Изучение иммуноцитохимическими методами локализации цитокинин-связывающего белка 70 кД в тканях и клетках этиолированных проростков кукурузы

Васильева, Виктория Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение иммуноцитохимическими методами локализации цитокинин-связывающего белка 70 кД в тканях и клетках этиолированных проростков кукурузы
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение иммуноцитохимическими методами локализации цитокинин-связывающего белка 70 кД в тканях и клетках этиолированных проростков кукурузы"

На правах рукописи

оозоезоэе

ВАСИЛЬЕВА ВИКТОРИЯ СЕРГЕЕВНА

ИЗУЧЕНИЕ ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ ЛОКАЛИЗАЦИИ ЦИТОКИНИН-СВЯЗЫВАЮЩЕГО БЕЛКА 70 кД В ТКАНЯХ И КЛЕТКАХ ЭТИОЛИРОВАННЫХ ПРОРОСТКОВ КУКУРУЗЫ

03 00 04 -биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 3 МАЙ 2007

Пущино - 2007

003063096

Работа выполнена в Филиале Института биаорганической химии

им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Научные руководители-

доктор биологических наук, профзссор

кандидат биологических наук

Кулаева Ольга Николаевна Бровко Федор Александрович

Официальные оппоненты*

доктор биологических наук, профессор

доктор биологических наук

Бурьянов Ярослав Иванович Клячко Нелла Леопольдовна

Ведущая организация

Институт биофизики клетки, РАН

Защита диссертации состоится 24 мая 2007 г в 11 ч на заседании диссертационного совета Д 002 056 01 при Институте фундаментальных проблем биологии РАН по адресу 142290, Московская обп, г Пущино, ул Институтская 2, ИФПБ РАН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института фундаментальных проблем биологии РАН

Автореферат разослан_елреля 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Г.Н Назарова

Обгдзя характеристика работы

Актуальность проблемы Цитокинины предсташтяют собой гормоны растений, уча вующиэ в регуляции те>сих важнейших процессов, как деление клеток, диффервнциро побегов, рост клеток листа, биогенез хлоропласгов, задержка старания листьев, усть ные движения, отпет растений на стресс и многие другие (Кулаеаа, 1973) В связи с эт очевидна теоретическая и практическая значимость исследований механизма дейсл этого класса фитогормонов

В настоящее время открыт мембранный рецептор цитокининов (Inoue et al, 20 Ueguchl et al., 2001), который воспринимает внешний по отношению к клетке цитокин Он относится к тек называемой двухкомпонентной регуляторной системе, включающе себя трансмомбранный рецептор, который является сенсорной гистидин-кинззой, ао фосфор илирующойся под действием цитокинина и передающей фосфат на цитоплаз! тический белок - фосфотрансмиттер, который транспортируется в ядро и перено фосфатную группировку на цитокинин-зааисимый трансфактор, включающий гены п вичного ответа на цитокинин (Sakakibara et et., 1998, Suzuki et al, 1S9S, 2000; Taniguch al, 1998) Таким образом, мембранный рецептор включает фосфатный каскад и пере er цитокининоаый сигнал через соть внутриклеточных посредников на генетический парат клетки Однако, в литература есть данные о содержании цитокининов внутри кл ки в цитоплазма, ядро и хлоропласта* (Ivanova et в!, 1994; Benkova et al, 1899; Hare,1 Staden, 1997) Это выдвигает задачу поиска внутриклеточных мишеней или рецепто| цитокинина С этой точки зрения представляют интерес цитокинин-свяэывающие 6ej (ЦСБ) 67 кД, из клеток листьев ячменя (Kulaeva et al, 1995) и ЦСБ-70 из этиолирована проростков кукурузы (Бровко и др, 19S6), которые участвуют в цитокинин-зависи«, регуляции транскрипции в системах In vitro (Kulaeva et al, 1998). Многое для понима! функциональной роли этих белков может дать выяснение их локализации в растении клетке. Большие возможности для этого открывает иммунохимия с использованием сокоспэцифичных монокпональных антител к ЦСБ Сочетание иммунохимии со cbstoi и электронной микроскопией дает возможность установления внутриклеточной лока зэции ЦСБ Исследование же корреляции между содержанием ЦСБ в тканях и актив стыо в них гормон-регулируемых процессов, несомненно, помогло бы прояснить мно аспекты функционирования этого белка.

Это определяет цель и задачи данной работы

Цвль и задачи исследования Цель данной работы - изучить тканевую и клаточь локализацию цитокинин-сапзывакнцэго белка ЦСБ-70 в проростках кукурузы Для достижения мы выделили следующие задачи.

1 Подобрать условия выявления ЦСБ-70 с помощью монокпональных антител на срезах этиолированных проростков кукурузы

2 Подобрать антитела для дифференцированного выявления ЦСБ-70 в органаллах растительных клеток

3. Исследовать локализацию ЦСБ-70 в ядрах различных типов тишай этиолирозанных проростков кукурузы с помощыо сочетания методов иммуноцитохимии, сзотоаой и электронной микроскопии 4 С помощью сочетания методов иммуноцитохимии, сватовой и электронной микроскопии исслэдоезтъ особенности локализация ЦС5 в пластидах разных типов клоток этиолированных проростков кукурузы

Научная новизна и практическая значимость работы Разработан матод выявления на срезах этиолированных проростков кукурузы лабильного белка ЦСБ-70, чувствительного к жесткой обработке растительной ткани Показано, что моноклональные антитела, полученные к ЦСБ-70 делятся на три группы по способности выявлять антиген1 выявляющие белок в цитоплазме и ядрах растительных клоток; способные узнавать балок в ядрах и цитоплазме, однако значительно эффеетизнее выявляющие его в пластидах; не выявляющие ЦСБ-70 в иммуноцитохимических тестах, несмотря вз реакцию этих антител с белком в условиях иммуноблоттинга

С помощью монокпональных антител впервые установлена тканевая и клеточная локализация ЦСБ-70 С помощью антител первой группы показано, что ЦСБ-70 содержится в цитоплазме и ядрах клеток преимущественно в зонах клеточных делений Максимальное содержание ЦСБ-70 обнаружено в ядре, с наибольшей его концентрацией в ядрышке как активно пролифорирующих, так и закончивших деление клаток С помощью антител второй группы показано, что ЦСБ-70 присутствует в значительных количествах в пластидах, в пропластидах и в этиопластах клеток листа и в емилоплэстах корневого чехлика. Установлена корреляция накопления ЦСБ-70 в зтиопластах с процессом формирования системы внутренних мембран этих органзлл. Полученные данные представляют интерес для фундаментальной науки, поскольку приближают к пониманию роли ЦСБ-70 в механизме действия цитокининов в растении

Апробация диссертационного материала Материалы диссертации были представлены на Международном симпозиуме «Intracellular Signalling In Plant end Animal Systems» в Киеве в 2001 г, 6-й и 7-й Школах-конференциях молодых ученых в Пущино в 2002 и 2003 г, Отчетной конференции ФИБХ, в Пущино, в 2004 г., 5-м съезде Общества физиологов растений России в Пензе в 2004 г, 2-м международном симпозиума «Сигнальные системы клоток растений Роль в адаптации и иммунитете» в Казани в 2006 г.

Публикшдии По тема диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 2 статьи в реферируемых журналах

Объем и структура работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов, изложения и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка цитированной литературы, который включает 150 работ, в том числе 126 иностранных Работа изложена на 107 страницах машинописного текста, содержит 19 рисунков и 3 таблицы.

Содзржениэ работы

Материалы и методы исследования

Объакг иссл^яов^жия. Для иммуноцитохимического исследования цитокинин-связывающих болхов использовали четырахднззныо этиолированные проростки кукурузы {Zea mays L) сорта «Нарт-150», выращенные в темноте при 25-27'С и влажности 95% Для анализа отбирали часта растений: кончик корня, участок из зоны растяжения корня, участок из середины мазокотиля, узел Для выделения белкового экстракта использовали надземную часть проростка

нии. Проростки кукурузы гомогенизировали в буфере А (Трио-HCI, рН 7 5 - 50 мМ, MgCI2-2 мМ, ЭДТА-Na - 2 мМ, KCI - 50 мМ, ФМСФ - 0.5 мМ, р-меркаптоэтанол - 5 мМ). Гомоге-нат после фильтрования центрифугировали 15 мин при 1000 д, затем 15 мин при 40 000 д Из еупернатанта белки осаждали сульфатом аммония 80% насыщения. Преципитат осаждали центрифугированием 40 мин при 20 000 д, растворяли в буфера с добавлением аскорбиновой кислоты и пропускали через колонки PD10 Высокомолекулярную фракцию собирали, измеряли в ней концентрацию белка и использовали для ИФА ЦСБ-70.

ТвгоаоФчзный иммуноФэрмонтны^ анализ белкового экстракта был провэдон для оценки влияния различных фиксаторов и способов обработки растительного материала на иммунореактивность ЦСБ-70.

Аналитический электрофорез и иммунобгюттинг ЦСБ-70 был провзден для анализа специфичности монокпонапьных антител разных групп

Фиксация и гапичка в смолу растительной ткани Части растения, выбранные для исследования, отделяли и погружали в фиксатор, содержащий пара формальдегида - 4%, глутаральдегида - 01%, пикриновой кислоты - 0 01%, на 8-12 ч при температуре 4"С. Далее образцы обезвоживали в серии спиртов до 56% спирта и заливали в гидрофильную смолу LR Whfíe. Для сватовой микроскопии с залитых блоков делали полутонки® срезы (0 7-1 мкм), для электронной микроскопии с тех же блоков делали ультратонкие (золотистые) срезы

Иммуномэчсжиа полутонах ссюзоа проводили с помощью моксклональных антител, полученных против ЦСБ-^О, биотинилирозанных ентимышиных антител (Amersham) и стрептавидин-фосфатазного конъюгата (Amersham). Реакцию проявляли с помощью 5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфата и нитро синего татразолия Для выявления структуры ткани срезы докрашивали 0 2% спиртовым раствором сафранина О или оставляли без докрашивания, непосредственно перед Микроскопировзнием заключали в кедровое масло, просматривали и фотографировали с помощью микроскопа Univar (Roichsrt-Jung, Австрия).

Иммуномечение ультрвтонких срезов проводили с помощью моноклональных антител, полученных против ЦСБ-70, биотинилирозанных антимышиными антителами (Amersham) и стрептавидин-золотой метки 15 им (Amersham) Срезы контрастировали уранил-вцетатом и цитратом свинца и просматривали под электронным микроскопом

Количественный анализ UCB п ооганвппах по подсчету частой колпоти?л?го вол отд. выявляющих локализацию белка Распределение золотых частиц в органеллах клетки подсчитывали, обрабатывая элетгронно-микроскопическиа снимки в программе TotalLab Определяли фоновую концентрацию частиц, рассчитывая количество золотых частиц на единицу площади на кусочке смолы LR Whlte, не содержащей растительной ткани Измеряли плоишь органелл в соответствии с масштабом фотографии, определяли количество золотых частиц в них, затем рассчитывали концентрацию метки на единицу площади, вычитая фоновую концентрацию частиц, Данные статистически анализировали с помощью программы Microsoft Excel Результаты экспериментов и их обсуждение

Разработка методов иммуноиитохимического исследования локализации UC6-70 в тканях и клетках проростка кукурузы. В процессе работы по выделению ЦСБ-70 была обнаружена его нестабильность под воздействием окислителей, повышенных температур, изменения рН Для изучения влияния различных способов фиксации нз ЦСБ-70 мы проводили иммуноферментиый анализ сорбированного на подложку и обработанного различными фиксаторами белкового экстракта проростков кукурузы В качестве ферментной метки в опыта была использована щелочная фосфатаза Полученные результаты (рис. 1) показали, что наибольшая сохранность ЦСБ-70 обеспечивалась при использовании фиксатора, содержащего низкую концентрацию глутаральдегида - 01% (фиксатор № 3) Этот фиксатор и применяли далее в работе

При подбора ферментной метки для выявления иммунных комплексов на срезах нам пришлось отказаться от использования пероксидазы, так как процедура ингибиро-вания эндогенной пероксидазы на срезах с Помощью 01 н HCI или 0 5% Н203 резко снижала иммунореактивность лабильного белка ЦСБ-70, а при обработке срезов HCI

% от контроле 1М

ЛЕВ

Рис, 1. Зависимость количества ЦСБ-70, выявляемого в экстракте растительных белков, от состава фиксатора, % от контроля. Контроль - количество ЦСБ -70, выявляемоедо обработки фиксатором.

1 - после фиксации; 2 - после фиксации и дегидратации. А - фиксатор N5 1(1% ГА, 2% ПФА); Б - фиксатор № 2 {0.5% ГА, 3% ПФА); В - фиксатор №> 3 (0.1% ГА, 4% ПФА)

% от контроля

120 100 80 «0 40 20 0

А Б В Г

Мл

[а.

121 1*0 М 6А 40 20 О

Д Е Ж

Рис. 2, Зависимость количества ЦСБ -70, выявляемого в экстракте растительных белков, от обработки экстракта химическими реагентами и способа блокирования несло пифического связывания антител, % от контроля. Контроль - количество ЦСБ -70, выявляемое в экстракте, обработанном фиксатором №3 и 1% БСА

в - обработка химическими реагентами, б - обработка различными типами

блокирующих растворов. 1 - на первом этапе иммунохимииаской реакции экстракт обработан антителами 11В1 (сигнал), 2 - без антител на первом этапе

иммукохимической реакции (фон). Все процедуры проводили при температуре 4?С. А-контроль; Б - после обр аботки 0.1 н НС); В - после обработки 0.5% Н гОг; Г - после обработки 0.5% N810, с последующей обработкой 1% ЫаВН<; Д - после блокирования н«специфического свнэ ыввния 3% БСА, Е - после блокирования неспецифического связывания 3% БСА с 0.5% желатином, Ж - после блокирования неспецифического связывания 5% эмбриональной сывороткой.

обнаружиаалось еще и усиление фонового окрашивания (рис 2а) Способ обработки срезов с помощью NalO< и NaBH*, рекомендуемый для улучшения иммуномечения, также оказался для нас неприемлем, поскольку при этом наблюдалось значительное снижение иммунореаетизности ЦСБ-70, и повышение фонового окрашивания (рис. 2а)

Для уменьшения неспецифического связывания антител (рис 26) наилучшим оказалось использование 3% БСА в сочетании с желатином - фонозый сигнал при этом уменьшается почти вдвое по сравнению с 1% БСА. Во многих источниках рекомендуется использование эмбриональной сыворотки, однако в нашем случае это привело к значительному повышению фонового сигнала

Подбор условий для иммобилизации растительного материала в полимерную среду. При подборе методики выявления исследуемого белка на срезах различных частей 4-днеаного этиолированного проростка кукурузы, заливку образцов проводили в гидрофильную метакрилатную смолу LR White. Образцы обезвоживали до 96% спирта. Мы были вынуждены определять время пропитки для каждой партии образцов эмпирически Растительный материал выдерживали в смоле несколько недель, и каждые несколько дней проводили контрольную заливку одного из образцов. Поскольку ЦСБ-70 оказался неустойчив к термическим воздействиям, полимеризацию смолы проводили с помощью ультрафиолета при комнатной температуре

Подбор условий для иммуноиитохимического выявления ЦСБ-70 на срезах растительной ткани. Оптимальные условия проведения реакции подбирали, используя тройной контроль В первом варианте исключали первые антитела против ЦСБ-70, во втором- в качостве первых антител использовали моноклонвльные мышиные антитела 9Е10 против Мус-бел ха, отсутствующего в растениях, в третьем - вместо мо но клепальных антител к ЦСБ-70 использовали сыворотку неиммунных мышей Условия, при которых все три варианта контроля выглядели идентично (с минимальным окрашиванием), использовались далее в эксперименте

Для оптимального усиления реакции нами была выбрана стрептввидин-биотиновая система, как наиболее чувствительная и специфичная В случае световой микроскопии вторые (античышиные) антитела, помеченные биотином, выявлялись с помощью стреп-тавидин-ферментного конъюгата При применении указанной методики иммунофер-монтного анализа на полутонких срезах оказалось, что она все же недостаточно чувствительна для выявления того количества антигена, которое имеется в тканях. Для усиления сигнала, мы использовали повторение инкубации срезов с биотинилироаанными антителами и стрегттавидиновым конъюгатом.

Для электронной микроскопии мы использовали те же блоки с растительным материалом, что и для световой При обработке ультрзтонких срезов стрегттавидин-

биотиновая система, использованная в иммунофзрмантиом анализа, вполне удовлетворительно работала без двойного усиления. Б качество мзркера была использована стрептаЕидин-золотал матка

Подбор антител для дифференцированного выявления ЦСБ-70 в органеллах растительных клеток, Исследование внутриклэточной локализации цитокинин-связывающвго белка ЦСБ-70 проводилось с использованием панели мышиных моноклональных антител, получанных ранее в группе Молекулярных аспектов иммунологии репродукции ФИБХ РАН (Заграничная и др, 1997). В работе (Kulaeva, 1998) было показано, что антитела различных клонов, полученные к белку ЦСБ-70, выделенному из этиолированных проростков кукурузы, способны узнавать функционально подобный ему цитокинин-связыаэющий белок ЦСБ-67, выделенный из листьев ячменя. Из этих результатов можно сделать выгод, что полученные к ЦСБ-70 антитела способны узнавать гомологичные ему белки Данные об усилении или ослаблении функциональной активности ЦСБ !п vhro под действием разных моноклональных антител позволяли предполагать их взаимодействие с различными эпитслами антигена. Поэтому мы ставили задачу исследовать особенности выявления цитокинин-сеязывающих белков в клетках этиолированного проростка кукурузы разными моноклональными антителами к ЦСБ-70, в надежде обнаружить таким путем белки, различающиэся по свойствам или локализации

Таблица 1. Количество золотых частиц на ед площади пластид клетки (1 мкм2) при выявлении ЦСБ-70 на ультратонких срезах с помощью антител первой (11В1) и второй (14А4) групп, антимышиных бкотинилиросанных антител и конъюгата стрелтавидин-коллоидное золото (электронная микроскопия)

Орган Антитела Пластиды Антитела Пластиды

растения 11В1 14А4

Лист + 0 34 ± 0 04 + 19 57 ± 11 82

- 0 35 ± 0 06 - 021 ±0.07

Корневой + 0 56 ± 0 09 + 26 92 ± 6 21

чехпик

- 0 42 ± 0 07 - 0 29 ± 0 09

В процессе работы было выявлено, что полученные ранее моноклональные антитела к ЦСБ-70 делятся на 3 группы по способности выявлять антиген на срезах растительных тканей К первой группе относятся моноклональные антитела 11В1, 11ВЗ, 13D3, 15, которые выявляют ЦСБ-70 в цитоплазме и ядрах растительных клеток (рис За) Ко второй группе - антитела 83,14А4, 523, 36, которые тоже способны узнавать белок в ядрах и цитоплазме, однако значительно эффективнее выявляют его в пластидах (рис 36, табл 1)

Рис. 3, Выявление ЦСБ-70 с помощью моноклональных мышиных антител резных групп.

в - поперечный срез апекса стебля 4~дневнаго этиолированного проростка кукурузы, для иимуноцитохими-ческото исследования попользованы антитола первой группы (11ВЗ), полученные прстав ЦСБ-70, которые способны выявлять белок в ядра* (черная стрелка), но не в пластидах клеток (бвпяя стрелка); В -та же ткань, обработанная с использованием антител второй группы (14А4), которые способны выявлять белок В ядрйд (черная стрелка), а также в дпасти-

66 ' дах клеток (белая стрелка);

в- иммуноблог прел врата ЦСБ-70, использованы ан-

дц титела всех групп; антиталв

--первой группы: 1 - 11ВЭ, 2

13D3; антитела второй гругь пы: 3- 14А4. 4-523; антитела третьей группы: В - 511, 6-189.

К третьей группе отлюсятся внткпегв 18, 33,199, 511, которые не выяалйпи ЦСЬ-70 в иммуноцигохимических тоствх. В то же время, антитела всех трех групп были способны специфично узнавать ЦСБ-70 на иммукоблотах (рис. Зв), а также в иммунофермвнт-ном анализе при подборе условий обработки растительного материала.

Такие различия могут объясняться тем, что при иммуноблоттинге происходит полная денатурация и диссоциация квтааных комплексов балков. Все антигенные детерминанты ЦСБ-70 при этом оказываются доступны для узнавания антителами. При процедуре нммуноцитохимического выявления используются мягкие методы обработки тканей с максимальным сохранением естественной конформации белка. В натик/ых условия* ЦСБ-70 может быть свернут таким образом, что часть антигенных детерминант оказывается «спрятанной» внутри белковой молекулы, или же находиться а ассоциации с другими вспомогательными белками и лиганцами, которые препятствуют связыванию антител. Нельзя исключить и того, что с помощью антител

-и-

сторой группы нам удалось выязить, помимо ЦСБ-70, гомологичный ему балок, содержащий значительную часть антигенных детерминант ЦСБ-70

Имкттоиигохимнческое исследование локализации UC&-70 в цитоплазма и ядрах клеток проростка кукурузы С помощью мышиных моноклональных антител 11В1,1183, 13D3 (первой группы) было проведено исследование локализации ЦСБ-70 в ядрах и цитоплазме клеток четырехдневных этиолированных проростков кукурузы Ранее нам удалось установить с помощью иммунохимических методов, что ЦСБ-70 содержится преимущественно в зонах клеточных делений, особенно в меристеме корня, где концентрация ЦСБ-70 оказалась значительно выше, чем в других органах и тканях растения (Шелеляковскяя и др., 2002) Выявление ЦСБ-70 на срезах кончика корня показало, что в апикальной меристеме корня максимальное содержание этого белка находится в ядрах, особенно, в ядрышках (рис 4, черные треугольники) Значительное количество ЦСБ-70 присутствует также в цитоплазме меристематических клеток, однако его концентрация здесь ниже, судя по интенсивности окрашивания ЦСБ-70 распределен в меристеме неразномерно. В ядрзх и цитоплазме митотически неактивных клеток покоящегося центра обнаруживается значительно меньше ЦСБ-70, чем в пролифе-рирующих клетках меристемы (рис 4а, черная двойная стрелка) Высоким оказалось содержание ЦСБ-70 в ядрах активно делящихся клеток корневого чехлика (рис. 4в, белая стрелка) Концентрация ЦСБ-70 в цитоплазме прстодермы и эпидермы кончика корня выше, чем в цитоплазме делящихся клеток меристемы (рис. 4г, белый треугольник) В клетка* зоны растяжения исследуемый белок обнаруживается в ядрах, особенно в ядрышках, причем видимых отличий в интенсивности окрашивания ядер в делящихся и растягивающихся клетках но выявлялось (рис. 4 г, д, черные треугольники) ЦСБ-70 обнаруживается также в цитоплазматических тяжах клеток зоны растяжения (рис. 4д, белая двойная стрелка). Ни в мелких вакуолях мэристематических клеток, ни в увеличенных вакуолях, занимающих почти весь объем клеток зоны растяжения, исследуемый белок не был выявлен Локализация ЦСБ-70 указывает на его участие в процессах, связанных с клеточным делением Необходимо отметить, что локализация ЦСБ-70 в корне коррелирует с распределением эндогенных цитокининов.

