Рестрикция............................................................................................................................73

8. Получение химически компетентных клеток....................................................................73

Agrobacterium tumefaciens GV3101.........................................................................................73

9. Трансформация химически компетентных........................................................................73

2

Agrobacterium tumefaciens GV3101.........................................................................................73

10. Трансформация растений Nicotiana benthamiana............................................................74

11. Получение сферопластов...................................................................................................75

12. Выделение мембран из Е. coli...........................................................................................76

12.2 Выделение мембран растительных клеток....................................................................77

13. Радиолигандный метод анализа связывания цитокининов с рецепторами в составе бактерий и сферопластов.........................................................................................................77

14. Радиолигандный метод анализа связывания цитокининов с рецепторами в составе растительных или бактериальных мембран.........................................................................78

15. Анализ активности ß-глюкуронидазы (GUS) в...............................................................78

проростках PARR5:GUS арабидопсиса..................................................................................78

16. Биотест на цитокининовую активность с проростками амаранта (амарантовый биотест).....................................................................................................................................80

17. Компьютерное моделирование сайта связывания цитокининов...................................80

18. Математические и статистические методы анализа.......................................................80

19. Биоинформатический анализ последовательностей белка............................................81

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ................................................................................82

Синтез азидопроизводных цитокининов и фотоаффинная модификация рецепторов цитокининов.........................................................................................................................82

Модификация отдельных аминокислот............................................................................90

Биоинформатический анализ сенсорного модуля рецепторов цитокининов.....................92

Экспрессия полноразмерного рецептора АНК2 и исследование его лигандной специфичности.......................................................................................................................100

Молекулярное моделирование сенсорных модулей рецепторов цитокининов из арабидопсиса и кукурузы: структурное обоснование лигандной специфичности..........103

Молекулярные модели гомологов CHASE домена АНК4................................................103

Обоснование лигандной специфичности шести цитокининовыхрецепторов из арабидопсиса и кукурузы, основанное на молекулярном докинге различных цитокининов.......................................................................................................................111

Влияние N9-pit6o3wiupoeanuH цитокининов на их связывание с рецептором..............113

Докинг азидопроизводных цитокининов: 2-азидо-б-бензшюминопурина и 8-азидо-б-бензиламинопурина............................................................................................................114

Общее заключение..............................................................................................................116

Направленный мутагенез лиганд-связывающего сайта рецептора ZmHKl.....................116

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.............................................................................................................127

ВЫВОДЫ.......................................................................................................................129

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ................................................................131

БЛАГОДАРНОСТИ......................................................................................................150

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АБК - абсцизовая кислота

АДФ - аденозиндифосфат

АМФ - аденозинмонофосфат

АТФ - аденозинтрифосфат

а.о. - амиокислотный остаток

ДМФ- диметилформамид

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДТТ - дитиотрейтол

мРНК - матричная РНК

ПЦР - полимеразная цепная реакция

реагент Траута (Traut's reagent) - 2-иминотиолан

РНК - рибонуклеиновая кислота

тРНК - транспортная РНК

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭР (ЭПР) - эндоплазматический ретикулум

АсОН- уксусная кислота

AcONa- Ацетат натрия

Ade - аденин

ВА - А^-бензиламинопурин

CHASE - Cyclase/Histidine kinase-Associated SEnsing Extracellular DMAPP - диметилаллилпирофосфат DMSO - диметилсульфоксид

DPM (disintegrations decays per minute) - число распадов в минуту DZ - дигидрозеатин Е. coli - Escherichia coli

l-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC or EDAC)

