Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование антител для количественного определения, очистки и локализации регуляторов роста растений и их метаболитов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Веселов, Станислав Юрьевич, Уфа

tp

.J' Jf *У

МИНИСТЕРСТВО ОБЩЕГО И ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

;на правах рукописи

- ОР/:

^^Е.СЕЛПВ-ХТ'.АНИСДАВ

ЮРЬЕВИЧ

УДК 577.175.1:57.083.3

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АНТИТЕЛ ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ, ОЧИСТКИ И ЛОКАЛИЗАЦИИ РЕГУЛЯТОРОВ РОСТА РАСТЕНИЙ И ИХ МЕТАБОЛИТОВ

03.00.04 - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Уфа - 1999

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Способность растения регулировать свои функции и обеспечивать согласованный ответ на внешние воздействия на уровне целого организма определяет их выживание в постоянно изменяющихся условиях обитания. Основная роль в интегративных процессах отводится фитогормо-нам. Полное понимание того, как именно гормоны растений осуществляют свою регуляторную 'функцию, является необходимой предпосылкой использования гормонов для управления жизнью растения в нужном человеку направлении. Однако, в гормональной теории все еще остается много неясного. Так предполагается, что в основном регуляторная функция гормонов реализуется через изменение их концентрации (Холодный, 1935; Went, 1936; Leopold, Nooden, 1994). Следует отметить, что до сих пор до конца не ясно, каким образом растение контролирует концентрацию своих гормонов. По крайней мере требует выяснения относительная роль систем синтеза, транспорта и дальнейшей биоконверсии гормонов в регуляции их концентрации. У растений могут накапливаться весьма значительные количества запасных форм гормонов (Reinecke, Banduski, 1987). Предполагается, что взаимопревращение свободных и запасных форм гормонов - это альтернативный, возможно наиболее важный, способ регуляции их концентрации, степень мобильности которого практически еще не изучалась. Дефицит знаний о том, как растение регулирует концентрацию своих гормонов, может быть причиной того, что до сих пор применение регуляторов роста в растениеводстве не дало ожидаемых результатов.

Недостаточность сведений о принципах функционирования гормональной системы растений связана со сложностью изучения гормонов, что объясняется очень низким содержанием регуляторов роста в тканях и необходимостью их длительной очистки перед определением с помощью физико-химических методов. Поэтому применение антител к гормонам с целью увеличения селективности детекции и высокая чувствительность иммуноанали-

за позволяет на новом уровне решить проблему количественного определения гормонов. В то же время использование антител для одностадийной очистки гормонов с помощью иммуноаффинной хроматографии может сделать гораздо менее трудоемкими физико-химические методы анализа. Еще одно перспективное направление в гормонологии связано с применением иммуно-химических методик в сочетании с гистологической техникой для изучения функционального значения распределения фитогормонов на уровне клеток и тканей.

Вместе с тем за время, прошедшее после первых попыток использования антител для изучения гормонов растений (Pengelly, Meins, 1977; Weiler, 1979), стало очевидно, что несмотря на колосальные возможности нового подхода, его необдуманное применение таит опасность получения артефактов. Наличие в растительных объектах компонентов, обеспечивающих специфическую и неспецифическую интерференцию, требует разработки способов повышения специфичности анализа и обозначения пределов необходимой и достаточной степени очистки образцов для получения достоверных результатов. С другой стороны могут возникнуть ситуации, когда необходимо расширять специфичность анализа. Например, при отборе синтетических гормонподобных соединений, скрининге микроорганизмов-продуцентов фитогормонов и др.

Довольно большое разнообразие применявшихся и описанных в литературе подходов для изучения гормонов растений с помощью иммунохими-ческих методов обуславливает необходимость обобщения накопленного опыта. В то же время наметившийся новый уровень исследования метаболизма регуляторов роста растений требует и новых нестандартных решений.

Цель настоящей работы состояла в разработке принципов регулирования специфичности, чувствительности, а также надежности иммунохими-ческих методов изучения гормонов и демонстрации их возможностей в ис-

следовании различных аспектов биохимии регуляторов роста растений. Для этого было необходимо:

1. Получить антитела к гормонам: ИУК, АБК и цитокининам (зеатинрибозиду, дигидрозеатинрибозиду и изопентениладенозину), - и на этой основе приготовить тест-системы для их количественного определения.

