Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Цитокинин- связывающий белок из листьев ячменя

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Цитокинин- связывающий белок из листьев ячменя"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА

ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М. В. ЛОМОНОСОВА

р Г Г) ОД БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

1 в да

На правах рукописи

ЗЕМЛЯЧЕНКО ЯНА ВИКТОРОВНА

ЦИТОКИНИН-СВЯЗЫВАЮЩИЙ БЕЛОК ИЗ ЛИСТЬЕВ ЯЧМЕНЯ

Специальность: 03.00.12 — физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 1996

Работа выполнена на кафедре физиологии растений биологического факультета Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова.

Научные руководители: доктор биологических наук

профессор Кулаева О. Н. кандидат биологических наук Каравайко Н. Н.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Кораблева Н. П. доктор биологических наук Носов А. В.

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии им. акад. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова, РАН

сов на заседании Специализированного совета по присуждению ученой степени кандидата биологических наук К 053 05 14 при Биологическом факультете Московского университета им. М. В. Ломоносова

Адрес: Москва, 119899, Воробьевы горы, Биологический факультет МГУ

Автореферат разослан » 1996 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Ученый секретарь Специализированного

совета —

канд. биол. наук

Защита диссертации состоится: « »

1996 г. в ча

Полесская О. Г.

Общая характеристика работы.

Актуальность проблемы. Цитокинины, подобно другим фитогормонам, регулируют многие физиологические процессы в растениях, включая деление клеток, рост и старение листьев, биогенез хлоропластов, дифференцировку побегов и многое другое (Skoog and Miller, 1957, Кулаева 1973, 1982, 1995). Однако наука находится лишь у истоков изучения молекулярного механизма действия цитокининов.

По современным представлениям важным этапом на пути реализации гормональных сигналов в клетке является взаимодействие гормонов со специфическими белками-рецепторами (Кулаева 1982, 1995; Venís, 1985; Романов 1989; Napier and Venís, 1990). Поэтому выделение и изучение гормон-связывающих белков растений привлекает большое внимание исследователей.

К настоящему времени цитокинин-связывающие белки (ЦСБ) выделены из ряда растительных объектов, включая зародыши пшеницы (Polya and Davis, 1978; Moore III, 1979; Erion and Fox, 1981; Brinegar and Fox, 1985). каллусные ткани (Chen et al., 1980; Hamaguchi et al., 1985) и листья табака (Takegami and Yoshida, 1975,1977; Momotani and Tsuji, 1992; Mitsui and Sugiura, 1993), проростки огурца (Jayabaskaran, 1990), листья ячменя (Романов и др., 1986; Каравайко и др., 1990), этиолированные проростки кукурузы (Romanov et al., 1990; Taran et al., 1992) и т. д. Однако, их рецепторная роль в ответе клеток на природный цитокинин транс-зеатин не была доказана.

Вместе с тем сведения о присутствии в листьях ячменя белка (или белков), опосредующего (опосредующих) активацию цитокинином синтеза РНК, были получены в лаборатории проф. О. Н. Кулаевой (Романко и др., 1980: Селиванкина и др., 1982; Харченко и др., 1983). Белок, участвующий в активации цитокинином синтеза РНК in vitro в системе, содержащей хроматин и связанную с ним РНК-полимеразу I из листьев ячменя, позднее был выделен в этой лаборатории на основании, сродства к синтетическому цитокинину 6-бензиламинопурину (БАП) (Kulaeva et а!., 1990; Каравайко и др., 1990). Однако хорошо известно, что БАП по многим параметрам существенно отличается от природного цитокинина — mpawc-зеатина, и что белок, обладающий высоким сродством к БАП, может иметь низкое сродство к природному цитокинину растений (Erion and Fox, 1981). Это указывало на необходимость поиска рецептора цитокинина в растительных клетках на основании его аффинности к трамс-зеатину.

Цель и задачи исследования. Целью нашей работы было выделение

из листьев ячменя транозеатин-связывающего белка (ЗСБ) и исследование его физико-химических и функциональных свойств.

Перед нами стояли следующие задачи:

1) получить антиидиотипические антитела (АТа_„) к зеатину,с помощью которых можно идентифицировать зеатин-связывающий белок и исследовать его свойства;

2) с применением аффинной хроматографии с иммобилизованным транс-зеатином разработать процедуру возможно полной очистки ЗСБ из цитозоля листьев ячменя;

3) с помощью [3Я]-трамс-зеатина изучить способность белка обратимо и специфично связывать цитокинин;

4) исследовать лигандную специфичность взаимодействия ЗСБ с природными и синтетическими цитокининами;

5) в совместных исследованиях с к.б.н. С. Ю. Селиванкиной изучить функциональную активность цитокинин-белкового комплекса.

Научная новизна. Из цитозоля листьев ячменя выделен и очищен зеатин-связывающий белок, отвечающий всем критериям рецептора цитоки-нина. Белок обратимо связывает [:,Я]-трамг-зеатин и проявляет высокую лигандную специфичность в связывании цитокининов. Белок не связывает другие фитогормоны. Цитокинин-белковый комплекс индуцирует активацию транскрипции цитокинином синтеза РНК in wit.ro в системе, содержащей хроматин и связанную с ним РНК-полимеразу I из листьев ячменя. Таким образом, цито-кинин-белковый комплекс моделирует in vitro типичное действие цитокининов tu vivo - активацию синтеза РНК в листьях ячменя.

Впервые получены АТа-и к зеатину и использованы для тестирования ЗСБ и исследования лигандной специфичности связывания выделенного белка с цитокининами.

Практическая значимость. Выделение белка со свойствами рецептора цитокинина открывает возможности изучения молекулярных механизмов действия цитокининов в растениях. Возникает перспектива выделения гена рецептора цитокининов и получения трансгенных растений с заданными параметрами чувствительности к цитокинину.

Апробация диссертационного материала. Материалы, представленные к защите, докладывались на II Российском симпозиуме «Новые методы биотехнологии растений» (Пущино, 1993); III съезде ВОФР (Санкт-Петербург, 1993); Международном симпозиуме «Рецепция и передача гормональных сигна-

о

о

лов» (Москва, 1994); XV Международной конференции по регуляторам роста растений (Minneapolis, 1995); II симпозиуме ВОФР (Пенза, 1996); на рабочем совещании по изучению восприятия и передачи цитокининового сигнала в высших растениях в рамках программы INTAS (Москва, 1996); на IV рабочем совещании в рамках программы русско-немецкого сотрудничества по биотехнологии (Санкт-Петербург, 1996).

Публикации. Материал диссертации опубликован в 10 печатных работах.

Объем и структура работы.Диссертация изложена на -lio страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания методов, изложения и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка цитированной литературы, который включает/¿^наименований.

Экспериментальные данные представлены в виде,2б?рисунков и 4 таблиц.

Содержание работы Объект и методы исследовании

Объект исследований. В качестве объекта исследований были выбраны закончившие рост листья первого яруса 10-ти дневных растений ячменя (Hordeum vulgare L.) сорта Винер, наиболее чувствительные к действию экзогенных цитокининов среди большого числа изученных растений, относящихся

<<

к разным систематическим группам (Кулаева. 1973). Растения ячменя выращивали в ящиках с почвой в факторостатных условиях: длина светового дня составляла 16 ч, освещенность — 50 Вт/.\г, температура 22--23°С днем и 16°С ночью, влажность воздуха — 70%.

Получение антиидиотипических антител. АТа —и выделяли из сыворотки к транс-зеатину после длительного периода иммунизации кроликов или из сыворотки", полученной против моноспецифйческих иммуноглобулинов к зе-атину (АТ:) (рис. 1). Кроликов иммуннзйр'овали конъюгзтом зеатинрибозида с БСА или АТ; по схеме, описанной ранее (Кудоярова и др., 1990). Моноспецифические антитела к зеатину выделяли из сыворотки к транс-зеатину аффинной хроматографией на зеатинрибозид-сефарозе (ZR-сефарозе). АТ- элю-ировали 0,2 М глицин-HCl буфером, рН 3.0, диализовали и иммобилизовали на CNBr-активированной сефарозе по методическим указаниям фирмы «Farmacia» (Affinity Chromatography, 1979). Полученный матрикс был использован для выделения АТа_и. Элюцию АТа-и проводили 0.25 М аммиаком.

Выделение ЗСБ. Для выделения ЗСБ из листьев ячменя использовали аффинную хроматографию на двух матриксах: ZR-сефарозе, полученной nv-

Конъгагат ZR-БСА

Иммунизация кролика

Антисыворотка

Рис. 1. Схема выделения антиидиотипических антител

тем иммобилизации зеатинрибозида на АН-сефарозе 4В периодатным методом (Moore III, 1979), и на зеатин-сефарозе (Z-сефарозе), для получения которой трсшг-зеатин иммобилизовали на эпокси-активированной сефарозе 6В (Мо-motani and Tsuji, 1992). В качестве контрольного сорбента применяли аденин-сефарозу (Kulaeva et al„ 1990).

Все процедуры по выделению ЗСБ проводились при 2-4° С. Для получения исходного белкового препарата листья ячменя гомогенизировали в буфере (50 мМ Трис-HCl, pH 7.7, 250 мМ сахароза, 10 мМ МдС12. 500 мМ NaCl. I мМ фенилметансульфонилфторид, 4 мМ 2-меркаптоэтанол). Гомогенат фильтровали с последующим центрифугированием при 160000д (2ч) (рис. 2). Супернатант освобождали от низкомолекулярных веществ гель-фильтрацией на сефадексе Г-50. Гидрофобную хроматографию полученной белковой фракции проводили на фенил-сефарозе CL-4B.

Присутствие ЗСБ в элюатах определяли по их реакции с АТа_и к зе-атину в системе твердофазного ИФА с иммобилизованным белком (Каравай-ко и др., 1990). Связанные с белком АТа —и проявляли вторичными ослиными противокроличьими иммуноглобулинами, мечеными пероксидазой. Активность пероксидазы измеряли, используя в качестве хромогена ортофенилендиамин.

СУПЕРНАТАНТ (160000 g, 1 ч) !

СЕФАДЕКС Г-50

ФЕНИЛ-СЕФАРОЗА

транс -ЗЕАТИН-СЕФАРОЗА

траяс-ЗЕАТИНРИБОЗИД-СЕФАРОЗА

1М NaCt-

-j ЗСБ f-

0.2 M NaOH

Электрофорез в ДДС-Na-nAAf

Нативный электрофорез

Конкурентное связывание Г3Н ]-транс-зеатина

Взаимодействие с АТа.и

в системе ИФА

Лигандная специфичность связывания

Активация

синтеза РНК in vitro

Рис. 2. Схема выделения и анализа ЗСБ из цитозоля листьев ячменя

Аффинную хроматографию фракций, содержащих ЗСБ, проводили параллельно на ЕЯ-сефарозе, Z-ceфapoзe и аденин-сефарозе. Связавшиеся белки элю-ировали или 1 М МаС1 в 50 мМ трис-НС1 буфере, рН 8.8, или 0,2 М МаОН.

Исследование свойств ЗСБ. Зеатин-связывающую способность выделенного белка определяли с использованием высокомеченого природного ци-токинина [:,Я]-транс-зеатина (Чешская республика) с удельной радиоактивностью 95 ГВк/ммоль методом высаливания сульфатом аммония. Специфическое связывание определяли как разницу между общим и неспецифическим связыванием, обнаруживаемым при разбавлении [3Я]-трамс-зеатина избытком немеченого гормона (Ки1аеуа е1 а!., 1995).

Лигандную специфичность связывания выделенного белка исследовали в системе твердофазного ИФА с помощью АТа-н к зеатину. Для этого определяли конкурентное вытеснение АТа_и из комплекса с иммобилизованным белком транс-зеатином, его структурными аналогами и другими гормонами.

Функциональная активность выделенного ЗСБ была исследована сотрудником лаборатории экспрессии генома растений (ИФР РАН) к.б.н. С. Ю. Се-ливанкиной по методу, описанному ранее (Селиванкина и др., 1982).

Электрофорез белков в неденатурируюших условиях проводили на холоду в градиенте концентраций ПААГ (4-20%) по Лэммли (Laemmly, 1970), исключая из состава буферов ДДС-NA. Электрофорез белков в денатурирующих условиях проводили в 10% ПААГ (Laemmly, 1970). Гели окрашивали Кумасси R-250. Если необходимо, докрашивали азотнокислым серебром (Oakley et al., 1980).

Электроперенос и иммуноблоттинг белков. Для иммуноблоттинга белки.с незафиксированного геля переносили на нитроцеллюлозную мембрану Hybond-C полусухим способом в приборе Multifor II Novablot. Буфер переноса: 39 мМ. глицин, 47 мМ Трис, рН 8.4, 0,1% ДДС-Na, 20% метанол. ЗСБ проявляли с помощью АТа_„, как описано в работе Каравайко с сотр. (1995).

Элюция белков из геля и их ренатурация. Для ренатурации белки после ДДС-ПААГ-электрофореза окрашивали хлоридом цинка (Dzandu et al., 1988). Зоны геля, содержащие белки, вырезали. После удаления из них металла (Lee et al., 1987), белки элюировали и ренатурировали как описано ранее (Hager and Burgess, 1980).

Количественное определение белка проводили по методу Лоури (Lowry et al., 1951), используя овальбумин в качестве стандарта.

Биотест по задержке цитокининами старения изолированных отрезков листьев ячменя проводили в темноте по методу Kende (1964) с некоторыми модификациями. Отрезки инкубировали в течение 5 суток на водных растворах испытуемых соединений при температуре 25° С. Для получения каждой экспериментальной точки были использованы 2 биологических и 3 химических повторности. После инкубации из отрезков 80%-ным ацетоном экстрагировали хлорофилл и определяли спектрофотометрически при длине волны 665 нм. Результаты обработаны статистически.

Результаты и их обсуждение

Получение антиидиотипических антител к зеатину. Поскольку цель данной работы состояла в выделении и очистке ЗСБ, первая экспериментальная задача сводилась к получению при помощи тпринс-зеатина АТа_н, которые позволили бы тестировать ЗСБ на всех этапах его выделения.

Антиидиотипическими называют вторичные антитела , которые вырабатываются в крови животного на первичные антитела против лиганда, которым проводилась иммунизация (в нашем случае против зеатина). Взаимодействие любого антигена с антителом и лиганда с его рецептором предполагает конфор-мационную комплементарность взаимодействующих структур (рис. 3).

Рис. 3. Схема образования АТа-и и их взаимодействия с рецепторным белком (Meyer, 1990).

а) лиганд-связывающий сайт рецептора характеризуется конформацией, определяющей его специфичность;

б) антитело, образованное против детерминант лиганда, структурой своего комбинированного сайта может имитировать рецептор;

в) комбинированные сайты вторичных АТа_и, узнающих лиганд-связывающие сайты первичных антител, имитируют детерминанты лиганда;

г) эти АТа-и могут затем использоваться для идентификации рецептора.

Вследствие этого АТа_и могут имитировать лиганд в его связывании с рецептором (Marx, 1985). Поэтому АТа_и являются по сути антителами к рецептору и широко используются для изучения рецепторных белков животных (Gaulton and Greene, 1986; Meyer, 1990). В ряде работ этот метод был применен для выделения и изучения рецепторов фитогормонов (Hooley et al„ 1990; Каравайко и др., 1990; Kulaeva et al„ 1990; Prasad and Jones, 1991).

Рис. 4. Хроматография белков на фенил-сефарозе. Сплошная линия — профиль элюции белков (А-^хо). заштрихованные столбики — иммуноферментный анализ белков с АТа_ц (А|э^). Элюэнты: « — линейный градиент №С1 (4,0—0 М) в 20 мМ Трис-НС1, рН 7,7; Ь — 10 мМ Трис-НС1, рН 7,7; с — дистиллированная вода.

АТа_н были получены нами двумя способами. Для их выделения использовали: I) антисыворотку против зеатина после длительного периода иммунизации кролика; 2) сыворотку, полученную против моноспецифических иммуноглобулинов зеатина, очищенных на 2Я-сефарозе. Схема выделения и очистки АТа-и представлена на рис. 1.

Выделение зеатин-связывающего белка. Для выделения ЗСБ использовали цитозоль клеток листьев ячменя, полученный после центрифугирования при 160000д (2 ч ) и, следовательно, очищенный от всех структур, включая рибосомы (рис. 2). Экстракт освобождали от низкомолекулярных веществ гель-фильтрацией на сефадексе Г-50, затем фракционировали на колонке с фенил-сефарозой.

Тестированием белков в элюатах с помощью АТа_и в условиях твердофазного ИФА с иммобилизованным белком было обнаружено, что ЗСБ элюируются с фенил-сефарозы водой (рис. 4). Водная фракция белков после фенил-сефарозы была использована для последующей аффинной хроматографии ЗСБ.

Для того, чтобы выделить из листьев ячменя белок, специфически взаимодействующий с биологически активным природным цитокинином транс-зеатином, нами были синтезированы два аффинных сорбента — ZR-сефароза и Z-сефароза. Эти два аффинных матрикса различались по способу иммобилизации зеатина и поэтому могли дать различные результаты.

При получении ZR-сефарозы транс-зеатинрибозид был иммобилизован через рибозу в 9-м положении пуринового кольца. В этом случае активная часть зеатина была свободна для взаимодействия с белком. При получении Z-сефарозы иммобилизация транс-зеатина проходила через ОН-группу радикала, расположенного у аминогруппы б-го атома углерода пуринового кольца.что могло ограничить связь белка с молекулой зеатина, но вместе с тем обеспечивало более мягкие условия элюции белка с аффинного матрикса.

Применение обоих матриксов позволило выделить ЗСБ. Однако условия их элюции различались: с ZR-сефарозы белки элюировались в жестких условиях 0.2 М NaOH и в большом объеме (рис. 5), а в случае Z-сефарозы требовались более мягкие условия элюции I М NaCl. Щелочью с Z-сефарозы также элюировались ЗСБ (рис. 6).

Анализ фракций элюатов с аденин-сефарозы в системе твердофазного ИФА не выявил присутствия среди них белков, реагирующих с АТа-и- Белки, полученные на колонках Z-сефарозы и ZR-сефарозы, не взаимодействовали с преиммунной сывороткой и АТ;, не способными узнавать зеатин-связывающие сайты, но реагировали с АТа_и (рис. 7). Это указывает на специфичность взаимодействия АТа_и с белками, очищенными с помощью Z-сефарозы и ZR-сефарозы.

Исследование свойств выделенного ЗСБ. Важной задачей было выявление функциональной значимости полученных ЗСБ. Сотрудником лаборатории экспрессии генома растений (ИФР РАН) к.б.н. С. Ю. Селиванкиной было показано, что выделенные с помощью ZR-сефарозы и Z-сефарозы белки обладали способностью активировать транскрипцию в присутствии mpawc-зеатина в концентрации Ю-* М в системе синтеза РНК in vitro, содержащей связанную с хроматином РНК-полимеразу I из листьев ячменя. При этом активация синтеза РНК, вызываемая ЗСБ, была специфична по отношению к физиологически активным цитокининам (Karavaiko et al„ 1996: Kulaeva et а!.. 1996). Способность

Рис. 5. Хроматография белков из цитозоля листьев ячменя на 2Я-сефарозе Элюэнты: а — 1 М. №С1 в 50 мМ Трис-НС1. рН 8,8; 6 — 20 мМ Трис-НС1. рН 7,7; с — 200 мМ №ОН. Сплошная линия — профиль элюции белков (Адао), заштрихованные столбики — иммуноферментный анализ белков с АТа_и (А.^^)-

Ачзо 0.06 р

а *

0.04 -

0.02 -

О

Рис. 6. Хроматография белков из цитозоля листьев ячменя на 2-сефарозе. Обозначения как на рис. 5.

белков взаимодействовать с АТа_и полностью совпадала с их способностью активировать синтез РНК в присутствии транс-зеатина.

Анализ активных, взаимодействующих с АТа-и фракций, после сефарозы и г-сефарозы в условиях неденатурируюшего ПААГ-электрофореза

75 125

Объем элю пни. мл

А492

Рис. 7. Взаимодействие с антителами в системе твердофазного ИФА белков, выделенных из листьев ячменя при помощи различных аффинных сорбентов.

Представлена величина хромофорного ответа (А492). Белки выделены с помощью: (А) — гЯ-сефарозы, (В) — 2-сефарозы, (С) — аденин-сефарозы

кД 30 43 67 94 140 333 440 669

Рис. 8. Электрофорез ЗСБ после аффинной хроматографии в ПААГ в неденату-рирующих условиях. Гель окрашен Кумасси Я-250. Числами указаны положения белков-маркеров.

выявил единственный полипептид с молекулярной массой 67±2 кД, показав, что использование двух аффинных матриксов позволило выделить, по-видимому, один и тот же белок (рис. 8).

Гель-электрофорез в денатурирующих условиях белков, выделенных с

помощью обоих аффинных матриксов, выявил дуплеты полипептидов с молекулярными массами 67 ±2 кД и 64 ±2 кД (рис. 9).

1

2 3 ш

4

кДа

-94 -67

-43 -30

-20.1

-14.4

Рис. 9. Электрофорез в ДДС-ПААГ белковых фракций из листьев ячменя после аффинной хроматографии.

1,2 — белки, элюированные с г-сефарозы 1 М №С1 и 0.2 М №ОН соответственно;

3 — белки, элюированные с гЯ-сефарозы 0.2 М №ОН.

4 — белки-маркеры.

Рис. 10. Вестерн-блот ЗСБ, очищенного на 2Я-сефарозе, проявленный с помощью АТа_н. Ден-ситограмма препарата белка после ДДС-№-электрофореза.

Метод иммуноблоттинга с АТа-и после денатурирующего электрофореза продемонстрировал, что оба полипептида, выделенные с помощью 2-сефарозы и 2Я-сефарозы, обладают зеатин-связывающей способностью (рис. 10).

Чтобы выяснить функциональное значение каждого из этих белков (67 кД и 64 кД), нами были поставлены специальные эксперименты. Каждый из полипептидов был элюирован из геля после электрофореза в денатурирующих условиях, а затем ренатурирован.

Как показывают результаты, после ренатурации оба полипептида связыва-

лись с АТа-и в прямом твердофазном ИФА (табл. № I). В присутствии транс-зеатина оба полипептида активировали синтез РНК in vitro. Следовательно, оба полипептида специфически узнавали тракс-зеатин и формировали с ним комплекс, способный активировать транскрипцию.

Таблица 1.

Взаимодействие АТа-и в системе твердофазного ИФА с полипептидами 67 кД и 64 кД после ренатурации. Представлен хромофорный ответ при 492 нм.

Белки после ренатурации АТа-и Преиммунная сыворотка

1. 67 кД 0.894 0.022

2. 64 кД 0.750 0.026

3. 67 кД + 64 кД 0.660 0.020

Рис. 11. Электрофорез ЗСБ из цитозоля листьев ячменя в ПААГ в неденатурирующих условиях.

Белки после разделения в ДДС-ПААГ-электрофорезе элюированы из геля и рена-турированы. Гели окрашены нитратом серебра. Числами указаны положения белкоз-маркеров.

(1) — белок, выявлявшийся в ДДС-ПААГ-электрофорезе как полипептид 67 кД:

(2) — белок, выявлявшийся в ДДС-ПААГ-электрофорезе как полипептид 64 кД;

Каждый из ренатурированных полипептидов (64 кД и 67 кД) был проанализирован с помощью неденатурирующего ПААГ-электрофореза (рис. 11). Не только белок 67 кД, но и полипептид 64 кД был выявлен как единственный полипептид с молекулярной массой 67 кД. Эти результаты позволяют предполагать, что белок 64 кД является модифицированной формой белка 67 кД, которая выявляется только в присутствии ДДС-Ма.

Следующей задачей нашего исследования было изучение способности выделенного белка связывать трамс-зеатин. Определение цитокинин-

связывающей активности выделенного белка проводили с помощью высокоме-ченного трамс-зеатина методом осаждения сульфатом аммония.

1000

500

Рис. 12. Конкурентное связывание [лН\-транс-зеатина с ЗСБ из цитозо-ля листьев ячменя. В среду инкубации с [3Я]-трамо-зеатином (5.6 • 10~9 М) вносили 4 мкг белка и 30 мкг овальбумина в качестве соосадителя сульфатом аммония. Тест-система содержала: (1) — ЗСБ, овальбумин, [,!Я] транс-зеатин; (2) — ЗСБ, овальбумин, [-!Я]-тр«нг-зеатин, немеченый трикозеатин (2.5 • Ш-1 М); (3) — овальбумин. [:!Я]-тр«мг-зеатин. Чертой на рисунке обозначены величины стандартных ошибок (н = 3).

Результаты проведенных экспериментов представлены на рис. 12. Данные демонстрируют, что белок 67 кД связывал меченый зеатин из раствора с концентрацией 5.6 • 10~9 М. Избыток немеченого трамс-зеатина вытеснял тритированный транс-зеатин из его комплекса с ЗСБ, что приводило к уменьшению радиоактивности до уровня неспецифической адсорбции меченого зеатина овальбумином. Следовательно, связывание ЗСБ 67 с трамс-зеатином было специфическим и обратимым.

Изучение лигандной специфичности связывания цитокининов с белком. По существующим представлениям молекула активного цитокинина должна пространственно соответствовать акцепторному центру рецептора (Ку-лаева, 1973; Рахманинова, Ягужинский, 1981; ЛШзиЬага, 1990). В связи с этим модификации молекулы, изменяющие ее пространственные параметры и нарушающие это соответствие, могут приводить к снижению и даже уничтоже-

0

1

3

нию физиологической активности соединения. Поэтому при исследовании ЦСБ большое внимание уделяется изучению лигандной специфичности связывания цитокининов белком. При этом предполагается, что биологическая активность соединений должна коррелировать с их сродством к рецепторному белку.

Лигандная специфичность связывания выделенным белком цитокининов была исследована нами в системе твердофазного ИФА по способности соединений вытеснять АТа-и из их комплекса с ЗСБ.

-оо -10

9 -3 -7 1&[С].М

Рис. 13. Конкуренция между тракс-зеатином и АТа-и за образование комплекса с ЗСБ в системе твердофазного ИФА. ЗСБ иммобилизован на полистироловом планшете. (1) — контрольный уровень без добавления гормона; (2) — конкурентная кривая. Стрелкой указана концентрация гормона, вызывающая 50%-ное вытеснение АТа_и из их комплекса с ЗСБ.

2

Исследования проводили при постоянной концентрации иммобилизованного ЗСБ, которая была подобрана в специальных опытах. Введение транс-зеатина в широком диапазоне концентраций (от Ю-10 М до 10~° М) в тест-систему с иммобилизованным белком одновременно с АТа-н приводило к конкуренции АТа_„ с гормоном за образование комплекса с белком. Как видно из рис. 13, транс-зеатин вызывал снижение хромофорного ответа, и величина этого снижения строго зависела от концентрации добавленного гормона.

Чтобы получить информацию о специфичности связывания белка с тране-зеатином(нами был исследован ряд его структурных аналогов, проявляющих различную степень биологической активности. Кроме того нами была

исследована способность белка связывать гиббереллин (ГА^), ауксин (ИУК) и абсцизовую кислоту (АБК), поскольку важным критерием рецептора гормона является отсутствие его взаимодействия с другими гормонами.

Для сравнения способности различных соединений связываться с исследуемым белком были определены количества этих соединений, вызывающие 50%-ное (от максимального) вытеснение АТа-и из их комплекса с белком, (табл. № 2).

Таблица 2.

Лигандная специфичность ЗСБ из цитозоля листьев ячменя, исследованная в системе твердофазного ИФА с АТа-и к зеатину.

Химическое соединение Количество соединения, вызывающее 50%-ное вытеснение АТа_и из их комплекса с ЗСБ 67 (пкмоль)

трамг-зеатин 0.7 ±0.2

дигидрозеатин 22.5 ± 3.2

БАП 34.5 ± 8.5

зеатин-О-глюкозид 60.5 ± 13.8

цш'-зеатин 140 ± 12.2

аденин не действует

Г Ал, АБК. ИУК не действует

Как показали полученные данные, ЦСБ 67 высокоспецифично узнает природный тромс-зеатин. Гидрирование двойной связи в боковом радикале молекулы зеатина, отличающее дигидрозеатин от тпранс-зеатина, в 30 раз снижает сродство соединения к ЗСБ из листьев ячменя. Еще меньшим сродством к белку обладал синтетический БАП, который отличается от зеатина не только структурой радикала, но и его высокой гидрофобностью. Гликозилирование бокового радикала молекулы зеатина приводило к снижению сродства конъюгата к белку по сравнению с зеатином в 80 раз.

цис-зеатин /яракс-зеатин

Рис. 14. Модель внутримолекулярной инактивации цис-зеатина (Chen et al., 1993)

Важно, что цис-зеатин обладал еще меньшей аффинностью к ЗСБ. Это соответствует модели внутримолекулярной инактивации цис-зеатина, предложенной Ченом с сотр. на основании рентгеноструктурного анализа цис- и транс-зеатина (Chen et al.. 1993). Согласно этой модели, ОН-группа боковой цепи ^•ш'-зеатина может образовывать водородную связь с первым атомом азота пу-ринового кольца, что должно блокировать взаимодействие соединения с рецептором (рис. 14). Поэтому tfuc-зеатин является хорошим контрольным соединением для проверки специфичности взаимодействия транс-зеатина с белком.

Аденин — структурный аналог транс-зеатина, лишенный радикала, активностью в тест - системе не обладал. Другие гормоны — ГА:(, ИУК и АБК также не взаимодействовали с ЗСБ, что является важным критерием рецептора цитокининов.

Таким образом, результаты проведенных экспериментов, анализирующих сродство различных соединений к белку, соответствуют имеющимся сведениям о цитокининовой активности этих соединений. Полученные данные в совокупности с результатами, обсуждавшимися ранее, позволяют предполагать, что ЗСБ 67 является рецептором цитокинина в листьях ячменя, который опосредует действие цитокининов на клетки листа. В связи с этим предположением интересно было сравнить данные по взаимодействию соединений с белком с их активностью в задержке старения листьев ячменя.

Анализ соединений в биотесте по задержке пожелтения отрезков из листьев ячменя.

Биотест проводили в темноте. Результаты эксперимента представлены на рис. 15.

исходный уровень

- ЮМ

-ю"6м □-Ю"5м

БАЛ зеатнн- транс- яигидро- цис- аденлн

О-глюколнд .»еатнн зеаткм згаггин

Рис. 15. Влияние различных соединений на содержание хлорофилла в отрезках листьев ячменя в темноте.

За 100% принята оптическая плотность экстракта хлорофилла из отрезков листьев на воде. Чертой обозначена стандартная ошибка опыта (п. = 6).

Оценивая эти данные, необходимо учитывать, что результаты биотеста зависят не только от цитокининовой активности соединения, но и от его способности проникать в клетку, от скорости его разрушения, его влияния на синтез, разрушение и функционирование эндогенных цитокининов (Кулаева, 1973; Мок, 1994).

Наибольшую активность в задержке старения листьев проявлял БАЛ, что соответствует данным о его стабильности в растительных клетках в связи с тем, что он устойчив к действию цитокининоксидаз (Letham and Palm, 1983; Armstrong, 1994) и зеатин-О-глюкозид — конъюгат фитогормона, более стабильный, чем свободный гормон, который постепенно превращается в клетках в транс-зеатин (Letham and Paini, 1983; Мок and Martin, 1994; Kleczkowski. 1995).

Биотест не позволил выявить существенных различий в активности

транс- и tfuc-зеатина, поскольку цпс-зеатин способен превращаться в клетках в транс-изомер (Bassil et al., 1993; Мок and Martin, 1994). Известно, что насыщение двойной связи в радикале стабилизирует соединение (Letham and Palni, 1983; Jameson, 1994). Поэтому в биотесте не выражено различие активности транс-зеатина и дигидрозеатина. Как известно, аденин задерживает деградацию цитокининов и проявляет в силу этого цитокининовую активность в ряде биотестов (Кулаева, 1973; Matsubara, 1990). Это-выражено и в данном опыте. Другие гормоны практически не влияли на старение листьев.

Таким образом, сопоставляя данные по взаимодействию исследуемых соединений с ЗСБ и результаты биотеста, можно заключить, что взаимодействие соединений с белком совпадает с имеющимися в литературе сведениями о ци-токининовой активности этих соединений. С другой стороны, в биотесте мета-болизация цитокининов и их различная стабильность в клетках оказываются значительно более важными свойствами соединений, чем их истинная активность. Это убедительно демонстрирует невозможность корректного применения использованного нами биотеста в исследованиях связи структуры и функции соединений.

Заключение

Проделанная работа показывает, что в высокочувствительных к цитоки-нинам листьях ячменя присутствует растворимый зеатин-связывающий белок, который в комплексе с цитокинином непосредственно участвует в регуляции транскрипции. В присутствии транс-зеатина выделенный белок активировал элонгацию транскрипции в системе, содержащей РНК-полимеразу I, ассоциированную с хроматином из листьев ячменя. Полученный нами ЗСБ активировал также в присутствии транс-зеатина элонгацию транскрипции, осуществляемую РНК-полимеразой И, что было показано на ядрах, выделенных из листьев ячменя (Kulaeva et al., 1995, 1996). В связи с обсуждением этих результатов следует подчеркнуть, что по последним данным, полученным на животных системах, элонгация транскрипции является важным уровнем регуляции экспрессии генов (Jones et al., 1994; Kane, 1994; Yankulov et al., 1994).

На основании проделанной работы можно заключить, что ЗСБ 67 кД отвечает всем основным критериям рецептора цитокинина: 1) белок специфически и обратимо связывает [3Я]-трамг-зеатин и АТа_и против зеатина. ЗСБ 67 кД не взаимодействует с другими гормонами (АБК, ИУК. Г Аз); 2) сродство структурных аналогов /пранг-зеатина с белком соответствует совокупности сведений о цитокининовой активности этих соединений; 3) в присутствии гпринозеатина

в концентрации Ю-" М белок активирует синтез РНК в системе, содержащей хроматин и РНК-полимеразу из листьев ячменя: 4) белок был выделен из высокочувствительных к цитокинину листьев ячменя и воспроизводил in vitro характерное действие цитокинина in vivo — активацию синтеза РНК.

Следует отметить, что ранее из цитозоля листьев ячменя был выделен зеатин-связывающий белок 42-45 кД с неустановленной до настоящего времени функцией (Романов и др., 1986; Romanov et al., 1988; 1991) Учитывая сложность белковых комплексов, принимающих участие в регуляции взаимодействия стероидных гормонов животных с их рецептором и обеспечивающих регуляцию гормон-белковым комплексом транскрипции (Pratt, 1993), нельзя исключить, что различные ЗСБ окажутся функционально связанными в клетке.

Необходимо также понять взаимосвязь между ЗСБ 67 кД и белком 30 кД из цитозоля листьев ячменя, выделенным на основании аффинности этого белка к БАП и принимающим участие в активации транскрипции в присутствии БАЛ (Kulaeva et al., 1990). Мы допускаем, что этот белок может быть одним из доменов ЗСБ 67 кД. Однако для ответа на этот вопрос необходимо определение аминокислотных последовательностей этих полипептидов.

Важно отметить, что недавно из этиолированных проростков кукурузы был выделен растворимый ЗСБ, характеризующийся сходной с белком из листьев ячменя молекулярной массой и функциональной активностью и имеющий общие с ним иммунодетерминанты (Бровко и др., 1996; Karavaiko et al., 1996). Это дает основания предполагать, что существует семейство зеатин-связывающих белков, обладающих свойствами рецептора т/;«кг-зеатина, участвующего в цитокинин-зависимой регуляции транскрипции в растительных клетках.

Выделение из листьев ячменя цитокинин-связывающего белка 67 кДа со свойствами рецептора цитокинина открывает перспективу дальнейшего изучения механизма действия цитокинина в растительной клетке.

Выводы

1. Получены антиидиотипические антитела к зеатину, способные распознавать зеатин-связывающие сайты и позволяющие идентифицировать зеатин-связывающий белок и исследовать специфичность его взаимодействия с цито-кинином.

2. Подобрана процедура очистки ЗСБ из цитозоля листьев ячменя, включающая аффинную хроматографию с иммобилизованным природным цитокини-ном транг-зеатином.

3. В результате использования двух аффинных матриксов, полученных на основании иммобилизации транс-зеатина и его рибозида, выделен из цито-золя листьев ячменя белок 67 кДа в высокоочищенном состоянии, который в присутствии цитокинина активирует синтез РНК in vitro.

4. Обнаружено, что выделенный белок специфически и обратимо связывает [3Я]-7пракс-зеатин.

5. Исследована лигандная специфичность связывания белком 67 кДа природных и синтетических цитокининов.

6. Установлено, что белок не взаимодействует с другими фитогормонами: индолил-3-уксусной кислотой, абсцизовой кислотой и гиббереллином (ГАз).

7. Показано, что взаимодействие цитокининов и их производных с ЗСБ 67 точнее отражает цитокининовую активность соединений, чем биотест по задержке старения листьев ячменя, большое влияние на который оказывает стабильность соединений в клетках.

8. Полученные данные позволяют обсуждать растворимый ЗСБ 67 в качестве одного из рецепторов цитокинина в листьях ячменя, который принимает участие в регуляции цитокинином транскрипции.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Каравайко Н. Н., Селиванкина С. Ю., Земляченко Я. В., Кулае-ва О. Н. — Выделение и очистка зеатин-связывакшего белка со свойствами рецептора цитокининов // Труды II Российского симпозиума «Новые методы биотехнологии растений» (18-20 мая 1993, Пущино), Пушино, 1993, с. 81.

2. Каравайко Н. Н., Селиванкина С. Ю., Земляченко Я. В., Кулае-ва О. Н. — Выделение и характеристика зеатин-связываюшего белка со свойствами рецептора цитокининов // Тезисы докладов III съезда Всероссийского общества физиологов растений (24-29 июня 1993, Санкт-Петербург), Санкт-Петербург, 1993, т. 1, с. 23.

3. Каравайко Н. Н., Земляченко Я. В., Селиванкина С. Ю., Кулае-ва О. Н. — Выделение из цитозоля листьев ячменя зеатин-связывающего белка, участвующего в активации транс-зеатином синтеза РНК in vitro // Физиология растений, 1995, т. 42, № 4. с. 547-554.

4. Karavaiko N. N.. Zemlyachenko Ya. V., Selivankina S. Yu., and Kulae-va 0. N.—Isolation and features of a zeatin-binding protein from barley leaf cy-tos.<ol // Abstracts of International Symposium on Plant Hormone Signal Perception and Transduction (September 4-10. 1994. Moscow), Moscow, 1994. p. 28.

5. Kulaeva O. N.. Karavaiko N. N.. Selivankina S. Yu., Moshkov I. E.. Noviko-va G. N.. Zemlyachenko Ya. V., Yakovleva L. A., and Shipilova S. V. — Cytokinin Signalling Systems: From the Whole Plant to the Molecular Level // Abstracts of International Symposium on Plant Hormone Signal Perception and Transduction (September 4-10, 1994, Moscow), Moscow, 1994, p. 39.

6. Kulaeva O. N.. Karavaiko N. N.. Selivankina S. Yu., Zemlyachenko Ya. V., Shipilova S. V. — Receptor of irarw-zeatin involved in transcription activation by cytokinin // FEBS Letters, 1995, № 366, p. 26-28.

7. Kulaeva O. N.. Karavaiko N. N.. Selivankina S. Yu., Zemlyachenko Ya. V., Shipilova S. V. — Zeatin-binding proteins involved in transcription activation by cytokinin // Abstracts of 15th International Conference on Plant Growth Substances (14-18 July, 1995,Minneapolis), Minneapolis, 1995, p. 204.

8. Kulaeva O. N., Karavaiko N. N.. Selivankina S. Yu., Moshkov I. E„ Noviko-va G. N.. Zemlyachenko Ya. V., Shipilova S. V and Orudgev E. M. — Cytokinin signalling systems: From a whole plant to the molecular level // Plant Hormone Signal Perception and Transduction / Eds Smith A. R., Berry A. W„ Harpham N. V. J.. Moshkov I. E., Kulaeva 0. N. and Hall M. A.. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, 1996, p. 57-65.

9. Karavaiko N. N„ Selivankina S. Yu., Brovko F. A., Zemlyachenko Ya. V., Shipilova S. V., Zagranichnaya T. K., Lipkin V. M., and Kulaeva O. N. — Zeatin-binding proteins participating in cytokinin-dependent activation of transcription // Plant Hormone Signal Perception and Transduction / Eds Smith A. R.. Berry A. W„ Harpham N. V. J.. Moshkov I. E„ Kulaeva 0. N. and Hall M. A.. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, 1996, p. 67-75.

10. Kulaeva 0. N„ Karavaiko N. N.. Selivankina S. Yu., Zemlyachenko Ya. V. — Zeatin receptor involved in transcription regulation // Plant Molecular Biology, Genetics and Biotechnology. German — Russian Cooperation in Biotechnology, Workshop IV: Abstracts. St.-Petersburg, 1996, p. 10.