По данным Aloni с ссзэт. (Alón! et а!, 2005) максимальное содержание физиологически активных цитокининов находится в меристеме и чохлике корня Ambidopsis theímna Совпадение картины распределения ЦСБ-70 и эндогенных цитокининов в корне укезыезет на возможное участие ЦСБ-70 в цитокинин-зевисимсй регуляции делений

При исследовании срезов мезокотиля было обнаружено низкое содержание ЦСБ-70, что совпадает с биохимическими данными, полученными ранее Белок выявлялся преимущественно в клетках обкладки сосудистых пучков, в ядрах, распластанных

Рис. 4. Выявление ЦСБ-70 на продольных срезах кончика (а-г) и зоны растяжения корня (д) 4-днвеного этиолированного проростка кукурузы с помощью моноклинальных мышиных антител первой группы (UBI), полученных против ЦСБ-70.

Срезы последовательно обрабатывали монокпональными мышиными антителами против ЦСБ-70, биотинилированными антимышиными антителами и конъюгатом стрвптавидинв с щелочной фосфатазой (б-д). Отрицательный контроль (а) - при обработке срезов исключали стадию с моноклинальными антителами, а - контроль; б - общий вид иммуноцитоки ми чески окрашенного кончика корня, пц - покоящийся центр, ч - корневой чехпик (граница отмечена пунктиром); в - фрагмент ¡6), апикальная меристема кончика корня; г - область формирования первичной коры и эпидерма корня ("4,5-1 мм от апекса); д-зона растяжении, проводящая ткань. ЦСБ-70 преимущественно вываляется в ядрах и ядрышках клеток (в, г, д, черные треугольники), ядрах клеток корневого чехлика (в, белая стрелка), в цитоплазме и ядрах клеток покоящегося центра содержание ЦСБ-70 значительно ниже (в, черная двойная стрелке). Эпидерма корня отличается высоким содержанием ЦСБ-70а цитоплазме клеток (г, белый треугольник). В клетках зоны растяжения ЦСБ-70 выявляется в ядрах и ядрышка* (д, черный треугольник) и в тяжах цитоплазмы (белая двойная стрелка).

по клеточной стенке, а также в ядрах клеток паренхимы (рис 56, в) Выявление ЦСБ-70 на срезах узла проростка показало, что общее содержание исследуемого белка в этой части растения выше, чем в мазокотиле Сильнее всего оказались окрашены зоны деления в впзкее стебля и края листовых пластинок - области с наивысшей меристема-таческой активностью в узле (рис. 5г, д, треугольники) Максимальное содержание ЦСБ-70 в клетках узла было отмечено в ядре, в особенности, □ ядрышке (рис. 5д, белая стрелка). Цитоплазма делящихся и цтотяазматические тяжи растущих клеток оказались также окрашены (рис. 5д, белая двойная стрелка) На срезах колаоптиля ЦСБ-70 выявлялся в ядрах клеток паренхимы, прижатых вакуолью к клеточной стенке (рис. 5з, и, белые стрелки) Надо отметить, что в клетках сосудистой ткани колеогпипя содержания ЦСБ-70 оказалось выше, чем в паренхиме. В этих клетках исследуемый белок также располагается в ядрах и ядрышках. Таким образом, по результатам иммуноци-тохимического исследования с помощью моногспональных антител данной группы и световой микроскопии обнаружено, что ЦСБ-70 в корне преимущественно аккумулируется в зонах клеточных делений, в тканях с максимальной пролиферативной активностью

Нами также было проведено исследование локализации ЦСБ-70 с помощью электронной микроскопии на ультратонких срезах с использованием мышиных монокло-нвльных антител из первой выделенной нами группы, антимышиных антител, меченых биотипом и конъюгата стрептавидин-коплоидное золото Срезы контрастировали ура-нилацетатом и цитратом соинца. На электронно-микроскопических снимках видно, что ЦСБ-70 выявлялся в цитоплазме и ядрах исследованных клеток (рис 6а) Наибольшая концентрация белка обнаружена в ядрышке. В нуклео плазма ядра ЦСБ-70 распределялся неразномерно (рис. 6). Это подтверждается данными количественного подсчета золотых частиц на единицу площади в разных частях клетки (тебл 2) В клетках листа количество метки в ядрышке вдвое превышает значение для остальной части ядра и в 3 5 раза - значение для цитоплазмы В клетках корня количество метки в ядрышке также примерно вдвое больше чем в ядре, и в 4.3 раза больше, чем в цитоплазме

Разброс значений для распределения золотых частиц в нуклео плазме является результатом неравномерного распределения в ней ЦСБ-70 По данным электронной микроскопии, в вакуоли и в области клеточной стенки этот белок практически отсутствует. Следует отмотить, что данные световой микроскопии также показывали, что ЦСБ-70 максимально сконцентрирован в ядрышке и отсутствует в вакуолях клетки.

Теким образом, в надземной часто проростка, как и в корне, ЦСБ-70 локализован в ядрах пролиферирующих клеток Такая локализация белка дает возможность предпо-

б в

Твбпкца 2 Количество золотых частиц на вд площади органелл клетки (1 мхм2) при выявлении ЦСБ-70 на ультратонких срезах с помощью антител первой (11В1) и второй (14А4) групп, антимышиных биотунилирозанных антител и коныогата стрептавидан-коллоидное золото (электронная микроскопия)

Орган Антитела Нукпзоллазма Ядрышко Цитоплазма

растения 11В1

Лист + 9.61 ± 3.98 20.89 ± 0.97 5.95 ± 0.40

- 0 39 ± 0 08 0 20 ± 0 06 0 53 ±0.10

Кончик + 10.98 ±4.53 21.45 ±0 84 4.99 ±0.48

корня

- 0514009 0 35 ± 0 06 0 50 ± 0 08

латать, что ЦСБ-70 может влиять нз процесс цитокинин-зависимого деления клеток В работах (1псио е! а!, 2001, 1!едисЫ е! а!, 2001; МвМтига м а!, 2004, НщисМ е1 а!.. 2004), было показано, что цитокининовая регуляция клеточного деление осуществляется через рецвпторные гистидин-киназы СЯЕ1/АНК4ЛЛГО1-, АНК2 и АН КЗ Все три белка необходимы для обеспечения клеточного деления, однако активность экспрессии генов гистидин-киназ в кончике корня АгаЬШорвШ, показанная в работе Н1дисМ с соавт. (Н|дисЫ е1 а1, 2004) не вполне соответствует активности клеточных делений, тогда как локализация ЦСБ-70 в кончике корня и других тканях растения связана с зонами деления более явно Важно, что мутация по всем трем генам гистидин-киназ, хотя и оказывает значительное влияние на фенотип растения АтЫйоря/я (замедление роста, стерильность, уменьшение размера и активности меристем), однако не подавляет полностью способность клеток к делению и не вызывает полное исчезновения меристематической активности Таким образом, в регуляции цитокинин-зависимого деления клеток могут участвовать другие системы восприятия и передачи сигнала, помимо рецепторных гистидин-киназ и индуцируемого ими фосфатного каскада <-

Рис, Б. Выявление ЦСБ-70 на поперечных срезах меэоштиля (а-в), узла (г-е) и колеошиля (ж-и) 4-днезного этиолированного проростка кукурузы с помощью моноклональных мышиных антител первой группы (1303) Срезы последовательно обрабатывали монокпональными мышиными антителами, биотинилированными антимышиными антителами и конъюгатом стрептавидина с щелочной фосфатезой (бд, з, и) Отрицательные контроля (а, е, ж) - при обработке срезов исключали стадию с монокпональными антителами Мезокогиль- а - контроль, б - область проводящих пучков, в - паренхима и эпидерма Узел г -общий вид иммуноцитохимически окрашенного узла, рамкой выделен фрагмент, лредстаэ-ленный при большем увеличении на (д), д - апекс стебля, е - контроль Колеоптиль ж - контроль, з - паренхима копэоптиля, и - проводящий пучок ЦСБ-70 выявляется в ядрах (белые стрелки), максимальная концентрация - в делящихся клетках края листовых пластин (г, белые двойные стрелки) и в очагах деления в апексе стебля (д, черный треугольник)

. * I

я ±

Рис. в. Выявление ЦСБ-70 а клетках кончика Юрия (а, 6) 4-дневного этиолированного проростка кукурузы с помощью электронной микроскопии с использованием мотоклоиапьных мышиных антител первой группы (11В1).

Срезы последовательно обрабатывали моноклональнымн мышиными антителами, биотини-лированными актимышиными антителами и кэкыогетом стрептввидинв с коллоидным золотом (а). Отрицательные контроля (б) - при обработке срезов исключали стадию с монокло-нальными в нт и телами. Я- ядро; я- ядрышко; п- пластида; м- митохондрия, кс- клеточная стенка; в - вакуоль. ЦСБ-70 вываляется в ядре (белый треугольник), ядрышке (черный треугольник), цитоплазме {черная ст релка}.

Элементом этой альтернативной системы может являться ЦСБ-70. В то же время, исследуемый белок обнаруживается не только в делящихся клетках, но и в ядра* и ядрышках клеток, закончивших деление - в зоне растяжения корня, в паренхиме мезо-котипя и колеоптиля, что может указывать на возможное участие этого белка а общих процессах транскрипции.

Иммуноцитох^мическое исследование локализации ЦСБ-70 в пластидах клеток проростка кукурузы. С помощью монокпональных антител S3, 14А4, 523, 36 (второй группы) было проведено исследование локализации ЦСБ-70 в ппвсгидэх клеток четырехдневных этиолированных проростков кукурузы

Рис. 7. Выявление ЦСБ-70 на продольных срезах чехпика корня и ыеэокотилй 4-днеаного этиолированного проростка кукурузы с помощью моноклональных мышиных антител второй группы {523), полученных против ЦСБ-70. Срезы последовательно обрабатывали моноклональными мы* шины ми анткталеми, бюти-нилированными антимышиными антитвлами И конъкна-том сгрелтая едина с щелочной фосфвтазой. а - общий вид иммуноцито-химичвски окрашенного чвхликя (<4, докрашивание сафранином, граница между чахлином и меристемой отмечена пунктиром, на срезе видны хорошо окрашенные а мил о пласты в клетках чехлика (черные треугольники); б - центральная часть меэо котил н сосудистая ткань мезокотили и прилагающая к ней паренхима; в - паренхима и эпидерма мезокотиля; ЦСБ выявляется в амилопластэх чехлика корня (черные треугольники) и зтмоппестах в меэокотиле (черные стрелки).

При проведении иммуноцетохимического исследования с помощью антител второй группы на срезах кончика корня было обнаружено, что максимальное количество ЦСБ-70 содержится а а мило гш а стаж корневого чехлика (рис. 7а, черная стрелка). В чехли ке корня верхние 2-3 ряда клеток составляют инициалам (рис- 7а). 8 этих клетках, претерпевающих постоянную пролиферацию, отсутствуют емилолласты, в в проплесггидах еще не происходит образование системы внутренних мембран, Иммуноцитохимическов исследование с помощью сэетовой микроскопии показывает, что в таких пластидах заметное количество ЦСБ-70 не обнаруживается. Развитие пластид происходит в клетках, которые расположены ниже 3-го ряда, причем в клетках колумаллы емилолласты, содержащие крахмальные зерна функционируют как статопиты, обеспечивая грааитропическую реакцию корня. В этих клетках и выявляется максимальное содержание ЦСБ-70 в пластидах. Необходимо подчеркнуть, что а этих клетках также отмечается

ч Ч \« - . * * ' • я ( * * *

Ф * " * * т * * - * >

•, * V 'л -

1 ' &- *

75 мм

• б 1 : в

- -щ__

■ . Я*- 7 ' 40 ммм 1 40МКМ

[ г

к Шш.

.-г«*, < . я

. ■ • ?2$чм* Щ

50 мМ

Рис. 8. Выявление ЦСБ-70 на поперечных срезах узле и колеоптиля дневного эт иолирова иного проростка кукурузы с помощью монокпональных мышиных антител второй группы (14А4) против ЦСБ-70. Срезы последовательно обрабатывали монокло нальными мышиными антителами, биотинилиро ванными антимышиными антителами и конъюгатом стрептавидина с щелочной фосфатазой.

а - общий вид иммуноци-то химически окрашенного узле, докрашивание сафранином; б - апекс стебля; в - сосудистый пучок и паренхима колеоптиля, докрашивание сафранином. ЦСБ выявлен в пластидах 2-го писта (а), апексе стебля (б), колеоптиля, (в) (черные стрелки), однако некоторые пластиды остаются неокрашенными (белые стрелки). Максимальное содержание ЦСБ в ядрах и цитоплазма клеток отмечено в очагах деления клеток (б, отмечены пунктиром), однако а этих клетках на обнаружены пластиды, содержащие ЦСБ.

и максимальное содержание цигокининов (А1оп! е1 аК, 2005).

При исследовании меэоыэтиля ЦСБ-70 также был выявлен в этиоппастах клеток, окружающих сосудистые пучки, расположенные в центре (рис. 76). Ни в крупных клетках паренхимы, ни в эпидерме мезокотипя пластид, содержащих исследуемый белок, не оказалось (рис. 7в).

На срезах узла проростка было показано, что ЦСБ-70 содержится в этиоппастах апикальной части стебля и листьев (рис. 8э-в, черные стрелки). Необходимо подчеркнуть, что неравномерность распределения исследуемого белка е пластидах разных тканей особенно хорошо видна именно в этом органе. Б узле, как уже отмечалось, находится множество очагов деления клеток: в листьях, апексе стебля. Клетки этих меристем этических зон, подобно инициалиям чехлика, постоянно пролиферируют и не успевают развивать плэстидный аппарат. В таких делящихся клетках не было этиогшастов,

содерзкащях ЦСБ-70 (рис. 86, б, треугольники). Этиопласты растягивающихся клеток паренхимы, прилэжащих к очагам деления, напротив, имэют значительные размеры и разную степень развития системы внутренних мембран Во многих растягивающихся клетках содержится до десятка пластид, в которых концентрация ЦСБ-70 была высока (рис 86, в, черные стрелки) Интересна разница, обнаруженная между разными листьями проростка - в клетках мезофилла второго листа находится множество пластид с большой концентрацией ЦСБ-70, а в клетках более старого первого листа и более молодых третьего и четвертого листьев количество этиопластов, содержащих исследуемый белок, невелико (рис 8 белые стрелки) При этом было отмечено, что в одной клетке находились пластиды с разным содержанием ЦСБ-70 В колэоптиле пластиды, накопившие значительную концентрацию ЦСБ-70, также были найдены только в клетках, прилегающих к проводящим пучкам, в некоторых клетках паренхимы и эпидермы (рис 8г, д, черные стрелки) В клетках колеоптиля и мезокотиля, как и в кончике корня, видна неравномерность окрашивания пластид

Электронно-микроскопические данные подтвердили, что антитела второй группы против ЦСБ-70 выявляют этот белок в пластидах эффективнее, чем в цитоплазме и нуклзоллазме ядра (рис. 9, тебя 1). В емилопластах корневого чехлика ЦСБ-70 выявляется в матрихсе вокруг крахмальных зерен (рис. 9а), причем концентрация метки в крупных пластидах, больше, чем в мелких На элеетронно-михроскопических снимках зтиопластов листа видна морфологическая разница между пластидами с высоким и низким содержанием ЦСБ-70 В пластиде, где система мембран только начинает развиваться, концентрация исследуемого белка невелика (рис 96), в этиопласте, где количество тилакоидов увеличилось, содержание ЦСБ-70 значительно повышено (рис. 9в), а в этиопласте, где уже сформировалась структура проламеллярного тела, количество ЦСБ-70 снова уменьшено (рис 9г) Таким образом, прослеживается связь между степенью развития оргеналл и содержанием в них ЦСБ-70

Все полученные данные о локализации ЦСБ-70 в пластидах клетки говорят о способности исследуемого белка влиять на процессы, происходящие в этих органеллах. Было показано, что пластиды одной и той же клетки могут содержать различное количество ЦСБ-70. С помощью электронно-микроскопических исследований обнаружена связь содержания исследуемого белка с ективностъю формирования мембранной структуры в пластидах Способность цитокинина воздействовать на дифференцировку пластид выражается, в частности, в стимуляции развития мембранной структуры в ходе образования хлорогшастов из про пластид (Хохлова и др , 1971, Микулович и др, 1971). В настоящее время известно, что эффект цитокинина сказывается на накоплении фото синтетических пигментов и белков толакоидных мембран хлоропластоа (Kuznetsov et al, 1994) и связан с экспрессией хлоропластаых генов (Зубо и др, 2005) Было установлено, что в каждом пигмент-белковом комплексе есть по крайней мере один белок, регуляция

К " " ■ ■ •

* т •

КС

ч , * и ( с

* • . а^

и * - •' 'Л?

■'. к Зн

1 мва О, • 1 мкм

$Г " ■/ ■■■ ■ ■ Ш

Пт

Рис. 9. Выявление ЦСБ-70 в клетка* корневого чехлика (а) и узла (б, в, г) 4-дневного этиол рованного проростка кукурузы с помощью электронной микроскопии с использованием ион •тональных мышиных антител второй группы (14А4> против ЦСБ-70.

Срезы последовательно обрабатывали ионоклопальными мышиными антителами прол ЦСБ-70, биотинилированными антимышиными антителами и конъюгатом стрелтавндина коллоидным золотом, а - выявление ЦСБ-70 в а ми л опл Эстах корневого чехлика; б - еыннл ние ЦСБ-70 в пропластиде листа; в - выналение ЦСБ-70 в развивающейся этиоппасте лист г выявление ЦСБ-70 в этиопласте листа с развитым проламеплярным тельцем, а - амил ппаст; к - крахмальное зерно; да - клеточная стенка; Пт - про л а «ел л ирное тепо; « - тип ко иды; з - этиоппаст ; Я - ядро. ЦСБ выявляется в пластидах (чернь« стрелки), цтоплаэ» (белая стрелка), ядра (черный треугольник).

которого осуществляется цитокинином на транскрипционном или посттранскрипционном урозне (Кигпойоу е{ а!., 1094). Необходмло такжо напомнить, что в хпоропластах обнаружен широкий спектр типичных для растений цитокининоз (Вепкоуа е1 о1, 1999) Выше нами было сделано предположение об участии ЦСБ-70 в регуляции процессов элонгации транскрипции ядерных геноо, направляемой РНК-полимеразой I, а, возможно, и РНК-полимеразой II Приведенные данные указывали на возможность участия ЦСБ в регуляции плзстомной транскрипции В связи с этим важно, что в совместной с нами работе в ИФР РАН была показана цитокинин-зэвисимая активация транскрипции в лизате хлоролластов с помощью ЦСБ, выделенного нами из этиопластов этиолированных проростков кукурузы Это данные соответствуют данным о ЦСБ хпоропластоа листьев ячменя, который избирательно регулировал транскрипцию в хпоропластах, не оказывая влияния на ядерную транскрипционную систему (Сеяивзнкина и др, 1997; КШаота е1 о1„ 2000, Лхжевич и др, 2002). Все это позволяет предполагать, что обнаруженный нами в хпоропластах ЦСБ может участвовать в комплексе с гормоном в регуляции экспрессии хпороплзстного генома Тот факт, что антитела второй группы против ЦСБ-70, эффективно связывающиеся с белком в пластидах, в то же время способны выявлять ЦСБ-70 в ядрах, ядрышках и цитоплазме аналогично антителам первой группы, указывает на общие иммунодетерминанты у ЦСБ, локализованного в ядрах и цитоплазма этиолированных проростков кукурузы и ЦСБ пластид отих проростков Наличие общих иммунодетерминант может указывать на структурную схожесть белков С другой стороны, на различие этих белков указывает отсутствие реакции первой групп-антител с ЦСБ пластид. Однако, это различие может зависеть от кон формации и молекулярного окружения белков пластид

Заключение

Основным результатом данной работы является установление локализации ЦСБ-70 в этиолированном проростке кукурузы с помощью разработанной методики иммуно-цитохимическога исследования этого белка в компартментах растительной клетки Для оптимального усиления специфической реакции иммуномечения нами была выбрана стрвптавидин-биотиновая система В исследованиях с помощью световой микроскопии ее использовали с дополнительным усилением, путем повторной обработки срезов био-тинилированными вторыми антителами и стрептавидин-ферментным конъюгатом, что существенно усиливало чувствительность метода

Использование панели мышиных моноклональных антител к ЦСБ-70 для проведения иммуноцитохимичзской реакции показало, что по способности выявлять антиген антитела делятся на 3 группы1 1) выявляющие белок в цитоплазме и ядрах растительных клеток; 2) способные узнавать белок в ядрах и цитоплазме, однако значительно эффективнее выявляющие его в пластидах, 3) не выявляющие ЦСБ-70 в иммуноцито-

химических тестах Вместе с тем, все три группы антител одинаково выявляли ЦСБ-70 на иммуноблотах '

С помощью моноклональных антител первой группы нам удалось показать, что ЦСБ-70 присутствует в цитоплазме клеток, максимальная его концентрация находится в ядре, особенно в ядрышке В кончике корня и надземных органах проростка ЦСБ-70 обнаруживается преимущественно в зонах клеточных делений Локализация ЦСБ-70 в зонах активней пролиферации позволяет предполагать ого участие в цитокинин-зависимой регуляции клеточных делений. Однако исследуемый белок обнаруживается не только в делящихся клетках, но и в ядрах и ядрышках клеток, закончивших деление, это может свидетельствовать о возможном участии этого белка также и о общих процессах транскрипции Моноклональные антитела второй группы позволили обнаружить реагирующий с ними белок в пластидах Оказалось, что распределение ЦСБ в пластидах зависит от степени развития в них внутренней мембранной системы' наибольшая концентрация балка обнаруживается в органеллах, где активно развивается мембранная структура Полученные нами данные указывают, что пластидный ЦСБ обладает общими иммунодетерминантами с ЦСБ-70 ядерной и цитоплазматической локализации и связан с формированием в пластидах внутренней мембранной системы.

До нашей работы не существовало данных, позволяющих предполагать участие ядерного и пластиднсго ЦСБ в одном из проявлений функциональной активности цито-кининов Полученные нами данные об аккумуляции ядерного ЦСБ-70 в зонах клеточной пролиферации позволяют ожидать участие этого белка в регуляции цитокинином деления клеток и открывают перспективу изучения механизма этого участия Соответствие накопления пластидного ЦСБ со стадией активного формирования системы внутренних мембран пластид указывает на связь ЦСБ с этими процессами и ставит задачу дальнейшего изучения этой езязи

Выгоды

1 Разработана методика иммуноцитохимического анализа с помощью моноклональных антител (мАТ) цитокинин-связывающего белка 70 кД (ЦСБ-70) на срезах органов этиолированных проростков кукурузы 2. Среди мышиных мАТ, полученных к ЦСБ-70, обнаружены две группы, различающиеся по способности выявлять антиген, что позволило установить присутствие ЦСБ-70 в цитоплазме и ядрах, а также в пластидах клеток проростка

3 С помощью мАТ первой группы ЦСБ-70 обнаружен в ядрах и ядрышках клеток всех тканей и органов этиолированных проростков кукурузы

4 Установлено, что ЦСБ-70 преимущественно накапливается в зонах клеточных делений: меристеме корня, корневом чехлике, апикальной меристеме стебля и зачаточных листьях, что указывает на его возможное участие в регуляции цитокинином деления клеток

5 Электронная микроскопия с определением локализации ЦСБ-70 с помощью мАТ и их мечения коллоидным золотом позволило установить внутриклеточную локализацию ЦСБ-70

6 С помощью мАТ второй группы впервые показано присутствие ЦСБ в зтиопластах и емилопластах Установлено, что накопление пластидного ЦСБ связано со степенью развития системы внутренних мембран в пластидах

Список работ, олубликазенных по теме диссертации

1 ФА Бровко, АО. Шеполяковская, Э.А Бурханова, ХМ Бозиев, А Г Ламан, B.C. Васильева, M А. Холл, О H Кулаева. Преимущественная локализация цитокинин-свя-зывакяцего белка (70-кД) в апикальной меристеме корня// ДАН 2001 №5 с 684-686

2 А.О Шепалякоеская, И Р Теплова, Д С Веселое, Э А Бурханова, X M Бозиев, А.Г Ламан, В С Васильева, Г.Р. Кудоярова, MA Холл, ФА Бровко, О.Н. Кулаева. Цито-кинин-связызающий белок 70 кД преимущественно локализован в меристеме корня // Физ раст. 2002. N31. с 113-120

3 VesSyeva V S , Povlik L L , Shepetynkovskays А О , Brovko FA, Mashkov D A, Kulaeva О N Imunocytochemical localization of cytokinin receptor CBP-70 in root bps tissues of maize seedlings // Signalling systems of Plant Cells: тез межд. симп 5-7 июня 2001 г Москва, 2001 с 56

4 F A Brovko, АО Shepelyakovskaya. ЕА. Burchanova, Kh.M. Boziev, AG. Laman, V S. VesByeva, MA Hall, O.N Kulaeva Predominant localization of cytoklnlne-blndlng protein (CBP-70) in the cell division zone of the apical root menstcm II Intracellular Signalling In Plant and animal Systems тез межд. симп. 9-14 сентября 2001 г Киев, 2001 с 104.

5 V S VocHyevo, LLPavllk, AL. Senina, AO Shepelyacovskaya, FA Brovko, DA Mashkov, О N. Kulaeva. Distnbution of cytokinin receptor CBP-70 ш maize shoot tissues and cells // Intracellular Signalling In Plant and animal Systems: тез межд. симп 9-14 сентября 2001 г Киев, 2001 с. 105

6 ВС. Васильева, А.Л Сенина, Е В Овчинникова. Исследование локализации белка-рецептора цитокининов ЦСБ-70 в клетке Zca mays L. иммунохимическими методами // 6-я Пущинская школа -конференция молодых ученых тез конф., 20-24 мая 2002 г. Пущино. 2002. с 221-222

7 Сенина АЛ , Васильева В С. Иммунохимяческое исследование локализации ЦСБ-70 в суспензионной культуре клеток кукурузы II 7-я Пущинская школа -конференция молодых ученых, тез. конф., 14-18 апреля 2003 г. Пущино, 2003. с. 375.

8. Васильева В С , Сенинз А.Л., Шепалякоеская А.О., Бозиев Х.М., Ламан А.Г., Аббасова С.Г., Брооко Ф.А., Кулаева О H Изучение локализации цитокинин-связывакнцего белка в проростке кукурузы // Отчетная конференция ФИБХ. тез конф. 22 января 2004 г Пущино, 2004. с 15

Отпечатано. ИП А. А. Кулаков, а Серпухов, Борисовское шоссе, 18, тел : 8-915-200-86-98, 39-11-20 Подписано в печать:20.04 2007г Тираж 100 экз.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Васильева, Виктория Сергеевна

СПИСОК УПОТРЕБЛЯЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Передача гормонального сигнала в растениях.

1.2. Передача цитокининового сигнала в растении.

1.2.1. Физиологические функции цитокининов.

1.2.2. Биосинтез цитокининов.

1.2.3. Механизм трансдукции цитокининового сигнала.

1.2.3.1. Мембранные рецепторы цитокининов гибридные гистидиновые протеинкиназы.

1.2.3.2. Трансдукция сигнала внутри клетки: фосфотрансмиттеры.

1.2.3.3. Гены первичного ответа на цитокинин и их продукты - регуляторы ответа.

1.2.3.4. Передача цитокининового сигнала через мембранный рецептор, общая схема.

1.2.3.5. Цитоплазматическиерецепторы цитокинина.

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1 Материалы и методы исследования.

2.1.1. Объекты исследования.

2.1.2. Выделение растворимых растительных белков для подбора условий иммуноцитохимического анализа ЦСБ-70.

2.1.3. Выделение ЦСБ-70 для анализа специфичности моноклональных антител разных групп.

2.1.4. Измерение концентрации белка.

2.1.5. Проведение аналитического электрофореза и иммуноблоттинга ЦСБ-70.

2.1.6. Иммуноферментный анализ влияния фиксации и дегидратации на сохранение иммунореактивности ЦСБ-70.

2.1.7. Иммуноферментный анализ влияния химических реагентов на сохранение иммунореактивности ЦСБ-70.

2.1.8. Фиксация и заливка в смолу растительной ткани.

2.1.9. Выявление ЦСБ-70 на полутонких срезах для световой микроскопии с помощью иммуномечения.

2.1.10. Выявление ЦСБ-70 на ультратонких срезах для электронной микроскопии с помощью иммуномечения.

2.1.11. Количественная оценка выявления ЦСБ-70 с помощью электронной микроскопии в компартментах клеток проростка кукурузы.

2.2. Результаты и обсуждение.

2.2.1. Разработка методов иммуноцитохимического исследования локализации ЦСБ-70 в тканях и клетках проростка кукурузы.

2.2.1.1. Исследование воздействия наЦСБ-70 реагентов, используемых для обработки растительного материала.

2.2.1.2. Подбор условий для иммобилизации растительного материала в полимерную среду.

2.2.1.3. Подбор условий для иммуноцитохимического выявления ЦСБ-70 на срезах растительной ткани.

2.2.2. Подбор антител для дифференцированного выявления ЦСБ-70 в органеллах растительных клеток.

2.2.3. Иммуноцитохимическое исследование локализации ЦСБ-70 в цитоплазме и ядрах клеток проростка кукурузы.

2.2.4. Иммуноцитохимическое исследование локализации ЦСБ-70 в пластидах клеток проростка кукурузы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение иммуноцитохимическими методами локализации цитокинин-связывающего белка 70 кД в тканях и клетках этиолированных проростков кукурузы"

Одна из самых существенных особенностей жизненных процессов заключается в способности организма самостоятельно регулировать и координировать свои метаболические реакции. У растений весьма эффективными биорегуляторами, оказывающими влияние на все этапы жизнедеятельности, включая рост и развитие, являются фитогормоны. В отличие от сигнальных веществ других многоклеточных организмов, растительные гормоны полифункциональны и способны воздействовать при определенных обстоятельствах на любые ткани организма, вызывая различные изменения физиологических процессов в зависимости от баланса фитогормонов и состояния клеток-мишеней. Большинство исследователей считает, что объяснение необычных свойств фитогормонов, нужно искать на уровне рецепции гормональных сигналов. Исследования в этой области важны не только для фундаментальной науки, на их основе возможно создание растений со свойствами, удовлетворяющими современным требованиям к урожайности и устойчивости к стрессовым условиям.

Фитогормонами являются природные органические соединения, которые в малых концентрациях могут проявлять регулирующее воздействие на процессы роста и развития, а также на многие другие физиологические программы растений. К растительным гормонам относят небольшие молекулы, с молекулярным весом до 1 кД, способные беспрепятственно проникать в клетку и транспортироваться (активно или пассивно) по растению, влияя на ткапь-мишень. Шестью основными гормонами растений являются ауксины, цитокинины, гиббереллины, брассиностероиды, этилен, и абсцизовая кислота. Цитокинины представляют собой гормоны растений, участвующие в регуляции таких важнейших процессов, как деление клеток, дифференцировка побегов, рост клеток листа, биогенез хлорогшастов, задержка старения листьев, устьичные движения, ответ растений на стресс и многие другие [Кулаева О.Н., 1973]. Однако каким образом выполняются столь различные функции до сих пор неясно. В связи с этим очевидна теоретическая и практическая значимость исследований механизма действия этого класса гормонов.