FAD - флавинадениндинуклеотид

GFP - зелёный флюоресцирующий белок

GUS - /?-глюкуронидаза

HMBDP - 1-гидрокси-2-метил-2-(Е)-бутенил-дифосфат

p-Hydroxyphenylglyoxal (HPG) - парагидроксифенилглиоксаль

iP - изопентениладенин

iPR - М6-(Д2-изопентенил)аденинрибозид

IPTG — изопропилтиогалактозид

Kin - кинетин

KinR - кинетинрибозид

LC-MS- ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

(N-B-Maleimidopropionic acid) BMPA - N-малеимидопропионовая

4-MUG - 4-метилумбеллиферон глюкуронид

NADPH - никотинамидадениндинуклеотидфосфат

N-Ethylmaleimide (NEM) - N-этилмалеиимид

NS - неспецифическое связывание

PMSF - фенилметансульфонилфторид

PVP - поливинилпирролидон

SB - специфическое связывание

SDS (sodium dodecyl sulfate) - додецилсульфат натрия

Sulfo-NHS-Acetate - сульфосукцинимидил ацетат

ТВ - тотальное связывание

TD - тидиазурон

tZ* - тра«с-[2-3Н]зеатин

tZR - т/?анс-зеатинрибозид

WT - дикий тип

ТСХ - Тонкослойная хроматография

ПРЕДИСЛОВИЕ

Рост, развитие и защитные реакции растений находятся под постоянным контролем фитогормонов, что обусловливает важность исследований молекулярных основ действия этих эндогенных регуляторов. Среди известных фитогормонов цитокинины занимают особое место, так как обладают широким спектром действия и регулируют такие важнейшие процессы, как деление, рост и жизнеспособность клеток. Цитокинины активно используются в современных биотехнологиях, с хорошими перспективами применения в агропроизводстве. Открытие рецепторов цитокининов в 2001 г. (Inoue et al., 2001; Suzuki et al., 2001) дало мощный импульс исследованиям молекулярных механизмов действия данных фитогормонов. Было установлено, что рецепторы цитокининов являются трансмембранными сенсорными гистидинкиназами и передают гормональный сигнал в клеточное ядро посредством так называемой двухкомпонентной системы. Благодаря рецепторам были раскрыты механизмы, с помощью которых данные фитогормоны участвуют в регуляции роста и развития растения, адаптации к различным неблагоприятным внешним воздействиям, взаимодействии с другими сигнальными процессами и т.д. Все последующие годы проводилось интенсивное изучение сигналинга цитокининов на молекулярном уровне, при этом большое внимаиие было уделено собственно рецепторам цитокининов. Во всех расшифрованных растительных геномах, а их известно уже более 30, были идентифицированы рецепторы цитокининов (Ломин и др., 2012). Однако пока наиболее детально исследованы рецепторы арабидопсиса, которых оказалось три: АНК 2, 3 и 4. Следует отметить, что все цитокининовые рецепторы филогенетически образуют 3 группы ортологов, и практически все рецепторы разных видов являются ортологами того или иного рецептора арабидопсиса. В участке рецептора, расположенном между трансмембранными спиралями, был идентицифирован так называемый CIIASE-домен, которому сразу приписали функцию связывания лиганда (Anantharaman & Aravind, 2001; Mougel & Zhulin, 2001), а весь участок получил название сенсорного модуля. Вскоре в составе CHASE-домена рецептора был обнаружен широко распространенный PAS-

субдомен, который, как было постулировано, и связывал цитокинины (Pas et al., 2004). Экспериментальное подтверждение того, что именно сенсорный модуль рецептора связывает цитокинины, появилось в 2007 году (Ileyl et al., 2007), после разработки простого и количественного метода тестирования связывания гормона рецептором (Romanov et al., 2005). Этот же метод позволил охарактеризовать лиганд-связывающую способность цитокининовых рецепторов арабидопсиса и выявить существенные различия между ними (Romanov et al., 2006). Была предложена гипотетическая схема цитокининовой сигнализации между корнем и побегом, объясняющая возможную физиологическую роль различий лигандной специфичности рецепторов (Romanov et al., 2006; Романов, 2009). Важное значение для сигналинга гормона имеет субклеточная локализация рецепторов. Разноплановые эксперименты показали, что основная масса рецепторов цитокипинов находится внутри клетки, в составе эндоплазматического ретикулума (Lomin et al., 2011; Wulfetange et al., 2011; Caesar et al., 2011). Эти данные позволяют предполагать особую роль внутриклеточных цитокининов в сигналинге этих фитогормонов. Большие усилия были предприняты для изучения пространственной структуры цитокининовых рецепторов. Наконец, в конце 2011 года была опубликована статья (Hothorn et al., 2011), был идеитифицирован CIIASE-домен у N-конца рецепторов цитокипинов, включающий PAS-субдомен, в составе которого находится сайт связывания цитокининов. Но остается еще много вопросов, ответы на которые пока не найдены. Например, все еще неясны особенности строения цитокинин-связывающих сайтов рецепторов, ответственные за различия в их лигандной специфичности, а также биологическая роль этих различий. Неизвестны закономерности структуры сенсорного модуля, конкретная функциональная роль и способы взаимодействия составляющих его доменов, характер конформационных изменений рецептора, которые происходят при связывании цитокининов и, наоборот, не происходят при связывании рецепторных антагонистов.

