Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение и характеристика цитокинин-связывающего белка из этиолированных проростков кукурузы, участвующего в регуляции транскрипции

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Выделение и характеристика цитокинин-связывающего белка из этиолированных проростков кукурузы, участвующего в регуляции транскрипции"

На правах рукописи УДК 577.112.083;577.175.142;57~7.214.32 ч

БРОВКО ФЕДОР АЛЕКСАНДРОВИЧ

ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ЦИТОКИНИН-СВЯЗЫВАЮЩЕГО БЕЛКА ИЗ ЭТИОЛИРОВАННЫХ ПРОРОСТКОВ КУКУРУЗЫ, УЧАСТВУЮЩЕГО В РЕГУЛЯЦИИ ТРАНСКРИПЦИИ.

Специальность 03. 00. 04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ПУЩИНО- 1996

рV Б ОД

Работа выполнена в Филиале Института биоорганической химии им акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, РАН

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор

доктор химических наук, профессор

Ольга Николаевна Кулаева Валерий Михайлович Липкин

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

доктор биологических наук

Ярослав Иванович Бурьянов Владимир Мамедович Вагабов

Ведущая организация:

НИИ Сельскохозяйственной биотехнологии, Российская Академия Сельскохозяйственных наук, Москва

Защита диссертации состоится: 10 июня 1996 г. в 11 час. 30 мин. на заседании ученого совета Д 200.29. 01 при Институте почвоведения и фотосинтеза РАН по адресу: 142292, Московская область, г. Пущино.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института почвоведения и фотосинтеза РАН.

Автореферат разослан 7 мая 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук

/

Б.Н. Иванов

Общая характеристика работы.

Актуальность проблемы. Цитокинины являются гормонами растений, участвующими в регуляции таких важнейших процессов, как деление клеток, дифференцировка побегов, задержка старения листьев, устьичные движения, ответ растения на стресс и многое другое (Skoog and Miller, 1957; Кулаева, 1973,1982,1995; Matsubara, 1990).

В связи с этим очевидна теоретическая и практическая значимость исследований механизма их действия. Центральной задачей этой проблемы является исследование рецепторов цитокининов, с помощью которых растительные клетки воспринимают и передают гормональный сигнал, индуцируя цепь событий, определяющих ответ клеток на данный фитогормон (Кулаева, 1995).

Поскольку цитокинины, как и все другие гормоны растений, полифункциональны, то до сих пор не известно, регулируются ли цитокининами разные физиологические программы с помощью разных рецепторов или во всех случаях гормональный сигнал воспринимается одним рецептором, а затем передается на различные системы, что и определяет многообразие возможных ответов клетки на гормон.

В настоящее время известно большое число цитокинин-связывающих белков (ЦСБ) (Кулаева, 1982, 1995; Romanov et al„ 1990; Brinegar, 1994). Однако функциональная активность гормон-рецепторных комплексов для большинства ЦСБ не установлена, что затрудняет их оценку в качестве рецепторных белков. Исключение в этом отношении составляет выделенный в последнее время из цитозоля листьев ячменя зеатин-связывающий белок с молекулярной массой 67кД (ЦСБ-67) (Каравайко и др., 1995; Kulaeva et al., 1995), который, подобно рецепторам стероидных гормонов животных, принимает участие в гормон-зависимой регуляции транскрипции.

Упомянутый выше функционально активный рецептор цитокинина был выделен из закончивших рост листьев ячменя, у которых цитокинин задерживает старение, не вызывая деления клеток, их роста или каких-либо процессов дифференцировки (Каравайко и др., 1995). Мы поставили своей задачей проверить, присутствует ли подобный рецепторный белок в совершенно иной биоло-

гической системе - побегах пятидневных этиолированных проростках кукурузы, состоящих из колеоптиля и заключенного в него первого листа (рнс.1). В такой системе происходит активное деление и рост клеток. Поэтому функция цитоки-нина в этиолированных проростках должна отличаться от функции этого гормона в закончивших рост листьях. Заранее трудно было предсказать, обнаружим ли мы в этиолированных проростках кукурузы рецептор цитокинина близкий по свойствам к рецептору из зрелых листьев ячменя. Этот вопрос нуждался в экспериментальной проверке.

Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в том, чтобы изучить, присутствует ли рецептор цитокинина в цитозоле клеток этиолированных проростков кукурузы. В связи с этим в задачу работы входило: разработать метод выделения ЦСБ из этиолированных проростков кукурузы, охарактеризовать цитокинин-связывающие свойства выделенного белка и выяснить, участвует ли он в регуляции цитокинин-завйсимой транскрипции.

Научная новнзна. Впервые из этиолированных проростков кукурузы выделен ЦСБ молекулярной массой 70 кД (ЦСБ-70). Разработано две схемы выделения этого белка. Обе схемы имеют препаративный характер и включают в себя оригинальные методы отделения белков от вторичных метаболитов растительной клетки. Выделение белка в чистом виде проводилось с использованием аффинной хроматографии на иммобилизованном зеатинрибозиде. Показано, что ЦСБ-70 специфически и обратимо связывает активные цитокинины. Белок узнается антиидиотипическими антителами, полученными на антитела к зеати-ну и взаимодействующими с зеатин-связывающим белком из ячменя. Изучено влияние ЦСБ-70 на цитокининзависимую РНК полимеразную реакцию в системе, содержащей хроматин из листьев ячменя. Показано, что ЦСБ-70 активирует синтез РНК в этой системе в присутствии зеатина в физиологически активной концентрации. Кроме того, выяснено, что ЦСБ-70 из этиолированных проростков кукурузы по всем изученным параметрам аналогичен ЦСБ-67 из ячменя и эти два белка являются представителями семейства рецепторов цитокинина в злаках.

Практическая значимость. Данные, полученные в результате проведенных исследований, имеют, прежде всего, ценность для фундаментальной науки, поскольку позволяют сделать вывод о существовании семейства рецепторов ци-токинина, участвующих в гормон-зависимой активации транскрипции. Это открывает перспективу детального изучения молекулярных механизмов гормон-рецепторных взаимодействий в растительной клетке.

С использованием предложенных в этой работе схем очистки ЦСБ-70 проводится выделение белка для структурных и иммунохимических- исследований. Разработанные методы разделения белков и вторичных метаболитов в растительном экстракте могут применяться в процессе выделения любых водорастворимых растительных белков как в аналитическом, так и в препаративном масштабе.

Апробация диссертационного материала. Материалы диссертации были представлены на международной конференции по рецепции и трансдукции гормональных сигналов у растений (Москва, 1994 г.) и на рабочем совещании INTAS (Москва, 16 марта 1996 г.).

Объем н структура работы. Диссертация изложена на 110 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, методического раздела, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитированной литературы.

Экспериментальные данные представлены в виде 22 рисунков и 4 таблиц.

Содержание работы.

Материалы и методы.

Для выделения ЦСБ-70 брали пятидневные этиолированные проростки кукурузы (Zea mays L.) сорта "Эльбрус", выращенные на влажной фильтровальной бумаге в темноте при +27°С. У проростков отделяли колеоптиль и заключенный в него первый лист (рис.1). Все работы по выделению ЦСБ-70 проводили при температуре +4°С.

Гомогенизацию растительного материала проводили в буфере "А" (50 мМ KCl, 2 мМ ЭДТА, 2 мМ MgCh, 20 мМ Трис-HCl, pH 8,0), содержащего 0,5 мМ фенилметансульфонилфторид (ФМСФ) и 8 мМ ß-меркаптоэтанола. в гомогенизаторе "Waring blender" (США). Все растворы для хроматографий делали на основе буфера "А".

Схемы выделения ЦСБ-70 представлены на рис.2 и рис.3. Их разработка входила в экспериментальную задачу нашей работы.

КоЛМШТМЛЬ +

Скручанным лист

- Миокотнль

Использовали для выделения ЦСБ-70

Рис. (.Этиолированный проросток кукурузы в возрасте 5 дней, использованный для выделения ЦСБ-70.

>

Концентрацию белка определяли по методу Bradford, используя сывороточный альбумин человека в качестве стандарта.

Аналитический гель-электрофорез проводили в системе Laemmli в градиенте ПААГ 7 - 20% в присутствии додецилсульфата натрия (ДДС-Na).

Цитокинин-связывающую активность определяли как разницу между тотальным и неспецифическим связыванием исследуемыми белками [3Н]дигидрозеатина ("Amersham", Великобритания, удельная радиоактивность 1,27 ГБк/мкмоль) в тесте с преципитацией гормон-белкового комплекса сульфатом аммония.

Антиидиогипические антитела получали путем иммунизации кроликов моноспецифическими антителами к транс-зеатинрибозиду.

Действие ЦСБ и транс-зеатина на активацию транскрипции in vitro проверяли в системе, содержащей РНК-полимеразу I, ассоциированную с хроматином из листьев ячменя (Селиванкина и др., 1982).

