Выделение и характеристика цитокинин-связывающих и АБК-связывающих белков Synechocystis sp. PCC 6803

Шевченко, Галина Васильевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Выделение и характеристика цитокинин-связывающих и АБК-связывающих белков Synechocystis sp. PCC 6803
ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Выделение и характеристика цитокинин-связывающих и АБК-связывающих белков Synechocystis sp. PCC 6803"

Шевченко Галина Васильевна

Выделение и характеристика цитокинин-связывающих и АБК-связывающих белков Synechocystis sp.PCC 6803

03.01.05 - физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 /, ДПР 2011

Москва -2011

4843883

Работа выполнена в Лаборатории экспрессии генома растений Учреждения Российской академии наук Института физиологии растений им. К.Л. Тимирязева РАН, Москва

Научный руководитель:

Кандидат биологических наук Каравайко Наталья Николаевна

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Озерецковская Ольга Леонидовна

Доктор биологических наук Клячко Нелла Леопольдовна

Ведущее учреждение:

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет.

Защита состоится «19» апреля 2011 г. в 11:00 часов на заседании диссертационного совета Д 002.210.01 при Учреждении Российской академии наук Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН по адресу: 127276, Москва, Ботаническая ул., 35.

Факс:(499)977-80-18; электронная почта: m-a2ark0vich@ippras.ra; ifr@ippras.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии паук Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН.

Автореферат разослан «18» марта 2011 года.

Ученый секретарь совета но защите докторских и кандидатских диссертаций, кандидат биологических наук

М.И. Азаркович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Хлоропласта являются одной из главных мишеней действия фитогормонов в клетке растения. Хорошо изучена активация цитокинином биогенеза хлоропластов, включая их структурную и биохимическую дифференциацию (Хохлова, 1977; Кулаева, 1973; Kusnetsov et al., 1994; Caers, Vendrig, 2006), и ингибирование этих процессов абсцизовой кислотой (АБК) (Кравяж и др., 1977; Хохлова и др., 1978). В хлоропластах присутствует полный спектр физиологически активных цитокининов (Benkova et al., 1999). Кроме того, показана активация цитокинином синтеза РНК в хлоропластах (Микулович и др., 1977; Roussaux et al., 1976; Зубо и др., 2005, 2008), получены данные в пользу посттранскрипционного влияния цитокининов на экспрессию хлоропласгных генов (Kusnetsov et al., 1994). Показано, что цитокинин может активировать транскрипцию ряда хлоропластных генов (Зубо и др., 2005; Ямбуренко и др., 2008; Zubo et al., 2008). Обнаружены хлоропластные цитокинин-связывающие белки, участвующие в гормон-зависимой регуляции транскрипции (Romanko et al., 1986; Kulaeva et al., 2000; Люкевич и др., 2002) и АБК-связывающие белки (Shen et al., 2006).

В литературе господствует представление о том, что хлоропласта произошли в результате эндоцитоза древних фотосинтезирующих цианобактерий в эукариотическую клетку (Margulis, 1970; Douglas, Turner, 1991; Кулаев, 1998). В связи с этим, большой интерес представляет вопрос о том, могли ли в процессе эволюции цианобактерии привнести цитокинины и АБК в клетку и определить их участие в регуляторной системе хлоропластов.

Способность цианобактерий выделять активирующие рост растений вещества была отмечена давно (Metting et al., 1988), позднее была показана цитокининовая активность их лизата на семядолях огурца и сои (Stirk, van Staden, 1997). В цианобактериях идентифицированы эндогенные изопентиниладенин, транс-зеатин, а затем и другие цитокинины (Stirk et al, 1999; Hussain et al., 2010; Hussain, Hasnain, 2011). Кроме того, показано влияние /яранс-зеатина на синтез РНК в транскрипционной системе цианобактерий (Селиванкина и др., 2006).

До настоящего времени не было работ, посвященных поиску цитокинин-связывающих (ЦСБ) и АБК-связывающих (АСБ) белков цианобактерий, которые могли бы быть молекулярными мишенями этих фитогормонов и участвовать в их влиянии на метаболизм клеток, хотя актуальность такой постановки вопроса очевидна с точки зрения анализа возможной роли цианобактерий в эволюции гормональной системы растений.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы являлось обнаружение и изучение цитокинин-связывающих (ЦСБ) и АБК-связывающих (АСБ) белков цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803 для выяснения возможной роли цианобактерий в эволюции гормональной системы растений. В соответствии с поставленной целью задачами работы было:

1) Выделить цитокинин- и АБК-связывающие белки из Synechocystis;

2) Изучить свойства выделенных белков;

3) Изучить возможность участия выделенных белков в регуляции транскрипции in vitro в лизате цианобактерий.

Научная новизна работы. Впервые показано присутствие цитокинин-связывающего белка (ЦСБ 67) в клетках цианобактерий Synechocystis sp. РСС 6803. Охарактеризовано его взаимодействие с природным цитокинином транс-зеатином. Установлена активация в присутствии транс-зеатина и ЦСБ 67 тотальной транскрипции in vitro в лизате цианобактерий.

Впервые установлено присутствие в клетках цианобактерий Synechocystis sp. РСС 6803 АБК-связывающих белков (23, 50, 60 и 67 кДа) и гомолога АБК-связывающего белка растений Cip2.1, который кодируется АБК-регулируемым геном. Установлена активация в присутствии АБК-связывающего белка транскрипции in vitro в лизате цианобактерий.

Полученные результаты указывают на возможность присутствия у цианобактерий молекулярных мишеней действия гормонов растений цитокининов и АБК. Это представляет интерес с точки зрения фундаментальной проблемы -эволюции становления гормональной системы растений. Полученные результаты указывают на возможность привнесения в растительную клетку регуляторных систем цитокинина и АБК с древними цианобактериями - предшественниками хлоропластов.

Полученная информация вносит вклад в фундаментальную проблему физиологии и биохимии растений - происхождение гормональной системы растений в процессе эволюции. Полученные результаты могут быть использованы при подготовке лекционного материала по физиологии, биохимии и эволюции растений.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на конференции «Физиология растений - фундаментальная основа современной фитобиотехнологии» (Ростов-на-Дону, 2006), Международной конференции «Современная физиология растений: от молекул до экосистем» (Сыктывкар, 2007), III Всероссийской конференции-школе «Высокоактивные интермедиаты химических реакций и биологических процессов» (Астрахань-Москва, 2007), Международной конференции «Физико-химические основы структурно-функцональной организации растений» (Екатеринбург, 2008), Международной конференции «Физико-химические механизмы адаптации растений к антропогенному загрязнению в условиях Крайнего Севера» (Апатиты, 2009), XVI Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2009» (Москва, 2009), XVII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2010» (Москва, 2010) и на Всероссийской (с международным участием) конференции молодых ученых, посвященной 90-летию Уральского государственного университета им. A.M. Горького «Биология будущего: традиции и инновации» (Екатеринбург, 2010).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 10 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты и их

обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Работа изложена на [ It страницах машинописного текста, содержит таблиц, 1£> рисунков. Список

литературы содержит tCaQ? наименований, из которых /УО на иностранном языке.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования являлся штамм цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803 («Du Pont», США), полученный из Национального института общей биологии (Оказаки, Япония), и предоставленный нам профессором Д.А. Лосем заведующим лаборатории молекулярных основ внутриклеточной регуляции Учреждения Российской академии наук Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева, РАН.

Цианобактерии культивировали фотоавтотрофно в стерильных условиях на среде BG11, при температуре 34°С, при постоянном освещении 70 мкмоль/м"2с"' M квантов света и барботировании газо-воздушной смесью, содержащей 2 % С02, в течение трех дней.

Выделение цитокинин-связывающнх н АБК-связывающих белков. Для

исследований использовали водорастворимую фракцию лизата Synechocystis. Клетки разрушали механически с помощью стеклянных бус G4649 («Sigma») в среде, содержащей 50 мМ трис-HCl (рН 8.0), 10 мМ MgCl2, 10 мМ КС1 и 4 мМ 2-меркаптоэтанола, затем центрифугировали при 160000 g в течение 2 часов при 4°С. Для выделения ЦСБ и АСБ на первом этапе использовали гидрофобную хроматографию на фенил-сефарозе. Фракцию белков в буфере выделения с добавлением NaCl до концентрации 2 M наносили на колонку (размер колонки 2.6x12 см) с фенил-сефарозой CL-4B («GE Healthcare»), уравновешенную буфером 50 мМ трис-HCl (рН 7.7), 10 мМ MgCl2,. 0.5 мМ NaCl. Несвязавшиеся белки удаляли промывкой фенил-сефарозы тем же буфером. Элюцию белков, связавшихся с фенил-сефарозой, проводили последовательно: 1) нисходящим градиентом NaCl в концентрации от 2 до 0 M в 20 мМ трис-HCl (рН 7.7); 2) 20 мМ трис-HCl рН (7.7); 3) Н2Одист. Все элюируемые фракции тестировали на содержание цитокинин- и АБК-связывающих белков с помощью антиидиотипических антител (АТа.„) к транс-зеатину и АБК.

Цитокинин-связывающие белки Synechocystis выделяли из очищенной на фенил-сефарозе фракции лизата двумя методами. При выделении методом аффинной хроматографии использовали зеатин-сефарозу, полученную иммобилизацией зеатинрибозида на АН-сефарозе 4В («GE Healthcare») периодатным методом (Moore, 1979) (размер колонки 2.6x6 см). Матрикс предварительно уравновешивали 20 мМ трис-HCl (рН 7.7) с 0.2 M NaCl, после чего наносили фракцию белков. Несвязанные белки отмывали тем же буфером, затем 1 M NaCl в 50 мМ трис-HCl (рН 8.3). Элюцию проводили 0.2 M NaOH, либо транс-зеаттом в концентрации 10'5 M в буфере, содержащем 1 M NaCl в 50 мМ трис-HCl (рН 8.3). При выделении ЦСБ методом иммуноаффинной хроматографии использовали моноклональные AT (мкАТ) к ЦСБ 70 кДа из этиолированных проростков кукурузы, предоставленные к.б.н. Ф.А Бровко

(филиал Института биоорганической химии им. академиков Ю. А. Овчинникова и М. м. Шемякина РАН, Пущино). мкАТцСб7о иммобилизовали на CNBr-активированную сефарозу 4В («GE Healthcare») согласно методическим рекомендациям фирмы «GE Healthcare». Фракцию гидрофобных белков наносили на колонку (размер колонки 1.4x3 см) в буфере, содержащем 50 мМ КС1, 2 мМ ЭДТА, 2 мМ MgCl2, 20 мМ трис-НС1 (рН 8.0). Элюцию проводили 0.2 N NH4OH.

Выделение АБК-связывающих белков проводили методом аффинной хроматографии. Для этого АБК иммобилизовали на АН-сефарозу 4В («GE Healthcare») (Ковалев и др., 1982). АБК-сефарозу (размер колонки 1.4x3.4 см) уравновешивали 20 мМ трис-HCl (рН 7.7) с 0.2 M NaCl, после чего наносили фракцию гидрофобных белков. Несвязанные белки отмывали тем же буфером, затем 1 M NaCl в 50 мМ трис-HCl (рН 7.7). Элюцию проводили 0.2 M NaOH, либо АБК в концентрации в буфере, содержащем 1 îvî NaCl в 50мМ трис-HCl (рН 8.3).

Детектирование цитокинин-связывающих и АБК-связывающих белков методом твердофазного иммуно-ферментного анализа (ИФА). На всех этапах работы присутствие ЦСБ и АСБ определяли с помощью антиидиотипических антител к гормонам: АТа.и к тиранс-зеатину, которые являются AT к зеатин-связывающему сайту белка и АТа.и к АБК, распознающих АБК-связывающие участки белка. АТа-и были получены, как описано у Moor et al. (1985). Детектирование ЦСБ и АСБ проводили в тест-системе твердофазного ИФА. Для этого исследуемую белковую фракцию иммобилизовали при 4°С в лунках полистиролового планшета в течение ночи. Лунки промывали ТФС-буфером (20 мМ фосфатный буфер (рН 7.4), содержащий 150 мМ NaCl и 0.2% Твин 20), после чего в них вносили АТа.„ в ТФС-буфере с добавлением 1% овальбумина и инкубировали в течение 1 ч при

37°С. После

промывки ТФС-буфером и Н20даст в систему в том же буфере, что и АТ„.И вносили ослиные противокрольичьии иммуноглобулины, меченые пероксидазой хрена («Медгамал», Россия). После инкубации в течение 1 ч при 37°С лунки промывали ТФС-буфером и Н2Одист. Активность пероксидазы измеряли, используя в качестве хромогена ортофенилендиамин. Интенсивность хромофорного сигнала измеряли при 490 нм на 8-канальном спектрофотометре вертикального сканирования Titrée Multiscan МСС-340 («Flow Laboratories», Великобритания).

Исследование свойств выделенных ЦСБ и АСБ. Наличие глютатион-связывающих сайтов у гормон-связывающих белков определяли с помощью хроматографии на глютатион-сефарозе. Глютатион иммобилизовали на сефарозу 4В («GE Healthcare») (Аберкромби и др., 1988). Белки на колонку (размер колонки 0.6x3 см) наносили в буфере, содержащем 20 мМ трис-HCl (рН 7.4), 200 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА. Элюция проводилась тем же буфером с добавлением 10 мМ дитиотриетола (ДТТ).

Определение специфичности связывания ЦСБ с цитокининами и АСБ с АБК проводили в конкурентной системе твердофазного ИФА. В лунках полистиролового планшета гормон-связывающие белки иммобилизовали в течение ночи при 4°С, лунки отмывали ТФС-буфером. Затем вносили тестируемые на связывание с белками

гормоны в различных концентрациях (АБК, цис-, транс-зеатин, зеатинрибозид, ИУК, гиббериллин и, кроме того, аденин) вместе с АТа.н к гормону для выяснения способности соединений вытеснять АТа_„ из комплекса с белком и инкубировали ночь при 4°С. После отмывания ТФС-буфером вносили противокроличьи AT, меченные пероксидазой хрена («Медгамал», Россия), и измеряли хромофорный ответ при 490 нм на спектрофотометре Multiscan MS («Labsystem», Великобритания).

Электрофорез белков в денатурирующих условиях в 10% ПААГ проводили в системе Лэммли (Laemmli, 1970). Гели окрашивали Кумасси R-250.

Активность гормон-связывающих белков и гормонов в регуляции транскрипции изучались в системе синтеза РНК in vitro, представляющей собой водорастроримую фракцию лизата клеток Synechocystis sp. РСС 6803, в котором присутствовали ДНК, РНК-полимераза, белковые факторы, необходимые для процесса транскрипции (Селиванкина и др., 2006). Радиоактивность определяли на сциптилляциошюм счетчике RIA GAMMA-1271 («LKB», Швеция).

Изоэлектрическое фокусирование ЦСБ проводили на приборе MicroRotofor (Bio-Rad) с использованием амфолитов диапазона 3-10 pH по протоколу Bio-Rad.

Электроперенос и иммуноблоттинг. Белки для иммуноблоттинга с незафиксированного геля переносили на нитроцеллюлозную мембрану Hybond-C полусухим способом на приборе Multifor II Novablot («LKB», Швеция) Перенос проводили, в 50 мМ Na-боратном буфере (pH 9.0) с 20% метанолом (анод) и 5% метанолом (катод). Окраску белков на мембране проводили смесью 19 мл 0.1% KJ в 0.1 М HCl и 1 мл 1% хлорамина-Т в метаноле. Проявка окраски осуществлялась 0.1%-ным водным раствором крахмала. Иммуноблотинг проводили с различными AT, для идентификации взаимодействия использовались вторичные противокроличьи флуоресцирующие AT (НИИЭМ, Россия). Сканирование мембраны проводили на многофункциональном сканере Typhoon («GE Healthcare», США).

Для идентификации ЦСБ методом MALDI масс-спектрометрии, проводили одномерный или двумерный электрофорез белков в ДЦС-Na-IIAAr. Трипсинолиз белка в геле, получение MALDI масс-спектров проводили в лаборатории протеомики Института физико-химической медицины РАМН, Москва. Идентификация белков осуществлялась с использованием поисковой системы Mascot (www.matrixscience.com) (Perkins et al., 1999) в доступной базе данных NCBInr для Synechocystis sp. РСС 6803.

Все эксперименты проводили не менее, чем в трех повторностях. В работе приводятся типичные данные, полученные методами хроматографии и электрофореза. Для данных ИФА и измерений транскрипционной активности представлены средние арифметические значения и их стандартные ошибки (Лакин, 1973).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Выделение и характеристика ЦСБ Synechocystis. Для выделения ЦСБ использовали фракцию лизата клеток Synechocystis, очищенную от мембран центрифугированием при 160000 g в течение 2 часов. Для очистки ЦСБ использовали подходы, которые применялись при выделении ЦСБ из разных растительных объектов (Каравайко и др., 1995).

Присутствие ЦСБ во фракциях, снимаемых с колонки, определяли с помощью антиидиотипических антител (АТа.„) к зеатину, которые можно рассматривать как AT к гормон-связывающему сайту белков (Marx, 1985).

На первом этапе очистки белки лизата фракционировали методом гидрофобной хроматографии. При гидрофобном фракционировании белков Synechocystis водорастворимую фракцию лизата наносили на фенил-сефарозу в присутствии 2 М NaCl. Фракционирование связанных белков проводили нисходящим градиентом NaCl от 2 до 0 М. Присутствие ЦСБ в полученных фракциях определяли в условиях твердофазного ИФА по взаимодействию белков с АТа.и к зеатину. Контролем служила неиммунная сыворотка.

50 100 150 200 250 300

объем элюции, мл

Рис. 1. Фракционирование водорастворимой белковой фракции лизата ^сиесАосцу/й методом гидрофобной хроматографии. Профиль элюции белков с колонки (сплошная линия, А280); результаты ИФА с АТа_„ к зеатину (заштрихованные столбики, А490).

Как видно на рис. 1, взаимодействие белков с АТа.„ к зеатину наблюдалось только во фракциях, элюированных НгОдщ.. Эти данные хорошо согласуются с представлением о том, что цитокинин-связывающие сайты должны иметь определенную степень гидрофобности, ввиду гидрофобности самой структуры

цитокининов (Fox, 1992). С контрольной неиммунной сывороткой все белковые фракции, выделенные при фракционировании, не взаимодействовали.

Для дальнейшей

2,5 1М NaCI a I TpuoHCI I 0,2 N NaOH 3 рабоТЫ ПО ОЧИСТКв И

идентификации ЦСБ ' из растворимой фракции лизата Synechocystis мы о использовали

I j oí

* I У/7/á < фракцию,

элюируемую с фенил-сефарозы водой, где . присутствовали цитокинин-связывающие белки.

На следующем этапе выделения ЦСБ

ЭФ

ИмБ

шшр

40 60

объем элюции, мл

ЭФ

ИмБ

97 66 45

-на *■ * M

' f N i ■tMIÍ flM| ЯН

М б в б в

Рис. 2. Выделение и очистка ЦСБ ЗупесУюсузйз методом аффинной хроматографии. А: Профиль элюции с зеатин-сефарозы (сплошная линия, А28о); результаты ИФА с АТа.и к зеатину (заштрихованные столбики, Аюо); Б: ЦСБ, элюируемые с зеатин-сефарозы 1 М №С1 (а); В: ЦСБ, элюируемые с зеатин-сефарозы 0.2 М №ОН: пик элюции белка с колонки (б), пик взаимодействия ЦСБ с АТа.и к зеатину (в), М - белковые маркеры. ЭФ - электрофорез в ДЦС-№-ПААГ; ИмБ - иммуноблот с АТа.„ к зеатину.

использовали аффинную хроматографию на зеатин-сефарозе. Очищенный на фенил-сефарозе препарат белков наносился на зеатин-сефарозу, где зеатинрибозид был иммобилизован через рибозу в 9-м положении пуринового кольца и активная часть зеатина оставалась свободной для взаимодействия с белками.

На рис. 2.А приведены профиль

элюции белков с

зеатин-сефарозы и данные проверки каждой фракции на взаимодействие белков с АТа.„ к зеатину. Для элюции белков, связавшихся с зеатин-сефарозой, были использованы 1 М ЫаС1 в 20 мМ трис-НС1 (рН 7.4) и 0.2 М №ОН.

Тестирование полученных фракций с помощью АТа.и показало, что фракции, элюируемые ЫаС1, слабо взаимодействовали с АТа_и к зеатину, а при элюции 0.2 М

ЫаОН было обнаружено активное взаимодействие, причем пик поглощения А28о и пик взаимодействия белков с АТа_и к зеатину не совпадали. Все элюируемые с зеатин-сефарозы фракции не взаимодействовали с неиммунной сывороткой. При дальнейшем анализе фракций ЦСБ при помощи электрофореза в ДЦС-Иа-ПААГ и иммуноблотинга с АТа.„ к зеатину было показано, что в пике элюируемых 1 М №С1 в трис-НС1 (рН 7.4) присутствует ряд ЦСБ, однако взаимодействует с АТа.и к зеатину только полипептид с молекулярной массой 67 кДа (рис. 2.Б).

При элюции белков 0.2 М ЫаОН мы проанализировали полипептидный состав фракций пика выхода белков с колонки (А28о) и последующие за пиком фракции. В пике элюции присутствуют несколько полипеотидов с молекулярными массами ниже 43 кДа (рис. 2.В). В последующих за пиком элюции фракциях, в основном присутствуют три полосы полипептидов в районе 67-60 кДа. С АТа.и к зеатину в обоих случаях взаимодействуют полипептиды с молекулярными массами в районе 67 кДа. В связи с этим, в дальнейшей работе мы старались использовать

Кроме того, специфичность белков, связавшихся с зеатин-сефарозой проверяли путем элюции их гормоном - зеатином в концентрации 10~5 М в 1 М №С1 в трис-НС1 (рН 8.4). В данном случае вытеснение ЦСБ с матрицы происходило конкурентным способом за счет его сродства к гормону. Так как присутствие зеатина в элюирующихся с колонки фракциях ЦСБ не позволяло визуализировать профиль элюции в А28о, отбирали фракции, взаимодействующие с АТа_и к зеатину в системе ИФА.

Дальнейший анализ этих фракций при помощи электрофореза в ДЦС-Ыа-ПААГ показал, что в них присутствуют три полосы полипептидов с молекулярной массой в районе 67-60 кДа (рис. 3). Иммуноблот с АТа.и к зеатину позволил выделить так же лишь одну полосу, с молекулярной массой в районе 67 кДа.

ЭФ

ИмБ

66 е

Рис. 3. Выделение ЦСБ 67 кДа методом аффинной хроматографии. ЭФ -электрофорез в ДДС-№-ПААГ; М-белковые маркеры; ИмБ -иммуноблот с АТа.„ к зеатину.

именно эти фракции ЦСБ.

45; 31

ЭФ ИмБ

¿Я*. ;

■К

Г"

• . . V

Рис. 4. Выделение ЦСБ 67 кДа методом иммуноаффинной хроматографии. ЭФ -электрофорез в ДДС-Ыа-ПААГ; М-белковые маркеры; ИмБ - иммуноблот с АТа_и к зеатину.

4 показано.

Для выделения и очистки ЦСБ мы использовали также другой подход, где на сефарозу были иммобилизован не гормон - зеатин, а моноклональные АТ к ЦСБ 70 кДа (мкАТцсб ?о) из этиолированных проростков кукурузы,

предоставленные коллегами из филиала Института биоорганической химии им. академиков Ю. А. Овчинникова и М. М. Шемякина РАН, Пущино.

Для выделения ЦСБ из водорастворимой гидрофобной фракции лизата ЗупесИосузШ использовали иммобилизованные мкАТ на сефарозе 4В. Элюцию белков проводили 0.2 N N11,011. Фракции, содержащие ЦСБ анализировали при помощи электрофореза в ДДС-Ыа-ПААГ и иммуноблота. При данном методе, ЦСБ на колонке связываются за счет взаимодействия со специфическими иммуноглобулинами,

полученными на структуру ЦСБ 70 кДа, а не за счет связывания с гормоном, как на зеатин-сефарозе. что электрофорез и иммуноблот фракции белков, иммуноаффинной хроматографии на сефарозе с позволили выделить единственный полипептид с

На рис. выделенной с помощью иммобилизованными мкАТцСБ70 массой ~ 67 кДа.

Таким образом, с помощью двух типов АТ, а именно - АТ, полученных к гомологичному ЦСБ 70 кДа из проростков кукурузы и АТа.„ к зеатину, которые взаимодействуют с цитокинин-связывающим сайтом белка, был выявлен один и тот же полипептид с массой около 67 кДа. Кроме того, этот полипептид связывается с зеатином, иммобилизованным на сефарозе.

4 5 6 номера фракций

эф

ббкДа"

имб

Для выделения и очистки ЦСБ мы использовали так же изоэлектрическое фокусирование (диапазон амфолитов 3-10 рН) в нативных условиях с помощью прибора МюгоЯо1ой)г (ВюЕЫ, США). Для разделения мы использовали сконцентрированную фракцию белков, связывавшуюся с фенил-сефарозой и элюированную водой и получили 10 белковых фракций. Для каждой из 10 полученных фракций, мы определяли рН, связывание с АТа-„ к зеатину, проводили электрофорез и иммуноблот.

На рис. 5.А представлены результаты разделения фракций белка в системе Яо1оРэг. Как видно на рисунке, фракционирование растворимой и

очищенной на фенил-сефарозе белковой фракции позволило сконцентрировать ЦСБ в одной фракции № 8 с рН 7.5, то есть сконцентрировать в 10 раз и очистить от белков, имеющих другие значения р1.

Электрофорез в ПААГ в денатуририрующих условиях позволил выявить 2 полипептида с молекулярной массой ~ 67 кДа во фракции № 8, большое количество фикоцианина во всех фракциях и, в особенности, во фракции № 5 и нескольких полипептидов с массами значительно меньшими, чем 67 кДа в других фракциях.

2 3

6 7

Рис. 5. Изоэлектрическое фракционирование растворимой белковой фракции лизата Зу^ес/госу-г/и в растворе в нативных условиях. А: взаимодействие фракций с АТа.„ к зеатину (столбики); рН (сплошная линия); Б: ЭФ - электрофорез в ДДС-Ыа-ПААГ; ИмБ - иммуноблот с АТа.и к зеатину на нитроцеллюлозе; 2-9 - белковые фракции. 1 и 10 фракции с крайними значениями рН, не взаимодействующие с АТа.и к зеатину при проведении твердофазного ИФА, не учитывались.

А490, % от контроля

Иммуноблотинг с помощью АТа_„ к зеатину выявил только один пептид массой - 67 кДа в 8-й фракции (рис. 5.Б). Таким образом, с помощью системы Яо1:ой>г нами в нативных условиях был с помощью АТа.„ к зеатину идентифицирован ЦСБ 67 кДа, который соответствовал белку, полученному с помощью аффинной хроматографии на зеатин-сефарозе и иммуноаффинного матрикса с мкАТцсб7о-

Исследование свойств выделенного ЦСБ. Для исследования

специфичности взаимодействия полипептида 67 кДа с зеатином, мы использовали конкурентную систему твердофазного ИФА, в которой ЦСБ 67 сенсибилизировали в лунках полистиролового планшета, а различные концентрации гормонов (от 10"5 до 10~9 М) вводили в тест-систему одновременно с очищенными моноспецифическими АТа.и, что приводило к конкуренции АТа.„ с гормоном за образование комплекса с белком.

Как видно на

рис. 6,

индолилуксусная кислота (ИУК), гиббериллин и абсцизовая кислота и не обладающий цитокининовой активностью аденин, не связывались с сайтом связывания зеатина ЦСБ и в силу этого не снижали взаимодействия ЦСБ с АТа.„ к зеатину. Цис-зеатин, который обладает особым положением среди

цитокининов и физиологическая роль которого изучена недостаточно, в системе вытеснения показал наименьшее сродство к ЦСБ 67. Зеатинрибозид более активно взаимодействовал с ЦСБ, а физиологически активный трапе-зеатин активнее всех вытеснял АТа.„ из комплекса с белком, причем 50% от максимального вытеснения происходило при концентрации транс-зеатина 10"7 М. Эти данные хорошо согласуются с данными, полученными для ЦСБ 67 кДа из листьев ячменя (Земляченко и др., 1997) и данными для ЦСБ 65 кДа хлоропластов листьев ячменя (Люкевич и др., 2002).

□ аденин

шиук

яабк

□гиббериллин Ш цис-зеатин ■зеатинрибозид И транс-зеатин

10'" 10'" 10"' 10"° 10"3 концентрация лиганда, М Рис.б. Действие различных фитогормонов на связывание ЦСБ ЛуиесАос^й^ с моноспецифическими АТа.„ к зеатину в системе твердофазного ИФА.

Таким образом, выделенный из Synechocystis ЦСБ 67 проявляет способность специфически связываться с цитокининами и не связывается с другими гормонами (АБК, ИУК, гиббериллин) и неактивным предшественником цитокининов -аденином. Сродство ЦСБ 67 Synechocystis к различным формам цитокининов соответствуют физиологической активности этих форм в растениях.

Для характеристики выделенных нами ЦСБ Synechocystis мы исследовали их способность участвовать в регуляции транскрипции in vitro. Для этого в качестве транскрипционной системы использовали лизат Synechocystis и лизат хлоропластов из листьев ячменя. Все исследования транскрипционной активности проводились сотрудником лаборатории экспрессии генома растений Учреждения Российской академии наук Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН к.б.н. С.Ю. Селиванкиной по методу, описанному ранее (Селиванкина и др., 1997,2006).

Таб. 1. Действие транс -зеатина, ЦСБ, выделенных из растворимой фракции Synechocystis, по-отдельности, а также совместно на активность транскрипции in vitro Synechocystis. И действие ЦСБ Synechocystis в транскрипционной системе хлоропластов ячменя._

Транскрипционная система Вариант опыта Включение JH-АМФ в РНК имп./мин 10 мкг ДНК Активация транскрипции, проценты от контроля

лизат Synechocystis Контроль 22514±1090 100

лизат Synechocystis аденин 10"? М 22731±1101 102

лизат Synechocystis транс -зеатин 10*7 М 63612±3140 283

лизат Synechocystis ЦСБ, 10 мкг 45361±2530 202

лизат Synechocystis ЦСБ, 10 мкг + транс-зеатин 10"? М 83999±4106 373

лизат хлоропластов ячменя ЦСБ, 10 ми- 51214±2810 215

Как видно из таб. 1, один транс-зеатин в подобранной в предварительных опытах концентрации значительно увеличивал активность транскрипции в транскрипционной системе Зупескосу^, в то время как аденин не влиял на активность реакции, что позволяет предположить, что в ней присутствовала мишень для действия транс-зеатша. Один препарат ЦСБ в то же время активировал транскрипцию в два раза, следовательно, в транскрипционной системе ¿уиес/госу.?//.? присутствовали все необходимые для его действия компоненты. Добавление в транскрипционную среду 5Уяесйосу.г<« ЦСБ совместно с /иранс-зеатином вызывало наибольшее повышение транскрипции. Кроме того, ЦСБ 5упесЬосу5Чз активировал транскрипцию в лизате хлоропластов листьев ячменя. Это говорит о том, что ЦСБ

Synechocystis может участвовать в гормон-зависимой регуляции транскрипции цианобактерий и хлоропластов.

Показано, что регуляция транскрипции может осуществляться с помощью факторов транскрипции, связывание которых с ДНК зависит от тиол-восстанавливающих агентов (Trou et al., 2002). В связи с этим для дальнейшей характеристики ЦСБ 67 Synechocystis мы попытались выявить наличие у белка глютатион-связывающих сайтов. При хроматографии на глютатион-сефарозе очищенной на фенил-сефарозе белковой фракции Synechocystis 10 мМ ДТТ был выделен полипептид, который связывался с очищенными моноспецифическими АТа.„ к зеатину и имел молекулярную массу 67 кДа. Таким образом, ЦСБ 67 Synechocystis имеет еще и сайт связывания с глютатионом, что может быть важным для проявления его функциональной активности в клетке.

Идентификация белков в препаратах ЦСБ. После очистки и концентрации ЦСБ методами, описанными выше, проводили одномерный электрофорез белков в ПААГ в денатурирующих условиях. Полипептиды, связывающиеся с АТа_„ к зеатину, передавались для MALDI-TOF масс-спектрометрии в лабораторию протеомики ИФХМ РАМН (Москва). Кроме того, альтернативно белковые фракции передавали в лабораторию протеомики ИФХМ РАМН, где они подвергались дополнительной очистке (Rotofor) и двумерному электрофорезу на стрипах BioRad (pH 3-10) по методике производителя. В этом случае так же белки исследовались методом MALDI-TOF масс-спектрометрии. Полученные спектры анализировались с помощью доступной поисковой системы Mascot (www.matrixscience.com) (Perkins et al., 1999) в базе данных NCBInr для Synechocystis sp. РСС 6803.

Как показал анализ результатов, в исследуемом материале с высокой степенью покрытия был определен белок шаперонин 60 кДа (Hsp60, GroEL) Synechocystis.

Для подтверждения данных масс-спектрометрии, мы использовали поликлональные AT к GroEL Escherichia coli, предоставленные нам профессором Д.А. Лосем (лаборатория молекулярных основ внутриклеточной регуляции Учреждения Российской академии наук Института физиологии растений им К. А. Тимирязева РАН).

Препарат ЦСБ, выделенный из клеток Synechocystis с помощью аффинной хроматографии на зеатин-сефарозе, исследовали на способность связывания с AT к GroEL в системе твердофазного ИФА и с помощью иммуноблотинга после ЭФ в ПААГ в денатурирующих условиях.

Как видно на рис. 7.А, AT к GroEL в системе твердофазного ИФА выявляли присутствие в препарате ЦСБ Synechocystis шаперонина 60.

Как видно на рис. 7.Б., в препарате ЦСБ Synechocystis элюированном как транс-зеатитм, так и щелочью, обнаруживался полипептид,

взаимодейстсующий с AT к GroEL с молекулярной массой ~ 67 кДа.

Полученные данные говорят о том, что в препарате ЦСБ 67 кДа Synechocystis, который связывается с зеатином и с АТа_и к

Рис. 7. Взаимодействие препарата ЦСБ Synechocystis с зеатннУ' присутствуют AT к GroEL Е. coli. А: В системе твердофазного ИФА белки-шаперонины с (А490). Б: Методом иммуноблота. ЭФ - электрофорез в высокой гомологией к ДДС-Ыа-ПААГ; М-белковые маркеры; ИмБ - GroEL, позволяющей иммуноблот с AT к GroEL. 1- ЦСБ, элюированные детектировать их с зеатином 10"5М; 2- ЦСБ, элюированные щелочью. помощью AT к GroEL.

Для понимания

полученных результатов необходимо было выяснить способен ли сам GroEL взаимодействовать с цитокининами и АТа_и к зеатину, то есть имеет ли он сайт связывания с гормоном.

Для проверки этого, мы исследовали очищенный белок GroEL, из Escherichia coli, который был предоставлен нам коллегами из Института биоорганической химии им. академиков Ю. А. Овчинникова и М. М. Шемякина РАН, Пущино. Для этого препарат GroEL Е. coli, разделяли с помощью ЭФ в ПААГ в денатурирующих условиях и проводили иммуноблотинг с полиспецифической сывороткой, содержащей АТа_и к зеатину, с очищенными моноспецифическими АТа.и к зеатину, с AT к зеатину и с неиммунной сывороткой. Ни одни из исследуемых AT не взаимодействовали с полосой GroEL. Это указывает на то, что GroEL не имеет ни сайта связывания цитокинина, ни эпитопов взаимодействия с исследуемыми AT.

Добавление GroEL в конкурентную систему определения зеатина показало отсутствие его взаимодействия с зеатином, сенсибилизированном на планшете.

Таким образом, ЦСБ 67 методом MALDI-TOF масс-спектрометрии достоверно определен не был, по-видимому, вследствие его малого количества в пробах. Однако, при всех использованных методах выделения и очистки ЦСБ 67 в полученных препаратах присутствовал шаперонин 60, который не обладает цитокинин-связывающими свойствами. Показано, что функции шаперонинов в клетке

äJ

М 1 2 12

разнообразны, от фолдинга белков (Hemmingsen, 1988; Cheng, 1989; Bochkareva et at., 1992; Bochkareva, Girshovich, 1992;) до участия в регуляции гормон-рецепторного взаимодействия (Scherrer et al., 1992). Возможное влияние шаперонина 60 на функции ЦСБ 67 должно быть исследовано в дальнейшем.

Выделение и определение биохимических и функциональных характеристик АСБ Synechocystis. Для выделения АСБ использовали водорастворимую фракцию лизата Synechocystis. Проведение гидрофобной хроматографии на фенил-сефарозе и анализ фракций с АТа.и к АБК проводились

ЭФ ИмБ

0,4

0.3

0,2

1,6

1,2

0,8

10 20 30 40 50 60 А объем элюции, мл Б

Рис. 8. Выделение и очистка АСБ Synechocystis методом аффинной хроматографии на АБК-сефарозе. А: Элюция АСБ с АБК-сефарозы 0.2 N NaOH и ИФА белковых фракций: 1-профиль элюции (А28о); 2-взаимодействие с AT к CIP2.1; 3-взаимодействие с АТа.и к АБК. Б: ЭФ - электрофорез в ДДС-Ыа-ПААГ. М-белковые маркеры; фракция АСБ, элюированная 0.2 М NaOH (1); ИмБ - иммуноблот с АТа.и к АБК(2) и AT к Cip 2.1 (3).

аналогично описанным для ЦСБ. Было показано наличие АБК-связывающих белков в гидрофобной фракции, элюируемой водой. Эта фракция использовалась в дальнейшей работе. Белки этой фракции наносили на колонку с сефарозой с иммобилизованной АБК. Несвязавшиеся белки отмывали буфером. АСБ с колонки элюировались 0.2 N №ОН (рис. 8) и АБК (10 "5М) (рис. 9), аналогично методикам, применяемым для выделения ЦСБ. При проведении элюции 0.2 N №ОН, элюцию белков с колонки контролировали с помощью проточного спектрофотометра А2т (рис. 8.А, линия 1). Присутствие АСБ в пробах определяли с помощью АТа.„ к АБК (рис. 8.А, линия 2). В качестве контроля использовали неиммунную сыворотку. Далее фракции АСБ исследовали с помощью ЭФ и иммуноблотинга.

Кроме того, для анализа полученных фракций АСБ нами были использованы поликлональные АТ к Ы-концевому фрагменту АБК-связывающего белка Слр2.1 Ьиртю ¡Ыеш (люпина желтого) (Демиденко, 2010). С1р2.1 является продуктом гена, экспрессия которого в значительной степени положительно регулируется абсцизовой кислотой и незначительно подавляется цитокинином.

На рис. 8.А (линия 3) показано взаимодействие белковых фракций с АТ к Сф2.1. В качестве контроля использовали неиммунную сыворотку, взаимодействие которой с белками не проявлялось, что говорит о специфическом взаимодействии использованных нами иммунных сывороток с белками препарата.

ЭФ

ИмБ

1.4

м 1

взаимодействовали с полипептидами, имеющими молекулярные массы 23, 50, 60 и 67 кДа, что указывает на АБК-связывающие свойства этих полипептидов.

Среди белков, элюированных с АБК-сефарозны, идентифицируются два полипептида, связывающиеся с поликлональными АТ к С1Р2.1. Это говорит о том, что в БупескосузИя присутствуют полипептиды, имеющие сходные иммунодетерминанты с С1Р 2.1, кроме того, молекулярная масса белка 73 кДа соответствует молекулярной массе полноразмерного С1Р 2.1 белка Ьиртия Ыеш, а 23 кДа соответствует массе фрагмента С1Р 2.1, на который были получены АТ. Можно предположить, что присутствующий в ЗупесИосузИя гомолог белка С1Р 2.1 частично разрушился в процессе проведения электрофореза, но пептид 23 кДа не утратил способности связываться с АТ к С1Р 2.1.

На рис. 9 представлены электрофореграмма и иммуноблоты АСБ, связавшихся с АБК-сефарозой и элюированных с матрикса АБК (10 "5М). Как видно, с помощью АТа.и к АБК и АТ к С1Р 2.1 были выявлены полипептиды с такими же молекулярными массами, что и при элюции щелочью.

Для определения специфичности связывания АСБ 8упесЬосузИз с АБК провели тест на вытеснение гормоном АТа.„ из комплекса с АСБ в твердофазном ИФА. Для этого в лунки полистироловых планшетов были иммобилизованы АСБ, выделенные с помощью аффинной хроматографии на АБК-сефарозе. Далее в лунки добавляли АТа.и к АБК совместно с гормонами в различной концентрации. Гормон, связываясь с иммобилизованным АСБ, вытесняет из комплекса с ними АТа-„ к АБК. Как видно на рис. 10, АСБ ЗупесИосуяНя специфично связывались с АТа.и к АБК, присутствие в системе транс-зеатина и ИУК не влияло на интенсивность этого взаимодействия. АБК вытесняла АТа.и к АБК из комплекса с АСБ, а увеличение концентрации гормона уменьшало взаимодействие АТа.„ к АБК с АСБ, пропорционально ее концентрации.

Рис. 9. Выделение АСБ методом аффинной хроматографии. АСБ, элюированные АБК (1); ЭФ - электрофорез в ДЦС-Ыа-ПААГ; М-белковые маркеры; ИмБ -иммуноблот с АТа.и к АБК (2) и АТ к Ир 2.1 (3).

100

□ транс-зеатин ■ иук

□ абк

/V», % от контроля Функциональная

120^1--активность АСБ была

исследована по методу, применяемому ранее для характеристики транскрипционной активности ЦСБ ЗупесЪосуяНх. При проведении опыта использовали в качестве

транскрипционной системы лизат цианобактерий. Непосредственное добавление абсцизовой кислоты в

концентрации 1СГ6 М, подобранной в предварительных опытах, в реакционную среду существенно активировало тотальную транскрипцию. АСБ, выделенные с помощью АБК-сефарозы, также повышали активность синтеза РНК (таб. 2). При совместном действии АСБ и абсцизовой кислоты эффект был несколько большим, чем в присутствии только АСБ.

10° Ю'7 10' концентрация лиганда,М

Рис. 10. Действие различных фитогормонов на связывание АСБ БупесИосузИв с моноспецифическими АТа_и к АБК в системе твердофазного ИФА.

Таб. 2. Действие АБК и АСБ, выделенных из растворимой фракции Synechocystis, на активность транскрипции in vitro при использовании в качестве транскрипционной системы лизата Synechocystis.

Вариант опыта Включение 3Н-АМФ в Активация транскрипции,

РНК имп./мин 10 мкг проценты от контроля

ДНК

Контроль 13624±6500 100

АБК 10"6М 38383±2100 282

АСБ, 10 мкг 50060±3009 368

АБК 10"6М + АСБ, 10 мкг 57115±3500 420

Полученные результаты позволяют заключить, что в лизате Synechocystis присутствовала как мишень для действия одной АБК, так и для АСБ, который активировал транскрипцию почти в три раза.

Поскольку фракция АСБ участвует в активации транскрипции, мы, как и для ЦСБ попытались охарактеризовать их по наличию глютатион-связывающего сайта. Было показано, что фракция АСБ, полученная на АБК-сефарозе и

взаимодействующая с АТ„.„ к АБК, связывается с глютатион-сефарозой и на электрофореграмме имеет тот же полипептидный состав. Эти данные позволяют заключить, что АСБ Synechocystis имеют сайт связывания глютатиона и сайт взаимодействия с АБК.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе впервые выделены и охарактеризованы цитокинин-связывающие и АБК-связывающие белки из цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803, древние предки которой, как предполагают, обеспечили появление хлоропластов в растительной клетке. Для выделения гормон-связывающих белков из цианобактерий были использованы методы, применяемые ранее для растений. Идентификация наличия и характеристики ЦСБ и АСБ проводились с помощью АТ,_И, которые, как известно, являются AT против лиганд-связывающих сайтов белков и широко используются для изучения взаимодействия гормонов с их рецепторами.

В работе проводили выделение ЦСБ с использованием аффинных матриксов двух типов. Один матрикс был получен путем иммобилизации зеатина на сефарозу 4В. Второй матрикс был получен путем иммобилизации на сефарозу 4В моноклональных AT, полученных к ЦСБ кукурузы. Полученные результаты показывают, что с помощью аффинной и иммуноаффинной хроматографии, то есть двумя принципиально различными способами, был выделен ЦСБ 67 Synechocystis. Было показано, что цитокинин-связывающий белок не способен образовывать комплекс с другими фитогормонами и неактивным предшественником цитокининов -аденином. Это указывает на высокую специфичность взаимодействия его специфического сайта связывания с транс-зеатшои. Как показали дальнейшие исследования, этот белок активировал тотальную транскрипцию in vitro в лизате Synechocystis sp. РСС 6803 и хлоропластов листьев ячменя, и у него было показано наличие глютатион-связывающих сайтов, что может быть важным для проявления его функциональных свойств. Выделенные ранее ЦСБ хлоропластов ряда растений (ячмень, рис, кукуруза, арабидопсис) имели сходные свойства. Молекулярная масса их варьирует в диапазоне 57-70 кДа, выделены они были из растворимой фракции и активировали транскрипцию in vitro, а ЦСБ хлоропластов ячменя участвовал в цитокинин-зависимой транскрипции в лизате клеток Synechocystis. Кроме того, ЦСБ 67 Synechocystis взаимодействовал с мкАТ к ЦСБ 70, которые выявляют ЦСБ хлоропластов кукурузы. Это позволяет думать, что ЦСБ 67 Synechocystis и ЦСБ хлоропластов растений принадлежат к древнему консервативному семейству белков, участвующих в регуляторных системах и способных узнавать гормон для проявления активации транскрипции.

При всех использованных методах выделения и очистки, наряду с ЦС Б67 в полученных препаратах присутствовал шаперонин 60, который, как было показано, не обладает цитокинин-связывающими свойствами. Его возможное влияние на функции ЦСБ 67 должно быть исследовано в дальнейшем.

С помощью метода аффинной хроматографии на АБК-сефарозе нами был выделен ряд АБК-связывающих белков. Фракция этих АСБ была специфична к

абсцизовой кислоте и не взаимодействовала с другими фитогормонами и, как и ЦСБ Synechocystis sp. РСС 6803, активировала тотальную транскрипцию in vitro в лизате Synechocystis sp. РСС 6803. Белки АБК-связывающей фракции имели сайты связывания с глютатионом. В этой фракции с помощью АТа.и к АБК были выявлены несколько полипептидов, а с помощью AT к растительному АБК-связывающему белку CIP2.1 детектированыны два полипептида. Изучение этих полипептидов требует дальнейших исследований.

Суммируя полученные результаты, можно сказать, что в цианобактериях имеются гормон-связывающие белки. Это важно для понимания эволюции гормональной системы хлоропластов растений.

ВЫВОДЫ

1. Из цианобактерий Synechocystis sp. РСС 6803 выделен двумя независимыми методами (аффинная хроматография на зеатин-сефарозе и иммуноаффинная хроматография с использованием моноклональных AT к ЦСБ 70 кукурузы) цитокинин-связывающий белок 67 кДа (ЦСБ 67).

2. Транс-зеатин конкурировал с антиидиотипическими антителами к транс-зеатину за связывание с ЦСБ 67 что указывает на присутствие в белке сайта связывания транс-зеатина. Другие гормоны растений не конкурировали с антиидиотипическими антителами к транс-зеатину за связывание с белком. Это указывает на высокое сродство ЦСБ к транс-зеатину и отсутствие связывания с другими фитогормонами.

3. ЦСБ и транс-зеатин активировали тотальную транскрипцию in vitro в лизате Synechocystis sp. РСС 6803, что указывает на возможное участие ЦСБ и транс-зеатина в регуляторных системах цианобактерий.

4. При всех использованных методах выделения и очистки ЦСБ 67 в полученных препаратах присутствовал шаперонин 60, который не обладает цитокинин-связывающими свойствами.

5. Показано присутствие в Synechocystis sp. РСС 6803 АБК-связывающих белков 23, 50, 60 и 67 кДа и гомолога АБК-связыващего белка растений Cip2.1, участвующего в антистрессовых реакциях растений.

6. Установлена активация АБК-связывающими белками и АБК тотальной транскрипции in vitro в лизате Synechocystis sp. РСС 6803.

7. Совокупность полученных результатов указывает на возможность присутствия у цианобактерий молекулярных мишеней действия цитокининов и АБК, что представляет интерес с эволюционной точки зрения.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Шевченко Г.В., Каравайко H.H., Зубкова Н.К., Куприянова Е.В., Селиванкина С.Ю., Кузнецов В.В., Лось Д.А., Кулаева О.Н. В цианобактериях есть цитокинин-связывающие белки. Конференция «Физиология растений - фундаментальная основа современной фитобиотехнологии» с. 99, Ростов-на-Дону, 2006.

2. Шевченко Г.В., Каравайко H.H., Кудрякова Н.В., Селиванкина С.Ю.,

Куприянова Е.В., Зубкова Н.К., Кузнецов В.В., Лось Д.А, Кулаева О. Н. Участвуют ли цитокинины в регуляции метаболизма цианобактерий? Сборник тезисов «Международнаяч конференция Современная физиология растений: от молекул до экосистем» с. 188-190, Сыктывкар, 2007.

3. Шевченко Г.В., Каравайко H.H., Кулаева О.Н. В цианобактериях обнаружены цитокинин-связывающие белки.Ш Всероссийская конференция - школа «Высокоактивные интермедиаты химических реакций и биологических процессов» с. 24, Астрахань-Москва, 2007.

4. Шевченко Г.В., Каравайко H.H., Демиденко A.B., Кудрякова Н.В., Кулаева О.Н., Кузнецов В.В. АБК- связывающие свойства белка CIP 2.1 из люпина желтого. Годичное собрание ОФР России Международная конференция «Физико-химические основы организации растений» с. 155, Екатеринбург, 2008.

5. Шевченко Г.В., Демиденко A.B., Каравайко H.H., Кудрякова Н.В., Кулаева О.Н., Кузнецов В.В. Измененные физиологические свойства мутантов ARADIDOPSIS THALIANA с инактивированными генами гомологов белка CIP2.1 люпина желтого. Годичное собрание ОФР России Международная конференция «Физико-химические основы структурно-функцонапъной организации растений» с.201, Екатеринбург, 2008.

6. Шевченко Г.В., Каравайко H.H., Селиванкина С.Ю., Зубкова Н.К., Куприянова Е.В., Лось Д.А., Кузнецов В.В., Кулаева О.Н. Цитокинин-связывающий белок Synechocystis sp. РСС 6803. Тезисы докладов «Физико-химические механизмы адаптации растений к антропогенному загрязнению в условиях крайнего севера» с. 150-152, Апатиты, 2009.

7. Шевченко Г.В., Каравайко H.H., Селиванкина С.Ю., Зубкова Н.К. Цитокини-связывающий белок Synechocystis sp.PCC 6803. «Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов-2009», с.241, Москва, 2009

8. Шевченко Г.В., Каравайко H.H., Селиванкина С.Ю., Зубкова Н.К. АБК-связывающий белок Synechocystis sp.PCC 6803. «Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов-2010» с.223, Москва, 2010.

9. Шевченко Г.В., Каравайко H.H., Демиденко A.B., Селиванкина С.Ю., Зубкова Н.К., Куприянова Е.В., Лось Д.А., Кузнецов В.В., Кулаева О.Н. Обнаружение АБК-связывающих белков в цианобактериях (Synechocystis sp. РСС 6803). «Вестник Российского университета дружбы народов». Серия-агрономия и животноводство. № 1, с. 13-19, Москва, 2010.

Ю.Шевченко Г.В., Каравайко H.H., Селиванкина С.Ю., Зубкова Н.К., Куприянова Е.В., Лось Д.А., Кузнецов В.В., Кулаева О.Н. Цитокинин-связывающий белок Synechocystis sp. РСС 6803. Всероссийская, с международным участием, конференция молодых ученых, посвященной 90-летию Уральского государственного университета им. A.M. Горького «Биология будущего: Традиции и Инновации» с. 133, Екатеринбург, 2010.

Подписано в печать:

15.03.2011

Заказ № 5136 Тираж -120 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шевченко, Галина Васильевна

ВСТУПЛЕНИЕ.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Роль цитокининов и АБК в жизни растений.

1.1.1. Цитокинины.

Цитокинин-связывающие белки.

Цитокинин-связывающий белок 67.

1.1.2. Абсцизовая кислота.

Механизм восприятия и передачи сигнала АБК.

Рецепторы АБК.

АБК-связывающие белки.

1.2. Регуляция биогенеза хлоропластов цитокинином и АБК.

Цитокинин.

Абсцизовая кислота.

1.3. Гормоны цианобактерий.

2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Объект исследований.

2.2. Синтез аффинных матриц.

2.2.1. Синтез зеатин-сефарозы.

2.2.2. Синтез АБК-сефарозы.

2.2.3. Синтез аффинной матрицы АТцСБ70-сефарозы.

2.2.4. Синтез аффинных матриц с иммобилизованными АТ к зеатину и АТ к АБК для выделения АТаи.

2.2.5. Синтез глютатион-сефарозы.

2.3. Синтез конъюгатов гормонов с белком.

2.3.1. Синтез конъюгатов зеатинрибозида с БСА или овальбумином.

2.3.2. Синтез конъюгатов АБК с БСА или овальбумином.

2.4. Получение АТаи.

2.4.1. Получение иммунной сыворотки против гормонов.

2.4.2. Определение специфичности антисывороток против зеатина и АБК.

2.4.3. Выделение АТ к зеатину и АТ к АБК.

2.4.4. Получение АТа.и.

2.4.5. Выделение АТаи с помощью хроматографии на сефарозе с иммобилизованными АТ к гормону.

2.5. Выделение гормон-связывающих белков БупесЬосузИу Бр. РСС 6803.

2.5.1. Выделение водорастворимой фракции белков из лизата клеток

БупесЬосузШ.

2.5.2. Гидрофобная хроматография на фенил-сефарозе.

2.5.3. Аффинная хроматография гормон-связывающих белков на сефарозе с иммобилизованным гормоном.

2.5.4. Фракционирование ГСБ с помощью глютатион-сефарозы.

2.5.5. Идентификация ГСБ методом твердофазного ИФА.

2.5.6. Определение специфичности связывания ГСБ с гормонами в конкурентной системе вытеснения.

2.6. Электрофорез белков в ДДС-Ка-ПААГ.

2.7. Электроперенос белков.

2.8. Иммуноблотинг.

2.9. Реакция транскрипции in vitro.

2.10. Изоэлектрическое фокусирование препарата ЦСБ в нативных условиях.

2.11. Подготовка препаратов для масс спектрометрии.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Выделение и определение биохимических и функциональных характеристик цитокинин-связывающих белков Synechocystis.

3.1.1 .Гидрофобная хроматография.•.

3.1.2. Аффинная хроматография на зеатин-сефарозе.

3.1.3. Иммуноаффинная хроматография на мкАТцсб 7<гсеФаРозе.

3.1.4. Очистка и концентрирование препарата цитокинин-связывающих белков с помощью изоэлектрического фокусирования в растворе в нативных условиях.

3.1.5. Определение специфичности связывания цитокинин-связывающего белка с гормонами в системе вытеснения цитокинин-связывающего белка из комплекса с

АТаи к зеатину.

3.1.6.Транскрипционная активность цитокинин-связывающего белка БупескосузШ.

3.1.7. Глютатион-связывающие свойства цитокинин-связывающего белка вупесНосувИз.

3.1.8. Идентификация белков в препаратах цитокинин-связывающего белка.

3.2. Выделение и определение биохимических и функциональных характеристик АБК-связывающих белков ЗупескосузИз.

3.2.1.Гидрофобная хроматография на фенил-сефарозе.

3.2.2. Аффинная хроматография на АБК-сефарозе.

3.2.3. Определение специфичности связывания АБК-связывающих белков с гормонами в системе вытеснения АБК-связывающих белков из комплекса с АТа., к АБК.

3.2.4.Транскрипционная активность АБК-связывающих белков 8упескосу&й5.

3.2.5. Глютатион-связывающие свойства АБК-связывающих белков ЗупесУюсуяНя

ОБСУЖДЕНИЕ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Выделение и характеристика цитокинин-связывающих и АБК-связывающих белков Synechocystis sp. PCC 6803"

Актуальность темы. Все важнейшие процессы жизненного цикла растительного организма протекают под контролем фитогормонов. Кроме того, фитогормоны играют важную роль в реакции растения на внешние воздействия, позволяя, координировать свой рост и развитие в соответствии с изменениями условий внешней ^ среды, участвуют в формировании устойчивости растения к стрессам. Поэтому, со времени открытия фитогормонов, изучение гормональной системы вызывает неослабевающий интерес исследователей физиологии, биохимии и молекулярной биологии растений. Изучение гормональной системы регуляции проводится по нескольким направлениям, таким как исследование биосинтеза, метаболизма, транспорта, восприятия, передачи и ответа на гормональный сигнал. К настоящему моменту получено большое количество информации о механизме действия гормонов, некоторые процессы изучены достаточно хорошо, о других имеется лишь примерное представление. Совершенно не изученным вопросом является появление и эволюция гормональной системы.

Хлоропласты являются одной из главных мишеней действия фитогормонов в клетке растения. Хорошо изучена активация цитокинином биогенеза хлоропластов, включая их структурную и биохимическую дифференциацию (Хохлова, 1977; Кулаева, 1973; Кизпе1зоу et а1., 1994; Саегс, Уепёг^, 2006), и ингибирование этих процессов абсцизовой кислотой (АБК) (Кравяж и др., 1977; Хохлова и др., 1978). В хлоропластах присутствует полный спектр физиологически активных цитокининов (Вепкоуа е/ а/., 1999). Кроме того, показана активация цитокинином синтеза РНК в хлоропластах (Кошзаих еГ а\., 1976; Микулович и др., 1988; Зубо и др., 2005), получены данные в пользу посттранскрипционного влияния цитокининов на экспрессию хлоропластных генов (Кивп^БОУ е1 а!., 1994). Показано, что цитокинин и АБК могут активировать транскрипцию ряда хлоропластных генов (Зубо и др. 2005). Обнаружены хлоропластные цитокинин-связывающие белки, участвующие в гормон-зависимой регуляции транскрипции (Romanko et al., 1986; Kulaeva et al., 2000; Люкевич и др., 2002) и АБК-связывающие белки (Shen et al., 2006).

В литературе господствует представление о том, что хлоропласты произошли в результате эндоцитоза древних фотосинтезирующих цианобактерий в-эукариогическую клетку (Margulis, 1970; Douglas, Turner, 1991; Кулаев, 1998). В связи с этим, большой интерес представляет вопрос о том, могли ли в процессе эволюции цианобактерии привнести цитокинины и АБК в клетку и определить их участие в регуляторной системе хлоропластов.

Способность цианобактерий выделять активирующие рост растений вещества была отмечена давно (Metting et al., 1988), позднее была показана цитокининовая активность их лизата на семядолях огурца и сои (Stirk, van Staden, 1997). В цианобактериях идентифицированы эндогенные изопентиниладенин, транс-зеатин, а затем и другие цитокинины (Stirk et al., 1999; Hussain et al., 2010; Hussain, Hasnain, 2011). Кроме того, показано участие транс-зеатина на синтез РНК-полимеразы в транскрипционной системе цианобактерий in vitro. При этом добавление транс-зеатина в среду для определения транскрипционной активности, представляющей из себя лизат клеток Synechocystis sp. РСС 6803 и содержащей о

ДНК и РНК-полимеразу, специфично и при биологических концентрациях (10" М) повышало активность синтеза РНК. Кроме того, выделенный ранее из хлоропластов листьев ячменя цитокинин-связывающий белок, участвующий в цитокинин-зависимой регуляции транскрипции в хлоропластах растений и не участвующий в гормон-зависимой активации транскрипции в ядрах, существенно усиливал реакцию на транс-зеатин в транскрипционной системе цианобактерий (Селиванкина и др., 2006). Эти данные говорят о том, что у цианобактерий существует регуляторная система с участием цитокининов, которую они могли привнести в растительную клетку. Однако очевидно, что элементы этой системы могли притерпеть значительные изменения.

До настоящего времени не было работ, посвященных поиску цитокинин-связывающих (ЦСБ) и АБК-связывающих (АСБ) белков цианобактерий, которые могли бы быть молекулярными мишенями этих фитогормонов и участвовать в их влиянии на метаболизм клеток, хотя актуальность такой постановки вопроса очевидна с точки зрения анализа роли цианобактерий в эволюции гормональной системы растений.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы являлось обнаружение и изучение цитокинин-связывающих (ЦСБ) и АБК-связывающих (АСБ) белков цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803 для. выяснения возможной роли цианобактерий в эволюции гормональной системы растений. В соответствии с поставленной целью задачами работы было:

1) Выделить цитокинин- и АБК-связывающие белки из Synechocystis;

2) Изучить свойства выделенных белков;

3) Изучить возможность участия выделенных белков в регуляции транскрипции in vitro в лизате цианобактерий.

Научная новизна работы. Впервые показано присутствие цитокинин-связывающего белка (ЦСБ 67) в клетках цианобактерий Synechocystis sp. РСС 6803. Охарактеризовано его взаимодействие с природным цитокинином транс-зеатином. Установлена активация в присутствии га/>а«озеатина и ЦСБ 67 тотальной транскрипции in vitro в лизате цианобактерий.

Полученные результаты указывают на возможность присутствия у цианобактерий молекулярных мишеней действия гормонов растений цитокининов и АБК. Это представляет интерес с точки зрения фундаментальной проблемы' -эволюции становления гормональной системы растений. Полученные результаты указывают на возможность привнесения в растительную клетку регуляторных систем цитокинина и АБК с древними цианобактериями - предшественниками, хлоропластов.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на конференции «Физиология растений - фундаментальная основа современной фито биотехнологии» (Ростов-на-Дону. 2006), Международной конференции «Современная физиология растений: от молекул до экосистем» (Сыктывкар, 2007), III Всероссийской конференции-школе «Высокоактивные интермедиаты химических реакций и биологических процессов» (Астрахань-Москва, 2007), Международной конференции «Физико-химические основы структурно-функцональной организации растений» (Екатеринбург, 2008), Международной конференции «Физико-химические механизмы адаптации растений к антропогенному загрязнению в условиях Крайнего Севера» (Апатиты, 2009), XVI Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2009» (Москва, 2009), XVII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2010» (Москва, 2010) и на Всероссийской (с международным участием) конференции молодых ученых, посвященной 90-летию Уральского государственного университета им. A.M. Горького «Биология будущего: традиции и инновации» (Екатеринбург, 2010).

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Шевченко, Галина Васильевна

выводы

1. Из цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803 выделен двумя независимыми методами (аффинная хроматография на зеатин-сефарозе и иммуноаффинная хроматография с использованием моноклональных AT к ЦСБ 70 кукурузы) цитокинин-связывающий белок 67 кДа (ЦСБ 67).

2. Транс-зеашн конкурировал с антиидиотипическими антителами к транс-зеатину за связывание с ЦСБ 67 что указывает на присутствие в белке сайта связывания транс-зеатина. Другие гормоны растений не конкурировали с антиидиотипическими антителами к транс-зеатину за связывание с белком. Это указывает на высокое сродство ЦСБ к транс-зсптииу и отсутствие связывания с другими фитогормонами.

4. При всех использованных методах выделения и очистки ЦСБ 67 в, полученных препаратах присутствовал шаперонин 60, который не обладает цитокинин-связывающими свойствами.

Автор выражает благодарность научному руководителю к.б.н. Каравайко Наталье Николаевне за чуткое руководство, всестороннюю поддержку, и непосредственное участие в работе.

Автор благодарит д.б.н. профессора Кулаеву Ольгу Николаевну за внимательный анализ работы, помощь и поддержку в процессе ее подготовки.

Автор выражает благодарность д.б.н. профессору Кузнецову Виктору Васильевичу за помощь и поддержку на всех этапах работы.

Автор благодарит д.б.н. Новикову Галину Викторовну и д.б.н. Мошкова Игоря Евгеньевича за ценные советы и поддержку в процессе подготовки работы.

Автор благодарит д.б.н. профессора Лося Дмитрия Анатольевича за помощь в процессе работы.

Автор выражает благодарность к.б.н. Селиванкиной Светлане Юрьевне, к.б.н. Пожидаевой Елене Станиславовне, к.б.н. Кудряковой Наталье Васильевне, Зубковой Наталье Константиновне, к.б.н. Куприяновой Елене Владимировне за постоянную помощь, важные советы и участие в работе.

Автор благодарит к.б.н. Бровко Федора Александровича и коллег из Института биоорганической химии РАН, сотрудников лаборатории протеомики ИФХМ РАМН за участие в работе.

Большое спасибо Демиденко Артему и Белозеровой Наталье за советы и поддержку, всем сотрудникам лаборатории экспрессии генома растений ИФР РАН за помощь в работе, идеи, обсуждение, советы и хорошее отношеие, остальным сотрудникам ИФР за всегда доброе отношение.

Отдельная благодарность родным и близким за веру, помощь и поддержку во всех отошениях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Идентификация наличия и характеристики ЦСБ и АСБ проводились с помощью АТаи, которые, как известно, являются AT против лиганд-связывающих сайтов белков и широко используются для изучения взаимодействия гормонов с их рецепторами.

В работе проводили выделение ЦСБ с использованием аффинных матриксов двух типов. Один матрикс был получен путем иммобилизации зеатина на сефарозу 4В. Второй матрикс был получен путем иммобилизации на сефарозу 4В моноклональных AT, полученных к ЦСБ кукурузы. Полученные результаты показывают, что с помощью аффинной и иммуноаффинной хроматографии, то есть двуми принципиально различными способами, был выделен ЦСБ 67 Synechocystis. Было показано, что цитокинин-связывающий белок не способен образовывать комплекс с другими фитогормонами и неактивным предшественником цитокининов - аденином. Это указывает на высокую специфичность взаимодействия его специфического сайта связывания с транс-зеатином. Как показали дальнейшие исследования, этот белок активировал тотальную транскрипцию in vitro в лизате Synechocystis sp. РСС 6803 и хлоропластов листьев ячменя, и у него было показано наличие глютатион-связывающих сайтов, что может быть важным для проявления его функциональных свойств. Выделенные ранее ЦСБ хлоропластов ряда растений (ячмень, рис, кукуруза, арабидопсис) имели сходные свойства. Молекулярная масса их варьирует в диапазоне 57-70 кДа, выделены они были из растворимой фракции и активировали транскрипцию in vitro, а ЦСБ хлоропластов ячменя участвовал в цитокинин-зависимой транскрипции в лизате клеток Synechocystis. Кроме того, ЦСБ 67 Synechocystis взаимодействовал с мкАТ к ЦСБ 70, которые выявляют ЦСБ хлоропластов кукурузы. Это позволяет думать, что ЦСБ 67 Synechocystis и ЦСБ хлоропластов растений принадлежат к древнему консервативному семейству белков, участвующих в регуляторных системах и способных узнавать гормон для проявления активации транскрипции.

При всех использованных методах выделения и очистки, наряду с ЦСБ 67 в полученных препаратах присутствовал шаперонин 60, который, как было показано, не обладает цитокинин-связывающими свойствами. Его возможное влияние на функции ЦСБ 67 должно быть исследовано в дальнейшем.

С помощью метода аффинной хроматографии на АБК-сефарозе нами был выделен ряд АБК-связывающих белков. Фракция этих АСБ была специфична к абсцизовой кислоте и не взаимодействовала с другими фитогормонами и, как и ЦСБ Synechocystis sp. РСС 6803, активировала тотальную транскрипцию in vitro в лизате Synechocystis sp. РСС 6803. Белки АБК-связывающей фракции имели сайты связывания с глютатионом. В этой фракции с помощью АТаи к АБК были выявлены несколько полипептидов, а с помощью AT к растительному АБК-связывающему белку CIP2.1 детектированыны два полипептида. Изучение этих полипептидов требует дальнейших исследований.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шевченко, Галина Васильевна, Москва

1. Аберкромби Д., Алленмарк С., Араме С. Аффинная хроматография //М. Издательство «Мир», 1988. С. 278.

2. Алехина Н.Д., Балнокин Ю.В., Гавриленко В.Ф., Жигалова Т.В., Мейчик Н.Р.,

3. Носов A.M., Полесская О.Г., Харитоношвили Е.В., Чуб В.В. // Физиологиярастений: Учебник для студентов вузов. М. Издательский центр «Академия», 2005. С. 422.

4. Арендарчук В.В. Влияние /*-ИУК на некоторые синезеленые водоросли // Гидробиол. журн. 1974. Т. 10. С. 64-69.

5. Гладун A.A., Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В. Выделение и исследование функций цитокинин-связывающих белков из культуры ткани табака // Физиология и биохимия культурных растений. 1986. Т. 18 С. 333-337.

6. Гладун A.A., Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В. Выделение и исследование функций цитокинин-связывающих белков из культуры ткани табака // Физиология и биохимия культурных растений. 1986. Т. 18 С. 333-337.

7. Зубо Я. О., Селиванкина С.Ю., Ямбуренко М.Б., Зубкова Н.К., Кулаева О.Н., Кузнецов В.В. Цитокинины активируют транскрипцию хлоропластных генов // Доклады Академии Наук. 2005. Т. 400. С. 396-399.

8. Каравайко H. Н., Мошков И. Е., Селиванкина С. Ю., Новикова Г. В., Кулаева О. Н. Выделение при помощи антиидиотипических антител белка со свойствами рецептора цитокининов // Докл. АН СССР. 1990. Т. 310. С. 765767.

9. Кравяж К., Караеайко H.H., Коф Э.М., Кулаева О.Н. Взаимодействие абсцизовой кислоты и цитокинина в регуляции роста и позеленения семядолей тыквы // Физиология растений. 1977. - Т. 24. - Вып. 1. С. 160166.

10. Кузнецов Вл. В., Дмитриева Г.А. Физиология растений // Москва, «Высшая школа», 2005. С. 736.

11. Кукина И.М., Микулович Т.П., Кулаева О.Н. Взаимодействие абсцизовой кислоты и цитокинина в регуляции синтеза пластидных и цитоплазматических рибосомальных РНК в изолированных семядолях тыквы//Физиология растений. 1985. Т. 32. Вып. 2. С. 298-307.

12. Кунаев И. С. Происхождение эукариотических клеток // Соросовский Образовательный Журнал, 1998, № 5, с. 17-22.

13. Кулаева О.Н. Цитокинины: их структура и функция. М.: Наука, 1973. С. 264.

14. Кулаева О.Н., Прокопцева О.С. Новейшие достижения в изучении механизма действия фитогормонов // Биохимия. 2004. Т. 69. С. 293-310.

15. Курсанов А.Л., Кулаева О.Н., Свешникова H.H., Попова Э.А., Болякина Ю.П., Клячко Н.Л., Воробьева И.П. Восстановление клеточных структур и обмена веществ в желтых листьях под действием 6-бензиламинопурина // Физиология растений. 1964. Т. 11. С. 838. '

16. Люкевич Т.В., Каравайко H.H., Кулаева О.Н., Кузнецов В.В., Селиванкина С.Ю. Поиск белков, участвующих в цитокинин-зависимой регуляции транскрипции хлоропластного генома // Вестник Башкирского Университета, № 2 (I), (2001)/ С.144-147.

17. Микулович Т. П., Кукина И. М. О влиянии цитокинина, фузикокцина и калия на накопление хлорофилла и каротиноидов в изолированных семядолях тыквы // Физиология растений. 1988. - Т. 32. - С. 143.

18. Микулович Т.П., Хохлова В.А., Кулаева О.Н., Свешникова И.Н. Влияние 6-бензиламинопурина на изолированные семядоли тыквы // Физиология растений. 1971. Т. 18. С. 98.

19. Романко Е.Г., Селиванкина С.Ю., Овчаров А.К., Кулаева О.Н. Активация цитокинин-рецепторным комплексом из листьев ячменя синтеза РНК in vitro

20. Докл. АН СССР, 1980, Т. 255, С. 1009-1011.

21. CipeHKO Л. А. , Богданова Т. Л. Стимулящя розвитку Anabaena Variabilis в культур! за помогаю ф1зюлдопчно активнних речовин // Bien. Кщв. Ун-ту. 1962. Вип. 2. № 5. С.7-9.

22. Селиванкина С. Ю., Каравайко H. И., Черепнева Г. H., Прищепова А. Е., Кузнецов В. В., Кулаева О. Н. Биологически активный зеатин-связывающий белок из хлоропластов листьев ячменя // Докл. АН. 1997. Т. 36. С.830-832.

23. Селиванкина С.Ю., Зубкова Н.К., Куприянова Е.В., Люкевич Т.В., Кузнег\ов В.В., Лось Д.А., Кулаева О.Н. Реакция на цитокинин у цианобактерий // Физиология растений. 2006. Т. 53. С. 851-856.

24. Селиванкина С.Ю., Каравайко H.H., Земляченко Я.В., Маслова Г.Г., Кулаева О.Н. Регуляция транскрипции рецептором цитокинина в системах in vitro // Физиология растений. 2001. Т. 48. С. 434-440.

25. Ситник K.M., Мусатенко Л.1., Васюк В.А., Ведетчева H.H., Генералова В.М., Мартин Г.Г., Нестерова А.Н. Гормональний комплекс рослин i гриб1в. Кшв: Академперюдика, 2003. С. 186.

26. Федина Ф. Б., Бурханова Э. А., Харченко В. И. Функциональная активность цитокинин-связывающих ядерных белков из листьев ячменя с помощью аффинной хроматографии // Физиология растений, 1987, Т. 34, №2, С. 324327.

27. Херрман Р. Г. Биогенез и Динамика Структуры Фотосинтетических: Мембран: Результат Сложной Эволюционной Загадки // XIII Гродневские Чтения. Минск. 2007.

28. Хохлова В. А. Действие цитокинина на формирование пластид на свету и в темноте в изолированных семядолях тыквы // Физиология растений. 1977. Т. 24. С. 1186.

29. Ъв. Хохлова В. А. Действие цитокинина на формирование пластид на свету и н темноте в изолированных семядолях тыквы // Физиология растений. 1977. Т. 24. С. 1186.

30. Хохлова В. А., Свешникова И. Н., Кулаева О. Н. Влияние фитогормонов на. формирование структуры хлоропластов в изолированных семядолях тыквы // Цитология. 1971. Т. 13. С. 1074.

31. Хохлова В.А., Каравайко H.H., Подергина Т.А., Кулаева О.Н. Антагонизм в действии абсцизовой кислоты и цитокинина на структурную и биохимическую дифференциацию хлоропластов в изолированных семядолях тыквы II Цитология. 1978. Т. XX. Вып.9. С. 1033-1038.

32. Хохлова В.А., Каравайко H.H., Подергина Т.А., Кулаева О.Н. Антагонизм в действии абсцизовой кислоты и цитокинина на структурную и биохимическую дифференциацию хлоропластов в изолированных семядолях тыквы//Цитология. 1978. Т. XX. Вып.9. С. 1033-1038.

33. Шепеляковская А.О., Теплова И.Р., Веселое Д.С., Бурханова Э.А., Бозиее Х.М., Ламан А.Г., Васильева B.C. Кудоярова Г.Р., Холл М.А., Бровко Ф.А.,

34. Кулаева О.Н. Цитокинин-связывающий белок 70 кД преимущественно локализован в меристеме корня // Физиология растений. 2002. Т. 49. С. 113120.41 .Шпаков А. О. Пептидные аутоиндукторы бактерий // Микробиология, том 78, № 3, май-июнь 2009, С. 291-303.

35. Adachi R., Fakayo Y. The thecal structure of a marine toxic dinoflagellate Gambierdicus toxicus gen. et sp. nov. Collected in a ciguatera endemic area // Bull. Jap. Soc. Sci. Fish. 1979. V. 45. № 1. P. 67-71.

36. AA.Anantharaman V., Aravind L. The CHASE domain: a predicted ligand-binding module in plant cytokinin receptors and other eukaryotic and bacterial receptors // Trends Biochem. Sci. 2001. V. 26 P. 579-582.

37. Auger H. Les hormones des algues. Etat actuel des connaissances // Botanica Marina. 1976. V. 19. № 4. P. 245-254.

38. Bartholomew D.M., Bartley G.E. and Scolnik P.A. Abscisic Acid Control of rbcS and cab Transcription in Tomato Leaves // Plant Physiol. 1991. V. 96. P. 291296.

39. Benkova E., Witters E., Van Dongen W., Kolar J., Motyka V., Brzobohaty В., Van Onckelen H.A., Machackova I. Cytokinins in tobacco and wheat chloroplasts: Occurrence and changes due to light/dark treatment // Plant Physiol. 1999. V. 121. P. 245-251.

40. Brault M., Caiveau O., Pedron J., Maldiney R., Sotta B., Miginiac E. Detection of membrane-bound cytokinin-binding proteins in Arabidopsis cells // Eur. J. Biochem. 1999. V. 260. P. 512-519.

41. Buchanan-Wollaston V. The molecular biology of leaf senescence // J. Exp. Bot. 1997. V.48.P. 181-199.

42. Caers M. and Vendrig J. C. Benzyladenine effects on the development of the photosynthetic apparatus in Zea mays: Studies on photosynthetic activity, enzymes and (etio)chloroplast ultrastructure // Physiologia Plantarum. 2006. -V. 66(4). P. 685-691.

43. Cato A.T., Nestl A., MinkS. Rapid actions of steroid receptors in cellular signaling pathways // Sci. STKE. 2002. V. 138. P. 9.

44. Chen C., Melitz D., Petschow B., Eckert R.L. Isolation of cytokinin-binding protein from plant tissues by affinity chromatiography // Eur. J. Biochem. 1980. V. 108. P. 379-387.

45. Evans L.V., Trewavas A.J. Is Algal Development Controlled by Plant Growth Substances // J. Phycol. 1991. V. 27. P. 322-326.

46. Fan L., Zheng S. and WangX. Antisense suppression of phospholipase Da retards abscisic acid- and ethylene-promoted senescence of postharvest Arabidopsis leaves // Plant Cel. 1997. V. 9. P.2183-2196.

47. Farinneau N., Roussaux M. J. Influence de la 6-benzylaminopurine sur la différenciation plastidiela dans les cotyledons de concombre // Physiol. Plantarum. 1975. V. 33. P. 194.

48. Hare P., Staden J. The molecular basis of cytokinin action // Plant Growth Regul. 1997. V. 23. P. 41-78.

49. Hetherington A. Guard cell signaling // Cell. 2001. V. 107. P. 711-714.

50. Hoffmann P., Rathsack R. Zur cytokinin-wirkung dei blauagen // Biochem. und Physiol. Piianz. 1970. V.6. № 1. S. 95-96.

51. Inoue T., Higuchi M., Hashimoto Y., Seki M., Kobayashi M., Kato T., Tabata S., Shinozaki K., Kakimoto T. Identification of CRE1 as a cytokinin receptor from Arabidopsis // Nature. 2001. V. 409. P. 1060-1063.

52. Inoue T., Higuchi M., Hashimoto Y., Sekl M., Kobayashi M., Kato T., Tabata S., Shinozaki K., Kakimoto T. Identification of CRE1 as a Cytokinin Receptor from ' Arabidopsis //Nature. 2001. V. 409. P. 1060-1063.

53. M.Isabel B., Dean C. The timing of development transitions in plants // Cell. 2006. V. 125. P. 655-664.

54. Jayabaskaran C. Isolation and characterization of a cytokinin-binding protein from cucumber cotyledons // Plant Growth Regulation. 1990. V. 9. P. 9-17.

55. Jayabaskaran C. Isolation of a cytokinin-binding protein from Cucumis sativus cotyledons //Proc. Indian Acad. Sci. 1988. V. 98. P. 269-276.

56. Kakimoto T. CKI1, a histidin kinase homolog implicated in cytokinin signal transduction// Science. 1996. V. 274. P. 982-985.

57. Kulaeva O.N., Karavaiko N.N., Selivankina S.Yu., Moshkov I.E., Novikova G.V., Zemlyachenko Y. V., Shipilova S. V., Orudgev E.M. Cytokinin signaling systems // Plant Growth Regul. 1996 V. 18. P. 29-37.

58. Kulaeva O.N., Prokoptseva O.S. Recent advances in the study of mechanisms of action of phytohormones // Biochemistry. 2004. V. 69. P. 233-247.

59. Kulaeva O.N., Zagranichnaya T.K., Brovko F.A., Karavaiko N.N., Selivankina S.Yu., Zemlyachenko Y.V., Hall M., Lipkin V.M., Boziev KM. A new family of cytokinin receptors from Cereales II FEBS Lett. 1998. V. 423. pp. 239-242.

60. Kusnetsov V., Landsberger M., Meurer J., Oelmuller R. The assembly of the CAAT-box binding complex at a photosynthesis gene promoter is regulated by light, cytokinin, and the stage of the plastids // J. Biol. Chem. 1999. - V. 274(50).-P. 36009-36014.

61. Kusnetsov V.V., Oelmuller R., Sarwat./., Porfirova S.A., Cherepneva G.N., Herrmann R.G., Kulaeva O.N. Cytokinins, abscisic acid in Lupinus luteus cotyledons without notable effect on stady-state mRNA levels // Planta. 1994. V. 194. P. 318-327.

62. Lange M.J.P., Lange T. Gibberellin biosynthesis and the regulation of plant development // Plant Biol. 2006. V. 3. P. 281-290.

63. Li L., Kim B.G., Cheong Y.H., Pandey G.K. and Luan S.A. Ca2+ signaling pathway regulates a K+ channel for low-K response in Arabidopsis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V. 103. P. 13625-12630.

64. Longo G. P. M., Bracale M., Rossi G., Longo C. P.Benziladenin Induced the Apperance of LHCP-mRNA and the Relevant Protein in Dark-grown Excised Watermelon Cotyledons If Plant Mol. Biol. 1990. V. 14. P. 569-573.

65. Longo G. P., Olginati M, Rossi G., Valente M., Longo C. P. Effect of brief treatments with benzyladenine on growth and development of watermelon cotyledons // Plant Cell and Environment. 1978. V. 1. P. 39-43.

66. Macknight R., Bancroft L., Page T. et al. FCA, a gene controlling flowering time in Arabidopsis, encodes a protein containing RNA-binding domains // Cell. 1997. V. 99. P. 737-745.

67. Metting, D. Micro-algae in agriculture // Micro-Algal Biotechnology. 1988. Cambridge University Press, Cambridge, pp. 288-304.

68. Metting, D., Ray burn, W. R. & Reynaud, P. A Algae and agriculture. // Algae and Human Affairs. 1988. Cambridge University Press, Cambridge, P. 33570.

69. Mitsui S., Sugiura M. A cDNA encoding the 57 kDa subunit of a cytokinin-binding protein complex from tobacco: the subunit has high homology to S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase // Plant Cell Physiol. 1993b. V. 34. P. 10891096.

70. Momotani E., Tsujl H. Isolation and characterization of cytokinin-binding protein from the water soluble fraction of tobacco leaves I I Plant Cell Physiol. 1992. V. 33. P. 407-412.

71. Moore F.H. A cytokinin binding proteins from wheat germ // Plant Physiol. 1979. V. 64. P. 594-599.

72. Mori I.C. CDPKs CPK6 and CPK3 function in ABA regulation of guard cell S-type anion- and Ca -permeable channels and stomatal closure // PLoS Bio. 2006. V. 4. P. 327.

73. Miiller A.H., Hansson M. The Barley Magnesium Chelatase 150-kDa Subunit Is Not an Abscisic Acid Receptor // Plant Physiol. 2009. V.150. P. 157166

74. Nagata R., Kawachchi E., Hashimoto Y., Shudo K. Cytokinin-specific binding protein in ethyolated mung bean seedlings // Biochem. Biophys. Res. Comm. 1993. V. 191. P. 543-549.

75. Nogue F., Mornet R., Laloue M. Specific photoaffinity of a thylakoid membrane protein with azido-cytokinin agonist // Plant Growth Regul. 1995. V. 18. P. 51-58.

76. Ohya Y, Anraku Y A galactose-dependent cmdl mutant of Saccharomyces cerevisiae: involvement of yeast calmodulin in nuclear division. // Curr Genet. (1989)V. 15. P.113-120.

77. Ohya Y, Kawasaki H, Suzuki K, Londesborough J, Anraku Y Two yeast genes encoding calmodulin-dependent protein kinases: isolation, sequencing, andbacterial expressions of CMK1 and CMK2.// J Biol Chem (1991). V. 266. P. 12784-12794.

78. Osakabe Y., Maruyama K., Seki M, Satou M., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K. Leucine-Rich Repeat Receptor-Like Kinase 1 Is a Key Membrane-Bound Regulator of Abscisic Acid Early Signaling in Arabidopsis // Plant Cell. 2005. V. 17. P. 1105-1119.

79. Paul A.L., Sehnke P.C., Ferl R.J. (2005) Isoform-specific subcellular localization among 14-3-3 proteins in Arabidopsis seems to be driven by client interactions. //Mol. Biol. Cell. Y. 16. P. 1735-43.

80. Pel Z.-M., Murata Y., Benning G., Thomine S., Klusener B., Allen G.J., Grill E., Schroeder J.I. Calcium channels activated by hydrogen peroxide mediate abscisic acid signalling in guard cells. // Nature. (2000). V. 406. P. 731-734.

81. Pernas M., Garcia-Casado G., Rojo E., Solano R., Sanchez-Serrano J.J. A protein phosphatase 2A catalytic subunit is a negative regulator of abscisic acid signaling. // Plant J. (2007). V. 51. P. 763-778.

82. Phillips I.D.J., Wareing P.F. Studies in dormancy of sycamore I Seasonal changes in the growth-inhibitors in Acer pseudoplatanus. II J Exp.Bot. (1958). V. 9. P. 350-64.

83. Poly a G.M., Davis A.W. Properties of high-affinity cytokinin-binding protein from wheat germ // Planta. 1978. V. 139. P. 139-147.

84. Provasoli L., Carlucci A.F. Vitamins and Growth Regulators //

85. Physiology and Biochemistry / Ed. Stewart W.D.P. Los Angeles: Berkeley, 1 c^-y^1. P. 741-784.

86. Razem F.A., Hill R.D. Hydrogen peroxide affects abscisic acid binding to ABAP1 in barley aleurones // Biochemistry and Cell Biology. 2007. V. 85. P. ^>8 637.

87. Razem F.A., Luo M., Liu J.-H., Abrams Z.R., Hill R.D. Purification and characterization of a barley aleurone abscisic acid-binding protein // Journal of Biological Chemistry. 2004. V. 279. P. 9922-9929.

88. Reski R Physcomitrella and Arabidopsis: the David and Goliath of reverse genetics.// Trends Plant Sci. (1998) V. 3. P 209-210.

89. Reski R., Wehe M., Hadeler B., Marienfeld J. R., and Abel W. O. Cytokinin and light quality interact at the molecular level in the chloroplast-mutant of the moss Physcomitrella. //J Plant Physiol. (1991). V. 138. P. 236-243.

90. Riefler M., Novak O., Strnad M., Schmiilling T. Arabidopsis Cytolonin Receptor Mutants Reveal Functions in Shoot Growth, Leaf Senescence, Seed. Size Germination, Root Development and Cytokinin Metabolism // Plant Cell. 2006 V 18. P. 40-54.

91. Ritchie S. and Gilroy S. Abscisic acid stimulation of phospholipase H> jn barley aleurone is G-protein-mediated and localized to the plasma membrane // Plant Physiol. 2000.V. 124. P. 693-702.

92. Romanko EG, Selivankina SY, Moshkov IE, Novikova GV. Effect of cytokinin-binding proteins isolated from chloroplasts on transcription // Fiziol Rast. 1986; V. 33/ P. 1078-1083.

93. Romanov G.A., Taran V. Ya., Chvojka L., Kulaeva O.N. Receptor-like cytokinin-binding protein(s) from barley leaves // J. Plant Growth Regul. 1988. V. 7. P. 1-17.

94. Saadet S., Fatih D. Effect of 24-epibrassinolide on biomass, growth andtfree proline concentration in Spirulina platensis (Cyanophyta) under NaCl stress // Plant Growth Regul. 2008. V. 56. № 3. P. 219-223.

95. Santner A, Calderon-Villalobos LI, Estelle M Plant hormones are versatile chemical regulators of plant growth. //Nat Chem Biol. (2009). V. 5. 301-307.

96. Schmitt J.M., Piepenbrock M. Regulation of phosphoe-nolpyruvate carboxylase and crassulacean acid me-tabolism induction in Mesembryantheum crystalli-num L. by cytokinins // Plant Physiol. 1992. V. 99. P. 1664-1669.

97. Schmulling T., Schafer S., Romanov G. Cytokinin as regulators of gene expression // Physiologia Plantarum. 1997. V. 100. P. 505-519.

98. Shen Y. Y., WangX. F., WuF. Q. The Mg-chelatase H subunit is an abscisic acid receptor // Nature 2006443, 823-826.

99. Stirk W., Or dor V., van Staden J. Identification of the cytokinin isopentenyladenine in a strain of Arthronemaafricanum (Cyanobacteria). Journal ofPhycology, 1999, vol. 35, no. 1, p. 89-92.

100. Stirk W.A., Novak O., Strnad M„ van Staden J. Cytokinins in Macroalgae // Plant Growth Regul. 2003. V. 41. P. 13-24.

101. Stirk W.A., van Staden J. Comparison of Cytokinin- and Auxin-Like Activity in Some Commercially Used Seaweed Extracts // J. Appl. Phycol. 1997. V. 8. P. 503-508.

102. Stirk, W. A. & van Staden, J. Isolation and identification of cytokinins in a new commercial seaweed product made from Fucus serratus L // J. Appl. Phycol. 1998. V. 9. P. 327-30.

103. Takegami E.T., Yoshida K. Isolation and purification of cytokinin binding protein from tobacco leaves by affynity column chromatiography // Biochem. Biophys. Res. Com. 1975. V. 67. P. 782-789.

104. Takei, K, Sakakibara, H., Sugiyama, T. Identification of genes encoding adenylate isopentenyltransferase, a cytokinin biosynthesis enzyme, in Arabidopsis II Biol.Chem. 2001. V. 276. P. 26405-26410.

105. Tsai M.J., O'Malley B.W. Molecular mechanisms of action of steroid. Thyroid receptor superfamily members // Annu. Rev. Biochem. 1994. V. 63. P. 451-486.

106. Ueguchi C., Koizumi H., Suzuki T., Mizuno T. Novel family of sensor histidine kinase in Arabidopsis II Plant Cell Physiol. 2001. V. 42. P. 231-235.

107. Urao T., Yamaguchi-Shinozaki K., Urao S., Shinozaki K. An Arabidopsis myb homolog is induced by dehydration stress and its gene product binds to the conserved MYB recognition sequence. // Plant Cell. (1993). V. 5/ P. 1529-1539.

108. Van den Wijngaard P.W.J., Sinnige M.P., Boobeek I., Reumer A., Schoonheim P. J., Mol J.N.M., Wang M., De Boer A.H. Abscisic acid and 14-3-3 proteins control K+ channel activity in barley embryonic root. // Plant J.V. (2005). V.41.P. 43-55.

109. Wang P., Song C.-P. Guard-cell signalling for hydrogen peroxide and abscisic acid.// New Phytologist. (2008). V. 178. P. 703-718.

110. Wang X., Zhang D. Abscisic Acid Receptors: Multiple Signal-perception Sites. //Annals of Botany. (2008). V. 101. P. 311-317.

111. Wu Y, Kuzma J., Marechal E., GraeffR., Lee H.C., Foster R., ChuaN.-H. Abscisic acid signaling through cyclic ADP-ribose in plants. // Science. (1997). V. 279. P.2126-2130.

112. Xu J., Li H.D., Chen L.Q., Wang Y, Liu L.L., He L., Wu W.H. A protein kinase, interacting with two calcineurin B-like proteins, regulates K+ transporter AKT1 in Arabidopsis // Cel. /2006. V. 125. P.1347-1360.

113. Yoshida K., Tagami E.T. Isolation of cytokinin binding protein from tobacco leaves by bioaffinity chromatography and its partial characterization // J. Biochem. 1977. V. 1. P.791-799.

Информация о работе

Шевченко, Галина Васильевна
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.05

Диссертация

Выделение и характеристика цитокинин-связывающих и АБК-связывающих белков Synechocystis sp. PCC 6803 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы