Регуляция транскрипции цитокинин-связывающим белком 70 кД кукурузы

Бровко, Федор Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Регуляция транскрипции цитокинин-связывающим белком 70 кД кукурузы
ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Регуляция транскрипции цитокинин-связывающим белком 70 кД кукурузы"

11-5 1041

На правах рукописи

БРОВКО ФЕДОР АЛЕКСАНДРОВИЧ

РЕГУЛЯЦИЯ ТРАНСКРИПЦИИ ЦИТОКИНИН-СВЯЗЫВАЮЩИМ БЕЛКОМ 70Кд КУКУРУЗЫ

03.01.05 - ФИЗИОЛОГИЯ И БИОХИМИЯ РАСТЕНИЙ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Пущино - 2011

Работа выполнена в филиале Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, г. Пущино.

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор

Кулаева Ольга Николаевна

Официальные оппоненты:

академик, доктор биологических наук, профессор

Тарчевский Игорь Анатольевич

доктор биологических наук

Клячко Нелли Леопольдовна

доктор биологических наук, профессор

Ерохин Юрий Евдокимович

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт физиологии и биохимии растений и микроорганизмов РАН, г. Саратов

Диссертационного совета Д 002.066.01 при Учреждении Российской академии наук Институте фундаментальных проблем биологии РАН, по адресу 142290, Московская обл., г. Пущино, ул. Институтская, 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии паук Института фундаментальных проблем биологии РАН, Московская обл., г. Пущино.

Автореферат разослан «_» октября 2011 г.

Ученый секретарь /¿Г

Диссертационного совета / " Г.Н. Назарова

кандидат биологических наук ,'/

Защита состоится «_».

.2011 г. в «.

_» часов на заседании

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ БИБЛИОТЕКА 2011

1. Общпи характеристика работы.

1.1. Актуальность проблемы. Цнтокипппы, открытые как факторы, реплирующие деление

клеток растений [Miller el al 1955], о6л;щшот широким спектром активностей, они не толi.ко активируют деление клеток, по и регулируют днфференцнровку побегов, активируют биогенез хлоропластов, задерживают старение, участвуют в регуляции транспорта веществ по растению и в регуляции азотного метаболизма [Кунаева 1982: Мок and Мок 2001: Nashimura el al 2004; Argueso el al., 2009]. Значительный прогресс в исследовании механизма действия цитокишшов достигну!" благодаря открытию мембранных рецепторов, являющихся гнегидиновыми протепнкниазамп [Inouc el al; Ueguclii el al 2001]. Функционирование этой сигнальной системы, обеспечивает передачу гормонального сигнала с рецепторной гистидиновой протеннкииазы в ядро, что, возможно, приводит к включению генов первичного ответа на цитокиннны ARR (Arabidopsis Response Regulator) А типа. Система включает переносчики фосфатной группы - АНР (Arabidopsis hislidine pliosphotransler proteins) от плазматического мембранного рецептора в ядро на цитокнннн-зависимые трансфакторы ARR-B типа, которые взаимодействуют непосредственно с промоторами генов первичного ответа на цитокипнп и обеспечивают их включение [Кулаева н Кузнецов 2002; То and Keiber 2008]. Белки ARR-A типа являются негативными регуляторами ответа растения на цитокиннны. Рассмотренный каскад в восприятии н передаче цитокинннового сигнала играет важную роль в реализации многих проявлений регуляторного действия цитокинина в растении [Fereira and Kieber 2005; Sakakibara 2006; To and Keiber 2008: Романов 2009]. Вместе с тем в указанную гипотетическую систему передачи цнтокининового сигнала в клетке от мембранных гистидиновых протеинкиназ в ядро могут быть внесены существенные изменения Так получены данные демонстрирующие, что белки - переносчики фосфата - АНР с мембранного рецептора в ядро не чувствительны к изменению концентрации цитокинииов, и их роль в передаче цитокинннового сигнала не ясна [Punwani el al 2010]. Более того, исследования тройных мутантов, у которых ннактивнрованы все три рецепторные гистидинкиназы, ответственные за восприятие цитокинннового сигнала, показало, что передача цитокинннового сигнала может быть еще более сложной, что позволило предполагать наличие и других механизмов участвующих в реализации цитокинннового сигнала [Higiichi et al 2004; Nisliimura et al 2004].

Рецепторные киназы ориентированы на взаимодействие с внеклеточными цмтокннпнамн. Вместе с тем, цитокиннны способны проникать в клетку, используя пурнновые [Burkle el al 2003] и нуклеозидные транспортеры [Hirose et al 2005]. Кроме того, цитокиннны обнаружены и в ряде компартментов клетки, включая ядро, цитоплазму и хлоропласта [Hare and Van Sladen, 1997; Benkova et al., 1999; Dewitte et al., 1999], что указывало на вероятность присутствия систем восприятия и реализации цнтокининового сигнала в этих компартментах. Действительно, предположение подтверждается тем, что в растениях обнаружены альтернативные пути рецепции и

реализации сигнала для других фитогормонов: ауксинов (Simon and PclrâSek 2011]; абсцизовой кислоты |l-Iauser et al. 2011; Wang and Albert 2011; Giio et al. 2011] гиббернллинов [Klinaler cl al. 2010; Lumba et al. 2010; Ueguchi-Tanaka and Matsuoka 2010]. Можно предположить, что существуют не только мембранные рецепторы, а и другие системы восприятия цитокинннового сигнала, которые, кооперируясь, реализуют цнтокншчювыи сигнал. Представляется вероятной гипотеза о существовании наряду с мембранными рецепторами внутриклеточных цитокшнш-связывающих белков - участников цптокнипи-завпспмой регуляции транскрипционного процесса. Один из таких белков цптокипнн-связываюшнй белок с молекулярной массой 67 кД (ЦСЕ67) был обнаружен в зеленых листьях ячменя [Kulaeva el al. 1995] п стареющих листьях растения Arabidopsis [Selivankina et al. 2004]. Комплекс этих белков с транс-зеатином активировал элонгацию транскрипции в системе, содержащей хроматин и РНК полнмеразу I. Есть четкая корреляция между взаимодействием ЦСБ67 с цитокининамн и его участием в регуляции элонгации транскрипции, что позволило предположили возможность участия этих белков в восприятии цитокинннов и трансдукцип цитокинннового сигнала.

На основании изложенного выше мы заключили, что поиск и изучение путей передачи цитокинннового сигнала, альтернативных мембранной сигнальной системе, является весьма важной и актуальной проблемой.

1.2. Цель н задачи исследования: Целыо исследования явилось обнаружение в растениях кукурузы внутриклеточных белковых сигнальных систем, способных участвовать в восприятии цитокинннового сигнала и его реализации в цитокинннзавпеимой регуляции транскрипции. Основные задачи исследования были следующие:

1. Из этиолированных проростков кукурузы выделить цнтокинин-связывающий белок 70 кД (ЦСБ70) и изучить специфичность его взаимодействия с цитокининами и их аналогами.

2. С помощью иммуиохимпческнх и иммуноцитохнмических методов щучить топографию ЦСБ70 в органах, тканях и типах клеток проростков кукурузы для выявления особенностей локализации ЦСБ70 в растении.

3. Изучить специфику внутриклеточной локализации ЦСБ70 в клетках растения кукурузы, включая ядерную и пластидную локализацию.

4. Разработать модельные системы для изучения функциональной активности цитокиини -белковых комплексов и изучить с их помощью участие цитокинннов и ЦСБ70 в регуляции транскрипции.

5. Изучить присутствие белков, иммупохимически и функционально родственных ЦСБ70 белков и у других представителей злаков: в ячмене, овсе ржи и пшенице, чтобы выяснить, является ли ЦСБ70 представителем семейства родственных цитокинин-связывающих белков злаков.

6. Для решения поставленных задач разработать: высокоэффективные методы выделения цптокннипемзывающпх белков, высокоспецнфпчные н высокочувствительные пммуиохцмнчсские м нммуноцптохнмпческпе методы анализа локализации ЦСБ70; методы оценки функциональной активности цитокипии - белковых комплексов.

1.3. Научная новизна.

Обнаружено, что в этиолированных проростках кукурузы, для которых характерны активные процессы деления н дифферепцировки клеток присутствует цитокннин-связыпающий белок 70 кД (ЦСБ70). Разработаны три оригинальные схемы выделения ЦСБ70. позволившие получить функционально активный белок. Разработан высокочувствительный и специфичный иммунохимический метод определения ЦСБ70, на основе представительной панели моноклональных антител к ЦСБ70. Впервые изучена локализация ЦСБ70 в органах и тканях растения, показано его преимущественное содержание в меристематическнх зонах корня и стебля этиолированного проростка кукурузы. Впервые получены данные о динамике содержания ЦСБ70 при развитии этиолированного растения кукурузы. Разработаны условия иммуноцитохнмического определения ЦСБ70 с помощью световой н электронной микроскопии. Впервые с помощью иммуноцитохимических методов определена внутриклеточная локализация и показано присутствие ЦСБ70 в ядре, ядрышке, цитоплазме, пластидах: этнопластах, амилопластах и хлоропластах. Показана связь между содержанием ЦСБ70 в пластидах п процессами их дифферепцировки и, в особенности, образования их внутренних мембранн. Показана и охарактеризована способность ЦСБ70 регулировать цитокинин-завнеимо элонгацию транскрипции как в ядерной системе, содержащей хроматин и РНК полимеразу I так и в пластидной Установлено, что локализация ЦСБ70 в клетках соответствует проявлению им функциональной активности в цитокшшн-зависимой регуляции транскрипции. Белки, родственные ЦСБ70 кукурузы, по функциональной активности и иммунохимически, обнаружены в ячмене, ржи пшенице и овсе, что указывает на принадлежность к общему для злаков семейству цитокинин-связывающнх белков, обеспечивающих цитокинин-зависимую регуляцию транскрипции. Разработанные методы анализа ЦСБ70 и его локализации в клетках растения могут быть использованы при исследовании других белков растений. Все полученные результаты носят приоритетный характер.

1.4. Научная и практическая значимость исследования.

Проведенные исследования имеют прежде всего фундаментальный характер, так как позволяют более полно представить картин)' функционирования цитокнпинов в растительной клетке. Разработанные методы фракционирования белков растений, методы отделения белков от вторичных метаболитов растений могут найти применение в биотехнологии растений при получении препаратов высокоочищенных белков из растений продуцентов. Разработанные методы иммунохимического и иммупоцитохимического анализа белков растений или в растительной

клетке Müiyr пайтп применение в научных исследованиях при изучении локализации пли динамики содержания белков, как впрочем и любых других антигенов « процессе роста и разпнтия растений.

Материал!,i, изложенные в диссертации, могут быть использованы в учебной работе, при обучении студентов п аспирантов и научных сотрудников, специализирующихся в области физиологии, биохимии растении и молекулярной биотехнологии.

1.5. Апробация работы. Материалы работы докладывались па следующих Российских и международных конференциях: Физико-химические основы физиологии растений н биотехнология, 3-й Съезд общества физиологов растений 1997, Москва, Россия. International conference Molecular, biochemical Physiological Aspects of Plant Science 1997, Moscow. IV Съезд общества физиологов растений России 1999, Москва. Иммуноаналнз регуляторов роста в решении проблем физиологии растений, растениеводства и биотехнологии. 2ÛOO, Уфа, Россия. The 12'1' Congress of the Federation of Europan Societies of Plant Physiology. Budapesht p.110, 2000. Plant Signaling Systems of Plant Cells 2001 Moscow. Signalling in Plant and animal Systems. 2001, Kyiv, Ukraine. V съезд Общества физиологов растений России, 2003, Пенза, Россия. VI съезд физиологов растений 2007, Сактывкар, Россия.

1.6. Публикации: По теме диссертации опубликовано 35 работ, из них 14 в Российских и международных журналах списка ВАК.

2. Содержание работы.

2.1. Выделение и характеристики ЦСБ70.

Объект исследований - молодые этиолированные проростки кукурузы, в которых, как известно, происходит активное деление, рост и дпффереицировка клеток, процессы, регулируемые цитокипшшми. В литературе описаны попытки выделения и исследования водорастворимых цитокиипн-связывающих белков одно- и двудольных растений с высокой способностью связывать цитокиннн [Fox, Erion 1975, Takegami, Yoshida, 1977: Polya, Devis, 1978; Polya, Bowman, 1979: l-Iarada, 1980: Klambt, 1981; Keim et al., 1981]. Полученные белки значительно вырьируют по молекулярной массе (от 4000—5000 дальтон в листьях табака до 180 000 в зародышах пшеницы) и по КДПС для цитокннина (10'f -10'7 M). Данные о функции этих белков и их роли в регулируемых цнтокинимами процессах отсутствовали. Только для цитокинин-связывающего белка ЦСБ67, выделенного из первых листьев ячменя, была показана связь с цитокннин-регулируемым процессом - участие в регулируемом гормоном синтезе РНК [Каравайко и сотр. 1995; Kulaeva et al 1995; Селнванкина и сотр. 2001]. Ранее предпринимались попытки выделить ЦСБ из этиолированных проростков кукурузы [Romanov et al., 1988; Romanov et al., 1990; Taran et al., 1992]. Основным параметром, по которому проводился поиск, была способность белка взаимодействовать с гормоном. Авторы показали, что в этиолированных проростках кукурузы присутствует белок с цитокиннн-связываюшей активностью, но его участие в проявлении регуляторного действия цптокининов показано

не было. Полому первая стоявшая перед ними состояла в необходимости разработать метод препаративного выделения ЦСГ>. Были разработаны три схемы выделения ЦСБ (табл.I). Отличительно!"] особенностью разработанных схем выделения ЦСЕ70 явилось использование оригинальных способов отделения белков от вторичных метаболитов [Бровко и др. 1994 Бровко и др. 1996а; Brovko and Zagranichnaya 19981 н применение тандемион аффинной хроматографии. состоящей в комбинации хроматографии па иммобилизованном адепознне, который не активен как цитокпнпн. н зсатии-рнбознде - функционально активном шггокинине [Бровко и др. 19966; Brovko el al 2010].

Табл. 1. Схемы выделения ЦСБ из этиолированных проростков кукурузы.

Гомогенизация - экстракция, фильтрация растительного материала

А. Выделение с использованием CA. Б. Центрифугирование lOOOOg

А-1. Гидрофобная хроматография на Toyopearl I-IW60 А-2. Осаждение СА - ПЭГ. Хроматография на колонках Sephadex G25 и DEAE Sepharose

Осаждение активных фракций СА. Хроматография на колонках Sephadex G25 и DEAE Sepharose Концентрирование на мембранах YM10, гельфильтрация на колонке Sephacryl S200SF

Тандемная аффинная хроматография Ado-Toyopearl и Zr-Toyopear!

Сокращения: CA - сульфат аммония; Ado - аденозин; Zr - зеатин-рибозид. ПЭГ -

полиэтиленгликоль.

В табл. I А-1 и А-2 представлены два разработанных способа отделения вторичных метаболитов от белков, один включал хроматографию гидрофобных взаимодействий на инертном носителе Toyopearl HW60, а второй - отделение вторичных метаболитов фракционированием сульфатом аммония в присутствии полиэтиленгликоля [Бровко и др., 1994, Бровко и др., 1996; Brovko and Zagranichnaya 1998]. Методы имеют общее значение и могут быть применены к выделению других белков растений. Методы позволяли перерабатывать от нескольких килограммов растительного материала по методу 1 и десятков килограмм по методу 2, но выход очищенного белка был небольшим, и это потребовало разработать более мягкий метод выделения ЦСБ. В третьем методе при выделении ЦСБ избегали растворов с высокой ионной силой, а для отделения вторичных метаболитов использовали традиционный подход - гельфнльтрацшо. Ранее было показано, что ЦСБ из этиолированных проростков кукурузы взаимодействует с рибозидом зеатина [Romanov et al,, 1990], описано использование зеатннрибознда для аффинной хроматографии ЦСБ [Chen el al., 1980]. На этом было основано использование зеатннрибознда в качестве лиганда на аффинном сорбенте. Носителем был выбран Toyopearl HW65, обладающий низкой неспецифическон сорбцией, механической прочностью, химической инертностью.

Цппжинины пурииового ряда являются про I в водными аденнна. Растительная клетка содержит большое количество белков, имеющих сродство к адешшу. такие белки было необходимо удалить до хроматографии на зеатии рибознд Тоуорсаг! (2г-Т). Для этого предварительно

проводили аффинную хроматографию на аденозин-Тоуореаг! (Ado-T) и затем, выделяли ЦСБ хроматографией на сорбенте транс-зеатин рибознд Тоуорсаг! (Zr-T). Емкость сорбента Ас1о-Т была в 5 раз выше, чем емкость носителя 2г-Т.

Рис. I. Схема выделения ЦСБ70 тандемной аффинной хроматографией на последовательно соединенных колонках с аденозин Тоуореаг! (Ас1о-Т) и зеатинрибознд Тоуореаг! ^г-Т). Фракции, содержащие ЦСБ, наносили на колонку с сорбентом Ас1о-Т и далее на колонку с носителем Zr-T.

ЦСБ содержащие фракции

Анализ ЦСБ после аффинной хроматографии с помощью ПААГ-ДСН показал, что белок содержал основную полипептидную полосу 70кД и минорный компонент 65 кД (рис 3). Для повышения выхода белка в ходе его выделения был разработан метод выделения ЦСБ, в котором для отделения вторичных метаболитов от белков использовали фракционирование сульфатом аммония в присутствии полиэтиленгликоля 6000 [Бровко и др., 1996; Brovko and Zagranichnaya 1998].

Рис. 2. Аффинная хроматография на зеатинрибознд Тоуореаг). А. Профиль элюции, поглощение при 280 нм. 1 -несвязавшийся материал, 2 - элюция белков, не специфически взаимодействующих с Zr-Toyopearl буфером содержащим 500мМ NaCl, 3 - элюция ЦСБ 25 мМ NaOH. Б. Цитокинин-связывающая активность

фракций в имп/мин. Столбики - связывание ЦСБ [3Н]-дигидрозеатина. Основная цитокинписвязывающая активность

определялась во фракции пика 3 элюата с Zr-T.

Метод позволил перерабатывать практически неограниченное количество растительного материала. Для

предотвращения возможного

2 -J А А

1,5 - А

I 1- со /\ 2

„ . 0.5 -< J1 LAi.

0 фракции40 60

Фракции

нротео.читмческого расщепления белка использовали набор ингибиторов протещ, по в олгааге после хроматографии на Zr-T также выявлялись полнпентнды 7(J кД п 65кД.

— 94

— 68 м> 43

— г»

1'нс. 3. ПААГ-ДСН анализ препарата ЦСЕ после тандемной аффинной хроматографии на Zт-T. I- препарат после осаждения 7,5% трнхлоруксуснои кислотой, 2 - стандарты, цифрами обозначены молекулярные массы белков-маркеров в кД.

Используя первый и второй методы, наработали достаточное количество ЦСБ70 для проведения функциональных исследований и получения моиоклоиальных антител (МА).

В дальнейшем для минимизации деструкции белка, возможного образования олпгомеров и других потерь белка на стадиях выделения, предшествующих аффинной хроматографии исключали процедуры, сопряженные с действием высоких концентраций соли (табл. I-Б) и ввели ионообменную хроматографию, гельфнльтрацию и далее аффинную хроматографию на Ado -Т и Zr-T. В результате получен ЦСБ70, по свойствам аналогичный выделенному по А-1 и А-2 табл. I, но выход белка был в 2 - 4 раза выше.

2.2. Цптокнмнн-связывающап активность ЦСБ70.

Важной характеристикой гормон-связывающих белков является специфичность и обратимость взаимодействия с гормоном. Для определения цнтокинип-связывающей активности использовался метод преципитации гормон-рецептороного комплекса сульфатом аммония [Romanov et al. 1990]. Проводили два параллельных измерения связывающей активности при добавлении в среду меченного по тритию активного цитокинпна [3Н]-днгидрозеатпна или [3Н]-транс-зеатина. Разница между тотальным связыванием меченного тритием гормона и взаимодействием белка с меченным гормоном, в присутствии 1000 кратного избытка немечеиного гормона (дигидрозеатнна или транс-зеатина соответственно) была обусловлена специфической гормон-связывающей активностью. При тестировании образцов с содержанием менее 50 мкг/мл белка в раствор добавляли белок-соосадитель (рис. 4), для него также определяли вклад во взаимодействие с гормоном. Один из обязательных критериев специфичности гормон-связывающего белка состоит в том, что он взаимодействует с гормоном специфически и обратимо. В наших опытах по связыванию ЦСБ70 [3Н]-дигидрозеатнна было установлено, что меченый щгтокинин вытеснялся немеченным дигндрозеатииом в концентрации 5х107М. Превышение специфического взаимодействия ЦСБ70 с меченным по тритию дигидрозеатином (рис. 4, 1) было больше таковое для опыта с вытеснением метки немеченым гормоном (рис. 4, 2) почти в четыре раза. Вклад белка соосадителя был незначительным, основная щггокннин-связывающая активность ЦСБ70 составляла 87% от общего связывания гормона (рис 4, 3). Полученные результаты говорят о высокоспецифическом

взаимодействии ЦС1970 с активным шгтокпшшом - дигидрозеатином. Аналогичные результаты были

полнены н при использовании меченного тритием транс-зеатниа.

6М ; 500 j 400 j

£»з I а

О !

; ® 1

; 100 | : a i—

Табл. 2. Вытеснение [^Н] транс-зеатнна из комплекса с ЦСБ70 другими цитокинпнами, аденпном, аденознном, основными классами гормонов растений и синтетическими аналогами гормонов.

Наименование соединения Вытеснение в %

Зеатнм 90-93

Дигидрозеатпн 85-87

6-бензиламннопурпн 80-85

Изопентениладенин 82 - 85

Кинетин 75-77

Зеатинрибознд 70-72

Аденин 12-20

аденозин 7-14

2.4D 5-7

NAA 4-7

ABA 3-8

GAj 2-5

Рис. 4. Цитокиннн-связывшощая активность препарата ЦСБ70. 1. ЦСБ (10 мкг/пробу) + РН]-дигидрозеатпн + овальбумин (50 мкг/нробу). 2. ЦСБ + [31-Г|-дпгидрозеатин + 5x10"7 дигидрозеатпн + овальбумин (50 мкг/пробу). 3. овальбумин (50 мкг/пробу) + 3[Н]-дигидрозеатин.

Мы использовали также антиндиотипические антитела для исследования гормон-рецепторных взаимодействий [Каравайко и сотр., 1995]. Анализ фракций элюата с Хг-Т на взаимодействие с антн-иднотипнческнми антителами к транс-зеатину показал, что кривая данного взаимодействия совпадала с профилем элюции ЦСБ70, а тест на взаимодействие ЦСБ70 с антпидиотипическими антителами оказался значительно

чувствительней, чем тест по связыванию ЦСБ70 с РН] дигидрозеатнном [Бровко и др. 1996].

Специфичность взаимодействия ЦСБ70 с цитокнницами исследовали по вытесненшо[3Н] транс-зеатина из комплекса белка с другими активными цитокинпнами, аденознном, основными гормонами растений и синтетическими аналогами гормонов. Было обнаружено, что наиболее специфично ЦСБ70 взаимодействовал с транс-зеатином, несколько менее специфично с дегидрозеатином, бензиламинопурином и изопентенил аденином. Кинетин, долгое время рассматривался как синтетический цитокинин, а в последнее время обнаружен в растениях и клетках животных [Levin and Momin 2010; Frebort et. al. 2011]. Он обладал несколько меньшей активностью связывания с ЦСБ70. чем рассмотренные выше соединения, но его уровень взаимодействия с ЦСБ70 оказался сравнимым с таковым для зеатин-рибозида. Важным явилось то, что степень вытеснения транс-зеаггина, из комплекса с ЦСБ70, аденином и аденознном была крайне низкой. Другие гормоны растений и их синтетические аналоги практически не вытесняли меченый транс-зеатин из его комплекса с ЦСБ70 (табл. 2), это показывает их неспособность конкурировать с цитокинпнами за место связывания у

ЦСБ70. Таким образом, проделанная работа показала высокую специфичность взаимодействия активных цнтокинннов и ЦСБ70.

2.3. Участие ЦСБ70, выделенного из этиолированных проростков кукурузы, в рсп'.тицнп транскрипции.

Одной из наиболее важных биологических функций цнтокинннов является регуляция биосинтеза РНК и белка в растительной клетке. Активность выделенного из этиолированных проростков кукурузы ЦСБ70, в качестве посредника в регуляции цнтокинином синтеза РНК была изучена в системе синтеза РНК in vin o, содержащей хроматин н РНК полимеразу из листьев ячменя [Каравайко и др. 1995; Kulaeva el al., 1998]. В результате проведенных исследований было выяснено, что активирующее действие белка кукурузы проявлялось при его добавлении в реакционную среду в

концентрации 1.2 мкг п менее и составляло 200-300% от контроля. ЦСБ70 активировал синтез РНК в присутствии транс-зеатина в концентрации от 10"8 до 10"6М, что сравнимо с таковыми для ЦСБ67, выделенным из ячменя [Каравайко и др. 1995; Бровко и др. 1996]. Эти результаты являются подтверждением того, что ЦСБ70 из этиолированных проростков кукурузы функционально активен и способен участвовать в комплексе с цитокининами в активации транскрипции. Транскрипционная активность ЦСБ70 в системе синтеза РНК, содержащей хроматин и РНК-полимеразу из листьев ячменя, показывает, что белок функционально похож на ЦСБ67, выделенный из зрелых, закончивших рост листьев ячменя [Каравайко и др., 1995; Kulaeva et al., 1995].

Таким образом, можно сделать первый важный вывод, что в растениях есть ЦСБ, принимающие участие в цитокинин-завнеимон регуляции транскрипции и можно предполагать, что они могут быть транскрипционными факторами или белками, регулирующими факторы транскрипции. Валено, что ЦСБ присутствуют не только в клетках ячменя, закончивших рост [Каравайко и др. 1995; Kulaeva el al., 1998], но н в этиолированных проростках кукурузы, то есть клеточной системе с активным делением, ростом и дпфференцировкой клеток [Бровко и др. 1996]. Узнавание ЦСБ70 в системой, содержащей хроматин и РНК- полимеразу из листьев ячменя, подчеркивает отсутствие видовой специфичности данных белков. Эти факты, а также данные [Selivankina et al 2001] о наличии ЦСБ, участвующих факторов цитокииин-зависимой регуляции

Табл. 3. Влияние ЦСБ70, выделенного из этиолированных проростков кукурузы и транс-зеатина, на синтез РНК в системе элонгации транскрипции, содержащей хроматин и РНК полимеразу 1 из зеленых листьев ячменя.

ЦСБ70 (1.2 мкг) Концентрация транс-зеатина (М) [á-",JP УТФ] включение в РНК (имп/мнн/50 мкг дню %

- - 19059±262 100

+ - 20965±944 100

- 10-" 18849±324 99

+ 10'* 38066±1944 200

+ 10" 41577±1977 218

+ 10* 57740±1728 302

элонгации транскрипции у двудольных растений, позволяют заключить, что в растениях присутствует класс родственных шпокнннп-завнепмых факторов элонгации транскрипции или белков, регулирующих эти факторы, которые, подобно рецепторам стероидных гормонов животных, могуг участвовать в регуляции транскрипции.

2.4. Исследование специфичности ЦСБ70 но отношению к цптокининам и другим соединениям в тесте регуляции элонгации транскрипции.

Следующей задачей было исследование влияния активных и неактивных цнтокипинов на функцию ЦСБ70 в регуляции элонгации транскрипции. Полученные результаты (табл. 4) хорошо коррелируют с результатами о конкурентном вытеснении транс-зеатипа из его комплекса с ЦСБ70 (табл.2). Транс-зеатпи, пзопеитенил аденин, 6-бензпл-амннопурни и кннетин проявляли высокую удельную активность как по вытеснению меченного транс-зеатнна из гормон-рецепторного комплекса (табл.2), так и по активации, в комплексе с ЦСБ70 элонгации транскрипции в системе синтеза РНК т vitro, тогда как добавление соединений, не обладающих цитокииииовой активностью: адеиина, траис-зеатин О-глюкозида и бензллтиопурина - не оказывало влияния ни на вытеснение транс-зеатнна из комплекса с белков ни на реакцию синтеза РНК in vitro. Полученные результаты позволяют заключить, что связывание функционально активных цитокннинов с ЦСБ70 приводит к образованию гормон-белкового комплекса, обладающего функциональной активностью в регуляции транскрипции.

На этом этапе исследований ЦСБ70 был охарактеризован по способности специфически

взаимодействовать с цитокининами, показана его высокая избирательность по отношению к транс-зеатину, и также показано, что он способен цитокиннн-зависимо регулировать элонгацию транскрипции в гетерологичной

Таол. 4. Влияние ЦСБ70, природных цитокинпиов, их производных, активных и неактивных аналогов и аденпиа на синтез РНК в системе элонгации транскрипции, содержащей хроматин-связанную РНК полимеразу из зрелых зеленых листьев ячменя.

Соединение Концентрация (М) [а-^-Р УТФ] включение в РНК (нмп/мин/50 мкг ДНК) %

Контроль - 10731±397 100

Контроль (- ЦСБ70) - 10301±416 96

Транс-зеатнн 10"' 31920±1309 297

Изопентенриладени н 10-' 25142±1055 234

6- бензиламинопурин 10"' 28931±1128 270

Кннетин 10"' 22261±957 207

Аденин Ю-' - 10"' Нет эффекта -

Цис-зеатпн-О-глюкозид 10"'- ю-5 Нет эффекта -

Еензплтиопурнн 10"'- 10° Нет эффекта -

системе.

3. Плшунохпмнческие исследования 11,(1)70.

Для анализа роли ЦСБ в этиолированном пророегке кукурузы, установления связи между ЦСБ70 и регулируемыми цитокипннамн биохимическими процессами, исследования органной и клеточной локализации ЦСБ70 в растении были проведены нммуиохимнческие исследования ЦСБ70.

3.1. Получение мопоклоиальпых антител к ЦСБ70.

Попытка получения рекомбимантных мнниантнтел к одному из растительных белков - актину

показала возможность такого подхода [Костеша п сотр 2005], но получаемые антитела плохо хранились и поэтому усилия были сфокусированы на получении мопоклональных антител (МА). Для выделения МА наращивали гибридомы в перитонеапыюй полости мышей [Baumgarten and Peters 1992]. Очистку МА к ЦСБ70 проводили фракционированием сульфатом аммония и ионообменной хроматографией. Выход МА составлял от 1 до 2 мг нз 1мл асцитной жидкости. Аффинность МА к ЦСБ-70 определяли по методу Beaty [Beaty 1987]. Характеристика МА представлена в табл.5, более половины антител были иммуноглобулинами класса М, они имели высокий уровень аффинности (табл. 5).

Для определения содержания ЦСБ70 в органах этиолированного проростка кукурузы необходимо было разработать высокочувствительный и специфичный способ анализа.

3.2. Эпитопный анализ ЦСБ70.

Эпитопный анализ важен при изучении структуры или центра связывания рецептора с лигандом. Он позволяет получить сведения о том, насколько близко на молекуле расположены эпитопы для различных МА. Это имеет большое значение для работ по созданию тест-системы количественного анализа содержания ЦСБ70 в органах и тканях растения, а таюке и при иммуноцитохимических исследованиях. Эпнтопное картирование проводили методом прямого ИФА. ЦСБ70 сорбировали на планшет, препараты МА попарно смешивали и вносили в лунки с сорбированным ЦСБ70. В другие лунки вносили только по одному нз трестируемых МА. Если оба антитела направлены против одного и того же эпитопа или их эпитопы расположены близко друг к другу, то сигнал от смешанных антител был незначительно выше, чем сигнал от индивидуального антитела. В случае, если МА узнавали далеко отстоящие друг от друга эпитопы и не конкурировали

Табл. э. Характеристика мопоклональных антител к ЦСБ70

Название Класс/подкласс. Константа

МА тип легкой цепи аффинности

14А4 IgGi к 1x10''

11В1 IgM к 1x10'J

199 IgM к: 1x10'

36 IgM к 1x10"

8 IgG, 1x10"

15 IgM к 1x10"

13D3 IgGi к 1 х 10V

520 IgG, X 1x10'

11ВЗ IgM к lxlO8

17 IgGi к 1x10"

за участок взаимодействия, сигнал от смешанных МЛ был значительно выше. Для определении возможной конкуренции между МА за место связывания использовали метод, называемый "индексы аддитивности" (А.1.) [Бпсрш! е1 аМ. 1983].

Если А.1. меньше 50%, это значит, что антитела конкурируют за один и тот же или близкие центры связывания. Если А.1. больше 50% - МА направлены против разных эпитопов. Из данных табл. 6 видно, что большинство полученных МА распознают близко расположенные эпнтопы на

молекуле ЦСБ70. Возможно, что некоторые эпнтопы

расположены настолько близко (АЛ.<10%), например, для пар антител 15 и !ЗДЗ, 13ДЗ и 11ВЗ, что МА конкурируют за эпитоп. Нами были обнаружены пары МА, не влияющие на взаимодействие каждого из МА с ЦСБ70. Например, пары 11ВЗ и 17, 199 и 15, 15 и 14А4 имеют А. 1. > 50%. Все остальные МА имели индекс аддитивности, промежуточный между 10 и 50%.

Во многих случаях взаимодействие МА с антигенами зависит от взаимодействия антигена с лнгандом. Возможно, что МА, полученные к белку, не содержащему лигаид или гормон не будут реагировать с комплексом гормон-белок (ЦСБ70). Для элективного использования МА в пммунохнмических и иммунощггохимическнх тестах предстояло определить, как МА могут влиять на взаимодействие ЦСБ70 с гормоном, и как гормон может влиять на взаимодействие аттггел с ЦСБ70.

3.3. Анализ влияния транс-зсатпна на образование комплекса ЦСБ70 - антитело.

Влияние МА и зеатнна на образование комплекса ЦСБ70 - анпггело исследовали методом ИФА. ЦСБ70 сорбировали на планшет, затем добавляли МА, содержащие определенную концентрацию гормона, и далее определяли уровень взаимодействия МА с антигеном. Результаты экспериментов демо1[сгрнру1от разные типы влияния транс-зеатина на реакцию аггшген-МА. МА могут изменять кои<|юрмацию молекулы, и ее способность связывать гормон может улучшиться, либо ингибироватъ взаимодействие ЦСБ70 с зезгином. Рис. 5 демонстрирует несколько разных типов влияния транс-зеашна на реакцию антиген - антитело в условиях прямого ИФА. Как пример плавного разрушения траис-зеатином комплекса ЦСБ70 с МА 14А4, 11В1, 8, 520, 199 н 15. А для МА 520 и 8 можно говор1гть об ттгибировании траис-зеатином взаимодействия МА с ЦСБ70. В случае МА 33 зеатин практически не влиял на реакцию

Таил. 6. Определение индекса аддитивности моноклинальных антител к ЦСБ70. Представлены данные усиления сигнала вторым антителом, в процентах к сигналу первого.

17 8 11ВЗ !ЗДЗ 15 11В1 36 520 199

15 17

11ВЗ 71 17

13ДЗ 38 0.9 4

15 41 20 5,6 9,8

11В1 32 32 3,6 25,4 27,7

36 40 47 32,6 47 11,8 28

520 5,8 32 24 15 19 6 7

199 4 17 12,6 33,8 54 39 36 4,5

14А4 26 20 8,63 25 100 23 14 15 7

антиген-антитело, а в случае МЛ 1ЭДЗ добавление транс-зеатина. вероятно, приводило к усилению взаимодействий МА с ЦСБ70.

Взаимодействие ЦСБ70 с МАТ 14А4

0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 О,!

О -9 -8.5 -8 -7.5 -7 -6.5 -6 -5.5 -5 Концентрация транс-зеатина. М

Взаимодействие ЦСБ70 с МАТ 11В1

0.5 0.4

-9 -8.5 -8 -7.5 -7 -6.5 -6 -5.5 -Концентрация транс-зеатина, М

Взаимодействие ЦСБ70 с МАТ 8

о.а 0.7 0.6 04 0.5 ? 0.4 1 0.3 0.2 0.1 о

О -9-8.5-8-7.5-7-6.5-6-5.5-5 Концентрация транс-зеатина. М

Взаимодействие ЦСБ70 с МАТ 33

0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 о

-9 -8.5 -3 -7.5 -7 -6.5 -6 -5.5 -5 Концентрация транс-зеатина. М

Взаимодействие ЦСБ70 с МАТ 15

О -9 -8.5 -8 -7.5 -7 -6.5 -6 -5.5 Концентрация транс-зеатина. М

Взаимодействие ЦСБ70 с МАТ 1ЭЭ

-Э -8.5 -8 -7.5 -7 -6.5 -6 -5.5 -5 Концентрация транс-зеатина, М

Взаимодействие ЦСБ70 с МАТ 520

-9 -а.5 -8 -7.5 -7 -6.5 -6 -5.5 Концентрация транс-зеатина. М

Взаимодейстрвие ЦСБ70 с МАИЗДЗ

0.6 0.5 гм 0.4 Щ 03 < 0.2 О 1 О

О -9 -8.5 -8 -7.5 -7 -6.5 -6 -5.5 -5 Концентрация транс-зеатина. М

Рис. 5. Влияние транс-зеатина на реакцию МА-ЦСБ70 (МАТ это МА) в условиях прямого ИФА. Квадраты -контроль МА + растворы зеатина. Крестики - только растворы транс-зеатина. Треугольники - ЦСБ70 -транс-зеатнн. концентрация транс-зеатина в молях.

Необходимо отметить, что основная часть антител к ЦСБ70 была в этом тесте функционально активна, их взаимодействие с ЦСБ70 завесило от наличия в среде транс-зеатина. Полученные данные также показывают, что взаимодействие ЦСБ70 с транс-зеатином приводит к конформационным изменениям белка, достаточным для ингибнровання взаимодействия ЦСБ70 с антителами.

3.4. Создание тест-системы для анализа ЦСБ70 на основе сандвнч-НФЛ в сочетании с стреп гавндин-бнотнновой системой.

Учитывая низкое содержание ЦСБ70 в экстрактах этиолированного проростка, необходимо было разработать высокочувствительный и специфичный метод его обнаружения и анализа содержания. Наиболее подходящим методом является сандвич-варнанг ИФА. При его проведении на поверхности планшета сорбировали первые МА, затем в лунки вносили анализируемую смесь белков, при этом на МА остаются антигены, узнаваемые первыми МА. Далее в лунки вносили вторые МА - биотпнилированные: в результате количество провзаимодействовавших верхних МА соответствует количеству антигена в анализируемой смеси. Условием использования этого метода являлся подбор пары МА к достаточно удаленным друг от друга эпитонам белка и доступность этих эпитопов для МА в условиях естественног о окружения антигена другими белками.

Подбор пары МА проводили, анализируя ЦСБ70 во фракциях, полученных при гель-

фильтрации белков этиолированных проростков кукурузы на Sephacryl S-200. Была найдена пара из МА №8 и 520. которая позволила успешно проводить определение ЦСБ70 в элюате растительных белков с колонки Sephacryl S-200 (рис.6, В-1).

Рис. 6. Подбор пары антител для определения ЦСБ70

сандвич вариантом ИФА. А - Профиль элюции белков этиолированных проростков кукурузы с колонки Sephacryl S-200 и Н-зеатин-связывающая способность полученных белковых фракций. Сплошная линия -профиль элюции белков с колонки, регистрация при 280 нм. Специфическая зеатин-связывающая способность представлена столбиками. Б: Иммуноблот анализ фракций 1, II и 111. В - иммуноферментный анализ ЦСБ70 в элюате с колонки Sephacryl S-200. Распределение ЦСБ70 и его фрагментов, выявляемых с помощью СтБС-ИФА во фракциях, а - при удачном выборе пары антител: b - при неудачном выборе пар антител; с -у ровень фона.

Анализ кривой 1 (рис.6. В-1) показал, что сэндвич-

вариант ИФА в сочетании со стрептавидин-биотнновой системой (СтБС) обнаруживал белки с

ам 1бо m к

I J I I

Имл/мин

л I II III

, L Ln

500 ш

лга с 5

Фракции

позитивной реакцией на МА к ЦСБ70 в высокомолекулярной фракции (фракция 1- 200-150 кД). во фракции 2, содержащей белки 70-65 кД и во фракции 3, содержащей низкомолекулярные белки около 30 кД. Белки каждой из этих фракций были проанализированы с помощью имуноблотннга с применением СтБС (рис. 6-Б) Полученные результаты показали, что в первой фракции (150-200 кД) реакция с МА к ЦС'Б70 обнаружила полипептиды 70 и 64 кД. По-видимому, в растительном экстракте они образовывали гомо- или гетеробелковые комплексы. Во второй фракции (65-70 кД) эти же полипептиды присутствовали в мономерной форме, а в третьей фракции МА выявили полипептпд с молекулярной массой около 30 кД. который мог быть продуктом частичной деградации ЦСБ70 в клетке пли получался в ходе очистки. Анализ соответствия между узнаванием белков МА к ЦСБ70 и их способностью специфически взаимодействовать с 'Н-зеатином показал (рис.б-В), что основное связывание зеатииа происходило во фракции 2, содержащей ЦСБ70 в мономерной форме. Фракция 1 высокомолекулярных белков имела низкую шпонннип-связывающую активность, а фракция 3. содержащая полипептпд с мол. м 30 кД. опознаваемый антителами против ЦСБ70, "'Н-зеатии не связывала. По-видимому, этот белок представляет собой продукт частичной деградации ЦСБ70, потерявший способность связывания гормона, но сохранивший эпитопы, узнаваемые МА В результате проведенных экспериментов разработан высокочувствительный метод определения ЦСБ70, основанный на использовании сэндвич-варианта ИФА в сочетании со стрептавиднн-бнотиновой системой. Полученные МА к ЦСБ70 были специфичны и взаимодействовали в растительном экстракте в сандвич ИФА п пммуноблотннге только с исследуемым белком. Необходимо отметить, что в парс МА 520-8, при анализе аддитивности, второе антитело увеличивало индекс аддитивности почти на треть (табл. 6). па образование комплекса МА-ЦСБ70 влиял транс-зеатнн (рис.5), при этом оба антитела по результатам иммуноблотинга были высокоспецифичны и узнавали только три полппептида с молекулярной массой 70, 65 и 30 кД (рис 6-Б).

3.5. Влияние антитела к ЦСБ70 на его способность регулировать элонгацию транскрипции в системе in vitro.

Полученные результаты позволяют предположить. 1по антитела к ЦСБ70 могут не только регулировать взаимодействие ЦСБ70 с гормоном, но и воздействовать на его влияние на элонгацию транскрипции Для выяснения этих вопросов Селиванкина C.IO. любезно согласилась проверить способность различных шгпггел к ЦСБ70 активировать элонгацию транскрипции белком ЦСБ67. выделенным из зеленых листьев ячменя, в транскрипционной системе, содержащей хроматин из зеленых листьев ячменя. Во-первых, было необходимо проверить, взаимодействуют ли антитела, полученные к ЦСБ70. из 4-х дневных этиолированных проростков кукурузы, с ЦСБ67 нз зеленых листьев ячменя

„: - , . 1'нс. 7. Анализ взаимодействия ЦСБ70 ячменя моноклональными

. с. О; ч I антителами к ЦСБ70 кукурузы. Линии I - 4 проявление ЦСБ67

! } . различными антителами.

! ЦСБ67

. , 1—1 -мр—Как видно на рис. 7. все проверенные в тесте иммуноблотинга МА к I 1ДСБ70 узнавали ЦСБ67. Препарат ЦСБ67 был любезно предоставлен

[ .' ' ' ' Н.Н. Каравайко ИФР РАН

В тесте регуляции элонгации транскрипции с помощью ЦСБ67 из зеленых листьев ячменя и транс-зеатина был использован ряд антител к ЦСБ70 кукурузы. В табл.7 приводятся данные, полученные для пяти МА. МА 14А4 обладало незначительным ингибирующпм воздействием на активацию элонгации транскрипции ЦСБ67 в присутствии транс-зеатина. Наибольший интерес представляло МА 15. которое, в значительной мере, усиливало элонгацию

транскрипции в присутствии ЦСБ67 и транс-зеатина.

Можно предположить, что в случае активации транскрипции роль МА может состоять как в регуляции взаимодействия белка с гормоном, так и в фиксации конформаций ЦСБ67. делающих его более активным в данной системе реакций.

Таким образом, показано, что полученные к ЦСБ70 МА проявляли активность, непосредственно связанную с функцией белка: регулировали взаимодействие ЦСБ70 с гормоном - транс-зеатином (Рис. 5) и регулировали активацию элонгации транскрипции при использовании в качестве активатора ЦСБ67 из зеленых листьев ячменя и транс-зеатина (табл. 7).

3.6. Исследование локализации ЦСБ70 в меристеме и зоне растяжения корня.

Представляло несомненный интерес выяснить, есть ли соответствие между содержанием ЦСБ70 в органах и тканях растений и активностью происходящих в них регулируемых цнтокининамн процессов. В качестве растительного материала для анализа локализации ЦСБ70 были выбраны 4-х дневные этиолированные проростки кукурузы, для них характерны активные процессы деления клеток и дифференцнровки тканей, то есть как раз ге процессы, которые и регулируются цнтокининамн. Одним из процессов, регулируемых цитокининами. является деление клеток.

"Гаол. 7. Влияние МА к ЦСБ70 и транс-зеатина на элонгацию транскрипции с помощью ЦСБ67. из зеленых листьев ячменя, в системе, содержащей РНК полнмсразу I и хроматин из зеленых листьев ячменя.

ЦСБ67 Транс МА к [Т-1] АМФ %

зсатин ЦСБ70 включение в РНК (срт/50мкт РНК)

- - - 10275±780 100

+ + - 17515±944 170

+ + 14А4 7661±548 75

+ + 18 12215±641 1 19

+ + 520 11483±211 112

- - - 9010±833 100

+ + - 15479±922 172

+ + 15 25038±1987 со

+ + 1303 13523±689 150

Рис. 8. Сравнение содержания ЦСБ70 в меристеме и зоне растяжения корней этиолированных проростков кукурузы в возрасте 4-х дней. Представлено относительное содержание ЦСБ70 в расчете на единицу сырого веса. I - меристема. II - зона растяжения корня.

Для проверки возможного участия ЦСБ70 в этом процессе решили сравнить его содержание в зонах растущего кончика корня

этиолированного проростка кукурузы. Выбор кончика корня в J д качестве объекта исследования был обусловлен тем, что в нем зона

клеточных делений и зона роста клеток пространственно разграничены. Для анализа у корней 4-х

дневных этиолированных проростков отделяли

А 492 600

500

400

300

200

100

Табл. 8. Число клеток и содержание общего белка в меристемеп зоне растяжения корней этиолированных проростков кукурузы в возрасте 4-х дней.

Зона корня Число клеток, млн/г сырого веса Содержание белка. мг/г сырого веса

Меристема Зона растяжения 110.7±5.1 1 б.0± 1.9 26±1.1 9.7±0.1

меристему (до 2 мм от кончика корня) и зону растяжения (от 2 до 7 мм ог кончика корпя ). В указанных зонах корня было проанализировано относительное содержание ЦСБ70

В расчете на единицу сырой массы меристема содержала в 17 раз больше ЦСБ70, чем зона растяжения корня (рис. 8). Для

выяснения, не ооусловлено ли такое резкое различие всего лишь высокой оводненностыо клеток зоны растяжения, существенную часть сырой массы которых составляют вакуоли, указанные зоны корня были охарактеризованы по таким признакам, как число клеток в I г сырой массы и суммарное содержание белка в 1 г сырой массы. Из табл. 8 видно, что единица сырой массы зоны растяжения корня содержит существенно меньше клеток, чем меристема, за счет быстрого роста

клеток после их выхода из меристемы. На

иг 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 ОД О

а4К 5

3 2 1

I п

единицу сырой массы зона растяжения содержала меньше белка, чем меристема. Полученные данные позволили сравнить содержание ЦСБ70 в клетках меристемы и зоны растяжения и определить изменение отношения количества ЦСБ70 к суммарному количеству клеточного белка при переходе клеток из зоны деления в зону растяжения (рис. 9).

Рнс.9. Сравнение содержания общего белка и ЦСБ70 в меристеме и зоне растяжения корня. Общий белок в расчете на 106 клеток (А): ЦСБ-70 в расчете на 10'' клеток (Б): ЦС'Б-70 в расчете на мг общего белка (В). I - меристема. 11 - зона растяжения.

Клетка юны растяжения содержала почти в три раза больше общего белка, чем клетка меристемы (рис. 9-Л) и. вместе с тем, она содержала » два раза меньше ЦСБ70 (рис. 9-Б). Расчет содержания ЦСБ70 в меристеме и зоне растяжения корня па единицу общего белка показал, что средняя мерпстематнческая клетка в 6 раз больше насыщена ЦСБ70, чем клетка зоны растяжения (рис. 9-В).

Таким образом анализ распределения 1ДСБ70 в меристеме и зоне растяжения убедительно показал, что наибольшее его содержание в зонах клет очных делений - в мернстематическпх тканях корня.

3.7. Исследование локализации ЦСБ70 в этиолированном проростке кукурузы. Задачей данного л апа работы было определить содержание ЦСБ70 в частях этиолированного пророока кукурузы н проследить возможную связь между содержанием ЦСБ70 и ростовыми и s днфференцировочными процессами, происходящими в ткани. Для

4 этого у проростка отделяли мезокотпль. \зел. колеоптиль и первый

лист, а у корня брали меристему (до 2 мм от кончика корня), зону растяжения (от 2 до 7 мм ог кончика корня), зону дифференцировкл (10 мм) и зону образования боковых корней (10 мм) и определяли в них содержание ЦСБ-70 (рпс. 10)

Рис. 10. Схематическое изображение проростка кукурузы. I - зерно. 2 — мезокотиль. 3 — узел. 4 - колеоптиль, 5 — первый лист, заключенный внутри колеоптиля: 6 - корень.

Как видно из рпс. II. максимальное количество ЦСБ70 было

обнаружено в меристеме корня. Содержание ЦСБ70 в зоне элонгации корня было в 17 раз меньше.

чем в мсристематпческон зоне, а а зоне днфференцпровки и зоне формирования боковых корней

содержание рецептора было меньше по сравнению с зоной элонгации на 41% и 58%

соответственно. В надземных частях проростка максимальным было содержание ЦСБ70 в узле, что

соответствует происходящим в нем процессам активных клеточных делении. В листе и колеоптиле.

но сравнению с узлом, содержание рецептора было меньше на 57% и 75% соответственно. Для

реального представления роли ЦСБ70 в процессах деления и днфференцпровки растительных

клеток необходимо оценивать его содержание не только в сыром весе ткани, но и знать его

содержание в пересчете на клетку и на белок ткани. Табл. 9 показывает, что органы и части

растения содержат не одинаковое количество клеток на грамм сырой массы, содержание белка в

клетках также различалось. То. что в мезокотнле ЦСБ70 практически отсутствует, подтверждает

сделанное ранее предположение о том, что ЦСБ70 имеет отношение к регуляции клеточных

делений, а в мезокотнле мптотнческая активность клеток в 4-х дневном этиолированном проростке

практически отсутствовала (рис.11). Высокое содержание ЦСГ>70 в зоне растяжения клеток

указывает на связь этого процесса с ЦСБ70, в зонах образования боковых корней имеются очаги А митотической активности, которые и могут быть местами

повышенного содержания ЦСБ70.

Рис.11. Относительное содержание ЦСБ70 в тканях 4-х дневного этиолированного проростка кукурузы в расчете па 1 г сырого веса. 1 - меристема, 11 - зона растяжения корня. Ш - зона дифференцировки, IV - зона образования боковых корней, V - мезокотиль. VI - узел. VII -колеоптиль, VIII -первый лист.

На рис. 12 представлено распределение ЦСБ70 по проростку в расчете на клетку в сравнении с содержанием в клетках общего белка. Максимальное содержание ЦСБ70 по этому параметру - в меристеме корня, хотя общее содержание белка в клетках зоны роста корня существенно выше.

П Ш Г\' V \"1 VII ЛТП

Ада

мг

4,5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1

0.5 0

■ 0.9 - 0,8

- 0.7

■ 0.6

- 0.5

- 0.4

- 0,3 ■ 0.2 ■0.1 ■ 0

I П Ш IV V VI Ш Табл. 9. Число клеток и содержание белка в частях 4-дневного этиолированного проростка кукурузы

Рис. 12. Распределение 1ДСБ70 в 4-х дневном этиолированном проростке кукурузы в сравнении с содержанием в клетках общего белка. Темные столбики - содержание ЦСБ70 в условных единицах, в расчете на 10" клеток. Светлые столбики - содержание общего белка в расчете на 10г> клеток. I - меристема корня. II -зона растяжения. Ill - зона дифференцировки. IV - зона образования боковых корней. V - мезокотиль, VI - узел, VII -колеоптиль, VIII - первый лист.

Информативно

Число клеток. Содержание белка

Части проростка млн/г сырой массы мг/г сырой массы п кг/клетку

Меристема корня 129,1 ±8.4 29±6.1 225±1.1

Зона растяжения 15,9±2,6 9.7±0,1 610+0.1

Зона 9.8+0.9 4.4+0,3 448±4.4

дифференциации

Зона образования боковых корней 12±0,4 5.1+0,5 423±12,7

Мезокотиль 9.8±1.1 7.0±0.5 711±79.6

Узел 80±1,9 20.3+0.6 253±6

Колеоптиль 14,2±1.8 11 ±0.5 816+2

Лист 243,7±5.3 33,2+2 136±2.9

клетках, эта величина в узле примерно вдвое больше, чем в колеоптиле (рис. 12). Это говорит о более высокой

концентрации ЦСБ70 в цитоплазме и органеллах клеток узла по сравнению с клетками колеоптиля. Именно в узле сосредоточены делящиеся клетки, таким образом, и в корне, и в надземной части проростка наибольшая концентрация ЦСБ70 сосредоточена в местах клеточных делении.

отношение ЦСБ70 к суммарного

количества количеству белка в

Первым лисг проростка полностью заключен внутри колеоптиля. Клетка первого листа содержит почти и в два раза меньше белка, чем клетка узла. Содержание ЦСБ70 в первом листе в пересчете на 1 иг клеточного белка примерно на треть ниже, чем в колеоптиле. Данные

проведенного анализа, отражают усредненное содержание ЦСБ70 в клетках листа, и на самом деле ЦСБ70 может быть распределен в клетках листа неравномерно. Рис. 13. Анализ содержания в условных единицах ЦСБ-70 в

"4И

V vi vu vni

ILxl

4-х дневном этиолированном проростке кукурузы в расчете на 1 ж суммарного клеточного белка: А. Б - вставка для V -VIII. увеличено в 5 раз от А. 1 - меристема корня, II - зона растяжения, III - зона дифференцировки, IV - зона образования боковых корней, V - мезокотиль. VI - узел, VII -колеоптиль. VIII - первый лист.

i п ш TV V vi vu vra

Таким образом, установлено, что в этиолированном проростке кукурузы клетки с наибольшей концентрацией ЦСБ70 расположены в меристеме кория. В надземной части проростка максимальное содержание ЦСБ70 обнаружено в узле, а минимальное - в мезокотиле. Концентрация ЦСБ70 в клетках тканей хорошо коррелирует с активностью в них клеточных делений.

3.8. Изучение динамики изменения содержания ЦСБ70 в различных органах нророегка в процессе его роста.

На следующем этапе исследовали изменение количества ЦСБ70 в различных частях проростка во время развития с 3 по 5 день. В изучаемый период в меристеме корня сохранялось очень высокое содержание ЦСБ70 (рис. 14 и рис. 15). что соответствует поддержанию в меристеме высокого уровня клеточных делений. Наименьшим, на протяжении всего изученного периода, было содержание ЦСБ70 в мезокотиле В узле проростка количество выявляемого ЦСБ70 уменьшаюсь. Узел представляет собой наиболее сложный по составу формирующих его клеток орган. Здесь сосредоточено несколько видов меристем. Клетки части узла, прилегающей к мезокотилю. делясь, переходят в состав мезокотиля [Александров 1966; Езаи 1977]. К пятому дню рост мезокотнля замедляется вследствие снижения митотическон активности клеток соответствующей зоны узла. Это один из факторов, объясняющих наблюдаемое уменьшение уровня ЦСБ70 в узле. Кроме того, узел является местом, от которого начинается рост придаточных корней проростка. На этапе третьего дня развития проростка точки роста боковых корней представлены клетками меристематических зон будущих корней, позднее, по мере деления этих клеток, начинают формироваться другие зоны, представленные клетками более крупных размеров и с более низким содержанием ЦСБ70.

Рис. 14. Анализ изменения содержания ЦСБ70 в этиолированном проросте кукурузы в пересчете на 1 г сырой массы. I - меристема корня, 2 - мезокотиль. 3 - узел. 4 -колеоптнль, 5 - первый лист, а, Ь. с - 3. 4, и 5 день -соответственно.

Таким образом, оценивая среднюю концентрацию

ЦСБ70 в клетках узла в ходе роста проростка, обнаружили, что

уровень выявляемого ЦСБ70 становится ниже, но и доля

клеток с высокой митотической активностью по отношению к

общему количеству клеток также уменьшается, В нервом листе

не было отмечено значительных изменений уровня

содержания ЦСБ70.

Рие.15. Анализ изменения содержания ЦСБ70 в этиолированном проростке кукурузы в расчете на I (/'клеток. 1

- меристема корня. 2 - мезокотиль, 3 - узел, 4 - колеоптнль. 5

- первый лист. а. Ь. с - 3. 4. и 5 день - соответственно.

Таким образом, на протяжении всего рассмотренного периода меристема корня и мезокотиль характеризуются постоянным уровнем ЦСБ70, что можно объяснить постоянством функций клеток этих тканей проростка. Узел характеризуется уменьшающимся количеством ЦСБ70. что можно объяснить сокращением в нем числа клеточных делений, а также развитием тканей

различных типов.

Для более полной характеристики ЦСБ70 и его роли в растении важным было выяснить, как связана сто локализация с содержанием активных цнтокппинов в тканях растения. (Эту работу нам любезно помогла выполнить Г.Р. Кудоярова ИБ РАН. г. УФА).

Как показано в табл. 10. меристема содержит, в расчете на единицу сырой массы, существенно больше всех форм цнтокинннов. чем зона растяжения, при этом наибольшая разница в содержании, обнаружена для физиологически активного цнтокинина - транс-зсатина. Таким образом, концентрация цитокинннов в единице объема двух типов клеток меристемы и зоны растяжения

гпл ГГП

А«2 4.5

Шь,

Таол. 10. Анализ содержания цитокининов в меристеме и зоне растяжения кончика корня.__

Содержание Содержание

цитокининов. цитокининов,

Форма нг/г сырого веса нг/10" клеток

цитокинина зона зона

меристема растяжен ия меристема растяжен ия

Зеатин 124.3±23.4 40.1±5.3 1. 1±0.2 2.5±0.3

Зеатин-рибозид 145.7±38.5 67.4±11.2 1.3±0.3 4.2±0.7

Зеатин- нуклеотид 104.4±22.1 63.4±9.5 0.9±0.2 4.0±0.6

Зеатин-Ы9-глюкозид 97.3±13.4 53.6±7.5 0.9±0.1 3.4±0.5

была существенно выше в меристеме. При расчете на клетку картина менялась, что связано с увеличением в несколько раз размера клеток в зоне растяжения по сравнению с размерами клеток в меристеме. В клетках, находящихся на разной стадии развития, от стволовых, находящихся в стадии дифференцировки и до стареющих клеток биосинтез белка и его деградация происходят с разной скоростью. Ннельзя исключить, что в них может определяться не только полноразмерный белок ЦСБ70, но и его фрагменты, что может искажать реальную картину. Поэтому, проверку того, что в используемом в работе варианте сандвич ИФА определяли ЦСБ70, а не его фрагменты, проводили с помощью иммуноблотинга. Образцы растительных экстрактов из органов и частей растения для электрофореза в ДСН ПААГе, на основании данных ИФА, готовили так, чтобы они

Рис. 16. Анализ иммуноблотингом содержания ЦСБ70 в органах 4-х дневных этиолированных растений кукурузы. Цифры - анализируемые органы и ткани: 1- меристема корня; 2 - зона элонгации корня: 3- зона дифференцировки корня; 4 - зона формирования латеральных корней; 5 - первый лист; 6 - узел; 7 - колеоптиль; 8 мезокотиль: 9 - стандарты молекулярных весов: стрелкой показано положение ЦСБ70.

Из результатов анализа (рис.16) следует: во всех тканях ЦСБ70 присутствует в виде белка имеющего молекулярную массу 70 кД, полосы 65 и 30 кД не выявлялись. Существенно, что данные сандвич ИФА отражают реальную картину содержания ЦСБ70 в органах и частях растения. Проведенные исследования показали, что наибольшее количество ЦСБ70 в пересчете на клетку содержится в меристематических тканях кончика корня и узла. При этом сами эти органы растения неоднородны по составу клеток. Так, в кончике корня, наряду с активно делящимися клетками, находятся и клетки покоящегося центра, с очень низклй активностью деления, в узле, как уже отмечалось выше неоднородность клеток очень велика.

Полученные результаты дают общее представление о содержании ЦСБ70 в тканях. Для лучшего понимания роли ЦСБ70 и его участия в программах развития клетки, проходящих под контролем цитокининов. важно знать внутриклеточную локализацию ЦСБ70. Мало знать, что белок участвует в регуляции транскрипции; его внутриклеточная локализация должна соответствовать компартментам клетки, в которых происходят регулируемые процессы. Это обусловило необходимость проведения детальных иммуноцитохимических исследований локализации ЦСБ70 в клетках растения кукурузы.

имели одинаковое содержание ЦСБ70.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 Ш

- 94

----------- _ 68

- 43

- 30

-I. Нммуношпохнмнческнс исследования ЦСБ70.

Иммуноцитохнмическис исследования активно проводятся при изучении локализации белков и часто служат диагностическими и прогностическими маркерами ряда процессов у животных и человека [Pelletier and Morel 1984J.

4.1. Подбор условии для иммуноцитохнмнческого исследования ЦСБ70.

Особенностям исследования растении и, в частности, растения кукурузы с помощью

иммуноцитохнмпческих методов, посвящено много руководств и публикаций [Timms 1986; Van Lammeren 1986; Freeling and Walbot 1994; Melan 1994; Roland and Vian 19911. Тем не менее в каждом отдельном случае необходимо проводить предварительные исследования по подбору условий фиксации, полимеризации смолы, использования метки для визуализации продуктов нммугюхнмических реакции. Важными являются правильный подбор условий контроля, обеспечивающего оптимальное соотношение сигнал - фон. Другим параметром, определяющим успех метода, является конструирование каскада усиления сигнала путем создания мулыпмерного комплекса стрентавндииа с бпотнннлпрованными антителами. Это позволяет при низком уровне неспецифических реакций на контрольных срезах получить хороший сигнал в опыте. При электронной микроскопии чувствительность стрептавидип-биотиновой системы (копыогата стрептавндииа с коллоидным золотом) оказатась достаточной [Васильева и сотр 2008J.

4.2. Анализ специфичности н способности антител узнавать ЦСБ70 на срезах.

При исследовании локализации ЦСБ70 использовали MA [Заграничная и др. 1997|. Они имели близкие константы аффинности, по обладали разной специфичностью в активации элонгации транскрипции с участием ЦСБ67 [Kiilaeva O.N., 1998]. В наших исследованиях MA по-разному взаимодействовали с ЦСБ70 в присутствии траис-эеатина (рис. 5) и различались гю индексам аддитивности (табл. 6). Мы предположили, что и в иммуноцитохнмпческих реакциях анппела могут не одинаково взаимодействовать с ЦСБ70. Кроме того, у функционально близкого 1ДСБ67 было показано существование аналога с хлоролластной локализацией [Ссливанкина и соавт.. 1997; Kulaeva et all., 2000]. Можно было предположить, что н ЦСБ70 может иметь различную внутриклеточную локализацию и важно было проверить, как антитела узнают белок па срезах в разных оргамеллах клетки. В результате проведенных исследований было установлено, что среди полученных к ЦСБ70 MA есть две группы MA, отличающиеся по их способности узнавать белок в электронной и световой микроскопии на срезах органон проростка MA первой группы ( 1 1BI. 1 IB3. 13D3, 15) обнаруживали ЦСБ70 в ядрах и цитоплазме, а антитела второй группы (83. 14А4. 523. 36). кроме взаимодействия с ЦСБ70 в ядрах, ядрышке и цитоплазме, эффективно выявляли его в пластидах [Brovko et al 20101.

Различие способности двух групп МЛ выявлять ЦСБ70 в разных компартментах клетки первого листа и корневого чехлнка кукурузы показано на рис. 17. и табл. 11. Контрольная сыноро1ка. не содержащая МЛ к ЦСБ70. давала лишь незначительное окрашивание при световой микроскопии и незначительное количество золотых частиц в клетках.

Табл. II. Распределение золотых частиц на 1 цт~ в компартментах клеток листа и клетках чехлпка кормя 4-х дневного этиолированного проростка кукурузы. Данные получены иммуноэлектронной микроскопией с использованием антител к ЦСБ70 первой (1 ] ВI) и второй (14А4) группы и коиыогата стрептавиднна с золотом.

Орган Гни Нуклео плазма Ядрышко Цитоплазма Пластиды

растения антител

Первый I4A4 9.26 ±3.79 18.92 ±0.83 5.14 ±0.33 21.60 ± 5.83

ЛИСТ' - 0.37 ±0.06 0.20 ±0.07 0.32 ±0.09 0.22 ±0.06

1 IBI 9.61 ±3.98 20.89 ±0.97 5.95 ±0.40 0.35 ±0.03

- 0.39 ±0.08 0.20 ±0.06 0.55 ± 0.10 0.33 ±0.06

Корневой 14Л4 9.14 ±3.93 19.14 ± 0.91 4.20 ±0.53 27.30 ±6.52

чехлик - 0.28 ± 0.08 0.37 ±0.06 0.30 ±0.07 0.28 ±0.08

11131 10.96 ±4.53 21.45 ± 0.84 4.99 ±0.48 0.51 ± 0.09

- 0.51 ±0.09 0.35 ±0.06 0.50 ± 0.08 0.39 ±0.08

Наши результаты, представленные в габл. 11, демонстрируют различную способность МА первой и второй групп взаимодействовать с ЦСБ70, локализованным в компартментах клеток апекса 4-х дневного этиолированного проростка кукурузы. Необходимо отметить, что антитела обеих групп узнавали ЦСБ70 в нуклеоплазме, ядрышке и цитоплазме клеток листа и клеток корневого чехлика. ЦСБ70 в пластидах выявляли только антитела второй группы. Различие способности МА первой и второй групп распознавать ЦСБ70 показано на рис 17, в котором представлены результаты изучения локализации ЦС'Б в клетках апекса стебля этиолированного проростка кукурузы. МА первой группы узнавали ЦСБ70 ядерной локализации (рис. 17-А, черная стрелка), но не в пластидах (рис. 17-А, белая стрелка). МА второй группы выявляли ЦСБ70 в ядрах (рис. 17-В черная стрелка), но при этом более эффективно определяли ЦСБ70 пластидной локализации (рис. 17-В белая стрелка). Следует отметить, что анализ взаимодействия МА первой и второй групп с препаратами ЦСБ70, выделенными из ядер и пластид, в тесте иммуноблотинга не показал специфичности реакции с ЦСБ70 ядерной и пластидной фракций (рис. 17-С). Можно предположить, что в естественном окружении белков в пластидах часть эпигонов ЦСБ70 оказывается недоступной для антител первой группы, возможно, что ЦСБ70 находится в комплексе с белками, которые препятствуют взаимодействию 1ДСБ70 с определенного типа МА. Другим предположением может быть существование семейства гомологичных белков в ядрах и пластидах различия, в которых позволяет антитела дифференциально взаимодействовать с ними.

г, ... .r■ Рис. 17. Изучение специфичности двух групп

i . • МА к ЦСБ70 гю способности распознавать

ЦСБ70 на срезах н в иммуноблотинге. А и В -

'. г ' • V * В'

■4 •

поперечные срезы апекса 4-х дневного V f У,. .. этиолированного проростка кукурузы. А

. ■ 'Л ' **•'.' • инкубировали с МА первой группы (11ВЗ), а . <4 . ' " ч . ■ секцию В - с МА второй группы (I4A4).

л*, s' • Далее обработка срезов

v*. биотинилированными антимышиными IgCi и коныогатом стрептавидин - щелочная фосфатаза. А. черной стрелкой отмечена локализация ЦСБ70 в ядре. Белок не обнаруживался в пластидах (черные стрелки). ЦСБ70 определяется в ядре и не . • • ' / • обнар>-живается в пластидах (белая стрелка).

• •'. . .""" В - антитела взаимодействуют с ЦСБ70.

¡ 2 3 4 локализованным в ядрах, черные стрелки.

С Активное окрашивание обнаружено в

к ~---пластидах (белые стрелки). Масштаб 25 мкм

для А и В.

С - выявление иммуноблотингом ЦСБ70 в белках ядерной и пластидной фракции. Фракции получали, выделяя органеллы из 5-ти дневного этиолированного проростка кукурузы. Линии 1С и 2С - ядерная фракция, обработанная антителами 11ВЗ и 14А4 соответственно. Линии ЗС и 4С - суммарная фракция белков пластид, обработанная антителами к ЦСБ70 11ВЗ и 14А4. соответственно.

Последнее предположение дополняется и аналогией с семейством цитокининсвязывающих белков зеленых листьев ячменя [Каравайко и соавт. 1990: Селиванкина и соавт.. 1997; Кулаева и Кузнецов 2002: Люкевич и соавт. 2002: Kulaeva et all., 1990: Kulaeva el all., 1995: Kulaeva el all.. 1998: Kulaeva et all.. 2000] Учитывая, что антитела и первой и второй групп не показывали предпочтения во взаимодействии с ядерными н пластидными белками в иммуноблотинге. более правильным является предположение о специфическом белковом окружении ЦСБ70 в пластидах, отличным от такового в ядрах и цитоплазме.

4.3. Изучение внутриклеточной локализации ЦСБ70 в этиолированных проростках кукурузы иммуноцнгохимическими методами.

4.3.1. Анализ локализации ЦСБ70 в клетках с помощью антител первой группы.

Исследование локализации ЦСБ70 в клетках меристемы корня проводили с использованием МА к ЦСБ70 первой группы (1IB1). Было обнаружено интенсивное окрашивание ядер меристематнческих клеток (рис 18 А, С. D) и в цитоплазме меристематических клеток (рис 18 D. белая стрелка). Результаты показывают, что 11СБ70 локализован практически во всех

меристематических клетках. Значительное окрашивание наблюдалось в ядрах клеток корневого чехлика, рис 18-А. Наиболее интенсивное окрашивание характерно для ядер меристематических клеток (рис 18 А, С, О, черные стрелки) и особенно для ядрышек этих клеток (двойные черные стрелки).

Рис. 18. Исследование локализации ЦСБ70 срезах кончика корня 4-х этиолированного проростка Е обрабатывали МА, биотинилированными коныогатом стрептавидин -. Контроли - секции В и против ЦСБ70. Секция й - обработка срезов сывороткой неиммунных мышей, секция Н - обработка МА к Мус.

. '-V. '.v • ■:•'.• "'V-

_ гё

Необходимо отметить

неравномерность распределения ЦСБ70 по меристеме кончика корня. Клетки покоящегося центра, в котором локализованы стволовые клетки [Laux 2003], имеют незначительное окрашивание по сравнению с меристематическими клетками, находящимися в стадии активного деления. Клетки, примыкающие к покоящемуся центру, для которых характерны незначительные скорости деления, содержали значительно меньше ЦСБ70 в цитоплазме и ядре, чем более активно делящиеся дочерние клетки, рис 18 А, С. Интенсивное окрашивание наблюдается и в клетках корневого чехлика (рис. 18-А, гс). Продольный срез корня в участке развития сосудистой ткани показывает высокое содержание ЦСБ70 в цитоплазме протодермальных и эпидермальных клеток (рис. 18-D, белая стрелка). В клетках зоны растяжения ЦСБ70 обнаруживается в ядрах (рис. 18-Е черная стрелка) и, особенно, в ядрышках (рис. 18-Е, двойная черная стрелка). ЦСБ70 также виден в цитоплазме клеток зоны растяжения (рис. 18-Е черная стрелка). При этом необходимо подчеркнуть, что в зоне растяжения клеток содержание ЦСБ70 значительно меньше, чем в зоне меристематических клеток.

Рис. 19. Локализация ЦСБ70 в поперечных срезах мезокотиля А, В, С; узла D, Е, F; колеоптиля G, Н, 1, 4-х дневного этиолированного проростка кукурузы В С. D. Е. Н, I последовательно инкубировали с МА против ЦСБ70; биотинилированными антителами против иммуноглобулинов мыши: коныогатом стрептавидин -щелочная фосфатаза. А, F, G -контроль, инкубация с неиммунной сывороткой мышей, биотинилированными антителами против иммуноглобулинов мыши: коныогатом стрептавидин - щелочная фосфатаза. В -сосудистый пучок мезокотиля. ЦСБ70 определяется в ядре (черная стрелка) клеток флоэмы. С - клетки паренхимы мезокотиля. ЦСБ70 определяется в ядре (черная стрелка) и особенно в ядрышке паренхимальных клеток. D - в клетках апекса узла, плотное окрашивание и содержание ЦСБ70 обнаруживается в активно делящихся клетках граней закладки листа (двойная белая стрелка). Е - фрагмент D: апекса стебля. Цитоплазма и ядра небольших клеток зоны деления клеток хорошо окрашены (белая стрелка). Н - поперечный срез паренхимы колеоптиля. ЦСБ70 определяется в ядрах, прижатых к клеточной стенке и в ядрышке (черные стрелки). 1 - Поперечный срез сосудистой ткани колеоптиля. ЦСБ70 локализован в ядре (черные стрелки), а также в ядрышке (двойная черная стрелка). Масштаб: 50 мкм для секций А. В, С и G, Н, I: 200 мкм для секции D; и 25 мкм для секций Е и F.

Поперечные срезы мезокотиля, узла и колеоптиля 4-х дневного этиолированного проростка кукурузы показывают локализацию ЦСБ70 в клетках надземной части растения. Для клеток мезокотиля характерно весьма низкое содержание ЦСБ70 (рис. 19-В. С черная стрелка). ЦСБ70 определяется в больших паренхимных клетках (рис. 19-С. черная стрелка), а также в клетках сосудистых тканей колеоптиля (рис. 19-Н и -I, черная стрелка), в ядрах прижатых к клеточной стенке вакуолями, а также в ядрах клеток паренхимы.