Между тем взаимодействие гормонов с рецептором является ключевым процессом сигналинга гормона и включает всю последующую цепь событий, приводящую к ответной реакции клетки на гормон. Поэтому поиск ответов на

вышеуказанные вопросы является важной и актуальной научной задачей и может помочь прояснить на молекулярном уровне механизм действия цитокининов и особенности их взаимодействия с рецепторами.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являются изучение особенностей строения сенсорных модулей рецепторов цитокининов и идентификация структурных детерминант, определяющих лигандную специфичность этих модулей на примере рецепторов арабидопсиса и кукурузы. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1) охарактеризовать аминокислотный состав лиганд-связывающих сайтов рецепторов цитокининов методами фотоаффинной и химической модификации отдельных аминокислотных остатков;

2) с помощью биоинформатических подходов изучить особенности строения сенсорного модуля рецепторов цитокининов и выделить консервативные участки, потенциально важные для функционирования рецептора;

3) экспрессировать полноразмерный рецептор АНК2 и провести анализ его лиганд-связывающих свойств;

4) с помощью компьютерного моделирования сенсорных модулей цитокининовых рецепторов арабидопсиса и кукурузы определить аминокислотные остатки, потенциально важные для лигандной специфичности рецепторов;

5) провести направленный мутагенез рецептора ZmHKl и экспериментально оценить роль конкретных аминокислотных остатков в детерминации лигандной специфичности изучаемых рецепторов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Методы изучения активного сайта рецептора

1.1. Фотоаффинная модификация

Фотоаффинное мечение в комбинации с современными масс-спектрометрическими исследованиями могут предоставить достаточно большое количество информации о взаимодействии лиганда с белком. Точные измерения молекулярного веса комплекса лиганд-рецептор могут предоставить информацию о количестве лигандов одновременно связывающихся с одной молекулой белка (Lafittel et al., 1997). Также, используя данный метод, можно определить взаимодействующие с лигандом аминокислотные остатки рецептора, а в некоторых случаях даже полный состав лиганд-связывающего сайта. Такие данные могут быть использованы для создания 3-х мерных моделей активного сайта изучаемого рецептора, которые в свою очередь, дают возможность лучше понять природу взаимодействия лиганд-рецептор и соответственно механизм активации рецептора. Также это дает возможность сгенерировать новые лиганды, обладающие большей аффинностью или другими интересующими исследователя свойствами (например антагонизмом, то есть ослаблением или полным отсутствием физиологического эффекта, несмотря на формирование комплекса лиганд-рецептор).

Фотоаффинное мечение рецепторов как метод был разработан и описан более пятидесяти лет назад (Sing et al., 1962) и основные его принципы с тех пор не изменились. При фотоаффинной модификации лиганд, обладающий УФ-активируемой группой, инкубируется для формирования комплекса лиганд-рецептор, в котором лиганд специфично и нековалентно связан с активным сайтом рецептора. Некоторые лиганды, как, например, олигонуклеотиды, уже сами по себе содержат фотоактивируемые группы, но чаще они вводятся направленно во время синтеза лиганда. Существуют три основных вида фотоактивируемых групп - это азидогруппы, бензофеноновые группы и диазирины. Облучение УФ светом активирует эти группы в лиганде и образуются высоко реакционноспособные интермедиаты (обычно это карбены или нитрены), ковалентно связывающиеся с рецептором в его активном сайте. Ковалентная связь между лигандом и

рецептором сильно упрощает исследование этого комплекса, так как становится возможным использовать электрофорез (808-РА0Е) и ВЭЖХ, а затем масс-спектрометрию, что невозможно при наличии только нековалентного взаимодействия (Рис. 1).

УФ облучение

ВЭЖХ Масс-спектрометрия

á^M • белок: - лиганл с азидогруппой:

Рис. 1. Классическая схема эксперимента по фотоаффинному мечению с последующим масс-спектрометрическим исследованием.

Наиболее важным этапом планирования эксперимента по фотоаффинному мечению является дизайн фотоактивируемой группы. В большинстве подобных опытов используются производные лигандов изучаемых рецепторов. Необходимая УФ-активируемая группа обычно синтетически вводится в лиганд, но бывают случаи, когда содержатся внутренние группировки (сульфиды, еноны, диеноны и различные галогенпроизводные) (Fleming, 1995). Выбор лиганда должен быть хорошо продуман и удовлетворять нескольким критериям, так как это напрямую влияет на формирование комплекса лиганд-рецептор (Brunner, 1993; Dormán &