Рис.2. Схема выделения цитокинин- Рис. 3. Схема выделения цитокинин

связывающего белка из этиолированных связывающего белка из этиолированных про проростков кукурузы по методу I. ростков кукурузы по методу 2.

Гомогенизация растительного материала Фракционирование сульфатом аммония

I

Гидрофобная хроматография на Тоуореаг1 Н\У60

I

Хроматография на сефадексе 61-25

*

Аффинная хроматография на аденозин- Тоуореаг1

I

Аффинная хроматография на

зетинрибозид- Тоуореаг!

_*_____

Цнтокинин-связывающнй белок |

Гомогенизация растительного материала

I

Хроматография на сефадексе (х-25

I

Ионообменная хроматография на ДЭАЭ сефарозе

I

Гель-фильтрация на сефакриле 8200

4

Аффинная хроматография на аденозин- Тоуореаг1

Аффинная хроматография на зетинрибозид- Тоуореаг1

-1.

Цитокинин-связывающий белок

Результаты н их обсуждение.

Известно, что содержание рецепторных белков в клетке, как животной, так и растительной, очень мало. В связи с этим трудно выделить такой белок в количестве, достаточном для серьезных исследований его структуры и функции. Особенно сложно это сделать для рецепторных белков растений, так как растительная клетка, в отличие от животной имеет твердую клеточную стенку и со-

держит много вторичных метаболитов, вызывающих инактивацию белков в процессе гомогенизации растительного материала.

Методы выделения цитокинин-связывающих белков из листьев злаков, предлагавшиеся ранее, как правило, достаточно трудоемки и позволяют получить лишь малые количества белка, недостаточные для изучения его структурно-функциональных свойств.

Для получения ЦСБ из этиолированных проростков кукурузы в препаративном масштабе нами разработаны две схемы выделения этого белка (рис. 2 и 3). Главные отличия предложенных схем от описанных ранее заключаются в использовании оригинальных методов отделения белков от вторичных метаболитов и применении аденина в качестве аффинного лиганда для дополнительной очистки белка, предшествующей выделению ЦСБ с помощью аффинной хроматографии на иммобилизованном зеатинрибозиде.

1. Разработка методических подходов для отделения растительных фе-Н0ЛЫ1ЫХ соединений от белков.

Вторичные метаболиты растений являются значительной помехой при выделении белков из растительных экстрактов. В особенности это справедливо для фенольных соединений. Эта группа ароматических соединений весьма реак-ционноспособна, и в некоторых случаях является причиной необратимой модификации белков. Быстрое удаление "фенолов" из растительного экстракта может значительно ускорить и облегчить процесс выделения белков и, что особенно важно, устранить одну из возможных причин их модификации и/или деструкции.

Первый из предлагаемых нами методов отделения белков от "фенолов" заключается в фракционировании растительного экстракта сульфатом аммония (СА) в присутствии небольшого количества полиэтиленгликоля (ПЭГ)- При добавлении ПЭГ в суспензию растительного экстракта в растворе СА происходит разделение экстракта на три фракции с разной плавучей плотностью. Верхняя фракция содержит суммарные вторичные метаболиты растений, средняя фракция содержит небольшое количество белка и фенольных соединений, и осадок, в котором находится белок с не значительным количеством фенольных соедине-

ний (рис.4). Фенольные соединения, находящиеся в осадке белка, легко удаляются при обессоливании на сефадексе 0-25, а ПЭГ отделяется от белка на ионообменном носителе. Этот метод позволяет провести процедуру отделения белков от "фенолов" в течении одних суток. Мы определили влияние молекулярной массы ПЭГ (рис.5), рН (рис.6) и времени инкубирования (рис.7) на образование осадка и наличие в осадке бежа и фонолъных соединений.

о

Рис. 4. Разделение фенольных соединений и белков при фракционировании растительного экстракта СА в присутствии ПЭГ. А -исходная смесь: растительный экстракт + СА + ПЭГ до центрифугирования и Б - после центрифугирования. Спектры в ультрафиолетовой и видимой области: 1- исходная смесь, 2 - верхняя пленка вторичных метаболитов, 3 - интерфаза и 4 - осадок.

мг/мл Исходный

экстракт

400 600 1000 1500 2000 3000 4000 6000 1000 10000 15000 20000

Молекулярная масса ПЭГ

Рис. 5. Влияние молекулярной массы ПЭГ на содержание белка и растительных фенольных соединений в осадке. По оси ординат - содержание белка и растительных фенольных соединений в осадке в мг/мл.

мг/мл

Рис. 6. Влияние рН среды на процесс отделения вторичных метаболитов от белков. По оси ординат - содержание белка и растительных фенольных соединений в осадке в мг/мл.

мг/мл

7 6 5 4 3 2 1 О

1.2 4 6 8 10 12 14 16 18

время (час.)

Рис.7. Влияние времени ннкубации растительного экстракта с СА и ПЭГ на содержание белка и растительных фенольных соединений в осадке. По оси ординат - содержание балка и растительных фенольных соединений в осадке в мг/мл.

В результате мы показали, что наилучший результат дают полиэтилен-гликоли с молекулярной массой 4000 - 6000 далътон. Процесс отделения фенольных соединений от белков зависит от времени инкубации и рН среды. Большее количество белка в осадке при одновременном низком содержании фенолов достигается при значениях рН, близких к нейтральным.

Полное удаление вторичных метаболитов и ПЭГ происходило после хроматографии на ДЭАЭ-сефарозе. В результате была получена фракция белков с высокой цитокинин-связываюшей активностью (табл. I).

Кроме того, следует отметить, что аналогичные результаты были получены при измерении распределения ферментативной активности пероксидазы и фосфатазы (табл.2).

Для пероксидазы при увеличении времени инкубации смеси происходило незначительное перераспределение активности - уменьшение в осадке и появление в средней фазе. Возможно, это связано с взаимодействием пероксидазы с

агрегированными "фенолами", находящимися в средней фазе и являющимися субстратами пероксидазы.

Таблица 1.

Цитокннин-связывающая активность (срт/мии), определенная методом преципитации гормон-рецепторного комплекса сульфатом аммония (в качестве меченого гормона использовали [3Н]дигидрозеатин).

Исходный экстракт не определяется

Верхняя фаза не определяется

Средняя фаза 487±26

Осадок 11385±38

Таблица 2.

Распределение ферментативной активности пероксидазы и фосфатазы по фазам, полученным при центрифугировании. Представлена удельная активность ферментов (Е/мл суспензии).

Пероксидаза Фосфатаза

Исходный экстракт 0.091+0.01 0.028+0.007

Верхняя фаза 0.09±0.01 0.005+0.002

Средняя фаза 0.15±0.03 0.025±0.005

Нижняя Фаза 3.24+0.12 0.4+0.008

Исходя из этих данных, можно рассматривать предложенный метод как универсальный, то есть пригодный для использования в процессе выделения не только ЦСБ-70, но и других водорастворимых белков растительного экстракта.

Помимо этого мы показали возможность успешного разделения белков и "фенолов" с помощью гидрофобной хроматографии на ТоуореаН Н\У60. В процессе этой хроматографии происходит эффективное отделение белков от фе-нольных соединений с одновременной существенной очисткой ЦСБ. Тоуореаг!

Н\У60 хорошо сорбирует как белки, так и фенольные соединения. Расштельный экстракт предварительно фракционировали СА (35% от насыщения), центрифугировали и наносил! на колонку с ТоуореаН. Элюируемый материал затем анализировали как на наличие цитокинин-связывающей активности, так и присутствие фенольных соединений, так как мы старались получить фракции, одновременно содержащие наибольшее количество ЦСБ и наименьшее - "фенолов". Обнаружено, что для простого отделения на Тоуореаг1 Н\У60 всей суммы растительных белков от "фенолов" достаточно провести хроматографию на колонке длиной 20 - 30см (рис. 8 и рис.9), а при использовании колонки длиной 60-100 см), происходит не только отделение "фенолов", но и существенная очистка ЦСБ (рис.10).

О

(NN4)2804,%

280

1.5

1.0

40

20

0

0

25 50 75

Номер фракций

Рис.8. Хроматографическое разделение растительного экстракта на колонке с носителем Тоуореаг1 НУ»'60 размером 10x20 см (элюция градиентом СА 40-10% от насыщения). А,Б и В - белковые пики.

200

320

440 Я. ,нм

Рис. 9. Спектры поглощения элюата белков (колонка 10x20 см с носителем Тоуореаг1 Н\У60), градиент СА 40-10% от насыщения. 1 - растительный экстракт до хроматографии, 2 -элюат с колонки (фракция В).

Рис. 10. Отделение белков от фенольных соединений растительного экстракта и очистка ЦСБ-70 гидрофобной хроматографией на Тоуореаг1 Н'Л' 60. 1 - поглощение при 280 нм, 2 - цитокинин-свяэываюшая активность (ерш). А, Б, В - белковые пики, Г - пик фенольных соединений.

Таким образом, хроматография на Toyopearl HW60 (на длинной колонке) была выбрана в качестве одного из основных этапов очистки ЦСБ-70. Этот этап непосредственно предшествовал аффинной хроматографии на иммобилизованном лиганде. Поскольку элюцию с Toyopearl HW60 проводили градиентом СА, то перед аффинной хроматографией применяли хроматографию на сефадексе G25 для обессоливания белкового препарата.

2. Выделение ЦСБ-70 с помощью аффинной хроматографии.

Как известно, одним из наиболее эффективных методов очистки индивидуальных белков, имеющих сродство к определенному лиганду, является аффинная хроматография с использованием иммобилизованного лиганда.

Мы решили использовать зеатинрибозид в качестве лиганда для синтеза аффинного сорбента. Носителем для иммобилизации лиганда был выбран Toyopearl HW65, так как он обладает низкой неспецифической сорбцией и превосходит другие носители, использующиеся для аффинной хроматографии, по механической прочности, химической инертности и продолжительности эксплуатации.

Цитокинины пуринового ряда, к которым принадлежит зеатинрибозид, являются производными аденина, имеющими гидрофобный радикал в 6 положении пуринового кольца. Растительная клетка содержит большое количество белков, использующих производные аденина как субстрат или кофактор. Таким образом, белки, которые взаимодействуют в клетке с аденином и его производными, могут взаимодействовать и с зеатинрибозидом во время аффинной хроматографии. Поэтому в нашей методике для предварительного удаления аденин-связывающих белков аффинной хроматографии на зеатинрибозид-Тоуореаг1 (Zr-Т) предшествовала хроматография на аденозин-Тоуореаг1 (Ado-T) (рис. 11).

Емкость колонки с иммобилизованным аденозином была в 500-1000 раз выше, чем емкость колонки с зеатинрибозидом, что достигалось, в основном, за счет увеличения количества иммобилизованного аденозина на единицу объема сорбента.

2.0 -

1.5

1.0 -

0.5 -

№ фракций

Рис.11. Аффинная хроматография на аденозин-Тоуореаг1. 1- белки, не связавшиеся с носителем, 2 - элюат 1М раствором КаС1, 3 - элюат 200мМ раствором КаОН. Заштрихованные столбики - цитокинин-связывающая активность белковых фракций.

Рис. 12. Аффинная хроматография на зеатинрибозид - Тоуореаг!. I - несвязав-шийся материал, 2 - элюат 1М раствором КаС1, 3 - элюат 50 мМ КаОН. Заштрихованный столбик - связывание белком [ЗН)-дигидрозеатина.

Для последующей хроматографии на Zт-T брали фракцию "проскока" (пик № 1 на рис. 11) с колонки Аёо-Т. Элюцию белков с колонки 7г-Т проводили как с использованием избытка синтетического аналога зеатина БАП в концентрации 5х10'5 М, так и с помощью 50 мМ Ь'аОН. Оказалось, что при элюции БАП существенной проблемой является регенерация носителя, которая очень трудоемка. Полная регенерация достигалась при промывке колонки 100 - 500 объемами 20% этилового спирта в 25 мМ К'аОН. Этих проблем не возникало при элюции щелочью. Поэтому мы остановились на 50 мМ ЫаОН (рис.12), тем более, что белки, полученные в результате обоих способов элюции по всем изученным параметрам не различались.

Проведение предварительной хроматографии на А<1о-Т способствовало существенной очистке ЦСБ-70, но, очевидно, снижало его выход. Как показывает рис. 11, цитокинин-связывающая активность белков, элюируемых с Ас1о-Т (пик № 3) составляла примерно 30% от цитокинин-связывающей активности ЦСБ-70, злюируемого с колонки Хг-Т (рис.12, пик № 3).

3. Электрофоретическин анализ ЦСБ-70 после аффинной хроматографии на 7.г-Т.

Рис. 13. Электрофоретическин анализ (7-20% ПААГ-ДСС-Ыа) препарата ЦСБ после аффинной хроматографии на ZI-^. 1- препарат после осаждения белка 7,5% трихлоруксусной кислотой, 2 - препарат после ультрафильтрами» на мембране УМ-10, 3 - препарат, полученный как в случае 2, но после хранения в течении месяца при -20° С и осаждения этанолом, Цифрами обозначены молекулярные массы стандартных белков-маркеров в кД.

В результате электрофоретического анализа ЦСБ-70 после аффинной хроматографии было обнаружено, что после осаждении элюата 7,5% трихло-

руксусной кислотой препарат содержал полипептид с молекулярной массой около 70кД и дополнительный минорный компонент 65-66кД (рис. 13-1). При нейтрализации элюата 300 мМ ацетатным буфером рН 5,7 с последующим концентрированием белка на мембранах УМ-10 и осаждением метанолом происходило снижение содержания полипептида 70кД и увеличение количества полипептида с меньшей молекулярной массой (рис. 13-2). При длительном (около месяца) хранении белка под этиловым спиртом при -20°С происходило его разрушение с образованием большого числа полипептидов с меньшей молекулярной массой (рис. 13-3).

Для подавления возможно присутствующей в выделяемом препарате про-теолитической активности мы использовали ряд ингибиторов протеаз (ФМСФ -1мМ, иодацетамид - 2мМ, 1,10-фенантролин - 2 мМ) , как вместе, так и по отдельности. Однако деструкция белка сохранялась. Это говорит в пользу автоли-тического процесса.

Таким образом, после аффинной хроматографии на Zr-T нам удалось получить высокоочищенный препарат ЦСБ-70, который, однако разрушался в результате некоего автолитического процесса с образованием полипептидов меньшей молекулярной массы. Вероятно, ЦСБ-70 разрушается в отсутствии стабилизирующего влияния других белков растительного экстракта и/или кофакторов небелковой природы.

4. Выделение ЦСБ-70 при помощи второй схемы, включающей гель-фильтрацию на сефакриле 8200.

Используя первую схему выделения, мы получали низкий выход ЦСБ-70 Возможно, это объяснялось разрушением бежа на стадиях, предшествующих аффинной хроматографии с иммобилизованым гормоном. Поэтому схема выделения была изменена таким образом, чтобы, по возможности, исключить все факторы и условия, приводящие к деструкции белка (см. рис. 3). В первую очередь мы устранили те процедуры выделения, которые сопряжены с действием высоких концентраций соли, так как, например, для рецептора стероидных гормонов показано, что в присутствии высокой ионной силы происходит отделение рецептора от связанных с ним кофакторов белковой и небелковой природы, и

как следствие, уменьшение выхода рецепторного белка. Во второй схеме выделения было исключено фракционирование белка CA. После центрифугирования растительного гомогената экстракт наносили на колонку с сефадексом G25, где происходило отделение вторичных метаболитов. Далее использовали ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-сефарозе. Белковую фракцию элюировали буфером, который содержал 200мМ KCl. Затем проводили гель-фнльтрацию на сефакриле S200. Белки с цитокинин-связывающей активностью элюировались при этом узким пиком, а объем элюата всего в 4 - 6 раз превышал объем наносимого образца. Суммарная цитокинин-связывающая активность при этом даже несколько возрастала (рис. 14).

Полученный таким путем препарат был использован для хроматографии на Zr-T без предварительного осаждения CA.

Рис. 14. Гель-фильтрация белков на сефакриле 5200. Сплошная линия - поглощение при 280нм, столбиками представлена цитокинин-связывающая активность.

В результате мы получили ЦСБ-70, аналогичный тому, который выделили по первой схеме, но выход белка при использовании второй схемы выделения

был значительно выше, чем при выделении по первой схеме. В этом большое преимущество второй схемы выделения.

Следует подчеркнуть, что выделенный по обоим схемам белок при гель-электрофорезе в денатурирующих условиях обнаруживал основной полипептид 70 кД и минорный полипептид 65-66 кД Кроме того, при обоих способах выделения белок проявлял одинаковую функциональную активность.

5. Функциональные свойства ЦСБ-70.

Как известно, аффинная хроматография на иммобилизованном гормоне позволяет выделить гормон-связывающие белки, к которым, кроме рецептор-ных белков относятся также ферменты, участвующие в метаболизме гормона, а также возможные транспортные белки. Поэтому необходимы специальные доказательства того, что гормон-связывающий белок является рецептором.

Один из обязательных критериев рецептора состоит в том, что он связывает гормон специфически и обратимо. В наших опытах по связыванию ЦСБ-70 РН]-дигидрозеагина было установлено, что меченый цитокинин на 100% вытеснялся немеченым дигидрозеатином в концентрации 5хЮ 7М (см. рис.15).

Немеченый дигидрозеатин снижал радиоактивность пробы до уровня неспецифической сорбции меченого соединения овальбумином, который добавляли для более полного осаждения белка СА, следовательно ЦСБ-70 связывал цитокинин специфически и обратимо.

Другой тест заключался в проверке способности полученного препарата взаимодействовать с антиидиотипическими антителами, полученными на антитела против зеатина и взаимодействующими с зеатин-связывающим белком (АТа-н). Нами были проанализированы фракции, полученные при элюции белка с Zг-T и показано, что кривая взаимодействия белка с АТа.„ совпадала с профилем элюции ЦСБ-70 и с данными по связыванию им меченого гормона (рис.16, сравни рис. 12). При этом было обнаружено, что тест, основанный на взаимодействии ЦСБ-70 с АТа-и значительно чувствительней, чем тест по связыванию белком [3Н] дигидрозеатина.

Рис. 15. Взаимодействие ЦСБ-70, выделенного аффинной хроматографией на зеатинрибозид Тоуореаг! с [3 Н]- дигирозеатином.

1. ЦСБ (10 мкг на пробу) + [3 Н]- ди-гирозеатин + овальбумин (15 мкг на пробу).

2. ЦСБ (10 мкг на пробу) + р Н]-дигирозеатин + 5x1 (ИМ дигидрозеа-тин.

3. Овальбумин + [' Н]-дигидрозеатин.

Рис. 16. Взаимодействие фракций элюата с колонки Zг■T с антиидиотипически-ми антителами (показано столбиками).

Одной из наиболее важных биологических функций цитокининов является активация биосинтеза РНК и белка в растительной клетке. Как упоминалось во введении, рецептор цитокинина, выделенный из закончивших рост листьев ячменя, участвовал в активации синтеза РНК цитокннином, что было показано

Активация синтеза РНК (%)

250

200

150

Рис.17. Активация сйнтеза РНК in vitro ЦСБ-70

100

в присутствии транс-зегпит

50

(Ю-'М).

0

О

400

800

1200

Белок, нг/образец

в системе, содержащей ядра или хроматин и РНК-полимеразу из листьев ячменя. Поэтому мы проверили активность выделенного из этиолированных проростков кукурузы ЦСБ-70 в системе синтеза РНК in vitro, полученной из листьев ячменя. При этом было показано, что ЦСБ-70 активирует в присутствии транс-зеатина синтез РНК in vitro в системе, содержащей хроматин и РНК-полимеразу из листьев ячменя.

Активирующее действие белка проявлялось при его добавлении в реакционную среду в концентрации 400-1200 нг и составляло 200% от контроля (рис.17). Белок активировал синтез РНК в присутствии транс-жлтт в концентрации )0 8М (рис.18). Активация составляла 200-250% в диапазоне концентраций транс-зеатина от 10 8 до 10 6М. Эти данные являются доказательством того, что ЦСБ-70 из этиолированных проростков кукурузы функционально активен и участвует в комплексе с цитокинином в активации транскрипции, а, следовательно, представляет собой рецептор цитокинина. Его активность в системе синтеза РНК, содержащий хроматин и РНК-полимеразу из листьев ячменя, показывает, что белок функционально тождественен рецептору цитокинина, выделенному ранее из зрелых, закончивших рост листьев ячменя (Каравайко и др., 1995; Kulaeva et al., 1995).

Активация синтеза РНК (%)

300 2S0 200 150 100 50 0

Рис.18. Активация синтеза РНК in vitro ЦСБ-70 при добавлении в среду транс-геатта. в концентрации от 108 до 10-6М.

У/-'-■-'

-8-7-6

Концентрация зеатина (logM)

Заключение.

Таким образом, мы приходим к выводу, что рецепторы цитокинина с близкой молекулярной массой и одинаковой функциональной активностью присутствуют не только в клетках листьев ячменя, закончивших рост, но и в этиолированных проростках кукурузы, для которых характерны деление и рост клеток.

Существенно, что рецептор цитокинина из проростков кукурузы узнается системой, содержащей хроматин и РНК-полимеразу из листьев ячменя. Это подчеркивает отсутствие видовой специфичности выделенных рецепторных белков и позволяет заключить, что в растениях присутствует класс родственных цитокининовых рецепторов, которые, подобно рецепторам стероидных гормонов животных, непосредственно участвует в регуляции транскрипции. Это не исключает возможности присутствия в клетках растений и других рецепторных белков, участвующих в передаче цитокининового сигнала.

Следует отметить, что изучение гормон-зависимых транскрипционных факторов растений позволит объяснить и в перспективе направленно регулировать молекулярные механизмы дифференцировки, роста и старения растительных клеток. Можно предположить, что хотя ЦСБ-70 и ЦСБ-67 и являются

представителями одного семейства гормон-зависимых транскрипционных факторов растений, но могут различаться по характеру процессов, которые они регулируют в растении.

Белки - рецепторы цитокинина, участвующие в регуляции фитогормоном транскрипции, обнаружены в ячмене и кукурузе - растениях, относящихся к семейству злаковых. В будущем важно продолжить исследования, включив в них растения, относящиеся к другим семействам.

Выводы.

1. Оптимизирована методика очистки белков растительного экстракта от фенольных соединений с помощью полиэтиленгликоля.

2. Разработана методика отделения растительных белков от фенольных соединений с помощью хроматографии на Тоуореаг1 Н\У60.

3. Разработано два метода последовательной очистки цитокинин-связывающих белков (ЦСБ) из этиолированных проростков кукурузы. Оба метода включают очистку ЦСБ аффинной хроматографией с использованием иммобилизованного аденина и зеатинрибозида.

4. С помощью разработанных методов из цитозоля пятидневных этиолированных проростков кукурузы выделен цитокинин-связывающий белок с молекулярной массой 70кД (ЦСБ-70).

5. Обнаружено, что ЦСБ-70 связывал транс-зеатин специфически и обратимо. 100% вытеснение рН]-дигидрозеатина из гормон-рецепторного комплекса в тесте с осаждением комплекса сульфатом аммония достигалось при концентрации немеченого дигидрозеатина 5х10"7 М.

6. Антиидиотипические антитела распознавали ЦСБ-70 в условиях прямого твердофазного иммуноферментного анализа.

7. ЦСБ-70 активировал в присутствии транс-зеатнна синтез РНК in vitro в :истеме, содержащей хроматин и РНК-полимеразу-1 из листьев ячменя.

8. Совокупность полученных данных позволяет заключить, что из цито-юля пятидневных этиолированных проростков кукурузы, для которых характерны активные деления и рост клеток, выделен белок со свойствами рецептора дитокинина. Выделенный рецептор принимает участие в регуляции цитокини-юм транскрипции.

Список работ автора, опубликованных по материалам диссертации.

1. Бровко Ф.А., Заграничная Т.К., Лисина О.Б. Способ разделения белков и фенолов в растительных экстрактах при помощи гидрофобной хроматографии на Toyopearl-HW60. Биотехнология. 1994. Т. 9-10. Стр. 15-18.

2. Бровко Ф.А., Заграничная Т.К., Бозиев Х.М. Разделение белков и фенольных соединений в растительном экстракте фракционированием сульфатом аммония в присутствии небольших концентраций полиэтиленгликоля. Биотехнология, 1996, (В печати).

3. Бровко Ф.А., Заграничная Т.К., Бозиев Х.М., Липкин В.М., Кара-вайко H.H., Селиванкина С.Ю., Кулаева О.Н. Выделение и характеристика цитокинин-связывающего белка молекулярной массой 70 кД из этиолированных проростков кукурузы. Физиология растений, 1996, Л!' 4.

4. Романов Г.А., Бровко Ф.А. Таран В.Я., Оруджев Э.М., Венис М.А. и Кулаева О.Н. Получение и свойства высокоочищенного цнтокшшнсвязы-вающего белка из некоторых злаков. Всесоюзный симпозиум химии белков, Тбилиси, 1990. Стр. 70.

5. Karavaiko N.N., Selivankina S.Yu., Brovko F.A., Zemlyachenko Ya. V., Shipilova S.V., Zagranichnaya Т.К., Lipkin V.M. and Kulaeva O.N. Zeatin-

binding proteins participating in cytokinin-dependent activation of transcription. 1996. (В печати).

6. Brovko F.A., Zagranichnaya Т.К., Boziev H.M., Karavaiko N.N., Seli-vankina S.Yu., Lipkin V.M. and Kulaeva O.N. A cytokinine-binding protein from maize coleoptiles. Int. Symposium Plant Hormone Signal Perception and Transduction 1994. Moscow. P. 13.

7. Selivankina S.Yu., Karavaiko N.N., Shipilova S.V., Zemlyachenko Ya. V., Brovko F.A. and Kulaeva O.N. Transcription activation by the complex of zeatin-binding protein and trans-zeatin // Int. Symposium Plant Hormone Signal Perception and Transduction 1994. Moscow. P. 78.

Ф.А. Бровко.

29.04.96 г. Зак.7048Р. Тир.100 экз. Усл.печ.л. 1,5 Отпечатано на ротапринте в ОНТИ ПНЦ РАН