Изучение локализации ЦСБ70 в тканях узла показало, что общее содержание ЦСБ70 в тканях узла значительно выше, чем в мезокотиле и колеоптиле. при этом в узле наибольшее содержание наблюдается в делящихся клетках апекса проростка и клетках листа (рис. 19-D).

В этих клетках ЦСБ70 локализован в ядре и в ядрышке (рис. 19-Е, черная двойная стрелка), белок также определяется в цитоплазматическом пространстве растущих клеток (рис. 19-Е, черная стрелка).

Результаты изучения локализации ЦСБ70 в проростке 4-х дневного растения кукурузы иммуноцитохимическими методами хорошо согласуются с данными о локализации, полученными

на основании биохимических исследований [Brovko et al 2007].

4.3.2. Исследование локализации ЦСБ70 в клетках меристемы кончика корня и листа методами электронной микроскопии с помощью антител к ЦСБ70 первой группы и коныогита стрсптавнднн-золого.

Внутриклеточную локализацию ЦСБ70 в меристематическпх клетках исследовали методами электронной микроскопии. В работе использовали МА первой группы (1 1В1). Аналогично ядерным рецепторам животных, внутри клетки растений могут существовать белки, способные специфически взаимодействовать с цитокининами и участвовать в регулировании цитокинин-зависп.мых программ. Мы предположили., что одним из кандидатов на эту роль и является ЦСБ70. Как было показано [Бровко и соавт 2002; Шепеляковская и соавт 2002; Вгоуко е! а1 2007], ЦСБ70 присутствует в клетках всех органах и тканях этиолированного проростка кукурузы (рис. 11-13). Это подчеркивает его важность для жизни растительных клеток. Высокое содержание ЦСБ70 зонах клеточных делений в корне и надземной части проростка дает основание предполагать участие ЦСБ70 в регу ляции деления клеток цитокининами. Связь ЦСБ70 с делением клеток подчеркивается тем обстоятельством, что в кончике корня высокое содержание ЦСБ70 обнаруживается в зоне клеточных делений (рис. 18), тогда как стволовые клетки покоящегося центра, имеющие низкий митотический индекс, окрашиваются незначительно по сравнению с окружающими клетками (рис. 18). ЦСБ70 присутствовал в цитоплазме делящихся меристематических клеток, он также обнаруживался в ядре и. особенно, в ядрышке (рис. 18, 20). Это соответствует его участию в цнтокнинн-завпеимой регуляции элонгации транскрипции РНК полимеразой I. которая также локализуется в ядрышке, В надземной части проростка, также как и в корне, наибольшее содержание ЦСБ70 обнаруживается в зонах клеточных делений. Для колеоптиля и мезокотиля это развивающаяся сосудистая ткань (рис. 19), данные иммуноцнтохимин уточняют результаты определения содержания ЦСБ70 в тканях, полученные иммунохимическими методами (рис. 13, 1519). В узле, органе с интенсивным делением клеток, высокое содержание ЦСБ70, полученное иммунохимическими методами (рис. 11-13), нашло подтверждение и в результатах иммуношттохнмнческих исследований (рис. 19).

Анализ результатов, полученных с помощью электронной микроскопии клеток меристемы копчика корня и листа показывает, что наиболее высокий уровень содержания ЦСБ70 в ядрышке (рис. 20 А. черная стрелка), далее в ядре и цитоплазме (рис. 20 А. белая стрелка). Необходимо отметить, что данные, полученные с помощью электронной микроскопии, хорошо коррелируют с результатами, полученными при использовании световой микроскопии, что подтверждает правильность выбора условий анализа.

■ ■ . ■ •.I— -.«.-'.< /л..

' \У

«¡Л

•»... * * ' -п

N.1 Г

• «г

• « -Л ,

',> у; *

■ < ♦

Рис. 20. Изучение

внутриклеточной локализации ЦСБ70 с помощью электронной микроскопии. А, С срезы меристемы кончика корня и В. О срезы клеток листа 4-х дневных этиолированных проростков

кукурузы. Срезы обрабатывали: А . и В МА к ЦСБ70. а С. Г> -. : сывороткой неиммунных мышей, 1 биотинилированными антителами против мыши и коиыогатом стептавидин-коллондное золото. ЦСБ70 выявлялся в цитоплазме

( (черная стрелка), нуклеоплазме (белая стрелка-треугольник) н ядрышке (черная стрелка -треугольник). N - ядро, п ядрышко, гп - митохондрии, с - цитоплазма, а -амилопласт, V - вакуоль, - клеточная стенка. Масштаб - I мкм.

Распределение ЦСБ70 в компартментах клетки неравномерно. Расчеты содержания белка в

нуклеоплазме и ядрышке

Табл. 12. Распределение золотых частиц в клетках меристемы корня и листа 4-х дневного этиолированного проростка кукурузы (количество частиц/мкм").

Орган Антитела Нуклеоплазма Ядрышко Цитоплазма

растения 11В1

Лист + 9.61 ±3.98 20.89 ±0.97 5.95 ±0.40

- 0.39 ±0.08 0.20 ± 0.06 0.53 ±0.10

Кончик + 10.96 ±4.53 21.45 ±0.84 4.99 ±0.48

корня - 0.51 ±0.09 0.35 ±0.06 0.50 ±0.08

показывают. что

количество его в ядрышке почти в два раза выше, чем нуклеоплазме. само

распределение ЦСБ70 в нуклеоплазме

неравномерно, обнаружены участки с его повышенным содержанием. Необходимо также отметить,

что содержание ЦСБ70 в цитоплазме было значительно ниже, чем в ядрышке и нуклеоплазме

ЦСБ70 не определялся в области клеточной стенки и вакуоли, рис. 20-А.-В.

Результаты определения ЦСБ70 в ткани находятся в хорошем соответствии с данными по

распределению в корнях цитокининов (табл. 10), хорошо согласуются также с литературными

данными о распределении цитокининов в зонах корня арабидопсиеа [АНош е1 а1 2005]. Результаты

иммуноцитохимического анализа наличия ЦСБ70 в ядре (рис. 20) хорошо коррелируют с данными о

содержании цитокининов в ядрах клеток апикальных частей побегов табака [Ое\мНе е1 а1 1499].

ЦСБ70 определи иммуноцитохимическими методами не только в делящихся клетках, но и в клетках

с низким уровнем деления (рис. 18. 19) в клетках зоны элонгации корня, клетках паренхимы

колеоптиля и мезокотиля. В этих клетках основное содержание белка обнаруживалось в ядре.

Данные электронной микроскопии клеток меристемы кончика корня и листа показывают, что

наиболее высокий уровень содержания ЦСБ70 в ядрышке (рис. 20 А. черная стрелка), далее в ядре и

цитоплазме (рис. 20 А, белая стрелка). Подсчет содержания золотых частиц на единицу площади среза показал, что содержание ЦСБ70 в ядрышке в четыре раза выше, чем в цитоплазме, и в два раза выше, чем в иуклеоплазме (табл. 12). При этом белок не обнаруживается в вакуоли или в видимых на рис. 20 фрагментах клеточной стенки. Следует подчеркнуть, что это первые сведения о внутриклеточной локализации ЦСБ70 в растении. Данные по локализации ЦСБ70 в клетках растения кукурузы подтверждают его направленное участие в регуляции транскрипции в ядрышке.

4.4. Изучение локализации ЦСБ70 в пластидах проростков кукурузы иммуноцнтохнмнчеекнмн методами, с использованием МА второй группы.

При регуляции цитокнпинамн процессов жизнедеятельности растений, пластиды имеют большое значение не только как органеллы. содержащие цнтокниниы в качествн возиожного депо (Benkova et. al. 1999]. но и как автономные органеллы синтеза цнгокннинов в нормальном растении [Kasahara et. al. 20041. а также чрезвычайно важны при трансформации растений бактериальной нзопептепил граисферазон (IPT) [Sakakibara ct. al. 2005]. В свою очередь, цитокиннны играют важнейшую роль в биогенезе хлоропластов [Sveslinikova et al. 1965: Steller and Laetsch 1965: Кулаена 1973: Kuznelsov et al 1994: Zavaleta-Mancera el al 1999]. Цитокиннны регулируют дифференцнровку хлоропластов из пропластпд [Хохлова 1977: Longo el al 1979]. Имея такой инструмент, как специфические МА. дифференциально узнающие локализацию ЦСБ70 в клетке, мы поставили задачу изучить его распределение не только в ядерло-цитоплазматическом компартменте клеток, но н в пластидах кукурузы. О важности этих исследовании говорит и то, что для хлоропластов листьев ячменя характерно присутствие ЦСБ (ЦСБхл). отличалнчающихся от ЦСБ67 имеющего ядерно-цнтоплазматнческую локализацию [K.ulaeva et al 2000: Lukevich et al 2002].

4.4.1. Изучение локализации ЦСБ70 в амилоплаетах.

Локализацию ЦСБ70 в клетках кончика корня изучали, используя два антитела второй группы: 14А4 и 523. МА принадлежали к разным классам и разлнчатнсь по аффинности (14А4 - IgGyl 10'7М и 523 - lgCiy2b l()r'M). Оба МА распознавали ЦСБ70 на продольных срезах корневого чехлика в амилоплаетах колумеллы (рис. 21-А, черная стрелка), при этом ЦСБ70 не выявлялся в калнптрогене. контрольные срезы также не окрашивались (рис. 21-В). Это подчеркивает высокую специфичность используемых для детекции антител. На рис. 21-С при более высоком увеличении хорошо видна локализация ЦСБ70 в амплопласте колумеллы кончика корня Иммуноцптохнмнческий анализ локализации с использованием антител против ЦСБ70 второй группы, копыогага стрептавпднн-золото и электронной микроскопии показал, что ЦСБ70 преимущественно локализован вне крахмазьных гранул (рис. 23-А) и незначительное количество ЦСБ70 определялось в цитоплазме.

Рис. 21. Изучение локализации ЦСБ70 на продольном срезе кончика корня и поперечном срезе мезокотиля 4-х дневного этиолированного проростка кукурузы. А. С, D. Е. F обработка срезов МА второй группы против ЦСБ70. биотиншшрованными антимышиными IgG и коныогатом стрептавидин-щелочная фосфатаза. В - контроль срезы инкубировали с неиммунной сывороткой мыши. А-С доокраска сафроннном

Пунктирная линия - граница между апексом н корневым чехликом. Вертикальные

пунктирные линии - отделяют колумеллу (CL) и калиптроген (СР) от других тканей. Амилопласты колумеллы содержат ЦСБ70 и интенсивно окрашены (черная стрелка). С - 2.5-кратное увеличение А. D, Е - ЦСБ70 в пластидах паренхимных клеток мезокотиля, окружающих сосудистые пучки VS (черная стрелка). Масштаб: А - 75цт, B.D - 60щп. Е, - 40цт и С - ЗОцт.

Хорошо известно, что специализированные амилопласты корневого чехлика - статолиты участвуют в гравитропических реакциях растения [Sievers et al., 1989: Volkmann et al.. 1991; Braun et al., 2002]. Участие ЦСБ70 в процессах гравитропизма представляется нам матовероятным. гак как ЦСБ70 определяется также и в неседиментирующнх краевых амилопласгах. Наиболее вероятным является участие ЦСБ70 в цитокинин-зависимых процессах биогенеза амилопластов из пропластид. Подтверждением этого предположения могут быть такие факты, как соответствие обнаруженного нами высокого содержание ЦСБ70 в амилопластах колумеллы кончика корня кукурузы (табл. 13). и данных о высокой концентрации активных цитокининов в колумелле корневого чехлика арабидопсиса [Alloni et al. 2005]. Решающим аргументом в пользу второго предположения является тот факт, что высокая концентрация цитокининов в питательной среде культуры клеток табака приводит к днфференцировке амилопластов из пропластид [Sakai et al. 1992: Miyazawa et al. 2002].

Транскрипционный анализ с использованием пластидного генетического аппарата показал, что цитокинин-индуцнруемый биогенез пропластид в амилопласты сопровождается перестройкой транскрипционной активности в пластидах [Sakai et al 1992]. Нами показано [Brovko et al 2010] участие ЦСБ70 в цитокинин-зависимой элонгации транскрипции в пластидной транскрипционной системе (табл. 14. 15). Важно, отметить, что мутации в гене, кодирующем хлоропластный фактор элонгации транскрипции (ET) растения кукурузы, блокирует не только развитие хлоропластов. но и амилопластов [da Costa е Silva et al 2004]. Следовательно фактор элонгации транскрипции важен

для регуляции биогенеза пластид, включая хлоропласты и амилопласты. Присугствне цитокинин-связывающего белка в амнлопластах клеток кончика корня показано впервые в нашей работе.

4.4.2. Анализ локализации ЦСБ70 в этиопластах и хлороплаетах помощью антител второй группы. Исследование методами световой микроскопии.

В 4-хдневном этиолированном проростке кукурузы ЦСБ70 выявлялся в этиопластах

мезокогиля (рис. 21-Э, -Е), листьях узла и апексе стебля (рис.22). Локализацию белка в пластидах

клеток мезокотиля изучали на поперечных срезах 4-х дневного проростка кукурузы, используя МА

второй группы (14А4).

Рис. 22. Изучение локализации ЦСБ70 на поперечном срезе узла 4-х дневного

этиолированного проростка кукурузы. Секции А, С, О инкубировали с МА второй группы, биотинилированными антителами против мыши и коныогатом стрептавидин-щелочная фосфатаза. А. С, О проводили доокраску ядер сафронином. А - пунктирные линии - границы

сформировавшихся листьев с I-го по 4-й. ар - апекс. Черными стрелками показано выявление ЦСБ70 в клетках второго листа. В других листьях окрашивания не обнаруживается. С двукратное увеличение А. Черная стрелка указывает обнаружение ЦСБ70 в пластидах, прилегающих к ядру, белая стрелка указывает пластиды, не окрашенные и не содержащие ЦСБ70. О - увеличенный фрагмент С, стрелкой указаны пластиды, содержащие ЦСБ70. В - выявление ЦСБ70 как и в А, С, Э. Большое количество пластид содержащих ЦСБ70, локализованы вокруг ядра. Е - фрагмент стволового апекса, иммуно выявление как в А, С, й, большое количество пластид, содержащих ЦСБ70. В - окрашенные пластиды отсутствуют в зонах клеточных делений, ЦСБ70 в этих зонах выявляется в ядрах и цитоплазме (черная стрелка треугольником). Б - контроль, первая стадия -обработка срезов неиммунной сывороткой мыши, а далее как для секций А, В и Е. Масштаб: А - 50 мкм. В, С. Е - 25 мкм, Б - 100 мкм.

Обнаружено, что ЦСБ70 присутствует в клетках, окружающих сосудистые пучки (рис. 21-0, черная стрелка). ЦСБ70 не выявлялся в клетках эпидермиса и в больших клетках паренхимы (рис. 21-Е). Узел представляет собой сложную систему, в которой присутствуют клетки, находящиеся на разном уровне дифференцировки. Здесь закладываются листья, и происходит удлинение в обе

стороны клеток стебля [Александров 1966: Няап 1977], Известна высокая гетерогенность и структуре и степени дифференцировки популяции этиопластов этиолированных листьев кукурузы [МасК.епс1ег 1978] В соответствии с представленными МасКепс1ег результатами, в наших исследованиях по изучению содержания ЦСБ70 в этиопластах было обнаружено, что популяции этиопластов в листьях, примыкающих к середине стебля этиолированного проростка, значительно различались по содержанию в них ЦСБ70 (рис 22-А). Различия наблюдались не только между этиопластами разных листьев, но и этиопластами одной клетки (рис 22-0). Второй лист содержал наибольшее количество ЦСБ70 (рис 22-А. -В). В первом листе, также как и п третьем и четвертом. ЦСБ70 не обнаруживался, что позволяет предположить, что содержание ЦСБ70. ею количество н органеллах связано со степенью развития этиопластов.

Необходимо отметить, что при изучении локализации ЦСБ70 в органах и частях растения иммунохимическими методами было установлено, что на второй и третий день роста растения содержание ЦСБ70 в узле сравнимо с его содержанием в меристеме кончика корпя (данные не представлены), а в последующие дни роста содержание ЦСБ70 в узле уменьшалось.

4.4.3. Исследование локализации ЦСБ70 в эгиопласгах и хлороилаетах с помощью антител второй группы ме тодами электронной микроскопии.

Для выяснения вопроса связи содержания в этиопластах п хлороиластах ЦСБ70 и степенью их дифференцировки изучали локализацию ЦСБ70 иммупоцитохпмпчкекимн методами, используя антитела второй группы, коныогат стреп гавиднп-золото и детектируя метку с помощью электронной микроскопии. Видно, что уровень содержания ЦСБ70 в органеллах связан с развитием в них внутренних мембран (табл. 13). Небольшое количество ЦСБ70 определяется в этиопластах па начальных стадиях развития внутренних мембран (рис 23-С). Количество ЦСБ70 значительно возрастало с увеличением развития внутренних мембран (рис. 23-0) и значительно уменьшалось в этиопластах с развитыми проламелларными телами (табл. 13: рис 23 -С. -О. -Е). Приведенные результаты показывают разные уровни содержания ЦСБ70 в этиопластах. в зависимости от степени их дифференцировки. Это, а также тот факт, что диффереицировка пластид регулируемся цитокининами [Хохлова и др. 1978]. позволяют предположить, что ЦСБ70 можез являться участником процессов биогенеза этиопластов.

1 am

■ г-:

s '

..-vim

•jr

Рис.23. Анализ локализация ЦСБ70 в амилопластах чехлика корня и в этиопластах второго листа узла с помощью электронной микроскопии. А - срезы чехольчика корня и С, Э, Е второго листа 4-х дневного этиолированного проростка кукурузы. Срезы обрабатывали МА к ЦСБ70 второй группы (14А4), контрольные срезы В. И сывороткой неиммунных мышей, биотинилнрованными

антителами против мыши и

коныогатом стрептавидин-золото. Большая плотность 1ДСБ70 выявлялась вне крахмальных гранул в амилопластах корневого чехлика (черные стрелки), и в незначительном количестве ЦСБ70 выявлялся в цитоплазме, белая стрелка. Контроль, секция В. золотые частицы не наблюдались. Небольшое количество золотых частиц у этиопластов с плохо развитой мембранной системой (секция С, черная стрелка). Высокая плотность ЦСБ70 в пластиде с активно развивающейся внутренней мембранной системамой (секция Э, черная стрелка). ЦСБ70 детектировался в нуклеоплазме, стрелка черным треугольником. Очень низкое содержание золотой метки в этиопластах с сформировавшимися проламилярными телами - Е. Контроль - Р. Обозначения: ат - амилопласт: э - крахмальные гранулы; рЬ - проламнлярные тела. Масштаб - 1 мкм.

4.4.4. Изучение локализации ЦСБ70 в хлоропластах зеленых листьев кукурузы.

Для дальнейшего изучения роли 1ДСБ70 в биогенезе пластид исследовали содержание ЦСБ70

Табл. 13. Концентрация золотых частиц в амилопластах и этиопластах 4-х дневного этиолированного проростка кукурузы и хлоропластах зеленого листа кукурузы определяемая с помощью электронной микроскопии, антител второй группы (14А4) и коныогата стрептавидин-золото. 1 - этиопласт на начальной стадии развития внутренних мембран; И -этиопласт с развитыми внутренними мембранами; III - этиопласт с дифференцированными проламилярными телами.

Пластиды Число золотых частиц на 1 рпг

Амилопласт 40.0 ±2.0

Этиопласты-1 3.4 ±0.2

Этиопласты -11 26.6 ±1.3

Этиопласты - 111 1.8 ± 0.1

Хлоропласт 14.1 ± 1.4

в хлоропластах зеленых листьев кукурузы. Брали участок средней части (10 см от основания) 3-го листа 20 дневных растений кукурузы. Функциональное значение ЦСБ70 для пластид было подтверждено обнаружением его в хлоропластах 3-х недельных зеленых растений кукурузы.

Рис. 24. Локализация ЦСБ70 в хлоропластах обкладки сосудистых пучков зеленых листьев

кукурузы при исследовании световой и электронной микроскопией. А, В -поперечные срезы средней части третьего листа 20 дневного растения кукурузы. А -срезы инкубировали с МЛ против ЦСБ70. второй группы, В - контролные срезы обрабатывали сывороткой неиммунных мышей. Далее инкубировали все срезы биотинилированными антителами к мыши и коньюгатом стептавидин - щелочная фосфатаза. С и О - определение ЦСБ70 в хлоропластах клеток сосудистых пучков электронной микроскопией. С - первая инкубация с МА ЦСБ70. второй группы. Э -контроль - первая инкубация с сывороткой неиммунных мышей. Последующие обработки секций С и Э биотинилированными антителами к мыши и коньюгатом стрептавидин - золото. Видно присутствие СВР70 в хлоропластах обкладки сосудистых пучков, с противоположной от сосудов стороны (А - черная стрелка). Пластиды в других клетках не окрашены. ЦСБ70 локализован в хлоропластах, черная стрелка, и не обнаруживается в крахмальных гранулах. Обозначения; Ьэс - клетки обкладки; сЫ - хлоропласты; N - ядро; Я - крахмальные граны; Уэ-сосудистые пучки. Масштаб 30 цш для А и В и 1 цш для С и О.

Наличие ЦСБ70 в хлоропластах обкладки сосудистого пучка, типичной для Cj растений [Romanowska and Drozak 2006] изучали иммуношпохимическн с помощью световой и электронной микроскопии (рис. 24). Необходимо заметить, что анализ методами протеомики выявил явные различия полипептидного состава для этнопластов и хлоропластов [Zychlinski el al 2005] и показал, что в хлоропластах присутствуют те белки этиопластов, которые важны для функционирования хлоропластов [Blomqvist el al 2008]. Следовательно, присутствие ЦСБ70 в зрелых хлоропластах позволяет предположить его функциональную важность для хлоропластов. 5. ЦСБ70 как регулятор элонгации транскрипции в пластидах.

Нами установлена способность ЦСБ70, выделенного из этиолированных проростков кукурузы, регулировать элонгацию транскрипции т vitro в модельной системе, содержащей ассоциированную с хроматином РНК полимеразу 1. выделенную из зеленых листьев ячменя (табл. 3 и 4). В этой системе новые транскрипты не инициируются, система только поддерживает элонгацию уже инициированных транскриптов in vivo. Антитела ингибировапи способность ЦСБ70 регулировать цитокинин-зависимую элонгацию транскрипции, это подчеркивает, что выделен функционально активный белок (табл. 7). Важным также было и то. что на регуляцию транскрипционной активности ЦСБ70 влияли активные цитокинины. а аденин и функционально неактивные

природные п синтетические аналоги цитокннинов не оказывали влияния (табл. 4). Вставал вопрос о функциональной роли ЦСБ70 пластид. Локализация ЦСБ70 в пластидах на разных этапах их дифференцировки, связь между содержанием ЦСБ70 в пластидах и биосинтезом внутренних мембран позволяют выдвинуть вопрос о функциональной роли пластидного ЦСБ70, в частности о возможном его участии в процессах регуляции транскрипции в этиопластах. К настоящему времени только один цитокинин-связывающин белок (ЗСБхл) был выделен из хлоропластов ячменя. Он в комплексе с транс-зеатином активировал синтез хлоропластной РНК в хлоропластном же лизате. Вместе с тем ЗСБхл не влиял на синтез РНК в изолированных ядрах РНК-полимеразами I или II [Селиванкина и соавт.. 1997; Kulaeva et all., 2000]. Было установлено, что свойства ЗСБхл как регулятора транскрипции изменяются с возрастом ткани листа [Люкевич и соавт., 2002]. При этом совместное действие ЗСБхл и транс-эеатина на синтез РНК в лизатах хлоропластов из ячменя в зависимости от возраста листа изменялось с активирующего на ингибирующее [Люкевич и соавт., 2002]. Все это представляло целесообразным исследовать способность ЦСБ70 этиопластов участвовать в цитокинин-зависимой регуляции транскрипции в этих органеллах.

5.2. Активация с помощью ЦСБ70 этиопластов элонгации транскрипции в лизатах хлоропластов и этиопластов.

Для выделения ЦСБ70 этиопластов использовали первый лист 5-ти дневных этиолированных растений кукурузы. Проводили выделение этиопластов, характеризовали их качественно и далее выделяли ЦСБ70 [Brovko et. al. 2010]. Для элюции использовали 6М гуанидин гидрохлорид и была введена процедура рефолдинга. Подбор условий рефолдинга показал, что при рефолдинге с помощью диализа или разбавлением значительная часть белка агрегировала и теряла цитокининсвязывшощую активность. Была разработана процедура рефолдинга со сменой буфера в автоматическом режиме на ячейке 8МС (Amicon USA). Элюат с аффинной колонки концентрировали на мембране YM10 (Millipore USA) до 100 мкл, далее в резервную камеру добавляли раствор буфера для рефолдинга, содержащий растворимое комплексное соединение цинка и меркаптоэтанола [Colvard and Wilson 1984]. Полученный таким образом препарат ЦСБ70 использовали для иммунохммических и функциональных исследований.

1 2 Рис. 25. Иммуноблот-анализ препарата ЦСБ70, выделенного из этиопластов тандемной аффинной хроматографией на аденозин и транс-зеатин рибозид Toyopearl. Линия 1 - для анализа наносили 100 мкг ^^ .. «м тотального белка этиопластов. Линия 2 - для анализа использовали 2 мкг препарата, выделенного аффинной хроматографией и рефолдированного ЦСБ70. Использовали МА второй группы (14А4). ^ __Цифрами обозначены маркеры молекулярных масс.

Рис 25 демонстрирует эффективность процедуры выделения ЦСБ70 Оба анализируемых образца, как выделенный, так и в составе

этнопластов содержали небольшое количество проектов с молекулярной массой меньше 70 кД.

имели электрофоретнческую

Табл. 14. Цнтокинин-завпснмая активация элонгации транскрипции в лизате этнопластов препаратом ЦСБ70 выделенным из этнопластов 4-диевных этиолированных проростков кукурузы.

ЦСБ70 (нг/100 Ц1) Транс-зеатин 10"7М Включение [3Н]иМР в РНК

Имп/мин/10 ДНК %

0 - 38682± 1802 100

0 + 35204 ± 2201 91

48 - 31196 ± 2464 81

16 + 47627 ±3810 123

32 + 78595 ±6951 203

48 + 115614 ± 6127 299

подвижность, аналогичную подвижности ЦСБ70, выделенному из этиолированных проростков кукурузы. ЦСБ70 этнопластов проверяли на способность цнтокиинп-зависимо регулировать элонгацию транскрипции в лизате этнопластов. который содержал все компоненты, необходимые для транскрипции. В присутствии транс-зеатина ЦСБ70 активировал синтез РНК. Активация отсутствовала при добавлении в систему только ЦСБ70 или только транс-зеатина (табл. 14).

Это показало, что ЦСБ70 способен активировать цитокннин-зависимую элонгацию транскрипции в системе, из которой он и был выделен - из этнопластов проростков кукурузы. В присутствии транс-зеатина ЦСБ70, выделенный из этнопластов, активировал включение метки в РНК пропорционально количеству белка, вносимого в реакцию (табл. 14).

В присутствии транс-зеатина ЦСБ70, выделенный из этнопластов кукурузы, также активировал элонгацию транскрипции в лизате хлоропластов, выделенных из зеленых листьев ячменя (табл. 15).

Таким образом, ЦСБ70, выделенный из этнопластов 5-ти дневных проростков кукурузы

Табл. 15. Цитокинин-зависимая активация элонгации транскрипции в лизате хлоропластов из зеленых листьев ячменя, в присутствии ЦСБ70, выделенного из этнопластов этиолированных проростков кукурузы. Концентрация транс-зеатина в реакционной смеси составляла 10'7М, ЦСБ70-32 нг/ЮОр! реакционной среды. еРж

сод

Добавляемые в реакционную смесь компоненты Включение 3Н-УМФ в РНК

Имп/мин/10 двДНК % от контроля

Контроль 27106 ± 1221 100

Транс-зеатин 26292±1314 97

ЦСБ7070, этнопластов 33875 ±2371 125

Транс-зеатин + ЦСБ70, 76984 ± 5388 284

этнопластов

ащи нся так же

хлоропластах зеленых листьев кукурузы, показывал способность цитокинин-зависимо регулировать

элонгацию транскрипции и в хлоропластной транскрипционной системе. Из полученных данных

можно сделать несколько важных выводов. Во-первых, ЦСБ этнопластов сохраняет

функциональную активность в хлоропластах.

Во-вторых, белок не проявлял видовой специфичности в своей функционапьнои активности.

ЦБ70, выделенный из кукурузы, был активен в транскрипционной системе, полученной из ячменя.

0ni данные, а также обнаружение ЦСБ с близкими молекулярными массами в листьях ржи. ячмени, пшеницы и овса, дчя двух из которых показано не только специфическое взаимодействие с цитокппннамн, но и участие в цптокпннп-завнепмой регуляции элонгации транскрипции, позволяют говорить о наличии в растениях семейства цитокнннн-связывающих белков - участников цнтокипин регулируемых транскрипционных процессов. Они могут быть факторами элонгации или белками, участвующими в регуляции факторов транскрипции.

Различие между этнопластами и хлоропластами ис только в полипептндиом составе, их транскрипционные системы также значительно различаются [Zuchlinski et al. 2005]. Несмотря на структурную похожесть РНК полпмераза бактериального типа и сигма подобный транскрипционный фактор (SLF) этпопластов и хлоропластов различаются функционально, это выражается в использовании различных промоторов и в различной длине транскриптов [Tiller and Link 1993]. Учитывая, что выделенный из этиопластов ЦСБ70 проявлял в присутствии транс-зеатина способность активировать элонгацию транскрипции как в лизате этиопластов кукурузы, так и в лизате хлороплатов полученных из зеленых листьев ячменя, можно заключить, что белок играет важную и универсальную роль в цитокииин-завненмой транскрипции во всех типах пластид [Brovkoet al 2010]

Исследования последних лет показывают, что белки - регуляторы этонгацни транскрипции имеют важнейшее значение в регуляции экспрессии генов у эукариот [Lis et al 2007; Mavrich et al 2009]. Активация нескольких сот ядерных генов, участвующих в контроле и ответе на внешний сигнал контролируется на уровне элонгации транскрипции [Aivar el al 2004; Muse et al 2007; Zeitlinger et al 2007]. К настоящему времени идентифицировано большое количество эукарнотических ядерных факторов элонгации транскрипции, активирующих или репрессирующих транскрипцию РНК полимеразами 1 и 11 [Aivar et al 2004; Yik et al 2005; Komori et al 2009; Zhang et al 2009].

Факторы элонгации транскрипции хлоропластов изучены весьма плохо, только несколько сигма-подобных транскрипционных факторов, регулирующих инициацию транскрипции идентифицированы и активно исследуются [Lysenko 2007]. Есть сведения о цинк содержащем факторе элонгации транскрипции хлоропластов кукурузы (ЕТ1) [Costa е Silva et al 2004]. Он структурно похож на эукариотическнй фактор элонгации транскрипции TFIIS, регулирующий РНК полимеразу II в ядре. Точный молекулярный механизм функционирования фактора ЕТ1 не установлен.

Представляется важным, что ЦСБ70 активировал элонгацию транскрипции in vitro как в системе содержащей хроматин [Бровко и др 1996; Kulaeva et al 1998; Brovko et al 2007], так и в системе содержащей лизат этиоплатов кукурузы и хлоропластов ячменя [Brovko et al 2010]. Имеющиеся на настоящее время данные не позволяют однозначно говорить об идентичности этих

белкой, регулирующих ядерную и хлоропластную транскрипцию, это может бить одни и тотжс белок или белки различающиеся как по структуре, так и по постснптетическнм модификациям. Похожая картина описана для стероидных рецепторов, в частности для рецептора эстрогенов. На протяжении длительного времени эти рецепторы рассматривались только как ядерные, но как показано сейчас в результате различного сплайсинга одной мРНК получаются набор рецепторов -ядерно-цптоплазматической н митохондриапьной локализации транскрипционных факторов и мембранных рецепторов [Zhou el al 2005; Yager abd Chen 2007]. Как обстоит дело с цитокннннамн еще предсто!гг выяснить.

6. Заключение.

Совокупность методов фракционирования белков, а также набора биохимических и иммунохимических методов, позволила выделить и охарактеризовать цитокинин-связывающип белок (ЦСБ70 этиолированных проростков кукурузы, участвующий в цнтокиннн-завнеимоп регуляции транскрипции. Важным явилось изучение взаимодействия ЦСБ70 с цитокпннпами и другими гормонами растения, а также аденином. Удалось показать, что взаимодействие ЦСБ70 с цитокининамн находится в соответствии с их активностью, определенной в других функциональных для цнтокининов тестах. Используя иммунохнмическне методы, мы впервые определили распределение ЦСБ70 по растению кукурузы. Обнаружено, что ЦСБ70 присутствует во всех типах клеток. Это говорит о его жизненной необходимости для растения. При этом основное содержание ЦСБ70 оказалось в зонах клеточных делений - мерпстематнческпх тканях корпя и стебля. Обнаружена динамика содержания ЦСБ70 и ее корреляция с активностью клеточных делений в органах. При помощи использования иммуноцптохимических методов в сочетании со световой и электронной микроскопией установлена локализация ЦСБ70 в ядре и ядрышке. Причем в ядрышке меристематических клеток кончика корня и листа была наибольшая концентрация ЦСБ70. Ядрышко в клетке является компартментом, в котором синтезируется предшественники рРНК и локализуется РНК полимераза I. Колокалнзацня в ядрышке ЦСБ70 и РНК полимеразы 1 является важным аргументом того, что ЦСБ70 является участником цитокинин-завнепмой регуляции синтеза рРНК, являющегося основой цитокинеза [Gaudino and Pikaard, 1997]. Установлено участие ЦСБ70 в регуляции цитокннин-зависимой элонгации транскрипции. Показано, что эта функция ЦСБ70 активируется функционально активными цитокннннами, аденнн и неактивные цитокинины не влияли на активность ЦСБ70 в тесте регуляции цитокипин-зависнмой элонгации транскрипции. Интересным оказалось и то, что ряд моноклональных антител к ЦСБ70 обладал способностью регулировать транскрипционную активность ЦСБ70, как активируя, так и ингибируя ее.

Моголами иммуноцнтохпмнн с использованием световой п электронной микроскопии обнаружена локализация ЦСБ70 во всех типах пластид. Необходимо отметить, что содержание и концентрация ЦСБ70 в пластидах не являются постоянными. На примере анализа среза узла обнаружено, что из проанализированных четырех листьев ЦСБ70 определялся только во втором, более того: н в одном типе ткани пластиды различались по содержанию ЦСБ70. Эти результаты находятся в соответствии с биохимически,ми и морфологическими данными о гетерогенности пластид кукурузы [MacKender 1978]. Методами электронной микроскопии установлено, что наличие ЦСБ70 в пластидах коррелирует с развитием внутренних мембран в этих органеллах. Это позволяет предположить, что ЦСБ70 в пластидах может выполнять регуляторную функцию. Пластиды - органеллы, имеющие собственный генетический аппарат, и тот факт, что ЦСБ70 способен принимать участие в регуляции цнтокиннн-завпеимоп элонгации транскрипции в лпзатах пластид, подтверждает возможную роль ЦСБ70 в биогенезе н дифференцировке пластид. Наличие ЦСБ70 в хлоропластах зеленых листьев кукурузы, активация белком цитокннин-зависпмой элонгации транскрипции в лизате хлоропластов зеленых листьев ячменя позволяют констатировать, что наряду с изменением содержания ЦСБ70 в процессе развития пластид он жизненно необходим этим органеллам и присутствует в них от начальных стадии дифференцировки этиопластов до формирования зрелых хлоропластов. Вторым интересным фактом является отсутствие видовой специфичности ЦСБ70 как цитокипин-зависимого фактора, участвующего в регуляции элонгации транскрипции. Он с одинаковой эффективностью работает как в лизате этиопластов, полученном из этиолированных растений кукурузы, так и в лизате хлоропластов, полученном из зрелых зеленых листьев ячменя. Важным фактором является и то, что ЦСБ70 определяется в органеллах, для которых показано, что они содержат цптокинины [Sossountzov et. al. 1986: Hare and Van Sladen, 1997; Benkova el. al. 1999; Dewitle et al., 1999; Aloni 2004]. Совокупность данных иммунохимических и биохимических исследований ЦСБ70 этиолированных проростков кукурузы, обнаружение ЦСБ67 в зеленых листьях ячменя, а также данные о ЦСБ ржи, овса и пшеницы позволяет предположить существование семейства цитокипнн-связывающих белков - регуляторов элонгации транскрипции В настоящее время у растений установлен основной путь рецепции цитокннинов через мембранные гистнднновые киназные рецепторные системы [Kakimoto et. al 1996; Takei et al., 2001]. Описаны три белка рецептора, они различаются по структуре и функциональным особенностям. Инактивация всех трех рецепторов приводила к значительным морфологическим изменениям в растении, но они сохраняли жизнеспособность и способность воспроизводства [Higuchi et. al, 2004, Nishimura et. al. 2004, Riefler et. al. 2006]. Инактивация следующих участников передачи сигнала с рецептора - белков фосфотрансмитгеров, которая также, как и инактивация мембранных рецепторов, должна блокировать передачу цитокинннового сигнала, имела для растения менее драматические последствия, по сравнению с инактивацией всех трех

рецепторов [Hutchison et. al. 2006]. Проведенные п лаборатории Richer J. нсслсдовання показало, что перемещение АНР в ядерный компартмент клетки, при добавлении цнтокннппои. не происходит [Pumvani et al 2010] Вероятно, что кроме мембранной рецепторпоп системы существуют какне-то другие, альтернативные механизмы восприятия цптокининов и ответа клетки на этот гормон.

Мембранные рецепторы - гпстидшювые протеинкпиазы - способны воспринимать внеклеточные цитокнииновый сигнал, между тем показано, что такие оргаиеллы, как ядро и хлоропласта содержат цитокинпны. Один из путей биосинтеза цнтокинпиов в растительной клетке пронсход1ГГ в хлоропластах. Бактериальная изопентеннл трансфераза локализуется и работает в хлоропластах. Все эти данные позволяют предположить существование в растительной клетке, наряду с мембранной сигнальной системой, другие системы восприятия и реализации цитокниииового сигнала. Если обратиться к животным системам, то для них хорошо исследованной является система ядерных рецепторов. Название «ядерные рецепторы» предполагает скорее традиционность устоявшегося названия, отражающего исторический аспект изучения передачи сигнала стероидов в клетке Как хорошо показано в настоящее время, в клетке одновременно могут существовать несколько типов рецепторов, различающихся по локализации, связи с определенным компартментом и, соответственно, результатом ответа на гормональный сигнал. Кроме классических рецепторов, имеющих ядерно-цитоплазматическую локализацию в клетке, присутствует мембранная форма рецептора И если для ядерных рецепторов основная активность состоит в регуляции считывания генетической информации, то есть в биосинтезе гормон индуцируемых белков, то мембранные рецепторы участвуют в активации широкого спектра мембранных рецепторпых систем, систем, которые не взаимодействуют с гормоном [Hammes and Levin 2007]. Активация мембранных рецепторных систем через мембранныуга форму рецепторов стероидных гормонов позволяет клетке моментально отвечать на изменение содержания гормона. И, наконец, показано существование митохондрпалы-ю-цитоплаэматической формы рецептора. Этот тип рецептора способен регулировать как генетический аппарат митохондрии, участвуя в транскрипции митохондриальных генов, так и в комплексе с гормоном непосредственно регулировать апоптоз этих органелл [Levin 2005; Yager and Chen 2007]. Суммируя вышеизложенное, можно отметить, что при реализации сигнала одного гормона используется набор путей, которые и определяют полпфункциональность ответа на гормон. Экстраполируя данные о функционировании рецепторов стероидных гормонов на гормональные рецепторные системы растения, можно предположить возможность наличия в клетке, наряду с мембранной протеинкиназной рецепторпоп системой, дополнительных сигнальных систем, принимающих как внеклеточный сигнал, так и внутриклеточный. Уместно также предположить кооперацию гормональных систем - мембранной и внутриклеточной. В этом плане представляет несомненный

интерес дальнейшее изучение цитокинин-связывающих белков, охватывающее как структурные исследования, так и молекулярные механизмы их функционирования в растительной клетке. Нельзя сказать, что при исследовании ЦСБ70, вернее семейства цнтокинпнсвязывающих белков, участвующих врегуляцин транскрипции (Ссливанкнна 2001 Kulaeva 1995 1998, 2002; Brovko et al 2007; Brovko et al 2010] мы встретили полную аналогию с рецепторами стероидных гормонов, но есть достаточно аргументов, говорящих о сходстве систем. На основании уже предложенных в литературе схем передачи цитокининового сигнала в растительной клетке [То and Kieber 2008], данных, полученных в результате исследования хлоропластного белка ячменя, результатов проведенных нами исследований [Селиваикина и др. 1997; Kulaeva 1995; 1998; 2002; Brovko et al 2007; Brovko et al 2010] можно представить следующую гипотетическую схему восприятия и передачи цитокининогвого сигнала (рис 26).

^Ответ клетки на цитокинины

Плазмалема

Рис. 26. Схема восприятия и передачи цитокининового сигнала в

растительной клетке. Обозначения:

ЦК

цитокинины; АНК1, АНК2, АНКЗ, АНК4/С11ЕI -мембранные рецепторы цитокининов, гистидиновые протеинкиназы; АНР - белки переносчики фосфата с киназ на регуляторы ответа и другие мишени; СИТ1

транскрипционные факторы ответа на цитокинин: АЯЛ-В и АЯК-А белки регуляторы ответа; ЦСБ67-ЦСБ70 - цитокинин-зависимые транскрипционные факторы ядерно-плазматической локализации; ЦСБ64-Хл-ЦСБ70 - цитокинин-зависимые регуляторы транскрипции этиоластно-хлоропластной локализации.

Схема учитывает мембранную рецепторную систему, наличие в компартментах клетки

цитокининов и цитокинин-связывающих белков. Крайне важной темой будущих исследований

является выяснение взаимодействия мембранной рецепторной сиситемы и внутриклеточных

цитокинин-связывающих белков Безусловно, главные открытия - впереди, и это, во-первых,

определение структуры белка, и, исходя из нее, перевод исследований на молекулярный уровень.

7. Выводы:

1. На примере цитокинин-евязывающего белка кукурузы исследованы функциональные аспекты рецепции цитокининов внутриклеточными белками. Из этиолированных проростков кукурузы выделен цитокинин-связывающий белок 70 кД (ЦСБ70). Доказано его специфическое взаимодействие с физиологически активными цитокининами и отсутствие взаимодействия с их неактивными аналогами, а также другими гормонами растений.

2. С помощью иммунохимических и иммуноцитохимических исследований на проростках кукурузы показано присутствие ЦСБ70 во всех типах тканей и клеток, что указывает на высокую значимость белка в жизни растения. Установлена преимущественная локализация ЦСБ70 в зонах клеточных делений (меристеме кончика корня и стебля), что соответствует регуляции цитокинином деления клеток и делает вероятным участие ЦСБ70 в этом процессе.

3. С помощью иммуноцитохимии, в сочетании со световой и электронной микроскопией доказана преимущественная локализация ЦСБ70 в клеточном ядре с наибольшим накоплением в ядрышке. В соответствии с локализацией ЦСБ70 в ядре установлено его участие в цитокинин-зависимой регуляции элонгации транскрипции в системе ш vitro, содержащей хроматин п РНК полимеразу из этиолированных проростков кукурузы и зеленых листьев ячменя.

4. Показано присутствие иммунохимически и функционально родственных ЦСБ70 кукурузы у растений ячменя, ржи, пшеницы и овса, что позволяет заключить, что ЦСБ70 является представителем семейства гомологичных цитокинин-связывающих белков злаков.

5. Установлено, с помощью иммунохимических исследований на проростках кукурузы, что ЦСБ70 присутствует во всех типах пластид, включая амилопласты корня, этиопласты этиолированных проростков и хлоропласта зеленых листьев. Доказано, что ЦСБ70 из этиопластов осуществляет цитокинин-зависимую регуляцию элонгации транскрипции in vilro в транскрипционных системах этиопластов и хлоропластов.

6. Получение представленных материалов стало возможным на основе разработки новых методов выделения и очистки ЦСБ70, разработки и модификации иммуноцитохимических методов для изучения локализации ЦСБ70 в тканях растений и изучения его функциональной активности.

7. Совокупность полученных данных позволяет заключить, что ЦСБ70 представляет собой цитокинин-зависимый фактор элонгации транскрипции или цитокинин-зависимый регулятор активности факторов транскрипции, который участвует в активации цитокинином элонгации транскрипции в чувствительных к фитогормону системах.

8. Список основных работ оиуПликоваипых по теме диссертации: 8.1. Статьи в репетируемых журналах

1. Бровко Ф.А., Заграничная Т.К., Лнсина О.И. Метод разделения белков и фенольных соединений растительного экстракта гидрофобной хроматографией на Toyopearl HW60 // Биотехнология 1994. Т. 9/10 С. 15-18.

2. Бровко Ф.А., Заграничная Т.К., Бозпев Х.М., Липкнн В.М., Каравайко Н.Н., Селиванкина С.Ю., Кулаева О Н. Выделение и характеристика цитокпиин-связывагащего белка молекулярной массой 70 кД из этиолированных проростков кукурузы. // Физиология растений. 1996. Т. 43 С. 533-540.

3. Бровко Ф.А., Заграничная Т.К., Бозпев Х.М.Разделение белков и фенольных соединеиий в растительном экстракте фракционированием сульфатом аммония в присутствии небольших концентраций полиэтиленглпколя. Биотехнология 1996. Т. 7. С. 36-41.

4. Заграничная Т.К., Бровко Ф.А., Шепеляковская А О., Бозиев Х.М., Липкин В.М. Моноклональные антитела к цитокинин-связывающему белку 70 кД из этиолированных проростков кукурузы. // Физиология растений. 1997. Т. С. 5-10.

5. Kulaeva О. N.. Zagranichnaya Т.К.. Brovko F.A., Karavaiko N.N., Selivankina S.Yu., Zemlyachenko Ya.V.. Hall M.A., Lipkin V. M., Boziev Kh. M. A new family of cytokinin receptors from cereales. // Febs Letters 1998. V. 423. P. 239-242.

6. Brovko F. A. and Zagranichnaya Т.К. Separation of proteins from phenols in sereal leaf extract by hydrophobic interaction - ammonium sulfate fractionation. // Plant Physiol Biochem. 1998. V.36 P .773777.

7. Шепеляковская A O., Доронина H.B., Ламан А.Г., Бровко Ф.А., Троценко Ю.А. Новые данные о способности аэробных метилотрофных бактерий синтезировать Цитокинины // Доклады Академии Наук 1999. Т. 368. С. 555-557.

8. Иванова Е.Г., Доронина Н.В , Шепеляковская А О., Ламан А.Г., Бровко Ф.А., Троценко Ю.А. Факультативные и облигатные аэробные метилобактерии синтезируют цитокинины // Микробиология 2000. Т. 6 С. 764-769.

9. Бровко Ф.А., Шепеляковская А О., БурхановаЭ.А , Бозиев Х.М.. Ламан А.Г.,

Васильева B.C., Холл М.А., Кулаева О.Н. Преимущественная локализация цитокинин-связывющего белка (70-кД) в апикальной меристеме корня. // Доклады Академии Наук 2002. Т. 381 №5 С. 684686.

10. Шепеляковская А.О., Теплова И Р., Веселов Д.С., Бурханова Э.А., Бозиев Х.М., Ламан А.Г., В.С.Васильева, Кудоярова Г.Р., Холл М.А., Бровко Ф.А., Кулаева О Н.. Цитокинин-связывагощий белок 70 кД преимущественно локализован в меристеме корня. Физиология Растений 2002. Т. 49. С. 133-120.

1 I. Костеша H.B., Ламам А.Г., Шепеляковская А О., Зайцева И.С., Орлов В.П.. Дыкман Л.А., Бровко Ф.А., Соколов О.И. Селекция и характеристика фаговых мини-антител к актинам различного происхождения. Биохимия 2005. Т.70 С. 1070-1077

12. Brovko FA, Vasil'eva VS, Shepelyakovskava AO, Selivankina SY, Kudoyarova GR, Nosov AV, Moshkov DA, Laman AG, Boziev KM, Kusnelsov VV, Kulaeva ON. Cylokinin-binding protein (70 kDa): localization in tissue and cells of etiolated maize seedlings and its putative function. // J Exp Bot. 2007 V. 58 P. 2479-2490.

13. Васильева B.C., Лушнпкова А.Л, Павлик Л.Л., Мошков Д А., Бровко Ф.А. Разработка метода для иммуноцитохимического исследования цитокинин-связывающего белка 70 кД и его локализация в тканях проростка кукурузы. // Физиология Растении 2008. Т.55 С. 552-559.

14. Brovko FA, Vasil'eva VS, Lushnikova AL. Selivankina SY, Karavaiko NN. Boziev KM, Shepelyakovskaya AO, Moshkov DA, Pavlik LL, Kusnetsov VV, Kulaeva ON. Cytokinin-binding protein (70 kDa) from etioplast and amyloplasts of etiolated maize seedlinds and chloroplast of green plants and its putative function. // J Exp Bot. 2010 V. 61 p. 3461-74.

15. Романов Г.А., Таран В.Я., Оруджев Э.М., Кулаева О.Н., Бровко Ф.А., Липкин В.М. Способ обнаружения веществ сцитокиновой активностью. Патент SU 1808128 A3 (1993).

8.2. Статьи в научных сборниках и других изданиях

1. Karavaiko N. N., Selivankina S.Yu., Brovko F.A., Zemlyachenko Ya V., Shipilova S. V., Zagranichnaya Т.К., Lipkin V. M., Kulaeva O. N. Zeatin-binding proteins participating in cytokinin-dependent activation of transcripton. // In Plant Hormone signal perception and signal transduction Ed by Smith A.R., Berry A.W., J. Harpharm N.V., Moshkov I.E.. Novikova G.V., Kulaeva O.N. and Hall M.A. Kluwer Academic Publ., Dordrecht. 1996 pp. 67-76.

2. Romanov G.A., Orudgev B.M., Brovko F.A., Kulaava O.K. Cereal' cylokinin-binding proteins belonging to putative receptor family recognize purine as well as phenvlurea cytokinins. //14th International Conference of Plant Growth Substances: Amsterdam, 1991. p. 44.

3. Orudgev B.M., Taran Y.Ya., Brovko .A., Romanov O.A. Temporal and spatial distribution of soluble cytokinin binding proteins in cereals: its relation to cytokinin content and sensitivity. // 14tlV International Conference of Plant's Growth Substances: Amsterdam, 1991. -p.51.

4. Brovko F.A., Zagranichnaya Т.К., Boziev Kh.M., Karavaiko N.N., Selivankina S.Yu., Lipkin V.M., Kulaeva O.N. A cytokinin-binding protein from maize coleoptiles. // International symposium on plant hormone signal perception and transduction 1994, P. 13. Moscow

5. Шепеляковская A.O., Заграничная Т.К., Бозиев Х.М., Бровко Ф.А. Тест-система для обнаружения цитокинин-связывающего белка (ЦСБ-70) в растительных экстрактах. // Физико-химические основы физиологии растений и биотехнология, 3-й Съезд общества физиологов растений 1997,. Москва Россия.

6. Заграничная Т.К., Шепеляковская Л.О., Бровки Ф.Л., Бознсв Х.М., Лнпкин В.М., Куласва 0.11. Моноклональные антитела против 1ДСБ-70 конкурируют с траис-зеатином за место связывания с рецептором. // «Физнко-хпмнческне основы физиологии растений и биотехнология», 3-й Съезд общества физиологов растений 1997,. Москва Россия.

7. Шепеляковская А О., Заграничная Т.К., Бознсв Х.М.. Бровко Ф.А. Тест-система для обнаружения цитокинин-спязывающего белка (ЦСБ70) в растительных экстрактах. «Физико-химические основы физиологии растений и биотехнология», 3-й Съезд общества физиологов растений 1997,. Москва Россия.

8. F.A.Brovko, T.K.Zagranichnaya, Kh.M.Boziev, A.0.Shepelyakovskaya, N.N.Anikeeva, O.N.Kulaeva. Investigation of structure and riincluons of cytokinin-binding protein CBP-70 tiom etiolated maize shoots. // International Conference Molecular, Biochemical and Physiological Aspects ofPlant Science, 1997, Moscow.

9. Шепеляковская A O., Васильева B.C., Бозиев X.M., Булгакова E.B., Ламан А.Г., Бровко Ф.А., Куласва О.Н. Иммунохимическое исследование рецептора цитокинннов из этиолированных проростков кукурузы. Распределение по растению IV Съезд общества физиологов растений России

1999, стр. 786. Москва, Россия.

Ю. Великов В.А., Ламан А.Г., Шепеляковская А.О., Ракова Н.Ю.. Бровко Ф.А. Получение комбинаторных библиотек одноцепочных антител; селекция и характеристика мнниантител к зеатнп-рибозиду. // Иммуноаналпз регуляторов роста в решении проблем физиологии растений, растениеводства и биотехнологии. 2000, стр. 5. Уфа, Россия.

11. Шепеляковская А.О.. Васильева B.C., Бозиев Х.М.. Ламан А.Г., Бурханова Э.А., Бровко Ф.А., Кулаева О Н. // Иммуноанализ регуляторов роста в решении проблем физиологии растении, растениеводства и биотехнологии. 2000, стр. 12-13. Уфа, Россия.

12. The 12lh Congress of the Federation of European Societies of Plant Physiology. Budapesht p. 110,

2000.

13. Vasileva V.S., Pavlik L.L., Shepelyakovskava A O., Brovko F.A., Moshkov D.A., Kulaeva O.N. Immunocytochemical localization of cytokinin receptor CBP70 in root tips tissue of maize shoots. // Plant Signaling Systems of Plant Cells 2001 p. 56. Moscow.

14. V.A. Velikov, A.O. Shepelyakovskaya, A.G. Laman, P.G. Suvorova, F.A. Brovko. Production of miniantibodies against zeatin in bacterial cells. International Symposium Intracellular Signalling in Plant and animal Systems. Kyiv, Ukraine, 9-14 September, 2001.

15. Shepelyakovskaya A.O., Teplova L.P., Veselov D.S., Bukharova E.A., Boziev Kh.M., Kudoyarova G.R., Brovko F.A., Kulaeva O.N. Cytokinin-binding protein - CBP70: The content in the root tip of 4-day maize plants. //Plant Signaling Systems of Plant Cells 2001 p. 107. Moscow.

16. V.S.Vasilvcva, L.L.Pavlik, A.L. Scnina, A.O.Shepclyacovskava, F.A.Brovko. D.A. Moshkov, O.N. Kulaeva. Distribution ofcytokinin receptor СВР-70 in maize shoot tissues and eells. International Symposium Intracellular Signalling in Plan! and animal Systems. Kyiv, Ukraine. 9-14 September. 2001.

17. F.A.Brovko, A.O.Shepelyakovskaya, E.A. Burchanova, Kh.M. Boziev, A G banian, V S. Vasilyeva, M.A. Hall, O.N Kulaeva. Predominant localization of cytokinine-binding protein (CBP-70) in the cell division zone of the apical root meristem. International Symposium Intracellular Signalling in Plant and animal Systems. Kyiv, Ukraine, 9-14 September, 2001.

18. Сенина Ф.Л., Васильева B.C., Долгих Ю.И., Бровко Ф.А. Исследование локализации ЦСБ70 во фракциях клеток суспензионной культуры кукурузы. // Рецепция и внутриклеточная сигнализация. 2003, стр. 299. Пущино, Россия.

19. Васильева B.C., Сенина А.Л., Шепеляковская А.О., Долгах Ю.И., Бровко Ф.А., Кулаева О.Н. ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЛОКАЛИЗАЦИИ ЦСБ-70 В ОРГАНАХ И ТКАНЯХ ПРОРОСТКА КУКУРУЗЫ // V съезд Общества физиологов растений России, 2003, Пенза, Россия.

20. Васильева B.C., Лушникова А.Л., Шепеляковская А.О., Мошков Д А.,

Павлик Л.Л., Бровко Ф.А., Кулаева О Н ИССЛЕДОВАНИЕ КЛЕТОЧНОЙ ЛОКАЛИЗАЦИИ ЦИТОКИНИН-СВЯЗЫВАЮЩЕГО БЕЛКА 70кД МЕТОДАМИ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ //VI съезд физиологов растений 2007, стр. 175-176. Сыктывкар, Россия.

Подписано в печать:

04.10.2011

Заказ № 5989 Тираж - 120 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

2010012795

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Бровко, Федор Александрович, Пущино

Филиал учреждения Российской Академии Наук

института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии Наук

На правах рукописи

05201152525

Бровко Федор Александрович (у /

РЕГУЛЯЦИЯ ТРАНСКРИПЦИИ ЦИТОКИНИН-СВЯЗЫВАЮЩИМ БЕЛКОМ 70Кд КУКУРУЗЫ

03.01.05 - ФИЗИОЛОГИЯ И БИОХИМИЯ РАСТЕНИЙ Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научный консультант д.б.н., профессор О.Н. Кулаева

Пущино —2011

СОДЕРЖАНИЕ

Список используемых сокращений 5

Введение 7

Глава 1 Обзор литературы. 12

1. Гормоны растений и методы исследования передачи гормонального сигнала. 12

1.1. Цитокинины. Активность, биосинтез и метаболизм 13

1.2. Молекулярные механизмы рецепции и передачи цитокининового сигнала в растении. 23

1.3. Передача гормонального сигнала в клетках животных. 24

1.3.1. «Ядерные рецепторы». 24

1.3.2. Мембранные рецепторы эстрогенов 29

1.3.3. Рецепторы стероидных гормонов митохиндриальной локализации. 32

1.4. Клеточная сигнализация у прокариот. 33

1.5. 1 Молекулярные механизмы рецепции цитокининов в растении. 38

1.5.1. Мембранные рецепторы цитокининов. Основные положения. 40

1.5.2. Белки бикомпонентной регуляторной системы, задействованные в передаче цитокининового сигнала. 48

1.5.2.1. Белки - переносчики фосфатной группы в гистидиновой протеинкиназной сигнальной системе — фосфотрансмиттерные белки (АНР). 47

1.5.2.2. Белки регуляторы ответа. 51

1.5.2.3. Характеристика регуляторов ответа А-типа. 52

1.5.2.4. Характеристика регуляторов ответа В-типа. 54

1.5.2.5. Цитокинин-индуцируемые транскрипционные факторы арабидопсис. 61

1.5.2.6. Особенности функционирования двукомпонентной рецепторной сигнальной системы. 63

1.6.1. Внутриклеточные рецепторы цитокининов. 67

1.6.2. Цитокинин-зависимый регулятор транскрипции хлоропластов. 69

Глава 2 Материалы и методы исследования. 72

Глава 3 Результаты и их обсуждение 89

3.1. Выделение и характеристика ЦСБ70. 89

3.1.1. { Метод 1. Выделения ЦСБ70 из этиолированных проростков кукурузы с отделением вторичных метаболитов хроматографией на основе гидрофобных взаимодействий, на ТоуореаН НЛУбО. 94

3.1.2. Метод 2. Разделение белков и "фенолов" растительного экстракта фракционированием СА в присутствии небольших концентраций полиэтиленгликоля (ПЭГ). 97

3.1.3. Первая схема выделения ЦСБ 101

3.1.4. Применение аффинной хроматографии на иммобилизованном лиганде для выделения ЦСБ70. 102

1.3.5. Вторая группа методов выделения ЦСБ70 105

3.1.6. Третья схема выделения ЦСБ. 107

3.2. Определение цитокинин-связывающей активности белка 108

3.3. 1 Функциональная характеристика ЦСБ. Особенности взаимодействия с 1 гормонами растений. 110

3.4. Регуляция ЦСБ70 транскрипции. Анализ реакции и ее зависимость от ЦСБ 70 и зеатина. 111

3.5. Иммунохимические исследования ЦСБ70. 115

3.5.1. Получение моноклональных антител к ЦСБ70. 115

3.5.2. Эпитопный анализ ЦСБ70 117

3.5.3. Влияние гормона на взаимодействие ЦСБ70 с антителами. 118

3.5.4. Разработка тест-системы для анализа ЦСБ70 на основе сандвич-варианта ИФА в сочетании с стрептавидин-биотиновой системой. 120

3.5.5. Регуляция ЦСБ70 транскрипции. Анализ влияния антител кЦСБ70 на активацию элонгации транскрипции белком. 123 ......124"

3.5.6. Иммунохимический анализ ЦСБ70 подобных белков в злаках

3.5.7. ? Исследование локализации ЦСБ70 в меристеме и зоне растяжения корня. 126

3.5.8. Локализация ЦСБ70 в этиолированном проростке кукурузы 128

35.9 Изучение содержания ЦСБ70 в различных органах проростка в процессе его роста. 132

3.5.10. Анализ содержания цитокининов в кончике корня проростка кукурузы 134

3.5.11 Анализ содержания ЦСБ70 в тканях растения кукурузы иммуноблотингом. 135

3.6. Иммуноцитохимические исследования ЦСБ70 136

3.6.1. Подбор условий для иммунохимического исследования ЦСБ70. Анализ применимости антител для изучения локализации ЦСБ70 в клетках растения кукурузы. 137

3.6.2. Анализ специфичности и способности антител узнавать ЦСБ70 на срезах. 142

3.7. Изучение внутриклеточной локализации ЦСБ70 в этиолированных проростках кукурузы иммуноцитохимическими методами. 144

3.7.1. Анализ локализации ЦСБ70 в клетках с помощью антител первой группы. 144

3.7.2. Исследование локализации ЦСБ70 в клетках меристемы кончика корня и листа методами электронной микроскопии с помощью антител к ЦСБ70 первой группы и коньюгата стрептавидин-золото. 147

3.8. Изучение локализации ЦСБ70 в пластидах проростков кукурузы иммуноцитохимическими методами с использованием МА второй группы. 150

3.8.1. Изучение локализации ЦСБ70 в амилопластах. 151

3.8.2. Анализ локализации ЦСБ70 в этиопластах и хлоропластах с помощью антител второй группы. Исследование методами световой микроскопии 152

3.8.3. Исследование локализации ЦСБ70 в этиопластах и хлоропластах с помощью антител второй группы методами электронной микроскопии. 154

3.8.4. Изучение локализации ЦСБ70 в хлоропластах зеленых листьев кукурузы. 156

3.9. ЦСБ70 как регулятор элонгации транскрипции в пластидах. 157

3.9.1. Активация с помощью ЦСБ70 этиопластов элонгации транскрипции в лизатах хлоропластов и этиопластов 158

4. Заключение. 162

5 Выводы: 168

6 Благодарности 170

7 Список цитированной литературы 170

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АБК - абсцизовая кислота Ado-T Аденозин Toyopearl АДФ - аденозиндифосфат АМФ - аденозинмонофосфат

АНР — Arabidopsis histidine-containing phosphotransfer factor, белки переносчики фосфата с

гистидиновых протеинкиназ

АТФ - аденозинтрифосфат

БАП - 6-бензиламинопурин

БСА - бычий сывороточный альбумин

ГА - глутаровый альдегид

ГК - гиббереллины

ГПК - гистидиновая протеинкиназа

ДСН - додецил сульфат натрия

ЗСБхл - хлоропластный цитокинин-связывающий белок

ИФА - иммуноферментный анализ

МА, МАТ - моноклональные антитела; MEV - мевалонат

МЕР — метилэритритол-фосфат

Ova - овальбумин

ПААГ - полиакриламидный гель

11111' - полипропиленгликоль

ПФА - параформальдегид

ПЭГ - полиэтиленгликоль

CA - сульфат аммония

ТБС — Трис-буфер с солью

ФМСФ - фенилметансульфонилфторид ФБС - фосфатный буфер с солью ТХУ - трихлоруксусная кислота ЦК - цитокинины

ЦСБ - цитокинин-связывающие белки

ЦСБ67 - цитокинин-связывающий белок с молекулярной массой 67 кД из первых зеленых листье ячменя

ЦСБ70 - цитокинин-связывающий белок с молекулярной массой 70 кД из этиолированных

проростков кукурузы ЭДТА — этилендиаминтетраацетат АНК—Arabidopsis histidine kinase

ARR -Arabidopsis response regulator, регуляторы ответа Арабидопсис

AtlPT - аденилат-изопентенилтрансфераза

CKI - белок, продукт гена CKI {cytokinin insensitive)

CRE — cytokinin response 1 ген

CRF - цитокинин-зависимые транскрипционные факторы Арабидопсис IPT - изопентенилтрансфераза TRG1— transcriptional regulator gene 1 ZrT - зеатин-рибозид Toyopearl

Введение

Цитокинины, открытые как факторы, регулирующие деление клеток растений [Miller et al 1955], обладают широким спектром активностей, они не только активируют деление клеток, но и регулируют дифференцировку побегов, активируют биогенез хлоропластов, задерживают старение, участвуют в регуляции транспорта веществ по растению и в регуляции азотного метаболизма [Кулаева 1982; Мок and Мок 2001; Nashimura et al 2004; Argueso et al., 2009]. Значительный прогресс в исследовании механизма действия цитокининов достигнут благодаря открытию мембранных рецепторов, являющихся гистидиновыми протеинкиназами [Inoue et al; Ueguchi et al 2001]. Функционирование этой сигнальной системы, обеспечивает передачу гормонального сигнала с рецепторной гистидиновой протеинкиназы в ядро, что, приводит к включению генов первичного ответа на цитокинины ARR (Arabidopsis Response Regulator) А типа. Система включает переносчики фосфатной группы - АНР (Arabidopsis histidine рhosphotransfer proteins) от плазматического мембранного рецептора в ядро на цитокинин-зависимые трансфакторы ARR-B типа, которые взаимодействуют непосредственно с промоторами генов первичного ответа на цитокинин и обеспечивают их включение [Кулаева и Кузнецов 2002; То and Keiber 2008]. Белки ARR-A типа являются негативными регуляторами ответа растения на цитокинины. Рассмотренный каскад в восприятии и передаче цитокининового сигнала играет важную роль в реализации многих проявлений регуляторного действия цитокинина в растении [Fereira and Kieber 2005; Sakakibara 2006; To and Keiber 2008; Романов 2009]. Вместе с тем в указанную гипотетическую систему передачи цитокининового сигнала в клетке от мембранных гистидиновых протеинкиназ в ядро могут быть внесены существенные изменения. Так получены данные демонстрирующие, что белки - переносчики фосфата - АНР с мембранного рецептора в ядро не чувствительны к изменению концентрации цитокининов, и их роль в передаче цитокининового сигнала не ясна [Punwani et al 2010]. Более того, исследования тройных мутантов, у которых инактивированы все три рецепторные гистидинкиназы, ответственные за восприятие цитокининового сигнала, показало, что

передача цитокининового сигнала может быть еще более сложной, что позволило предполагать наличие и других механизмов участвующих в реализации цитокининового сигнала [Higuchi et al 2004; Nishimura et al 2004].

Рецепторные киназы ориентированы на взаимодействие с внеклеточными цитокининами. Вместе с тем, цитокинины способны проникать в клетку, используя пуриновые [Burkle et al 2003] и нуклеозидные транспортеры [Hirose et al 2005]. Кроме того, цитокинины обнаружены и в ряде компартментов клетки, включая ядро, цитоплазму и хлоропласты [Hare and Van Staden, 1997; Benkova et aL, 1999; Dewitte et al., 1999], что указывало на вероятность присутствия систем восприятия и реализации цитокининового сигнала в этих компартментах. Действительно, предположение подтверждается тем, что в растениях обнаружены альтернативные пути рецепции и реализации сигнала для других фитогормонов: ауксинов [Simon and Petrâsek 2011]; абсцизовой кислоты [Hauser et al. 2011; Wang and Albert 2011; Guo et al. 2011] гиббериллинов [Klingler et al. 2010; Lumba et al. 2010; Ueguchi-Tanaka and Matsuoka 2010]. Можно предположить, что существуют не только мембранные рецепторы, а и другие системы восприятия цитокининового сигнала, которые, кооперируясь, реализуют ответ на цитокининовый сигнал. Представляется вероятной гипотеза о существовании наряду с мембранными рецепторами внутриклеточных цитокинин-связывающих белков — участников цитокинин-зависимой регуляции транскрипционного процесса. Один из таких белков цитокинин-связываюший белок с молекулярной массой 67 кД (ЦСБ67) был обнаружен в зеленых листьях ячменя [Kulaeva et al. 1995] и стареющих листьях растения Arabidopsis [Selivankina et al. 2004]. Комплекс этих белков с транс-зеатином активировал элонгацию транскрипции в системе, содержащей хроматин и РНК полимеразу I. Есть четкая корреляция между взаимодействием ЦСБ67 с цитокининами и его участием в регуляции элонгации транскрипции, что позволило предположить возможность участия этих белков в восприятии цитокининов и трансдукции цитокининового сигнала.

На основании изложенного выше мы заключили, что поиск и изучение путей передачи цитокининового сигнала, альтернативных мембранной сигнальной системе, является весьма важной и актуальной проблемой.

Цель и задачи исследования:

Целью исследования явилось обнаружение в растениях кукурузы внутриклеточных белковых сигнальных систем, способных участвовать в восприятии цитокининового сигнала и его реализации в цитокининзависимой регуляции транскрипции. Основные задачи исследования были следующие:

1. Из этиолированных проростков кукурузы выделить цитокинин-связывающий белок 70 кД (ЦСБ70) и изучить специфичность его взаимодействия с цитокининами и их аналогами.

2. С помощью иммунохимических и иммуноцитохимических методов изучить топографию ЦСБ70 в органах, тканях и типах клеток проростков кукурузы для выявления особенностей локализации ЦСБ70 в растении.

4. Разработать модельные системы для изучения функциональной активности цитокинин -белковых комплексов и изучить с их помощью участие цитокининов и ЦСБ70 в регуляции транскрипции.

5. Изучить присутствие белков, иммунохимически и функционально родственных ЦСБ70 у других представителей злаков: в ячмене, овсе ржи и пшенице, чтобы выяснить, является ли ЦСБ70 кукурузы представителем семейства родственных цитокинин-связывающих белков злаков.

6. Для решения поставленных задач разработать: высокоэффективные методы выделения цитокининсвязывающих белков; высокоспецифичные и высокочувствительные иммунохимические и иммуноцитохимические методы анализа локализации ЦСБ70; методы оценки функциональной активности цитокинин - белковых комплексов.

Научная новизна.

Обнаружено, что в этиолированных проростках кукурузы, для которых характерны активные процессы деления и дифференцировки клеток, присутствует цитокинин-связывающий белок 70 кД (ЦСБ70). Разработаны три оригинальные схемы выделения ЦСБ70, позволившие получить функционально активный белок. Разработан высокочувствительный и специфичный иммунохимический метод определения ЦСБ70, на основе представительной панели моноклональных антител к ЦСБ70. Впервые изучена локализация ЦСБ70 в органах и тканях растения, показано его преимущественное содержание в меристематических зонах корня и стебля этиолированного проростка кукурузы. Впервые получены данные о динамике содержания ЦСБ70 при развитии этиолированного растения кукурузы. Разработаны условия иммуноцитохимического определения ЦСБ70 с помощью световой и электронной микроскопии. Впервые с помощью иммуноцитохимических методов определена внутриклеточная локализация и показано присутствие ЦСБ70 в ядре, ядрышке, цитоплазме, пластидах: этиопластах, амилопластах и хлоропластах. Показана связь между содержанием ЦСБ70 в пластидах и процессами их дифференцировки и, в особенности, образования их внутренних мембран. Показана и охарактеризована способность ЦСБ70 регулировать цитокинин-зависимо элонгацию транскрипции как в ядерной системе, содержащей хроматин и РНК полимеразу I так и в пластидной. Установлено, что локализация- ЦСБ70 в клетках соответствует проявлению его функциональной активности в цитокинин-зависимой регуляции транскрипции. Белки, родственные ЦСБ70 кукурузы, по функциональной активности и иммунохимически, обнаружены в ячмене, ржи пшенице и овсе, что указывает на принадлежность ЦСБ70 к общему для злаков семейству цитокинин-связывающих белков, обеспечивающих цитокинин-зависимую регуляцию транскрипции. Разработанные методы анализа ЦСБ70 и его локализации в клетках растения могут быть использованы при исследовании других белков растений. Все полученные результаты носят приоритетный характер.

Научная и практическая значимость исследования.

Проведенные исследования имеют прежде всего фундаментальный характер, так как позволяют более полно представить картину функционирования цитокининов в растительной клетке. Разработанные методы фракционирования белков растений, методы отделения белков от вторичных метаболитов растений могут найти применение в биотехнологии растений при получении препаратов высокоочищенных белков из растений продуцентов. Разработанные методы иммунохимического и иммуноцитохимического анализа белков растений могут найти применение в научных исследованиях при изучении локализации или динамики содержания белков, как впрочем и любых других антигенов в процессе роста и развития растений.

Материалы, изложенные в диссертации, могут быть использованы в учебной работе, при обучении студентов и аспирантов, а также в исследованиях научных сотрудников, специализирующихся в области физиологии, биохимии растений и молекулярной биотехнологии.

Глава 1. Обзор литературы.

1. Гормоны растений и методы исследования передачи гормонального сигнала.

У растений описаны шесть основных классов гормонов [Кулаева 1973, Кулаева 1982, Kende and Zeevaart 1997; Taiz and Zeiger 2002]: этилен, ауксины, цитокинины, гибберелины, абсцизовая кислота и брассиностероиды. Некоторые авторы [Santner et. al. 2009] относят к гормонам растений и такие соединения как жасмоновая кислота, салициловая кислота и стриголактоны.

Изучение молекулярных механизмов передачи гормонального сигнала в растении имеет большое значение как для фундаментальной науки, так и для практической сельскохозяйственной биотехнологии, ведь, используя методы молекулярного картирования, можно отбирать или создавать сорта, оптимизированные по скорости роста, засухоустойчивости, короткому репродуктивному циклу и, в конечном итоге, по высокой урожайности для данной климатической зоны. Поэтому актуально и важно знать и изучать молекулярные механизмы регуляции биосинтеза и инактивации или метаболизации гормонов, механизмы рецепции гормонов и перевода гормонального сигнала на язык биохимических реакций. Различные биохимические сигналы, суммируясь, определяют ответ клетки и, в конечном итоге, целого растения на действие гормонов. Из названных ранее классов гормонов растений сложно выделить самый главный, они, безусловно, все необходимы для нормального роста растения; но особое место, критическу�

Информация о работе

Бровко, Федор Александрович
доктора биологических наук
Пущино, 2011
ВАК 03.01.05

Диссертация

Регуляция транскрипции цитокинин-связывающим белком 70 кД кукурузы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы