Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование цитокининов, продуцируемых ризосферными микроорганизмами

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Архипова, Татьяна Николаевна, Уфа

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК УФИМСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ

На правах рукописи

АРХИПОВА ТАТЬЯНА НИКОЛАЕВНА

УДК 577.175.14

ИССЛЕДОВАНИЕ ЦИТОКИНИНОВ, ПРОДУЦИРУЕМЫХ РИЗОСФЕРНЫМИ МИКРООРГАНИЗМАМИ

(Специальность 03.00.12 - физиология растений)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: к.м.н. С.Ю. Веселое

Научные консультанты: д.б.н. Г.Р.Кудоярова к.т.н. А.И.Мелентьев

Уфа - 1999

ВВЕДЕНИЕ 4

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7

1.1. Цитокинины 7

1.2. Некоторые аспекты практического применения цитокининов 13

1.3. Микроорганизмы, синтезирующие цитокинины 16

1.4. Микроорганизмы как агенты биологического метода борьбы с заболеваниями растений 22

1.5. Методы определения цитокининов 27

1.6. Методы анализа цитокининов, продуцируемых микроорганизмами 34

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 36

2.1. Используемые в работе материалы и реактивы 36

2.2. Объекты и методы исследования 37

2.2.1. Объекты исследований 37

2.2.2. Приготовление конъюгатов цитокининов с белком 38

2.2.3. Получение антисыворотки к цитокининам 38

2.2.4. Твердофазный иммуноферментный анализ 39

2.2.4.1. Определение цитокининов 39

2.2.4.2. Определение ИУК и АБК 40

2.2.4.3. Определение неспецифического ингибитора иммунологи ческой реакции антиген-антитело в культуральной жидкости 41

2.2.5. Экстракционная очистка цитокининов 41

2.2.6. Ионообменная хроматография 41

2.2.7. Тонкослойная хроматография 42

2.2.8. Ультрафильтрация 42

2.2.9. Приготовление аффинного носителя 42

2.2.10. Иммуноаффинная хроматография 42

2.2.11. Высокоэффективная жидкостная хроматография в сочетании с масс-спектрометрией 43

2.2.12. Разделение свободных и связанных форм цитокининов 43

2.2.13. Определение молекулярного веса комплекса неспецифического ингибитора с цитокининами 43

2.2.14.УФ-спектрометрия 44

2.2.15. Биотест на цитокинины 44

2.2.16. Определение глюкозы 45

2.3.Статистическая обработка 45

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 46

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 83

5. ВЫВОДЫ 91

6. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 93

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность. В процессе своей жизнедеятельности растения входят в сложные взаимоотношения с микроорганизмами, населяющими почву (Звягинцев и др., 1993). Микроорганизмы, окружающие растение в естественных условиях обитания, могут оказывать влияние на их рост и развитие. Предполагается, что одним из факторов воздействия является способность некоторых бактерий и грибов продуцировать гормоны растений (Мишке, 1988). Однако до сих пор остается неясным, в какой мере гормоны, продуцируемые микроорганизмами, влияют на физиологические процессы растений. Более ясное понимание характера влияния на растения гормонов, синтезируемых микроорганизмами, могло бы способствовать разработке эффективных рост-регулирующих препаратов как на основе самих гормон-продуцирующих микроорганизмов, так и синтезируемых ими гормонов. В настоящее время исследования по микробной продукции гормонов сфокусировались преимущественно на микроорганизмах, которые являются патогенами высших растений или входят с ними в симбиоз (Green, 1980), причем последним уделялось гораздо меньше внимания. В лаборатории прикладной микробиологии Института биологии УНЦ РАН было показано, что предпосевная обработка семян препаратом из микроорганизмов, отобранных по их способности подавлять рост патогенных для растений грибов, не только повышает устойчивость растений к грибным болезням, но и вызывает ряд эффектов, которые указывают на возможную продукцию данными микроорганизмами гормонов. Биотестирование, проведенное в лаборатории прикладной микробиологии, давало основание предполагать, что этими гормонами могли быть цитоки-нины, что не было до конца установлено. Проблема исследования продукции фитогормонов микроорганизмами, их влияния на рост и развитие растений в первую очередь связана со сложностью достоверного определения регуляторов роста растений. Применение антител к гормонам с целью увеличения селективности детекции и высокая чувствительность иммуноанализа может по-

зволить на новом уровне решить проблему количественного определения гормонов, синтезируемых микроорганизмами.

Все сказанное наметило цель работы, которая состояла в разработке методов идентификации и количественного определения цитокининов, что необходимо для изучения данных гормонов, продуцируемых ризосферными микроорганизмами.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1) Сконструировать иммуноферментную тест-систему с расширенной специфичностью для первичного скрининга бактерий, способных к продукции цитокининов.

2) Используя полученную тест-систему, отобрать штаммы-продуценты цитокининов из коллекции культур Института биологии Уфимского научного центра РАН.

3) Разработать методы очистки, разделения и количественного опреде ления отдельных форм цитокининов, синтезируемых микроорганизмами.

Научная новизна. Обнаружено изменение содержания гормонов у растений пшеницы, семена которых были обработаны препаратами на основе ризосферных микроорганизмов-антагонистов фитопатогенов. Создана имму-ноферментная тест-система с расширенной специфичностью, позволяющая выявлять присутствие основных форм гормонов растений из класса цитокининов. С помощью представленной тест-системы среди ризосферных микроорганизмов-антагонистов фитопатогенов был произведен скрининг штаммов, способных синтезировать цитокинины. В результате был выявлен штамм-суперпродуцент цитокининов Bacillus subtilis ИБ-22. Разработана схема количественного определения отдельных форм цитокининов, продуцируемых ризосферными микроорганизмами, включающая иммуноаффинную хроматографию, термообработку, тонкослойную хроматографию и иммуннофермент-ный анализ. Впервые в культуральной жидкости штамма Bacillus subtilis ИБ-22 обнаружена и охарактеризована новая связанная форма цитокининов,

представляющая собой комплекс фитогормона с полисахаридом. Установлено, что связь гормона с полисахаридом носит нековалентный характер и ци-токинины макромолекулярного комплекса обладают биологической активностью. Показано, что в состав комплекса преимущественно входят рибозид зеатина и его нуклеотид; минорные компоненты представлены изопентенила-денозином и изопентениладенином.

Практическая ценность. Разработанные методы могут быть использованы для отбора штаммов-продуцентов цитокининов, при мониторинге биотехнологического синтеза цитокининов, а также при изучении взаимодействия микроорганизмов с растениями.

Апробация работы. Основные положения работы были представлены на П-ой Всесоюзной конференции «Регуляторы роста и развития растений» (Москва, 1992), 4-м Объединенном симпозиуме Фламандского общества физиологов растений и Комиссии по физиологии растений Королевского Голландского ботанического общества (Дипенбик, 1993), 5-ом международном симпозиуме по исследованию корней (Южная Каролина, 1996), 1У-ом съезде биохимического общества Российской академии наук (Москва, 1997).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Автор выражает искреннюю признательность и благодарность своему научному руководителю Веселову Станиславу Юрьевичу за постоянную помощь на всех этапах выполнения работы. Ценные советы, замечания и доброжелательное отношение д.б.н. Кудояровой Г.Р. помогли мне в решении многих вопросов, возникавших в ходе работы. Автор благодарен к.т.н. Ме-лентьеву А.И. за помощь в работе и ценные замечания. Особую признательность автор выражает Симонян М.В. и Хисматуллиной А.Т. за помощь в проведении экспериментов, а также благодарит всех сотрудников лабораторий физиологии растений и прикладной микробиологии за всестороннюю помощь и поддержку.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Цитокинины

Цитокинины - класс растительных гормонов, известный как фактор, «ответственный» за деление клеток (Miller et al., 1955). Первым цитокинином (ЦК), выделенным из растений, был зеатин (Letham, 1963; Letham, 1973). Природные цитокинины являются производными пурина, а именно аденина. Известны также синтетические производные аденина, которые обладают ци-токининовой активностью. Это 6-бензиламинопурин (БАП) и 6-фурфириламинопурин (кинетин). С точки зрения химической природы большинство цитокининов можно разделить на три группы, каждая из которой базируется на трех основных представителях каждой группы, а именно - зеатине (3), дигидрозеатине (ДЗ) и изопентениладенине (ИПА). Все эти соединения могут существовать как в свободном виде, так и в качестве рибозидов (рибоза находится в положении N9 пуринового кольца), риботидов (т.е. фосфатных производных рибозидов) или глюкозидов (глюкоза может находиться в N7 или N9 положении; или присоединяться через кислород в боковой цепи) (Jackson, 1993). Атом углерода в положении 2 может нести в качестве заместителя водорода метальную или метилтиогруппу. По крайней мере около 30 различных цитокининов были идентифицированы с помощью GC/MS, хотя только несколько растительных видов было проанализировано всесторонне (McGaw, 1987).

Существует связь между химической структурой и физиологической активностью. Присоединение дополнительных радикалов к пуриновому кольцу, как правило, снижает цитокининовую активность соединения (Кулаева, 1973; Skoog et al., 1967; Дерфлинг,1985). Стереохимия двойной связи в боковой цепи играет определенную роль в проявлении активности. Присутствующие в природных источниках цис- и транс-формы зеатина активны, однако активность цис-формы в биотесте с каллусом табака значительно ниже (Hall,

Shrivastava, 1968). Хотя в последнее время показана способность взаимопревращения цис- и транс-$(урм (Bassi et al., 1993).

Цитокинины найдены не только в свободном виде, но и в качестве минорных компонентов т-РНК (Nishimura, 1972). Основной цитокинин, встречающийся в т-РНК многих организмов, - рибозид изопентениладенина (ИПАР); он же является единственным цитокинином, который присутствует в т-РНК животных (Robins et al., 1967). В высших растениях и микроорганизмах помимо ИПАР в состав т-РНК входят метилтиоизопентениладенозин, зеатинрибозид (ЗР) и метилтиозеатинрибозид (Armstrong et al., 1976; Petersen, 1973). Все т-РНК, содержащие цитокинины, узнают кодоны, в которых первым основанием является урацил. Цитокининовые нуклеозиды, встречающиеся в т-РНК, всегда находятся в одном положении, примыкая З'-концу антико-дона (Armstrong et al., 1969). Физиологическое значение цитокининовых производных т-РНК в качестве растительных гормонов не было установлено вследствие того, что скорость превращения т-РНК, которая была бы необходима для накопления цитокинина, не была исследована (Letham, Palni, 1983; McGaw, 1987). Имеется ряд доказательств того, что цитокинины в растении скорее всего синтезируется без участия деградации т-РНК (Letham, 1978; Полевой, 1982). Однако, по мнению Р.Хоргана (Horgan, 1992), этот путь образования цитокининов в растении не должен быть полностью исключен.

Прогресс в изучении биосинтеза цитокининов был достигнут благодаря экспериментам на опухолевых тканях. Исследования в области молекулярной биологии Ti плазмиды из бактерии Agrobacterium tumefaciens позволил осуществить клонирование и экспрессию in vitro двух генов, кодирующих ферменты биосинтеза цитокининов (Klee et al., 1984). Дальнейшие исследования позволили установить ключевую реакцию этого процесса. Она представляет собой присоединение диметилаллилпирофосфата в N6 позиции к адено-зинмонофосфату (AMP) при помощи изопентенилтрансферазы с образованием цитокининриботида, М6У2-изопентенилАМР. В настоящее время из экс-

тракта бактерий выделен, очищен и детально охарактеризован фермент, катализирующий эту реакцию (изопентилтрансфераза) (Morris, 1986).

Несмотря на то, что был сделан быстрый прогресс в понимании биосинтеза цитокининов в системе опухолевых тканей, его изучение в нормальных растительных тканях и целом растении все еще остается проблемой. Установлено, что растения обладают ферментами, способными катализировать вышеописанную реакцию (Chen, 1982). То есть, в растительном экстракте была обнаружена активность данного фермента, но до сих пор выделить и очистить его не удавалось (Horgan, 1992). И, несмотря на доказательства включения меченого аденина в цитокинины в отдельных случаях (Wang et al., 1981), явная демонстрация биосинтеза цитокининов в целых растениях и растительных тканях затруднена.

Физиологически важный вопрос о том, как происходит и где локализуется биосинтез цитокининов в растении в настоящее время ясно не освещен (Horgan, 1992). Однако, большинство косвенных данных, а именно: обнаружение цитокининов в пасоке растений (Кулаева, 1973; Palmer,Wong, 1985), резкое снижение содержания этих гормонов в побегах, лишенных корней (Дерфлинг, 1985; Овсянникова, 1985), возрастание уровня цитокининов после укоренения побегов (Тоггеу, 1976), свидетельствуют в пользу того, что цитокинины синтезируются в корнях.

Метаболизм цитокининов включает превращение N6V2-изопентенилАМР в другие ^-замещенные производные аденина (В inns, 1994). Основными превращениями являются дефосфорилирование и дерибо-зилирование, в результате чего образуются рибозиды и свободные основания, соответственно; а также гидроксилирование боковой цепи с образованием производных транс-зеатина и восстановление боковой цепи, в результате которой образуются производные дигидрозеатина. Эти соединения могут также затем метаболизироваться с образованием О-глюкозида зеатина или дигидрозеатина или N-глюкозида в 7 и 9 позициях аденинового основания. Как было

показано Торнер, сахара, отличные от глюкозы и рибозы (например, ксилоза) также могут быть присоединены к молекуле цитокининов (Turner et al., 1987). Цитокинины могут деградировать с помощью фермента цитокининоксидазы, которая удаляет изопентильную боковую цепь с образованием аденина или аденозина (Letham, Palni, 1983; Chatfield, Armstrong, 1986; Burch, 1989).

До сих пор остается актуальным вопрос о том, какие цитокинины являются физиологически активными и одинаковы ли они для каждого вида растений и ткани. Цитокининовые рибозиды и их свободные основания - наиболее вероятные кандидаты в «активные» формы (Van Staden, Drewes, 1991). С другой стороны, есть данные о том, что гидролиз рибозидов до соответствующих оснований является непременным условием для проявления биологической активности (Laloue, Pethe-Terrine, 1982). Показано, что N-глюкозиды и аланиновые конъюгаты являются более стабильными и проявляют низкую биологическую активность in vitro (Horgan, 1992; Eklof et al., 1997). Напротив, О-глюкозиды могут деглюкозилироваться и участвовать в регуляции содержания активных цитокининов (Letham, Palni, 1983; Van Staden, Drewes, 1991).

Р.Хорган предлагает определиться между тем, что могут делать экзо-генно примененные цитокинины и как гормоны функционируют эндогенно (Horgan, 1992). В случае цитокининов спектр физиологических эффектов, полученных после внешнего применения гормонов, очень большой; возможно, более широкий, чем у всех остальных гормонов. Разнообразие действия цитокининов приводит к мнению, что они (цитокинины) вовлечены почти во все фазы развития растений (Horgan, 1992).

Наиболее специфическим действием цитокининов является стимуляция клеточного деления. Такая способность цитокининов была обнаружена при работе с культурами клеток (Skoog et al., 1967), большинство из которых не могут делиться, если в среду не добавлен этот гормон. Показана способность цитокининов влиять не только на деление клеток, но и на их растяже-

ние, что наиболее ярко проявляется на примере регуляции цитокининами роста клеток мезофилла листа (Miller, 1963; Кулаева, Цибуля, 1974).

Цитокинины устраняют явление апикального доминирования, стимулируя рост боковых побегов (Aung, 1986; Li, Bangerth, 1990). Они способны активировать прорастание семян, выход клубней и почек древесных видов растений из состояния покоя; ускорять рост побегов и формирование новых почек; задерживать процессы старения (Kende, 1964; Тао et al., 1983) и продлевать жизнь отделенных от растения листьев, предотвращая распад хлорофилла (Кулаева, 1982; Шакирова и др., 1982); уменьшать степень деградации листовых структур (Кулаева, 1982).

Установлено, что цитокинины ингибируют рост корней в длину (Van Staden, Harty, 1988) и особенно формирование боковых корней (Дерфлинг, 1985). Однако, использование низких концентраций гормонов иногда давало стимулирующий эффект (Блохин, 1986; Nandi et al., 1989).

Экзогенные цитокинины ускоряют (Pharis, 1972) и реже ингибируют (Krekule, Seidlova, 1977) инициацию цветения у различных видов растений в зависимости от количества гормонов и времени обработки (Чайлахян, 1988). Они играют важную роль в определении пола цветков. Показано, что ЦК способствует формированию женских цветков у конопли, огурца, кукурузы (Полевой, 1982).

Цитокинины способствуют образованию проводящей системы растений (Гамалей, 1972). Кинетин ускорял дифференцировку вторичной ксилемы древесных растений на ранних стадиях этого процесса (Little, Pharis, 1995).

Цитокинины оказывают влияние на фотосинтетический аппарат, световые реакции фотосинтеза и метаболизм уг