2. Изучить влияние разведения иммунореагентов, химической модификации гаптенов, замены гормонов в гомологичных системах на их структурные аналоги, а также использование систем усиления сигнала на специфичность и чувствительность иммуноанализа регуляторов роста растений.

3. Разработать методы устранения интерференции за счет повышения селективности экстракционной очистки, иммуноаффиной хроматографии и сочетания хроматографического разделения с иммуноферментным анализом.

4. Провести сравнение иммунохимических и физико-химических методов количественного определения и идентификации фитогормонов.

5. Оценить возможности иммуноанализа для отбора гормоноподобных синтетических соединений путем определения физиологической активности отобранных веществ.

6. Исследовать особенности определения гормонов, продуцируемых ризосферными микроорганизмами, иммунохимическими методами.

7. Провести исследование метаболических превращений гормонов с помощью иммунохимических методов, включая сопоставление динамики гормонов и их иммунореактивных метаболитов в онтогенезе на фоне различных воздействий.

8. Разработь метод гистохимической локализации гормонов растений с использованием антител и продемострировать его возможности на примере исследования трансгенных растений, отличающихся гиперпродукцией гормонов.

Научная новизна. Обоснованы теоретические и практические аспекты регулирования специфичности иммуноанализа в системе с твердофазным антиге-

ном за счет изменения концентрации специфических поликлональных антител или замены антигена на его структурный аналог. Направленное регулирование параметра может быть использовано как для более надежного определения индивидуальных веществ благодаря увеличению специфичности анализа, так и поиска биологически значимых структурных аналогов антигена в случае расширения специфичности тест-системы. На этой основе предложен новый способ отбора синтетических гормонподобных соединений с применением антител к природным фитогормонам. Лабораторные и полевые испытания отобранных химических веществ выявили их биологическую активность и подтвердили эффективность и надежность метода.

Предложена иммуноферментная тест-система с расширенной специфичностью для отбора цитокининпродуцирующих микроорганизмов. Разработана схема подготовки бактериальной культуральной жидкости к иммуноанализу, обеспечивающая нивелирование неспецифической интерференции и надежную количественную оценку продукции цитокининов ризосферными микроорганизмами. В процессе исследования фитогормонов, продуцируемых В. виЫШБ, впервые обнаружен и охарактеризован высокомолекулярный комплекс цитокининов с полисахаридом.

Разработаны тест-системы с усилением сигнала для определения цитокининов и ауксинов на основе циклических окислительно-восстановительных реакций. Применение данного подхода в 50 раз повысило чувствительность традиционного иммуноферментного анализа и позволило принципиально решить вопрос о возможности изучения транспорта цитокининов с ксилем-ным потоком в растительных проростках и индикации ауксинподобных гербицидов в окружающей среде.

Показано, что модифицированный метод экстракционной очистки гормонов АБК и ИУК, с уменьшением объема экстрагента на каждой стадии экстракции и реэкстракции, обеспечивает повышение селективности очистки и надежности результатов иммуноанализа. Разработана схема иммуноанализа

различных форм цитокининов, основанная на сочетании их иммуноаффинной очистки, ферментативной и химической модификации иммунореактивности и хроматографического фракционирования, обеспечивающая раздельное определение свободных оснований, рибозидов, 9N-, О-глюкозидов и нуклеотидов.

Путем сопоставления динамики АБК, цитокининов и их метаболитов показана роль метаболических превращений гормонов в органе, дистанцирова-ном от места восприятия внешних воздействий, в быстрой передаче сигналов по растению.

Разработана новая методика оценки активности фермента цитокинин оксид азы на основе иммуноферментной регистрации убыли экзогенного изо-пентениладенозина, исключающая применение радиоактивных изотопов. С использованием этого подхода показано, что быстрое снижение концентрации цитокининов в побегах проростков пшеницы под влиянием охлаждения их корней происходит за счет усиления активности процессов, обеспечивающих деградацию гормона.

Сравнение динамики зеатина и его конъюгатов, выполняющих запасную функцию, а также изопентениладенозина, являющегося первым продуктом в цепи синтеза цитокининов в растении, подтвердило способность изолированных листьев к синтезу цитокининов de novo.

С помощью иммуногистохимического метода изучена локализация цитокининов в клетках листьев растений табака разного возраста, трансформированных с помощью конструкции, содержащей индуцируемый светом ipt-TQH. Показано, что уровень иммунного окрашивания зависит не только от содержания гормонов в клетках, но их компартментизации, определяющей доступность гормона для его фиксирования

Практическая ценность. Использование разработанного нами высокопроизводительного и надежного метода иммуноанализа гормонов растений способствует повышению эффективности исследований в области биохимии, физиологии и биотехнологии растений. Предложенный способ первичного

скрининга гормоноподобных соединений позволяет повысить производительность отбора потенциальных регуляторов продуктивости и устойчивости растений. Обнаруженная способность ауксиподобных гербицидов реагировать с антителами к ИУК в сочетании с методом, обеспечивающим повышение чувствительности реакции за счет усиления сигнала, и методом, позволяющим инактивировать ИУК на фоне сохранения неизменного количества синтетических ауксинов, может явиться основной для разработки тест-систем для контроля остаточных количеств ауксинподобных гербицидов в окружающей среде и пищевых продуктах. Выявленные с помощью иммуноанали-за закономерности в регуляции метаболизма гормонов при стрессе могут быть использованы для разработки эффективных технологий применения синтетических регуляторов для повышения устойчивости и продуктивности растений. Данные по теоретическим основам иммуноанализа фитогормонов включены в программу спецкурса "Современные биохимические методы исследования в физиологии растений" на биологическом факультете Башкирского государственного университета. Изданы соответствующие методические пособия.

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на 5 Всесоюзном биохимическом съезде (Москва, 1986), 1 и 2 Всесоюзной школе-семинаре по иммуноферментному анализу фитогормонов (Уфа, 1988 и 1990), 7 Конгрессе Федерации европейских обществ физиологов растений (ФЕОФР) (Швеция, 1990), 8 Конгрессе ФЕОФР (Антверпен, 1992), 3 Всероссийском съезде физиологов растений (С-Петербург, 1993), Рабочем совещании "Регуляторы роста и развития растений" (Москва, 1993), 9 Конгрессе ФЕОФР (Брно, 1994), Международном Симпозиуме "Рецепция и трансдукция гормональных сигналов" (Москва, 1994), Симпозиуме "Корни растений: от клеток к системам" (Бристоль, 1996), Симпозиуме "Физико-химические основы физиологии растений" (Пенза, 1996), 10 Конгрессе ФЕОФР (Флоренция, 1996), 5-м Симпозиуме Международного общества по изучению корней (Южная

Каролина, 1996), четвертой международной конференции "Регуляторы роста и развития растений" (Москва, 1997), 3-м ежегодном Симпозиуме ВОФР "Физико-химические основы физиологии растений и биотехнологии"( Москва, 1997), втором съезде биохимического общества РАН (Москва, 1997), 5-м международном симпозиуме "Структура и функция корней (Словакия, 1998), 11 Конгрессе ФЕОФР (Варна, 1998).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 48 работ.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом для исследования служили растения кукурузы (Zea mays L.) гибрида Слава, пшеницы (Tr. durum L.) сорта Безенчукская 139, табака (Nicotiana tobaccum L.) сорта Petit Havana SR-1, линии HSIPT и PSSUIPT.

В опытах с этиолированными проростками растения пшеницы и кукурузы выращивали в термостате, при 24° С. В остальных случаях - в ростовой камере с лампами ЗН и ДНАТ-400, освещенностью 18000 лк и 16-часовой продолжительностью светового дня. Растения в основном выращивали в водной культуре или в гравии на смеси Хогланда-Арнона-1 (Х-А).

Конструкция плазмиды, трансформация дисков листьев табака Nicotiana tabaccum L. сорта Петит Гавана SR-1 и регенерация растения из каллуса были описаны ранее (Beinsberger et al, 1991). Семена трансгенных и исходных растений проращивали и прекультивировали в стерильных условиях в чашках Петри на 1 %-ном агаре, приготовленном на среде Murashige, Skoog. В случае трансгенных растений в среду добавляли сульфат канамици-на (50 мг/мл). Через 4 недели растения переносили в полиэтиленовые горшки с землей. Растения выращивали в теплице (относительная влажность воздуха: 65 %, освещенность 0,15 ммоль кв м~2 с"1). Их поливали водопроводной водой и раз в неделю 50 % -ным раствором Хогланда-Арнона.

Бактериальные штаммы и культуральная среда. В данной работе использовали бактерии рода Bacillus, выделенные из почвы и проявлявшие антагонизм по отношению к грибам рода Fusarium (Мелентьев, Еркеев, 1990). Бактерии выращивали на следующей среде: пептон - 0,3 %, дрожевой экстракт - 0,3 %, крахмал - 1%, кукурузный экстракт - 0,3 %, К2НРО4 - 0,2 % (N£[4)2804 - 0,2%. Культивирование бактерий осуществляли на шейкере (160 об./мин) при 37° С. Биомассу собирали на поздней логарифмической фазе роста или в начале стационарной фазы (обычно на третий день). Культураль-ную жидкость центрифугировали при 10000 об./мин и супернатант сразу же анализировали или хранили при -15 0 С.

С целью очистки и концентрирования ауксинов, абсцизовой кислоты (АБК) и цитокининов (ЦК) растительный материал гомогенизировали и экстрагировали 80 %-ным этанолом в соотношении 1:10 в течение 16 часов при 4° С. Спиртовый экстракт отделяли центрифугированием, упаривали до водного остатка, отделяли аликвоту для определения цитокининов и после разведения остальной части водного остатка и его подкисления до pH 2-3 1 н HCl экстрагировали индолилуксусную кислоту (ИУК) и АБК дважды диэти-ловым эфиром в соотношении 1:3 (органическая фаза/водная фаза). Из объединенной органической фазы кислые ауксины и АБК реэкстрагировали 1 % гидрокарбонатом натрия, взятым в соотношении 1:3 (водная фаза/органическая фаза). Органическую фазу отделяли и отбрасывали, а из водной (после подкисления до pH 2-3) вновь дважды извлекали ауксины диэти-ловым эфиром и метилировали их диазометаном (Кислин и др., 1982).

Гидролиз связанных ауксинов проводили при pH 12, 70° С в течение 1 часа, после чего из гидролизата извлекали ауксины по приведенной выше схеме.

Приготовление конъюгатов гормонов с белком. Индолилуксусную кислоту и АБК ковалентно связывали с человеческим сывороточный альбумином (ЧСА) или овальбумином (ОВА) с помощью карбодиимида (Weiler, 1979).

Конъюгат щелочной фосфатазы и ИУК для прямого варианта иммуно-ферментного анализа готовили также с использованием карбодиимида (Weileret. al., 1981).

Рибозилированные цитокинины конъюгировали с белком по методу, предложенному Эрланджером и Бейсером (Erlanger & Beiser, 1964) с некоторыми модификациями. 10 мг фитогрмона растворяли в 5 мл 0,01 M периодата натрия и оставляли на 20 минут при комнатной температуре. Избыток периодата устраняли добавлением 0,3 мл 0,1 M этиленгликоля. К реакционной смеси приливали по каплям белок, растворенный в воде (100 мг в 5 мл). В

течение всего периода инкубации смеси (2 ч при 20 °С) поддерживали рН 9,4. Конъюгат стабилизировали добавлением 10 мг боргидрида натрия, доводили рН раствора до 6,5 и диализовали против физиологического раствора.

Иммунизацию кроликов проводили введением внутримышечно 1 мг конъюгата гормона с ЧСА в смеси с 0,5 мл полного адъюванта Фрейнда. Повторные иммунизации с интервалом в 2 недели выполняли в течение 3 месяцев, используя то же количество иммуногена, смешанного с 0,5 мл неполного адъюванта Фрейнда. Через неделю после последней иммунизации от каждого кролика собирали по 25-30 мл крови и отделяли сыворотку.

Очистку сыворотки против АБК от антител к сайту связывания белка с гаптеном проводили,