Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности регуляции цитокининами экспрессии генов первичного ответа

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Особенности регуляции цитокининами экспрессии генов первичного ответа"

На правах рукописи

Ракова Наталья Юрьевна

ОСОБЕННОСТИ РЕГУЛЯЦИИ ЦИТОКИНИНАМИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ПЕРВИЧНОГО ОТВЕТА

03.00.12-физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2005

Работа выполнена в лаборатории роста и развития им. академика М.Х. Чайлахяна Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук

Романов Георгий Александрович

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук кандидат биологических наук

Клячко Нелла Леопольдовна Тараканов Иван Германович

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, г. Москва

Защита состоится «22» марта 2005 г в 11м часов на заседании диссертационного совета К 002.210.01 при Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН по адресу: 127276, Москва, ул. Ботаническая, 35. Факс:(095)977-80-18

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН.

Автореферат разослан «22» февраля 2005 г

Ученый секретарв диссертационного совета,

кандидат биологических наук

Актуальность проблемы. Анализ механизмов рецепции и трансдукции гормональных сигналов является важным и актуальным аспектом исследований гормональной регуляции высших организмов, в том числе растений. Одними из основных фитогормонов являются цитокинины, регуляторы метаболизма и деления клеток, а также роста, морфогенеза и старения растения. Для этого класса фитогормонов недавно обнаружены мембранные рецепторы, гены первичного ответа и основные элементы сигнальной трансдукции (Kakimoto, 2003). Однако молекулярные механизмы действия цитокининов еще во многом не изучены и продолжают активно исследоваться.

Остаются неясными, в частности, пути взаимодействия сигнала цитокининов с другими известными сигнальными системами. В последнее время в литературе появились сведения о влиянии ряда веществ (микро- и макромолекул) на эффекты, вызываемые фитогормонами (в том числе цитокининами) и о возможном участии этих веществ в трансдукции гормональных сигналов. Для цитокининов такими веществами могут являться фосфолипаза Д (ФлД) и образуемые ей фосфатидные кислоты (Romanov et al., 2002), полиамины (Ferny А. et al., 1992) и малые сигнальные молекулы, содержащие кислород, в частности, NO (Scherer & Hoik, 2000; Tun et al., 2001). При этом остаются не выясненными вопросы, на каком биохимическом уровне реализуется их взаимодействие с цитокининами и каким способом эти вещества влияют на молекулярный механизм действия данных фитогормонов.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось исследование неизученных аспектов молекулярного механизма действия цитокининов и взаимодействия этих фитогормонов с другими сигнальными системами, с привлечением новых трансгенных моделей.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи: - подбор и освоение модельных систем, позволяющих количественно оценивать эффект цитокининов на экспрессию индивидуальных генов первичного ответа;

- сравнение действия разных форм цитокининов, включая стереоизомеры зеатина, на отработанных модельных системах;

- оценка возможности участия фосфолипазы Д и окиси азота N0 в процессе трансдукции цитокининового сигнала;

- изучение влияния различных полиаминов на ранние эффекты цитокининов и раскрытие молекулярных основ этого влияния.

Научная новизна работы. Полученные данные позволили прояснить вопросы взаимодействия цитокининовой регуляторной системы с другими регуляторными системами (с участием N0, фосфолипазы Д) и молекулами (полиамины) у растений. В частности, подтверждена возможность участия фосфолипаз Д, за исключением семейства ФлД типа а, в трансдукции цитокининового сигнала. Установлено отсутствие у окиси азота N0 роли сигнального посредника действия цитокинина. Показано посттранскрипционное ингибирующее действие полиаминов на цитокинин-зависимую индукцию генной экспрессии. Установлены количественные характеристики способности широкого спектра веществ цитокининового ряда индуцировать экспрессию генов первичного ответа. Обнаружены различия лигандной специфичности у близких по структуре рецепторов цитокининов АНКЗ и AHK4/CRE1. Подтверждено наличие собственного цитокининового действия у цис-зеатина и синтетических цитокининов -производных фенилмочевины (тидиазурона).

Практическое значение работы. Полученные результаты имеют как чисто фундаментальный характер, так и возможность практического применения. Данные фундаментального характера о молекулярном механизме действия цитокининов могут быть использованы для подготовки лекционного материала при чтении курса физиологии и биохимии растений в высших учебных учреждениях, а также послужить базой для дальнейших исследований в данном направлении. Адаптированные модельные системы на основе трансгенного арабидопсиса и трансформированной E.coli могут быть с успехом использованы для анализа действия широкого спектра веществ на трансдукцию цитокининового сигнала на молекулярном уровне, а также для скрининга новых соединений с цитокининовой или

антицитокининовой активностью. Использованная в работе модельная система на основе трансформированной E.coli является готовым инструментом для изучения особенностей функционирования и свойств отдельных цитокининовых рецепторов.

Апробация работы. Основные положения работы доложены на NATO-Russia Workshop «Phytohormones in Plant Biotechnology and Agriculture» (Москва, 2002), Международном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пущино-на-Оке, 2003), 7-ой конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино-на-Оке, 2003), V Съезде Общества физиологов растений России (Пенза, 2003), рабочих совещаниях INTAS по теме «Role of Phospholipases in the Mechanism of Cytokinin Action» (Санкт-Петербург, 2003; Киев, 2004), Международном симпозиуме «Cell Biology of Nitric Oxide and Cell Death in Plants» (Ялта, 2004).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ (одна в печати), включая 6 статей в отечественных и зарубежных изданиях.

Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения и пяти глав: обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждений, а также заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Материалы диссертации изложены на 142 страницах машинописного текста, содержат 2 таблицы и 30 рисунков. Библиография состоит из 203 источников, из которых зарубежной литературы-165.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Особенности экспериментальныхмоделей

Дня изучения особенностей трансдукции цитокининового сигнала были выбраны две растительные модельные системы: на основе амаранта и трансгенного арабидопсиса, - и одна бактериальная, на основе трансформированной E.coli. Эти системы дают четкую и однозначную

реакцию на воздействие цитокининов и основаны на индукции экспрессии цитокинин-зависимых генов.

Модельная система на основе амаранта. Этиолированные проростки амаранта при воздействии цитокининов накапливают в своих семядолях пигмент амарантин (бетацианин). Эта реакция основана основана на быстрой индукции транскрипции цитокинин-зависимых генов (генов первичного ответа) (Романов и др., 1999; Romanov et al., 2000) и относится к ранним эффектам цитокининов, проявляющимся через считанные часы после воздействия фитогормона. Данная система удобна не только тем, что результаты действия исследуемых веществ могут быть оценены визуально, но и тем, что позволяет проводить кинетико-ингибиторный анализ. Уровень накопления амарантина зависит от промежутка времени между введением в систему цитокинина и ингибитора. Время инкубации проростков с гормоном составляет 8 часов. По полученным кинетическим кривым можно определить этап, на котором действует данный ингибитор.

Модельная система на основе трансгенного арабидопсиса. Проростки амаранта являются одним из лучших биотестов, однако на нем пока нет возможности следить за экспрессией индивидуальных цитокинин-зависимых генов. Поэтому в данной работе были использованы также проростки трансгенного арабидопсиса V/ggs'.'.GUS (репортерный ген GUS под контролем цитокинин-специфичного промотора гена ARR5). Эти проростки реагируют на цитокинин активацией экспрессии репортерного гена, что позволяет количественно следить за индукцией экспрессии генов первичного ответа на цитокинин (D'Agostino et al., 2000; Romanov et al., 2002). Время инкубации проростков с гормоном составляет 5 часов.

Помимо удобства работы с репортерным ферментом тест-система трансгенного арабидопсиса позволяет оценивать эффект цитокининов и на уровне транскрипции индивидуальных генов первичного ответа, таких, как GUS или ARR5. Время тестирования в этом случае сокращается до 30-40 минут.

Модельная система на основе трансгенной E.coli. Для выявления взаимодействия рецепторов цитокининов с веществами, обладающими

цитокининовой активностью, требовалась модель, содержащая не всю группу рецепторов, а отдельный тип цитокининового рецептора. Такой моделью послужили бактерии Е. coli, штамм KMI001, трансформированные плазмидами pINAEH-AHK4 или pSTV28-AHK3, экспрессирующими гены рецепторов цитокининов арабидопсиса AHK4/CRE1 или АНКЗ, соответственно. У данного штамма Е. coli рецепторы цитокининов замещают близкую по структуре сенсорную гистидин-киназу бактерии RcsC, инактивированную мутацией. Бактериальная хромосома трансформирована также репортерным геном lacZ (кодирующим ß-галактозидазу) под промотором cps, восприимчивым к сигналу от RcsC (Yamada et al., 2001). Таким образом, в данной системе lad становится геном первичного ответа на цитокинины. Время инкубации с гормоном составляет 6 часов (для АНК4-бактерий) или 14 часов (для АНКЗ-бактерий).

Активность репортерных ферментов GUS и lacZ определяли флуоресцентным методом (Зверева, Романов, 2000; Spichal et al., 2004).

Относительное содержание транскриптов генов GUS и ARR5 определяли с помощью Northern-блотинга (Sambrook et al., 1999).

РЕЗУЛЬТАТЫ

/. Анализ способностиразличных цитокининов вызывать экспрессию генов первичного ответа

Вещества, обладающие цитокининовой активностью, представлены производными аденина с заместителями в ^-положении и производными фенилмочевины. Определение гормональной активности цитокининов с помощью рутинных биотестов, как правило, длительно (несколько дней или недель), недостаточно избирательно и не дает возможности дифференцировать первичные (специфичные к данным цитокининам) и вторичные (часто неспецифичные) эффекты.

С помощью измерения GUS-активности у трансгенного арабидопсиса мы определили способность 24 природных и синтетических соединений индуцировать экспрессию гена первичного ответа на цитокинины (таблица).

Таблица. Сравнительная способность цитокининов индуцировать активность GUS у проростков трансгенного арабидопсиса

Вещество Относительная активность

транс-зеягт 100.0

т/итс-зеатинрибозид' 47.9±8.9

транс- зеатинрибозид 5'-монофосфат 100.Ü2.0

транс-зеатин О-глюкозид 92.0±8.1

транс-зеатин О-глюкозид рибозид 84.1±0.6

транс-жхтн Ш-глюкозид 10.6Ü.8

транс-зеатан Ы9-глкжозид 14.1±2.0

транс-зеатин О-ацетил 100.5±4.4

^ис-зеатин 40.5±3.6

дигидрозеатин 11.8±1.3

дигидрозеатин рибозид 12.5±0.5

Ы6-(А2-изопентенил)аденин 108.2±11.2

1Чб-(Д2-изопентенил)аденозин 77.3±8.1

кинетин 94.0±19.6

кинетин рибозид 61.7±0.2

1^-бензиладенин 93.6±10.7

Ы6-бензиладенозин 47.7±8.2

орто-тополин 52.8±1.9

ордео-тополин рибозид 31.Ü1.3

л<ета-тополин I23.4Ü3.8

ле/иа-тополин рибозид 83.5±4,7

Л^'-дифенилмочевина 0.0±1.34

тидиазурон 131.7±7.6

аденин 1.6±0.9

* Приведены данные для концентрации веществ 0,5 мкМ

Наиболее высокой гормональной активностью обладали транс-зеатин, транс-зеатинрибозид 5'-монофосфат, транс-зеатин 0-ацетил, мета-тополин, изопентениладенин и тидиазурон. Рибозиды цитокининов действовали слабее по сравнению со свободными основаниями. Слабой активностью обладали N7- и №-глюкозиды зеатина, а также дигидрозеатин и его рибозид. Существенную цитокининовую активность проявил цис-зеатин (таблица).

В литературе содержатся противоречивые данные относительно того, обладает ли цис-зеатин цитокининовой активностью или его активность кажущаяся и обусловлена переходом в транс-зеатин (Мок & Мок, 2001), один из основных цитокининов в растении.

Использованный в нашей работе цис-зеатин был специально очищен для полного удаления возможных примесей транс-формы (степень чистоты > 99,9%). При этом обе растительные тест-системы показали, что цис-зеатин проявляет четко прослеживаемое цитокининовое действие, хотя и значительно более слабое, чем действие транс-зеатина (рис. 1).

0,003 0,01 0,03 0,1 0,3 1 3 0,005 0,05 0,5 5

концентрация гормона, мкМ

Рис. 1. Дозовая зависимость эффектов транс- и цис-зеатинов у проростков амаранта и трансгенного арабидопсиса. За 100% принят эффект транс-зеатина в концентрации 3 мкМ (амарант) или 5 мкМ (арабидопсис).

Сопоставление раздельного и совместного действия цис- и транс-зеатина на модели арабидопсиса показало, что их совместное действие соответствовало величине эффекта, ожидаемого при суммировании соответствующих концентраций цис- и транс-зеатина (рис. 2) Все эти результаты указывали на наличие собственной цитокининовой активности у цис-изомера зеатина.

Рис. 2. Влияние транс-ицис-

зеатинов (Z) и их комбинации на проростки трансгенного арабидопсиса. В скобках -концентрации цитокининов в мкМ За 100% принят эффект транс-зеатина в концентрации 0,1 мкМ

Для исключения возможности ферментативного превращения цис-формы зеатина в транс-зеатин, опыты с обеими изоформами зеатина были проведены на модельной системе трансформированной Е coli. АНК4-бактерии экспрессировали ген рецептора цитокининов AHK4/CRE1, АНКЗ-бактерии - ген АНКЗ. Активация рецепторов цитокининами приводила к индукции экспрессии репортерного гена ß-галактозидазы (lacZ).

На бактериальной тест-системе оба рецептора показали высокую чувствительность к транс-зеатину и достаточно высокую - к изопентениладенину (рис. 3). Цис-зеатин у АНКЗ-экспрессирующих бактерий показывал активность, достигающую половины активности транс-зеатина. Таким образом, это доказывает наличие достоверной цитокининовой активности у цис-зеатина

цис-Z транс-Z цис-Z (0,5)+ цис-Z транс-Z (0,5) (0,05) транс-Z (0,05) (1) (0,1)

Рис. 3. Индукция цитокининами экспрессии генов первичного ответа у трансгенных бактерий и арабидопсиса. За 100% принят эффект транс-зеатина. в концентрации 1 мкМ (активность LacZ у E.coll) или 0,5 мкМ (активность GUS у арабидопсиса).

На бактериальной тест-системе было показано (рис. 3), что рецепторы имеют различную относительную чувствительность к разным видам цитокининов. Так, цис-зеатин и дигидрозеатин в концентрации 1 мкМ активировали рецептор АН КЗ, но не АНК4. Это может свидетельствовать о специфичности функций различных типов цитокининов, зависящих от присутствия тех или иных рецепторов в клетках и тканях.

Сравнение результатов исследований на бактериальной и растительной (арабидопсис) системах показало, что относительная величина ответа растения на тот или иной цитокинин была, в основном, промежуточной по отношению к степени ответа АНКЗ- и АНК4-бактерий. Это служит еще одним подтверждением адекватности выбранных нами модельных систем для анализа молекулярных процессов, вызванных цитокининами.

//. Исследование влияния некоторыхкомпонентовразличных сигнальных путей наранние эффекты цитокининов

Возможность участия фосфолипазы Д

Существует предположение об участии фосфолипазы Д (ФлД) в трансдукции цитохининового сигнала (Romanov et al., 2002). Данный фермент расщепляет концевую фосфодиэфирную связь фосфолипидов с образованием фосфатидных кислот и спирта типа холина или глицерина. В настоящее время показано, что фосфатидные кислоты обладают активностью вторичных мессенджеров (Wang, 2001). В присутствии определенных спиртов ФлД катализирует реакцию трансфосфатидилирования и образует фосфатидилспирты вместо фосфатидных кислот. В данной реакции принимают участие первичные, но не вторичные спирты, наибольшей активностью обладает 4-х атомный спирт (1-бутанол), диапазон действующих концентраций от 0,1 до 1% (Munnik et al., 1995; Ella et al.,

Наши опыты на проростках арабидопсиса показали, что первичные спирты в низких концентрациях (0,2-1%) подавляли эффект цитокининов, при этом наибольшую активность проявлял четырехатомный спирт 1-бутанол (рис. 4).

1997).

0

♦

ряда спиртов на цитокининовый

эффект у проростков трансгенного арабидопсиса.

За 100% принят эффект БА (5 мкМ) в отсутствие спирта

Рис. 4. Влияние

Т-1-г

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Концентрация спиртов, %

Вторичный спирт 2-бутанол, в отличие от своего 1-изомера, оказывал слабое влияние на цитокининовый эффект, при концентрации 1% он подавлял действие цитокинина всего на ~ 6 %. (рис. 4). Эти данные хорошо согласуются с аналогичными данными, полученными ранее (Гетман, 2003) на модели проростков амаранта.

Для определения этапа, на котором первичные спирты оказывают действие, проводили анализ содержания мРНК генов первичного ответа на цитокинин (GUS, ARR5), с использованием Northern-блотинга (рис. 5). Измерения проводили относительно мРНК контрольного гена актина 2.

Как оказалось (рис. 5), действие 1-бутанола затрагивало процесс накопления индивидуальной мРНК гена GUS, приводя к резкому снижению количества GUS-транскриптов. 2-бутанол практически не влиял на накопление мРНК гена GUS. Сходные результаты были получены при анализе содержания мРНК цитокинин-зависимого гена ARRS.

Рис. 5. Влияние бутанолов на цитокинин-индуцированное содержание мРНК гена GUS у проростков трансгенного арабидопсиса, индуцированного БА (5 мкМ).

1-Бут - инкубация в присутствии 1-бутанола (0,5%) и БА.

2-Бут - инкубация в присутствии 2-бутанола (0,5%) и БА. Время действия БА - 40 минут.

Н20 БА 2-Бут 1-Бут

Н20 БА 2-Бут 1-Бут

Таким образом, спирты характеризуются специфическим действием на цитокининовый эффект: показано влияние первичных, но не вторичных спиртов, подтвержденное на двух модельных системах; воздействие заметно уже при низких (0,2-1%) концентрациях и приходится на очень раннюю стадию, соответствующую стадии рецепции/трансдукции цитокининового сигнала. Все это указывает на возможность участия фосфолипазы Д в трансдукции цитокининового сигнала.

На основе анализа генома у арабидопсиса идентифицировано 12 генов ФлД, относящихся к пяти семействам: а, В, Y, б и Z (Wang, 2002). Поэтому представляло интерес выяснить, все ли ФлД принимают участие в реализации действия цитокининов. К настоящему времени известны ингибиторы а-семейства ФлД, представляющие собой N-ацил-этаноламины (NAE), действующие в субмикро- и микромолярных концентрациях (Austin-Brown & Chapman, 2002). Испытанный нами в широком диапазоне концентраций ингибитор NAE 12 не оказывал влияния на цитокининовые эффекты (рис. 6). Таким образом, фосфолипазы Д а-семейства, видимо, не принимают участия в трансдукции цитокининового сигнала. Для ФлД а-семейства ранее показано участие в трансдукции сигнала АБК (Ritchie, Gilroy, 2000). Это может указывать на определенную специфику ФлД разных семейств в реализации действия фитогормонов.

Рис. 6. Оценка влияния ингибитора КАБ12 на цитокининовый эффект у проростков трансгенного арабидопсиса. За 100% принят эффект БА в отсутствие NAE12.

Возможность участия окиси азота N0

В последнее время активно дискутируется вопрос участия окиси азота N0 в реализации действия фитогормонов (Lamattina et al., 2003). На проростках амаранта и арабидопсиса мы провели детальную проверку выдвинутого ранее (Scherer & Hoik, 2000; Tun et al., 2001) предположения об участии NO в трансдукции цитокининового сигнала.

В работе использовали ингибитор NO-синтазы L-NMMA и его неактивный аналог D-NMMA. Опыты на обеих моделях показали, что L-NMMA действительно эффективно снижает эффект цитокининов уже в концентрации 1-5 мМ (рис. 7). Однако дальнейшие опыты показали, что D-NMMA действует сходным образом. Аналогичные результаты были получены при использовании ингибитора NO-синтаз L-NAME и его D-изомера. Это указывало на то, что действие данного ингибитора неспецифично и не относится к этапу трансдукции цитокининового сигнала.

Рис. 7.

Подавление L-^МММЛэффекга БА у амаранта (а, содержание амарантина) и трансгенного арабидопсиса(6, активность GUS). За 100% принят эффект БА в отсутствие ингибитора. Контроль -проростки инкубированы на безгормональной среде.

Прямые доказательства отсутствия участия N0 в трансдукции цитокининового сигнала были получены в опытах с донорами N0. Доноры NO N0R3 и SNAP в широком диапазоне концентраций (до 0,5 мМ) не индуцировали увеличение активности GUS у проростков арабидопсиса (рис. 8). Это свидетельствует против роли N0 как прямого мессенджера сигнала цитокинина. Совместное добавление доноров N0 с БА и L-NMMA не приводило к преодолению действия L-NMMA, что говорит против участия N0 в каком-либо параллельном пути при трансдукции цитокининового сигнала.

Рис. 8.

Анализ влиянии доноров N0 на активность GUS у трансгенного арабидопсиса. За 100% принят эффект БА (5 мкМ) в отсутствие доноров N0. Контроль -проростки инкубированы на безгормональной среде

Ког&егп-блот на модели арабидопсиса показал отсутствие влияния Ь-КММА на индукцию цитокинином синтеза мРНК генов первичного ответа (рис. 9). В качестве индикатора валидности системы выступал 1-бутанол, ингибирующий действие цитокининов и подтвердивший свое действие на уровне мРНК.

Рис. 9. Аккумуляция

мРНКгенаОШв

проростках

траасгенного

арабидопсиса,

индуцированного БА

(5МКМ).МММА-

инкубация в

присутствии Ь-ЫММА

(5мМ)иБА.

Бут - инкубация в

присутствии 1-бутанола

(0,5%) и БА.

Время действия БА - 40

минут.

III. Исследование влияния полиаминов

Полиамины представляют собой группу низкомолекулярных положительно заряженных молекул, способных взаимодействовать с гормональными системами регуляции, в том числе с участием цитокининов. В литературе имеются сведения о влиянии цитокининов на биосинтез и содержание полиаминов и о воспроизведении экзогенными полиаминами ряда цитокининовых эффектов (Altaian, 1989; Uphold et al., 1991; Feray et al., 1992; Sergiev et al., 1995). В связи с этим высказывались предположения (Naik et al., 1980, Galston & Kaur-Sawhney, 1995) о том, что полиамины могут

выполнять функцию вторичных мессенджеров в механизме действия фитогормонов или что цитокинины и полиамины воздействуют на некий общий белок-рецептор.

В наших опытах все испытанные полиамины (спермин, спермидин, кадаверин и путресцин) сами по себе не вызывали стимуляции экспрессии цитокинин-зависимых генов, однако проявили четкий ингибирующий эффект по отношению к действию цитокинина.

У арабидопсиса экзогенно добавленные полиамины заметно подавляли действие цитокининов уже в концентрациях 5 мкМ. При этом наибольшее влияние оказывал спермин (ок. 35% ингибирования), далее - спермидин и кадаверин (ок. 20%). При концентрации порядка 5 мМ эффекты всех полиаминов сравнивались, при этом подавление индуцированной GUS-активности превышало 90% (рис. 10а).

Рис. 10. Подавление полиаминами эффекта БА (5 мкМ) у трансгенного арабидопсиса (а) и амаранта (б). За 100% принят эффект БА (5 мкМ) в отсутствие полиамина.

Проростки амаранта показали более низкую чувствительность к полиаминам по сравнению с арабидопсисом. Наибольшая цитокинин-

ингибирующая активность выявлена у путресцина, далее следуют спермин и кадаверин. Как и на арабидопсисе, относительная активность путресцина несколько снижалась с увеличением концентраций полиаминов. При концентрации 2 мМ ингибирующее действие полиаминов было мало, но существенно возрастало уже при концентрации 5 мМ. При концентрации 50 мМ ингибирующее действие полиаминов составило 93-99% (рис. 106).

Поскольку спермин в высокой концентрации повышал рН среды до 1112 в зависимости от исходного буфера, был проведен опыт с нейтрализацией раствора спермина 0,2 М НС1 для выявления собственного действия полиамина. Результаты показали (рис. 11), что нейтрализация раствора спермина на обеих тест-системах не уменьшила его способность подавлять действие цитокинина.

Рис. 11. Сравнение действия спермина (для арабидопсиса - 50 мкМ, для амаранта - 25 мМ) в двух модельных системах при разных рН. За 100% принят эффект БА (5 мкМ) в отсутствие полиамина.

Это доказывает, что полиамины обладают собственным ингибиторным действием на индукцию экспрессии цитокинин-регулируемых генов вне зависимости от влияния на рН окружающего раствора.

Для изучения возможного действия эндогенных полиаминов на гены первичного ответа был использован ингибитор катаболизма полиаминов аминогуанидин (АГ). Это соединение подавляет активность фермента диаминооксидазы, которая катализирует окислительное дезаминирование в

первую очередь диаминов (путресцин и кадаверин) (Torrigiam Ы а1., 1989; БиЬаж й а1., 2002).

При краткосрочной обработке проростков арабидопсиса АГ в концентрации 0,5 и 1 мМ не влиял на цитокининовый эффект, что показывает отсутствие влияния АГ также на общую жизнеспособность растения и на тестирование активности ОШ. Однако при обработке проростков АГ в течение суток ответная реакция на цитокинин снижалась на 40-60% (рис. 12). Это показывает возможность влияния эндогенных полиаминов на экспрессию генов первичного ответа на цитокинин.

Рис. 12. Влияние 24-часовой предобработки аминогуанидином (АГ) на цитокининовый эффект у проростков трансгенного арабидопсиса. За 100% принят эффект БА (5 мкМ) в отсутствие АГ

Для выявления временного интервала, в котором реализуется действие полиаминов, был проведен кинетико-ингибиторный анализ на тест-системе амаранта. По графику зависимости степени индукции биосинтеза амарантина от задержки времени добавления ингибитора по отношению к БА определяется время полумаксимального эффекта, которое является характерным для данного ингибитора (Романов и др., 1999). Ранее на тест-системе амаранта были охарактеризованы временные параметры для процессов трансдукции цитокининового сигнала, индуцированной транскрипции, индуцированной трансляции и индуцированного биосинтеза бетацианина (Гетман, 2003). Сравнивая время полумаксимального эффекта

БА Н20 БА+АГ БА+АГ

0,5 мМ 1 мМ

для используемого ингибитора с таковым показателем для процессов транскрипции (1,8 ч) и трансляции (3,8 ч), можно оценить, на какой период приходится действие данного ингибитора.

В наших опытах в качестве ингибитора использовали спермин в концентрации 25 мМ. Время полумаксимального эффекта для спермина составило ~4,5 ч (рис. 13), то есть приходится на заведомо посттранскрипционный этап.

Рис. 13. Кинетико-ингибиторный анализ действия спермина на проростки амаранта. 1 - кривая ингибирования актиномицином Д, 2- кривая ингибирования циклогексимидом, 3 - кинетика накопления пигмента.

Еще одним важным показателем отсутствия влияния полиаминов на этапы, предшествующие транскрипции, служат данные по содержанию мРНК гена GUS на модели трансгенного арабидопсиса. Радиоавтография Northern-блота показала (рис. 14), что уровень транскрипции репортерного гена GUS при инкубации со спермином и цитокинином не изменился по сравнению с транскрипцией гена под воздействием только цитокинина, что подтверждает вывод о посттранскрипционном действии полиаминов. Таким образом, полиамины блокируют индукцию цитокининами экспрессии генов первичного ответа, при этом данное действие реализуется на

посттранскрипционном этапе, то есть полиамины не влияют на трансдукцию сигнала цитокининов на гены первичного ответа.

Рис. 14. Аккумуляция мРНКгенаОШв

проростках трансгенного арабидопсиса индуцированного БА (5 мкМ).

Спе - инкубация в присутствии спермина (50 мкМ) и БА. Бут - инкубация в присутствии 1-бутанола (0,5%) и БА. Время действия БА - 40 минут.

ВЫВОДЫ

1. Отработана методология количественного изучения эффектов цитокининов на трех модельных системах, отвечающих на фитогормон быстрой активацией транскрипции генов первичного ответа: проростках амаранта и трансгенного РАакз '-ОиЗ арабидопсиса, а также трансформированной Е.еоИ, экспрессирующей гены рецепторов цитокининов АНК3 И АНК4/СКЕ1.

2. С помощью измерения ОШ-активности у трансгенного арабидопсиса определена гормональная активность широкого спектра природных и синтетических цитокининов, включающего 24 различные соединения. Наиболее высокой биологической активностью обладали транс-зеатин, транс-зеатинрибозид 5'-монофосфат, изопентениладенин, мета-тополин и тидиазурон. Рибозиды цитокининов действовали слабее по

сравнению со свободными основаниями. Слабой активностью обладали N7-и №-глюкозиды зеатина, а также дигидрозеатин и его рибозид. Цис--зеатин проявлял промежуточную активность.

3. Опыты с цис- и транс-зеатином на отработанных моделях, включая трансформированную E.coli, продуцирующую рецепторы цитокининов, показали, что цис-зеатин обладает собственной цитокининовой активностью, хотя и существенно меньшей по сравнению с транс-формой. При этом выявлены различия лигандной специфичности рецепторов цитокининов AHK3 И AHK4/CRE1.

4. На проростках арабидопсиса показано подавление цитокинин-зависимой индукции активности GUS первичными спиртами (1-бутанолом, этанолом и метанолом) в низких концентрациях, ингибирующих действие фосфолипазы Д. Вторичные спирты, не взаимодействующие с фосфолипазой Д, мало влияли на действие цитокинина. Данные на арабидопсисе хорошо соответствуют аналогичным данным на амаранте.

5. Первичный спирт 1-бутанол на модельной системе трансгенного арабидопсиса подавлял цитокинин-зависимую индукцию накопления мРНК генов первичного ответа: трансгена GUS и собственного гена ARR5.

6. Ингибитор фосфолипаз Д а-семейства N-ацил-этаноламин (NAE12) практически не влиял на развитие первичных эффектов цитокининов на проростках амаранта и трансгенного арабидопсиса, что свидетельствует против участия данной формы фосфолипазы Д в трансдукции цитокининового сигнала.

7. Ингибиторы NO-синтазы L-NMMA и L-NAME подавляли в миллимолярных концентрациях цитокинин-зависимую индукцию GUS-активности у трансгенного арабидопсиса. Вместе с тем серия специальных опытов показала, что на модельных системах арабидопсиса и амаранта окись азота N0 не является сигнальным посредником действия цитокинина.

8. На обеих растительных тест-системах показано антагонистическое действие полиаминов в отношении цитокинин-зависимых эффектов, более выраженное у арабидопсиса. При этом полиамины действовали посттранскрипционно, не затрагивая стадии сигнальной трансдукции.

Ингибирование катаболизма полиаминов аминогуанидином in vivo снижало амплитуду эффекта цитокининов.

9. Полученные данные расширяют наши представления о характере рецепции и трансдукции цитокининового сигнала, биологической активности разных цитокининов и о взаимодействии цитокининовой регуляторной системы с другими регуляторными системами, в первую очередь с участием фосфолипаз Д, N0 и полиаминов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Romanov GA, Getman I.A., Bolyakina Yu.P., Rakova N.Yu., Kieber J.J., Schmuelling T. (2002) Putative components of cytokinin signal transduction. Abstr. NATO-Russia Intern. Workshop «Phytohormones in Plant Biotechnology and Agriculture», Moscow, 12-16 May, p. 12

2. Ракова Н.Ю., Гетман ИА, Романов ГА. (2003) Изучение влияния полиаминов на цитокинин-зависимую экспрессию генов у проростков амаранта и арабидопсиса. Труды V международного симпозиума «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования», Пущино, 9-14 июня, том 1, с. 70-72

3. Болякина Ю.П., Гетман ИА, Ракова Н.Ю., Романов ГА. (2003) Действие цитокинина на структурно-функциональную организацию ядра в семядолях проростков амаранта. Труды V международного симпозиума «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования», Пущино, 9-14 июня, том 1, с. 8-10

4. Ракова Н.Ю., Гетман ИА, Шмюллинг Т., Романов ГА (2003) Изучение влияния полиаминов на цитокинин-зависимую экспрессию генов растений. Тезисы 7 конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 14-18 апреля, с. 367

5. Ракова Н.Ю., Шмюллинг Т., Романов ГА. (2003) К вопросу об участии кислород-содержащих молекул NO и Н2О2 в трансдукции сигнала цитокининов. Тезисы 7 конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 14-18 апреля, с. 368

6. Ракова Н.Ю., Шмюллинг Т., Романов Г.А. (2003) Молекулярный механизм действия цитокининов. Участвуют ли NO и Н2О2 в трансдукции сигнала? Тезисы V Съезда Общества физиологов растений России, Пенза, 15-21 сентября, с. 424-425

7. Романов Г.А., Гетман ИА, Ракова Н.Ю., Шмюллинг Т., Марганец Я., Валентова О., Махачкова И. (2003) Молекулярный механизм действия цитокининов. Роль фосфолипазы Д в восприятии цитокининового сигнала.

Тезисы V Съезда Общества физиологов растений России, Пенза, 15-21 сентября, с. 426

8. Ракова Н.Ю., Гетман ИА, Романов ГА (2003) Влияние полиаминов на экспрессию цитокинин-зависимых генов арабидопсиса и амаранта. Тезисы V Съезда Общества физиологов растений России, Пенза, 15-21 сентября, с. 471

9. Романов ГЛ., Ракова Н.Ю., Гетман И А, Болякина Ю.П., Емкова И.В., Кибер Дж. Дж., Махачкова И., Шмюллинг Т. (2003) Регуляция цитокининами экспрессии генов первичного ответа in vivo. Тезисы V Съезда Общества физиологов растений России, Пенза, 15-21 сентября, с. 472

10. Romanov GA, Getman IA, Bolyakina Yu.P., RakovaN.Yu., Kieber J.J., Schmtilling T. (2003) Primary alcohols, substrates for phospholipase D-catalyzed transphosphatidylation, suppress the cytokinin action. In: Phytohormones in Plant Biotechnology and Agriculture (eds Machackova I., Romanov GA) Kluwer Academic Publishers, Dordecht/Boston/London. P. 129-139.

П.Романов ГА, Ракова Н.Ю., Ванюшин Б.Ф. (2004) Полиамины подавляют экспрессию цитокинин-зависимого трансгена у арабидопсиса. Доклады АН, Т. 39, №3, с. 415-418

12.Spichal L., RakovaN.Yu., Riefler М., Mizuno Т., Romanov GA., Strnad М., Schmulling Т. (2004) Two cytokinin receptors of Arabidopsis thaliana, CRE1/AHK4 and AHK3, differ in their ligand specificity in a bacterial assay. Plant Cell Physiol., V. 45, № 9, p. 1299-1305

13. Romanov G., Rakova N., Schmulling T. (2004) Does NO participate in cytokinin signaling? Abstr. International Symposium "Cell Biology of Nitric Oxide and Cell Death in Plants", Yalta, September 8-11

14. Ракова Н.Ю., Романов ГА (2005) Полиамины препятствуют проявлению первичных эффектов цитокининов. Физиология растений, Т. 52, №1, с. 59-67

15. Romanov GA, Rakova N.Yu., Schmulling Т. (2005) Does NO participate in cytokinin signal transduction? (в печати)

Усл. печ. л. 1,4 Зак. 83 Тираж 100 экз.

Издательство МСХА 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44

Í г \ "

2 2 MAP 2G05

516

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ракова, Наталья Юрьевна

Список условных сокращений

Введение

Литературный обзор

I. Цитокинины

1.1. Химическая структура цитокининов

1.2. Функциональная активность цитокининов

1.3. Действие цитокининов на ткани и органы растения

1.4. Действие цитокининов на клеточном уровне

II. Регуляторы ответа ARR

III. Рецепторы цитокининов

IV. Полиамины

V. Фосфолипаза Д

VI. Общие закономерности функционирования сигнальных систем

VI. 1. Аденилат- и гуанилатциклазная системы

VI.2. Липоксигеназная сигнальная система

VI.3. Участие N0 в трансдукции сигнала

VI.4. МАР-киназный каскад

VI.5. Супероксидсинтазная система и молекулы, содержащие активные формы кислорода^

Материалы и методы исследований

1. Реактивы

2. Объекты исследований

2.1. Модельная система на основе амаранта

2.2. Модельная система на основе трансгенного арабидопсиса

2.3. Модельная система на основе трансгенной E.coli

3. Ингибиторный анализ на модели амаранта

4. Кинетико-ингибиторный анализ на модели амаранта

Результаты и обсуждение

I. Анализ способности различных цитокининов вызывать экспрессию генов первичного ответа

II. Исследование влияния некоторых компонентов различных сигнальных путей на ранние эффекты цитокининов

5. Оценка жизнеспособности проростков

6. Выявление влияния цитокининов на формирование супероксид-анионов на модели амаранта

7. Ингибиторный анализ на модели арабидопсиса

8. Определение активности GUS

9. Определение количества белка методом Bradford

10. Анализ действия полиаминов при их эндогенном накоплении

11. Анализ действия цитокининов на отдельные рецепторы на модели Е. coli

12. Анализ содержания мРНК репортерного гена GUS

13. Электронная микроскопия

14. Гистохимическое окрашивание арабидопсиса с помощью X-Gluc

15. Статистическая обработка данных

II. 1. Возможность участия фосфолипазы Д

11.2. Возможность участия окиси азота NO

11.3. Возможность участия супероксид-радикалов и перекиси ^ водорода

III. Исследование влияния полиаминовЮ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности регуляции цитокининами экспрессии генов первичного ответа"

Интенсивные исследования последних лет многое прояснили в проблеме рецепции и трансдукции гормональных сигналов у растений. Большой прогресс был достигнут в изучении молекулярного механизма действия цитокининов: обнаружены мембранные рецепторы цитокининов (сенсорные гистидинкиназы), гены первичного ответа и основные элементы сигнальной трансдукции (Kakimoto, 2003). В настоящий момент главным путем передачи цитокининового сигнала считается переброска фосфата по типу Гис—>Асп-»Гис от сенсорной гистидинкиназы через специальные белки-фосфотрансмиттеры до внутриядерных факторов транскрипции. Однако многие важные аспекты трансдукции цитокининового сигнала, а также пути взаимодействия сигналинга цитокининов с другими известными сигнальными системами остаются неясными и продолжают активно изучаться.

Остаются малоизученными, в частности, пути взаимодействия сигнала цитокининов с другими известными сигнальными системами. В последнее время в литературе появились сведения о влиянии ряда веществ (микро- и макромолекул) на эффекты, вызываемые фитогормонами, в том числе цитокининами, и о возможном участии этих веществ в трансдукции гормональных сигналов. Для цитокининов это прежде всего такие вещества как фосфолипаза Д (ФлД) и образуемые ей фосфатидные кислоты (Romanov et al., 2000, 2002), полиамины (Feray et al., 1992) и малые сигнальные молекулы, содержащие кислород, в частности, NO (Scherer & Hoik, 2000; Tun et al., 2001).

Фосфолипаза Д гидролизует фосфолипиды с образованием в числе других продуктов реакции фосфатидных кислот. В настоящее время показано, что фосфатидные кислоты обладают активностью вторичных мессенджеров (Wang, 2001; Munnik, 2001), участвуют в передаче сигнала абсцизовой кислоты (Ritchie & Gilroy, 2000) и, предположительно, могут участвовать в трансдукции цитокининового сигнала (Romanov et al., 2002).

Полиамины являются одним из классов регуляторных низкомолекулярных биомолекул, принимающих участие в широком круге физиологических процессов как в растительных, так и в животных организмах. У растений полиамины регулируют такие физиологические ответы как деление клеток, формирование клубней, цветение, индукция соматического эмбриогенеза, созревание плодов, развитие цветков, старение, стрессорные реакции (Altman, 1989; Walden et al., 1997; Duhaze et al., 1999; Kakkar et al., 2002). Таким образом, в физиологическом действии полиаминов имеется ряд общих черт с действием фитогормонов, в частности, цитокининов, однако характер взаимоотношений между цитокининами и полиаминами изучен мало.

Окись азота NO является уникальной сигнальной молекулой у животных и растений (Wendehenne et al., 2001), которая в низких концентрациях у растений вызывает такие гормоноподобные эффекты, как стимуляция прорастания семян, роста листовой пластинки и корневой системы, задержка старения и созревания плодов, развитие защитных реакций (Belligni, 2001; Romero-Puertas, 2003; Del Rio et al., 2004). Исходя из этого, были высказаны предположения о том, что NO может тесно взаимодействовать с гормональной системой растений и служить в качестве вторичного мессенджера (Lamattina et al., 2003).

В последние годы появились данные о том, что NO может участвовать в молекулярном механизме действия цитокининов (Scherer, 2000; Tun et al., 2001). Была показана способность цитокининов стимулировать выделение NO клетками уже через 3 мин после обработки фитогормоном (на культурах клеток табака, петрушки и арабидопсиса) (Tun et al., 2001). Все эти результаты позволили авторам предположить, что NO участвует в трансдукции сигнала цитокининов в качестве вторичного посредника.

Очевидно, что накоплено много фактического материала, позволяющего оценивать отдельные аспекты трансдукции цитокининового сигнала. При этом остаются актуальными вопросы, на каком биохимическом уровне реализуется взаимодействие описанных веществ с цитокининами и ч каким способом эти вещества влияют на молекулярный механизм действия данных фитогормонов.

Исходя из сказанного, целью нашей работы являлось исследование неизученных аспектов молекулярного механизма действия цитокининов и взаимодействия этих фитогормонов с другими сигнальными системами, с привлечением новых трансгенных моделей.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

- подбор и освоение модельных систем, позволяющих количественно оценивать эффект цитокининов на экспрессию индивидуальных генов первичного ответа; сравнение действия разных форм цитокининов, включая стереоизомеры зеатина, на отработанных модельных системах;

- оценка возможности участия фосфолипазы Д и окиси азота NO в процессе трансдукции цитокининового сигнала;

- изучение влияния различных полиаминов на ранние эффекты цитокининов и раскрытие молекулярных основ этого влияния.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

I. Цитокинины

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Ракова, Наталья Юрьевна

ВЫВОДЫ

1. Отработана методология количественного изучения эффектов цитокининов на трех модельных системах, отвечающих на фитогормон быстрой активацией транскрипции генов первичного ответа: проростках амаранта и трансгенного РARR5::GUS арабидопсиса, а также трансформированной E.coli, экспрессирующей гены рецепторов цитокининов АНКЗ и AHK4/CRE1.

2. С помощью измерения GUS-активности у трансгенного арабидопсиса определена гормональная активность широкого спектра природных и синтетических цитокининов, включающего 24 различные соединения. Наиболее высокой биологической активностью обладали транс-зеатин, /ярянс-зеатинрибозид 5'-монофосфат, изопентениладенин, мета-тополин и тидиазурон. Рибозиды цитокининов действовали слабее по сравнению со свободными основаниями. Слабой активностью обладали N7-и Ш-глюкозиды зеатина, а также дигидрозеатин и его рибозид. Цис-зеатин проявлял промежуточную активность.

3. Опыты с цис- и транс-зеатином на отработанных моделях, включая трансформированную E.coli, продуцирующую рецепторы цитокининов, показали, что i/ис-зеатин обладает собственной цитокининовой активностью, хотя и существенно меньшей по сравнению с транс-^орыои. При этом выявлены различия лигандной специфичности рецепторов цитокининов АНКЗ и AHK4/CRE1.

4. На проростках арабидопсиса показано подавление цитокинин-зависимой индукции активности GUS первичными спиртами (1-бутанолом, этанолом и метанолом) в низких концентрациях, ингибирующих действие фосфолипазы Д. Вторичные спирты, не взаимодействующие с фосфолипазой Д, мало влияли на действие цитокинина. Данные на арабидопсисе хорошо соответствуют аналогичным данным на амаранте.

5. Первичный спирт 1-бутанол на модельной системе трансгенного арабидопсиса подавлял цитокинин-зависимую индукцию накопления мРНК генов первичного ответа: трансгена GUS и собственного гена ARR5.

6. Ингибитор фосфолипаз Д а-семейства N-ацил-этаноламин (NAE12) практически не влиял на развитие первичных эффектов цитокининов на проростках амаранта и трансгенного арабидопсиса, что свидетельствует против участия данной формы фосфолипазы Д в трансдукции цитокининового сигнала.

7. Ингибиторы NO-синтазы L-NMMA и L-NAME подавляли в миллимолярных концентрациях цитокинин-зависимую индукцию GUS-активности у трансгенного арабидопсиса. Вместе с тем серия специальных опытов показала, что на модельных системах арабидопсиса и амаранта окись азота N0 не является сигнальным посредником действия цитокинина.

8. На обеих растительных тест-системах показано антагонистическое действие полиаминов в отношении цитокинин-зависимых эффектов, более выраженное у арабидопсиса. При этом полиамины действовали посттранскрипционно, не затрагивая стадии сигнальной трансдукции. Ингибирование катаболизма полиаминов аминогуанидином in vivo снижало амплитуду эффекта цитокининов.

9. Полученные данные расширяют наши представления о характере рецепции и трансдукции цитокининового сигнала, биологической активности разных цитокининов и о взаимодействии цитокининовой регуляторной системы с другими регуляторными системами, в первую очередь с участием фосфолипаз Д, N0 и полиаминов.

Благодарности. Приношу глубокую благодарность научному руководителю д.б.н. Г.А. Романову за помощь и поддержку в работе, к.б.н. Ю.П. Болякиной за обеспечение электронной микроскопии, проф. Т. Шмюллингу за предоставленную возможность работы в его лаборатории, проф. д.б.н. Н.И. Шевяковой за предоставление аминогуанидина и ценные консультации по работе с полиаминами, проф. д.б.н. Б.Ф.Ванюшину и сотрудникам лаборатории молекулярных основ онтогенеза за руководство этапом работы с супероксиддисмутазой, и всему коллективу лаборатории роста и развития им. академика М.Х. Чайлахяна и сотрудникам Института физиологии растений за внимание и помощь, без которых выполнение работы было бы невозможно.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Гормоны растений исследуются уже более века, однако интерес к ним не ослабевает. По мере открытия новых фитогормонов и регуляторов роста становилось все более очевидным, что практически все процессы роста и развития растения так или иначе контролируются фитогормонами. Следует отдать должное дару предвидения классика гормонологии растений М.Х. Чайлахяну, который еще в 30-х годах прошлого столетия, когда собственно о гормонах растений почти ничего не было известно, предложил оригинальную гормональную теорию развития растений (Чайлахян, 1937). К настоящему времени эта теория выдержала испытание временем и сейчас у биологов нет сомнений в особой роли фитогормонов для правильного протекания физиологических процессов в растении. Сейчас усилия ученых переместились на новый уровень, уровень исследования молекулярных механизмов действия фитогормонов. Здесь также в последние годы были достигнуты значительные успехи, что позволило выявить и даже классифицировать отдельные пути передачи гормональных сигналов внутри клетки (Тарчевский, 2002). При этом становится все более ясно, что разные пути сигнальной трансдукции функционируют не изолированно, а в виде единого комплекса, так называемой регуляторной сети, тем самым обеспечивая надежность и тканевую специфику систем внутриклеточной регуляции. Разобраться в многокомпонентной системе внутриклеточной регуляции, где принципиально возможно огромное число разнообразных взаимодействий, но реализуется только малая их доля, достаточно сложно, но необходимо для правильного понимания механизмов гормонального контроля. Этой проблеме как раз и была посвящена настоящая работа, поставившая своей целью изучить взаимоотношения уже ставшей классической двухкомпонентной передачи сигнала цитокининов (Kakimoto, 2003) с другими известными системами сигнальной трансдукции, такими как фосфатидатная, NO-синтазная, а также с регуляторной системой полиаминов.

Важно отметить, что в работе использованы быстрые и количественные модельные системы, как растительные, так и бактериальные, которые позволяют следить за первичными ответными реакциями, а именно экспрессией генов первичного ответа на цитокинин. Главным результатом работы стало подтверждение возможности участия фосфолипазы Д в механизме действия цитокининов, в том числе в трансдукции цитокининового сигнала, установление ингибиторного действия полиаминов на посттранскрипционном этапе экспрессии цитокинин-зависимых генов, а также опровержение гипотезы об участии окиси азота NO в трансдукции цитокининового сигнала. Кроме того, были сделаны более точные оценки физиологической активности широкого спектра цитокининов разной структуры, доказана собственная цитокининовая активность цис-зеатина и производного фенилмочевины тидиазурона, а также получены первые данные о различии в лигандной специфичности рецепторов цитокининов арабидопсиса АНКЗ и CRE1/AHK4. Как положительные, так и «отрицательные» результаты работы имеют важное значение, так как расширяют наши представления о характере рецепции и трансдукции цитокининового сигнала, биологической активности разных цитокининов и о взаимодействии цитокининовой регуляторной системы с другими регуляторными системами. Эти результаты будут служить базой для дальнейших углубленных исследований в этом направлении.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ракова, Наталья Юрьевна, Москва

1. Бернье Ж., Корбезье Л., Перийе К. (2002) Процесс цветения: поиск регуляторных факторов у Sinapis alba. Физиология растений, 49: 500-506

2. Гетман И.А. (2003) Ранние эффекты цитокининов в модельной системе проростков амаранта. Дисс. канд. биол. наук. М.: РУДН, 132 с

3. Гречкин А.Н., Тарчевский И.А. (1999) Липоксигеназная сигнальная система. Физиология растений, 46: 132-142

4. Гудвин Т., Мерсер Э. (1986) Введение в биохимию растений. Изд-во «Мир», Москва, 2, 304 с

5. Дерфлинг (1985) Гормоны растений. Системный подход. Изд-во «Мир», Москва, 392 с

6. Зверева С.Д., Романов Г.А. (2000) Репортерные гены для генетической инженерии растений: характеристика и методы тестирования//Физиология растений, 47: 479-488

7. Иванова Е.Г., Шепеляковская А.О. (1999) Биосинтез цитокининов аэробными метилотрофными бактериями: Новые данные. Материалы IV Пущинской конференции молодых ученых, Пущино

8. Калинин Ф.А. (1984) Биологически активные вещества в растениеводстве. Изд-во «Наук, думка», Киев, 320 с

9. Карначук Р.А., Головацкая И.Ф. (1998) Гормональный статус, рост и фотосинтез растений, выращенных на свету разного спектрального состава. Физиология растений, 45, 6: 925-934

10. Клячко H.JI. (1985) Посттранскрипционная регуляция синтеза белка фитогормонами. Автореф. дисс. доктора биол. наук, Москва

11. Константинова Т.Н., Аксенова Н.П., Голяновская С.А., Сергеева Л.И., Романов Г.А. (1999) Действие ауксина (ИУК) и цитокинина (кинетина) на клубнеобразование картофеля в культуре in vitro. Доклады Академии Наук, Общая Биология, 369: 708-711

12. Кузнецов Вл.В., Ракитин В.Ю., Садомов Н.Г., Дам Д.В., Стеценко JLA,, Шевякова Н.И. (2002) Участвуют ли полиамины в дистанционной передаче стрессорного сигнала у растений? Физиология растений, 49: 136147

13. Кулаева О.Н. (1973) Цитокинины, их структура и функции. Изд-во «Наука», Москва, 264 с

14. Кулаева О.Н. (1982) Гормональная регуляция биологических процессов у растений на уровне РНК и белка. Изд-во «Наука», Москва, 84 с

15. Кулаева О.Н., Хохлова В.А., Фофанова Т.А. (1984) Цитокинины и абсцизовая кислота в регуляции роста и процессов внутриклеточной дифференцировки. Гормональная регуляция онтогенеза растений. Изд-во «Наука», Москва, с. 71-86

16. Куликова A.JL, Куликов А.Ю., Ерохина М.А., Клячко H.JI. (2001) Зависимость доли цитоскелет-связанных полисом от физиологического состояния растений. Физиология растений, 48: 705-711

17. Курсанов A.JI. (1976) Транспорт ассимилятов в растении. Изд-во «Наука», Москва, 646 с

18. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбук Дж. (1984) Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Изд-во «Мир», Москва, 479 с

19. Митриченко А.Н. (1998) Динамика и распределение цитокининов в проростках пшеницы при изменениях температуры. Физиология растений, 45, 3: 468-471

20. Мустафина А.П., Кудоярова Г.Р., Веселов Ю.С. (1997) Изменение спектра иммунореактивных форм цитокининов в обезвоженных проростках пшеницы и кукурузы. Известия АН: Серия биологическая, 6: 750-754

21. Полевой В.В. (1985) Фитогормоны. Изд-во Ленингр. университета, Ленинград, 284 с

22. Пузина Т.И., Бахтенко Е.Ю. (1997) Значение гормонального баланса в реакции растений картофеля на формы азотного питания. Физиология растений, 44,6: 926-930

23. Романов Г.А. (1990) Цитокинины и тРНК: новый взгляд на старую проблему. Физиология растений, 37: 1196-1210

24. Романов Г. А. (1992) Модель гормонально-организуемого пролиферативного роста: аналогии с ростом растения. Онтогенез, 1992: 228-236

25. Романов Г.А. (2002) Рецепторы фитогормонов. Физиология Растений, 49,4: 615-625

26. Романов Г.А., Гетман И.А., Шмюллинг Т. (1999) Быстрая активация транскрипции ядерных генов необходима для индуцированного цитокининами образования бетацианина в проростках амаранта. Докл. АН, 365: 832-835

27. Свешникова И.Н., Хохлова В.А. (1969) Цитологическое изучение действия 6-бензиламинопурина и кинетина на изолированные семядоли льна. Физиология растений, 16: 687-693

28. Тарчевский И.А. (2000) Элиситор-индуцируемые сигнальные системы и их взаимодействие. Физиология растений, 47: 321-331

29. Тарчевский И.А. (2002) Сигнальные системы клеток растений. Изд-во «Наука», Москва, 294 с.

30. Уэринг Ф.Ф. (1984) Физиология клубнеобразования и роль фитогормонов. Гормональная регуляция онтогенеза растений. Изд-во «Наука», Москва, с. 55-70

31. Холл М.А., Новикова В.Г., Мошков И.Е., Мур Дж.Л.А., Смит А.Р. (2002) Протеинкиназы растений в трансдукции абиотических и биотических сигналов. Физиология растений, 49: 121-135

32. Хохлова В.А. (1977) Действие цитокининов на формирование пластид в семядолях тыквы на свету и в темноте. Физиология растений, 24: 1189-1193

33. Чайлахян М.Х. (1937) Гормональная теория развития растений. Изд-во АН СССР, Москва, 198 с.

34. Чайлахян М.Х. (1964) Факторы генеративного развития растения. Тимирязевские чтения XXV. Изд-во «Наука», Москва, 58 с

35. Чайлахян М.Х., Хрянин В.Н. (1982) Пол растений и его гормональная регуляция. Изд-во «Наука», Москва, 173 с

36. Чернядьев И.И. (1997) Фотосинтез растений в условиях водного стресса и протекторное влияние цитокининов. Прикладная биохимия и микробиология, 33: 5-17

37. Чернядьев И.И. (2000) Онтогенетические изменения фотосинтетического аппарата и влияние цитокининов. Прикладная биохимия и микробиология, 36: 611-625

38. Шевякова Н.И. (1981) Метаболизм и физиологическая роль ди- и полиаминов в растениях. Физиология Растений, 28: 1052-1061

39. Aschlimann D., Paulsson M. (1994) Transglutaminases: proteins cross-linking enzymes in tissues and body fluids. Thromb Haemostasis, 71: 402-415

40. Astot C., Dolezal K., Nordstrom A., Wang Q., Kunkel Т., Moritz Т., Chua N.H., Sandberg G. (2000) An alternative cytokinin biosynthesis pathway. PNAS, 97: 1477814783

41. Athwal G.S., Huber S.C. (2002) Bivalent cations and polyamines bind to loop 8 of 14-3-3 proteins, modulating their interaction with phosphorylated nitrate reductase. The Plant J., 29: 119-129

42. Austin-Brown S.L., Chapman K.D. (2002) Inhibition of phospholipase D alpha by N-acylethanolamines. Plant Physiol., 129: 1892-1898

43. Bamberger E., Mayer A.M. (1960) Effect of kinetin on formation of red pigment in seedlings of Amaranthus retroflexus. Science, 131: 1094-1095

44. Bassi N.V., Мок D., Мок M.C. (1993) Partial purification of a cis-trans-isomerase of zeatin from immature seed of Phaseolus vulgaris L. Plant Physiol., 102: 867-872

45. Belligni M.V., Lamattina L. (2001) Nitric oxide in plants: the history is just beginning. Plant, Cell and Environment, 24: 267-278

46. Bernier G., Houssa C., Iacqmard A. (1994) Regulation of the cell cycle by cytokinins. In: Cytokinins, Chemistry, Activity and Function. Eds Мок D. & Мок M.C. Corvallis, Oregon: CRC Press, pp 197-211

47. Bhatnagar P., Glasheen B.M., Bains S.K., Long S.L., Minocha R., Walter C., Minocha S.C. (2001) Transgenic manipulation of the metabolism of polyamines in poplar cells. Plant Physiol., 125: 2139-2153

48. Blackman P.G., Davies W.J. (1984) Age-related change in stomatal response to cytokinins and abscisic acid. Annals Bot., 54: 121-125

49. Blatt M.R. (2000) Cellular signalling and volume control in stomatal movements in plants. Curr. Opin.Plant Biol., 16: 221-241

50. Blee E. (1996) Phytooxylipins: the peroxygenase pathway. Lipoxygenase and lipoxygenase pathway enzymes. Ed. Piazza G.Ch., AOCS Press, pp 138161

51. Bogdan C. (2001) Nitric oxide and the regulation of gene expression. Trends Cell Biol., 11: 66-75

52. Bouchereau A., Aziz A., Larher F., Martin-Tanguy J. (1999) Polyamines and environmental challenges: recent development. Plant Sci., 140: 103-125

53. Bradford M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgramm quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 72: 248-254

54. Brandstatter I., Kieber J.J. (1998) Two genes with similarity to bacterial response regulators are rapidly and specifically induced by cytokinin in Arabidopsis. Plant Cell, 10, 6: 1009-1019

55. Bueb J.-L., De Silva A., Mousli M., Landry Y. (1992) Natural polyamines stimulate G-proteins. Biochem.J., 282: 545-550

56. Camp W.V., Montagu M.V., Inze D. (1998) H202 and NO: redox signals in disesease resistance. Trends Plant Sci., 3: 330-333

57. Cazale A.-C., Rouet-Mayer M.-A., Barbier-Brygoo H., Mathien Y., Lauriere C. (1998) Oxidative burst and hypoosmotic stress in tobacco cell suspensions. Plant Physiol., 116: 659-669

58. Chamnongpol S. (1998) Defense activation and enhanced pathogen tolerance induced by H202 in transgenic plants. PNAS, 95: 5818-5823

59. Chandok M.R., Ytterberg A.J., van Wijk K.J., Klessig D.F. (2003) The pathogen-inducible nitric oxide synthase (iNOS) in plants is a variant of the P protein of the glycine decarboxylase complex. Cell, 113: 469-482

60. Chang C., Stewart R.C. (1998) The two-component system. Regulation of diverse signaling pathways in prokaryotes and eukaiyotes. Plant Physiol., 117: 723-731

61. Che P., Gingerich D.J., Lall S., Howell S.H. (2002) Global and hormone-induced gene expression changes during shoot development in Arabidopsis. Plant Cell, 14: 2771-2785

62. Chen Z., Silva H., Klessig D.F. (1993) Active oxygen species in the induction of plant systemic acquired resistance by salicylic acid. Science, 262: 1883-1886

63. Christinet L., Burdet F.X., Zaiko M., Hinz U., Zryd J.P. (2004) Characterization and functional identification of a novel plant 4,5-extradioldioxygenase involved in betalain pigment biosynthesis in Portulaca grandiflora. Plant Physiol., 134: 265-274

64. Clementi E. (1998) Role of nitric oxide and its intracellular signaling pathway in the control of Ca2+ homeostasis. Biochem. Pharmacol., 55: 713-718 Cohen S. (1998) A Guide to the Polyamines. Oxford University Press, Oxford, New York, 595 p

65. Corpas F.J., Barroso J.B., del Rio L.A. (2001) Peroxisomes as a source of reactive oxygen species and nitric oxide signal molecules in plant cells. Trends Plant Sci., 8,4: 145-150

66. Correa-Aragunde N., Graziano M., Lamattina L. (2004) Nitric oxide plays a central role in determining lateral root development in tomato. Planta, 218: 900-905

67. D'Agostino I.B., Deruere J., Kieber J.J. (2000) Characterization of the response of the Arabidopsis response regulator gene family to cytokinin. Plant Physiol., 124: 1706-1716

68. Dangl J. (1998) Plants just say NO to pathogens. Nature, 394, 526-527 Datta N., Hardison L.K., Roux S.J. (1986) Polyamine stimulation of protein phosphorylation in isolated pea nuclei. Plant Physiol., 82: 681-684

69. Del Rio L.A., Javier C.F., Barroso J.B. (2004) Nitric oxide and nitric oxide synthase activity in plants. Phytochemistry 65: 783-792

70. Delledonne M., Xia Y., Dixon R.A., Lamb C. (1998) Nitric oxide functions as a signal in plant disease resistance. Nature, 394, 585-588

71. Desikan R., Cheung M.K., Bright J., Henson D., Hankock J.T., Neill S.T. (2004) ABA, hydrogen peroxide and nitric oxide signalling in stomatal guard cells. J. Exp. Bot., 55: 205-212

72. Dhonukshe P., Laxalt A.M., Goedhart J., Gadella T.W., Munnik T. (2003) Phospholipase D activation correlates with microtubule reorganization in living plant cells. Plant Cell, 15: 2666-79

73. Dobrovinskaya O.R., Muniz J., Pottosin I.I. (1999) Inhibition of vacuolar ion channels by polyamines. J. Membrane Biol., 167: 127-140

74. Draper J. (1997) Salicylate, superoxide synthesis and cell suicide in plant defence. Trends Plant Sci., 2: 162-165

75. Durand R., Durand B. (1994) Cytokinins and reproductive organogenesis in Mercurialis. In: Cytokinins, Chemistry, Activity and Function. Eds Мок D. & Мок M.C., Corvallis, Oregon: CRC Press, pp 295-304

76. Durner J., Wendehenne D., Klessig D.F. (1998) Defense gene induction in tobacco by nitric oxide, cyclic GMP, and cyclic ADP-ribose. PNAS, 95: 10328-10333

77. Dyer J.H., Ryu S.B., Wang X. (1994) Multiple forms of phospholipase D following germination and during leaf development of castor bean. Plant Physiol., 105: 715-724

78. Ella K.M., Meier K.E., Kumar A., Zhang Y., Meier G.P. (1997) Utilization of alcohols by plant and mammalian phospholipase D. Biochem Mol Biol Int., 41: 715-724

79. Emery R.J., Leport L., Barton J.E., Turner N.C., Atkins C.A. (1998) Cis-izomers of cytokinins predominate in chickpea seeds throughout their development. Plant Physiol., 117: 1515-1523

80. Estelle M. (1998) Cytokinin action: Two receptors better than one? Current Biology, 8: 539-541

81. Fan L., Zheng S., Cui D., Wang X. (1999) Subcellular distribution and tissue Expression of phospholipase Da, Db, and Dg in Arabidopsis. Plant Physiology, 119: 1371-1378

82. Feray A., Hourmant A., Penot M., Moisan-Cann C., Caroff J. (1992) Effects of interaction between polyamines and benzyladenine on betacyanin synthesis in Amaranthus seedlings. J. Plant Physiol., 139: 680-684

83. Feuerstein B.G., Marton L.J. (1989) Specificity and binding in polyamine/nucleic acid interactions. In: The Physiology of Polyamines. Eds Bachrach U., Heimer Y.M., CRC Press, Boca Raton, FL, 1: 109-124

84. Ficker E., Taglialatela M., Wible B.A., Henly C.M., Brown A.M. (1994) Spermine and spermidine as gating molecules for inward rectifier K+ channels. Science, 266: 1068-1072

85. Friedman D.L. (1986) Polyamine-activated protein phosphatase activity in HeLa cell nuclei. Biochem. Biophys. Res. Commun., 134: 1372-1378

86. Frydman R.B., Gamarnik A. (1991) Cadaverine, an essential diamine for the normal root development of germinating soybean (Glycine max) seeds. Plant Physiol., 97: 778-785

87. Galston A.W. (1983) Polyamines as modulators of plant development. Bioscience, 33: 382-388

88. Galston A.W. and Kaur-Sawhney R. (1995) Polyamines as endogenous growth regulators. In: Plant Hormones, Physiology, Biochemistry and Molecular Biology (2nd ed). Ed Davies P.J., Kluwer Academic Publishers, Dordecht, the Nethrelands, 158-178

89. Galston A.W., Kaur-Sawhney R., Altabella Т., Tiburcio A.F. (1997) Plant polyamines in reproductive activity and response to abiotic stress. Bot. Acta., 110: 197-207

90. Gardiner J., Collings D.A., Harper J.D., Marc J. (2003) The effects of the phospholipase D-antagonist 1-butanol on seedling development and microtubule organisation in Arabidopsis. Plant Cell Physiol., 44: 687-96

91. Gerats A.G.M., Kaye C., Collins C., Malmberg R.L. (1988) Polyamine levels in Petunia genotypes with normal and abnormal floral morphologies. Plant Physiol., 86:390-393

92. Gouvea C.M.C.P., Souza J.F., Magalhaes A.C.N., Martins I.S. (1997) NO-releasing substances that induce growth elongation in maize root segments. Plant Growth Regul., 21: 183-187

93. Gow A. J., Ischiropoulos H.J. (2001) Nitric oxide chemistry and cellular signalling. J. Cell Physiol., 187:277-282

94. Guo F.-Q., Okamoto M., Crawford N.M. (2003) Identification of a plant nitric oxide synthase gene involved in hormonal signaling. Science, 302: 100103

95. Hare P.D., Van Staden J. (1994) Inhibitory effect of thidiazuron on the activity of a cytokinin oxidase isolated from soybean callus. Plant Cell Physiol., 35: 1121-1125

96. Harper J.E. (1981) Evolution of nitrogen oxide(s) during in vivo nitrate reductase assay of soybean leaves. Plant Physiol., 68: 1488-1493

97. Hoffman F., Ammendola A., Schlossmann J. (2000) Rising behind NO: cGMP-dependent protein kinases. J. Cell Sci., 113: 1671-1676

98. Hogg N., Kalyanaraman В., Joseph J., Parthasarathy S. (1993) Inhibition of low-density lipoprotein oxidation by nitric oxide. Potential role in atherogenesis. FEBS Lett., 334: 170-174

99. Hua J., Chang C., Sun Q., Meyerowitz E.M. (1995) Ethylene insensitivity conferred by Arabidopsis ERS gene. Science, 269: 1712-1714

100. Hutchison C.E., Kieber J.J. (2002) Cytokinin signaling in Arabidopsis. Plant Cell, 14: 47-59

101. Hutty A.K., Phillips A.L. (1995) Gibberellin-regulated expression in out aleurone cells of two kinases that show homology to MAP kinase and a ribosomal protei kinase. Plant Mol.Biol., 27: 1043-1052

102. Jensen A.B., Роса E., Rigaud M., Freyssinet G., Pages M. (1997) Molecular characterization of L2 lipoxygenase from mayse embryos. Plant Mol.Biol., 33: 605-614

103. Kakimoto T. (1996) CKI1, a histidine kinase homolog implicated in cytokinin signal transduction. Science, 274: 982-985

104. Kakimoto T. (2003) Biosynthesis of cytokinins. J. Plant Res., 116: 233239

105. Kakimoto T. (2003) Perception and signal transduction of cytokinins. Annu. Rev. Plant Biol., 54: 605-627

106. Kakkar R.K., Vipen K. (2002) Sawhney polyamine research in plants a changing perspective. Physiol. Plant., 116: 281

107. Kaminek M., Paces V., Corse J., Challice J.S. (1979) Effect of stereospecific hydroxylation of N6-(A2-isopentenyl)adenosine on cytokinin activity. Planta, 145: 239-243

108. Kieber J.J., Rothenberg M., Roman G., Feldmann K.A., Ecker J.R. (1993) CTR1, a negative regulator of the ethylene response pathway in Arabidopsis, encodes a member of the raf family of protein kinases. Cell, 72: 427-441

109. Klyachko N.L., Ananiev E., Kulaeva O.N. (1979) Effect of 6-benzylamino-purine and abscisic acid on protein synthesis in isolated pumpkin cotyledons. Physiol. Veget., 17: 607-617

110. Klyachko N.L., Erokhina M.A. (2003) Phytohormones and cytoskeleton. In: Phytohormones in Plant Biotechnology and Agriculture. Eds Machackova I., Romanov G.A. Kluwer Academic Publishers, Dordecht/Boston/London, pp. 249-253

111. Knetsch M.L.W., Wang M., Snaar-Jagalska B.E., Heimovaara-Dijkstra S. (1996) Abscisic acid induces mitogen-activated protein kinase activation in barley aleurone protoplasts. Plant Cell, 8: 1061-1067

112. Koenig R.L., Morris R.O., Polacco J.C. (2002) tRNA is the source of low-level trans-zeatin production in Methylobacterium spp. J. Bacteriol., 184, 7: 1832-1842

113. Kohler K.H., Conrad K. (1966) Ein quantitaver phytokinintest. Biol. Rundschau, 4: 36-37

114. Kohler K.-H., Opits K., Fritsch G. (1987) Physiology and biochemistry of the Amaranthus cytokinin bioassay and its applications. Biologia Plantarum, 29: 10-16

115. Maccarrone M., Veldink G.A., Finazzi Atro A., Vliegenthart J.F. (1995) Modulation of soybeanlipoxygenase expression and membrane oxidationby water deficit. FEBS Lett., 371: 223-226

116. Maeda Т., Wurgler-Murphy S.M., Saito H. (1994) A two-component system that regulates an osmosensing MAP kinase cascade in yeast. Nature, 369: 242-245

117. Mahonen A.P., Bonke M., Kauppinen L., Riikonen M., Benfey P.N., Helariutta Y. (2000) A novel two-component hybrid molecule regulates vascular morphogenesis of the Arabidopsis root. Genes Devel. 14: 2938-2943.

118. Marshall C.J. (1995) Specificity of receptor Tyrosine kinase signaling: transient versus sustained extracellular signal-regulated kinase activation. Cell, 80:179-185

119. Martin R.C., Мок M.C., Habben J.E., Мок D.W.S. (2001) A maize cytokinin gene encoding an O-glucosyltransferase specific to cw-zeatin. PNAS, 98,10: 5922-5926

120. Martin R.C., Мок M.C., Мок D.W.S. (1999) A gene encoding the cytokinin enzyme zeatin O-xylosyltransferase of Phaseolus vulgaris. Plant Physiol., 120: 553-558

121. Мок D.W.S., Мок M.C. (2001) Cytokinin metabolism and action. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 52: 89-118

122. Мок M.C. (1994) Cytokinins and plant development an overview. In: Cytokinins, Chemistry, Activity and Function. Eds Мок D. & Мок M.C., Corvallis, Oregon: CRC Press, pp 155-166

123. Munnik T. (2001) Phosphatide acid: an emerging plant lipid second messenger. Trends in Plant Science, 6: 227-233

124. Nicander В., Bjorkman P.O., Tillberg E. (1995) Identification of an N-glucoside of cis-zeatin from potato tuber sprouts. Plant Physiol., 109: 513-516

125. Nishimura Ch., Ohashi Y., Sato S., Kato Т., Tabata S., Ueguchi Ch. (2003) Histidine kinase homologs that acts as cytokinin reseptors posess overlapping functions in the regulation of shoot and root growth in Arabidopsis. The Plant Cell, 16: 1365-1377

126. Obrucheva N.V., Antipova O.V. (2003) Germination of horse chestnut seeds-cell growth and hormonal regulation. Seed technology 25, 2 :126-137

127. Pappan K., Austin-Brown S., Chapman K.D., Wang X. (1998) Substrate selectivities and lipid modulation of plant phospholipase D-alpha, -beta, and -gamma. Arch. Biochem. Biophys., 353: 131-140

128. Parker C.W., Badenoch-Jones J., Letham D.S. (1989) Radioimmunoassay for quantifying the cytokinins cw-zeatin and cw-zeatin riboside and its application to xylem sap samples. J. Plant. Growth Regul., 8: 93-105.

129. Proud C.G. (1994) Translation: turned on by insulin. Nature, 371: 747748

130. Qin W., Pappan K., Wang X. (1997) Molecular heterogeneity of phospholipase D (PLD): cloning of PLDy and regulation of plant PLDy, -p and -a by polyphosphoinositides and calcium. J. Biological Chemistry, 272: 28267— 28273

131. Rezka A.A., Seger R., Diltz C.D., Krebs E.G., Fisher E.H. (1995) Assosiation of mitogen-activated protein kinase with the microtubule cytoskeleton. PNAS, 92: 8881-8885

132. Romanov G.A. (1990) Cytokinins and tRNAs: a hypothesis on their competitive interaction Via specific receptor proteins. Plant, Cell & Environment, 13:751-754

133. Romanov G.A. Kluwer Academic Publishers, Dordecht/Boston/London, pp 129-139

134. Romanov G.A., Getrnan I.A., Schmulling T. (2000) Investigation of early cytokinin effects in a rapid Amaranthus seedling test. Plant Growth Regulation, 32: 337-344

135. Romanov G.A., Kieber J.J., Schmulling T. (2002) A rapid cytokinin response assay in Arabidopsis indicates a role for phospholipase D in cytokinin signaling. FEBS Lett., 515: 39-43

136. Romero-Puertas M.C., Delledonne M (2003) Nitric oxide signaling in plant-pathogen interaction. IUBMB Life, 55: 579-83

137. Ryu S.B., Wang X. (1996) Activation of phospholipase D and the possible mechanism of activation in wound-induced lipid hydrolysis in castor bean leaves. Biochim. Biophys. Acta, 1303: 243-250

138. Sakai H., Aoyama Т., Oka A. (2001) Arabidopsis ARR1 and ARR2 response regulators operate as transcriptional activators. Plant J., 24: 703-711.

139. Sakakibara H. (2003) Nitrate-specific and cytokinin-mediated nitrogen signaling pathways in plants. J. Plant Res., 116: 253-257

140. Sang Y., Cui D., Wang X. (2001) Phospholipase D and phosphatidic acid-mediated generation of superoxide in Arabidopsis. Plant Physiol., 126: 1449-1458

141. Sano H., Ohashi Y. (1995) Involvement of small GTP-binding proteins in defense signal-transduction pathways of higher plants. PNAS, 92, 10: 41384144

142. Schaller G.E., Bleecker A.B. (1995) Ethylene-binding sites generated in yeast expressing the Arabidopsis ETR1 gene. Science, 270: 1809-1811

143. Scherer G.F.E. (1996) Auxin activation of phospholipase A generated lipids, and the function of lipid-activated protein kinase. Plant Hormone Signal Perception and Transduction. Eds Smith A.R., Kluver Acad. Press, pp 185-189

144. Scherer G.F.E., Hoik A. (2000) NO donors mimic and NO inhibitors inhibit cytokinin action in betalaine accumulation in Amaranthus caudatus. Plant Growth Regul., 32: 345-350

145. Schmitz R.Y., Skoog F., Playtis A.J., Leonard N.J. (1972) Cytokinins: synthesis and biological activity of geometric and position isomers of zeatin. Plant Physiol., 50: 702-705

146. Schmulling T. (2001) CREam of cytokinin signalling: receptor identified. Trends Plant Sci., 6: 281-284

147. Schmulling Т., Schafler S., Romanov G. (1997) Cytokinins as regulators of gene expression. Physiol. Plant, 100: 505-519

148. Schmulling Т., Werner Т., Riefler M., Krupkova E., Manns I.B. (2003) Structure and function of cytokinin oxidase/dehydrogenase genes of maize, rice, Arabidopsis and other species. J. Plant Res., 116: 241-252

149. Seo S., Sano H., Ohashi Y. (1999) Jasmonate-based wound signal transduction requires activation of WIPK, a tobacco mitogen-activated protein kinase. Plant Cell, 11: 289-298

150. Serafini-Fracassini D., Del Duca S, Beninati S. (1995) Plant transglutaminases. Phytochemistry, 40: 355-365

151. Sergiev I.G., Alexieva V.S., Karanov E.N. (1995) Cytokinin and anticytokinin effects on growth and free polyamine content in etiolated and green radish cotyledons. Plant Physiol., 145: 266-270

152. Shaw G. (1994) Chemistry of adenine cytokinins. In: Cytokinins Chemistry, Activity and Function. Eds Мок D. & Мок M.C., Corvallis, Oregon: CRC Press, pp 15-35

153. Shevyakova N.I., Rakitin V.Yu., Duong D.B., Sadomov N.G., Kuznetsov VI.V. (2001) Heat shock-induced cadaverine accumulation and translocation throughout the plant. Plant Science, 161: 1125-1133

154. Skoog F., Hamzi H.Q., Szweykowska A.M., Leonard N.J., Carraway K.L., Fujii Т., Helgeson J.P., Loeppky R.N. (1967) Phytochemistry, 6: 11691192

155. Skoog F., Miller C.O. (1957) Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro. Symp.Soc.Exp.Biol., 54: 118-130

156. Soyka S., Heyer A.G. (1999) Arabidopsis knockout mutation of ADC2 gene reveals inducibility by osmotic stress. FEBS Lett., 458: 219-223

157. Stoddart J.L., Venis M.A. (1980) Molecular and subsellular aspects of hormone action. In: Hormonal Regulation of development I. Molecular Aspects of Plant Hormones. Ed. MacMilan J., Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New-York, pp 445-510

158. Surech M.R., Ramakrishna S., Adiga P.R. (1978) Regulation of arginine decarboxylase and putrescine levels in Cucumis sativus cotyledons. Phytochemistry, 17: 57-63

159. Suttle J.C., Banowetz G.M. (2000) Changes in cw-zeatin ribozide levels and biologicalactivity during tuber dormancy. Physiol. Plant., 101: 68-74

160. Taller B.J. (1994) Distribution, biosynthesis and function of cytokinins in tRNA. In: Cytokinins, Chemistry, Activity and Function. Eds Мок D. & Мок M.C., Corvallis, Oregon: CRC Press, pp 101-112

161. Tassoni A., Napier R.M., Franceschetti M., Venis M.A., Bagni N. (1998) Characterization of spermidine binding to solubilized plasma membrane proteins from Zucchini hypocotyls. Plant Physiol., 117: 971-977

162. Tassoni A., Napier R.M., Franceschetti M., Venis M.A., Bagni N. (2002) Spermidine-binding proteins. Purification and expression analysis in maize. Plant Physiol., 128: 1303-1312

163. Torrigiani P., Serafini-Fracassini D., Biondi S., Bagni N. (1985) Evidence for the subcellular localization of polyamines and their biosynthetic enzymes in plant cells. J. Plant Physiol., 124: 23-29

164. Torrigiani P., Serafini-Fracassini D., Fara A. (1989) Diamine oxidase activity in different physiological stages of Helianthus tuberosus tuber. Plant Physiol., 89: 69-73

165. Tun N.N., Hoik A., Scherer G.F.E. (2001) Rapid increase of NO release in plant cell cultures induced by cytokinin. FEBS Lett., 509: 174-176

166. Uphold S.J., Van Staden J. (1991) Polyamines and carnation senescence: endogenous levels and the effect of applied polyamines on senescence. Plant Growth Regul., 10: 355-362

167. Urao Т., Yakubov В., Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K. (1998) Stress-responsive expression of genes for two-component response regulatorlike proteins in Arabidopsis thaliana. FEBS Lett., 427: 175-178

168. Van Staden J., Cook E.L., Nooden L.D. (1988) Cytokinins and senescence. In: Cytokinins, Chemistry, Activity and Function. Eds Мок D. & MokM.C., Corvallis, Oregon: CRC Press, pp 281-328

169. Veach Y.K., Martin R.C., Мок D.W.S., Malbeck J., Vankova R., Мок M.C. (2003) O-glucosylation of cw-zeatin in maise. Characterization of genes, enzymes, and endogenous cytokinins. Plant Physiol., 131: 1374-1380

170. Veronesi C., Rickauer M., Fournier J., Pouenat M.L., Esquerre-Tugaye M.T. (1996) Lipoxygenase gene expression in the tobacco-Phytophthora parasitica nicotianae interaction. Plant Physiol., 112: 997-1004

171. Walden R., Cordeiro A., Tiburcio A.F. (1997) Polyamines: small molecules triggering pathways in plant growth and development. Plant Physiol., 113: 1009-1013

172. Walker M.A., Roberts D.R., Shih C.Y., Dumbroff E.B. (1985) A requirement for polyamines during the cell division phase of radicle emergence in seeds of Acer saccharum. Plant Cell Physiol., 26: 967-971

173. Wendehenne, D., Pugin, A., Klessig, D.F. and Durner, J. (2001) Nitric oxide: comparative synthesis and signaling in animal and plant cells. Trends Plant Sci., 6: 177-183

174. Werner Т., Motyka V., Strnad M., Schmulling T. (2001) Regulation of plant growth by cytokinin. PNAS, 98: 10487-10492

175. Yonekura-Sakakibara K., Kojima M., Yamaya Т., Sakakibara H. (2004) Molecular characterization of cytokinin-responsive histidine kinases in maize.Differential ligand preferences and response to си-zeatin. Plar^Physiol., 134: 1654-1661