В настоящее время открыты гены первичного ответа на цитокинин. В 2001 г. [InoueT. et al., 2001; Ueguchi С. et al., 2001] был открыт мембранный рецептор цитокининов. Он относится к так называемой двухкомпонентной регуляторной системе, включающей в себя трансмембранный рецептор, который является сенсорной гистидин-киназой, она взаимодействует с цитоплазматическим белком - переносчиком фосфатной группировки в ядро на цитокинин-зависимый трансфактор, включающий гены первичного ответа на цитокинин. Таким образом, мембранный рецептор передает цитокининовый сигнал через сеть внутриклеточных мессенджеров. Показано, что подобная система трансдукции работает и в случае других гормонов растений, например, этилена [Stock A.M. et al., 2000]. Однако, в литературе есть данные о содержании цитокининов в цитоплазме, ядре и хлоропластах [Sossountzov L. et al., 1988; Ivanova M. et al., 1994; Benkova E. et al., 1999; Kasahara H. et al., 2004]. В связи с этим, можно предполагать существование альтернативных, внутриклеточных форм рецепторов для этих гормонов. Один из таких белков - цитокинин-связывающий белок (ЦСБ) 67 кД, был выделен из клеток листьев ячменя [Kulaeva O.N. et al., 1995]. Он способен регулировать транскрипцию в системе in vitro, содержащей цитокинин. В нашей лаборатории из этиолированных проростков кукурузы также был выделен цитокинин-связывающий белок со свойствами рецептора - ЦСБ-70 [Бровко Ф.А. и др., 1996]. К нему была получена панель моноклональных антител, с помощью которых было показано, что ЦСБ-70 имеет общие иммунодетерминанты с ЦСБ-67, и способен заменять его в опытах по активации транскрипции в системе из листьев ячменя [Kulaeva O.N. et al., 1998]. Внутриклеточный цитокинин-связывающий белок, связываясь с цитокинином, активируется и проникает в ядро или другие ДНК-содержащие органеллы, где принимает участие в регуляции транскрипции.

Применение методов иммунохимии с использованием высокоспецифичных моноклональных антител даст возможность установления внутриклеточной локализации ЦСБ-70. Исследование же корреляции между содержанием рецепториого белка в тканях и активностью в них гормон-регулируемых процессов, несомненно, помогло бы прояснить многие аспекты его функционирования.

Исходя из сказанного выше, цель данной работы - изучить тканевую и клеточную локализацию цитокинин-связывающего белка ЦСБ-70. Для ее достижения мы выделили следующие задачи:

1. Подобрать условия выявления с помощью моноклональных антител на срезах этиолированных проростков кукурузы.

2. Подобрать антитела для дифференцированного выявления ЦСБ-70 в органеллах растительных клеток.

3. Исследовать локализацию ЦСБ-70 в ядрах различных типов тканей этиолированных проростков кукурузы с помощью сочетания методов иммуноцитохимии, световой и электронной микроскопии.

4. С помощью сочетания методов иммуноцитохимии, световой и электронной микроскопии исследовать особенности локализации ЦСБ-70 в пластидах разных типов клеток этиолированных проростков кукурузы.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Васильева, Виктория Сергеевна

ВЫВОДЫ

1. Разработана методика иммуноцитохимического анализа с помощью моноклональных антител (мАТ) цитокинин-связывающего белка 70 кД (ЦСБ-70) на срезах органов этиолированных проростков кукурузы.

2. Среди мышиных мАТ, полученных к ЦСБ-70, обнаружены две группы, различающиеся по способности выявлять антиген, что позволило установить присутствие ЦСБ-70 в цитоплазме и ядрах, а также в пластидах клеток проростка.

3. С помощью мАТ первой группы ЦСБ-70 обнаружен в ядрах и ядрышках клеток всех тканей и органов этиолированных проростков кукурузы.

4. Установлено, что ЦСБ-70 преимущественно накапливается в зонах клеточных делений: меристеме корня, корневом чехлике, апикальной меристеме стебля и зачаточных листьях, что указывает на его возможное участие в регуляции цитокинином деления клеток.

5. Электронная микроскопия с определением локализации ЦСБ-70 с помощью мАТ и их мечения коллоидным золотом позволила установить внутриклеточную локализацию ЦСБ-70.

6. С помощью мАТ второй группы впервые показано присутствие ЦСБ в этиопластах и амилопластах. Установлено, что накопление пластидного ЦСБ связано со степенью развития системы внутренних мембран в пластидах.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Передача гормонального сигнала в растении является одной из основных областей исследования современной физиологии растений. В настоящее время большое внимание уделяется изучению путей рецепции и трансдукции цитокининового сигнала в растительной клетке. На сегодняшний день установлена и продолжает изучаться система цитокининовой регуляции, включающая мембранные сенсорные гистидин-киназы CRE1 (АНК4), АНК2, и АНКЗ [Grefen Ch., Harter К., 2004; Hutchison С.Е., KieberJ.J., 2002], белки-фосфотрансмиттеры AHP и регуляторы ответа ARR групп А и В. Однако, блокирование способности рецепторных гистидип-киназ связывать гормон в тройном мутанте арабидопсиса не выключает механизм цитокинииовой регуляции полиостью. Это говорит о существовании альтернативной системы восприятия и передачи цитокининового сигнала. Предположительно, цитокинин-связывающие белки ЦСБ-67, выделенный из листьев ячменя, и ЦСБ-70 из этиолированных проростков кукурузы, а также ЦСБ 64 кД, выделенный из хлоропластов ячменя, входят в такую систему.

Основным результатом данной работы является разработка методики иммуноцитохимического исследования ЦСБ-70 в этиолированном проростке кукурузы и установление локализации этого белка в компартментах растительной клетки. Предварительная работа с ЦСБ-70 показала, что этот белок весьма чувствителен к воздействию окислителей, повышенных температур, изменения рН. На белковых экстрактах, выделенных из проростков, было проверено влияние различных реагентов, используемых для обработки растительного материала в процессе фиксации подготовки к иммуномечению, на сохранение иммунореактивности ЦСБ-70. Было обнаружено, что высокие концентрации глутарового альдегида в фиксаторе затрудняют выявление ЦСБ-70, причем попытки обрабатывать растительный материал периодатом натрия, рекомендуемые для уменьшения последствий перефиксации, отрицательно влияют на иммупореактивность исследуемого белка. Вследствие этого, был выбран фиксатор содержащий минимальное количество глутарового альдегида. При подборе способа выявления ЦСБ-70 на срезе, нами была учтена такая особенность растительной ткани, как наличие эндогенной пероксидазы. Оказалось, что реагенты, используемые обычно для ингибирования этого фермента (НС1, Н2О2), также оказывают негативное влияние на сохранение иммунных детерминант ЦСБ-70, поэтому было решено использовать в качестве ферментной метки щелочную фосфатазу.

Процедура иммуноцитохимического выявления ЦСБ-70 подбиралась с использованием разных вариантов контроля: исключение моноклональных антител к ЦСБ-70, замена их па моноклональные антитела к белку, заведомо отсутствующему в растительных тканях и использование вместо специфических антител преиммунной сыворотки. Это позволило добиться минимального уровня фонового окрашивания на срезах растительных образцов. Для оптимального усиления специфической реакции иммуномечения нами была выбрана стрептавидин-биотиновая система. В исследованиях с помощью световой микроскопии ее использовали с дополнительным усилением, путем повторной обработки срезов биотипилированными вторыми антителами и стрептавидин-ферментным коньюгатом.

Использование панели мышиных моноклональных антител к ЦСБ-70 для проведения иммуноцитохимической реакции показало, что по способности выявлять антиген антитела делятся на 3 группы: 1) выявляющие белок в цитоплазме и ядрах растительных клеток; 2) способные узнавать белок в ядрах и цитоплазме, однако значительно эффективнее выявляющие его в пластидах; 3) не выявляющие ЦСБ-70 в иммуноцитохимических тестах.

Моноклональные антитела второй группы позволили обнаружить реагирующий с ними белок в пластидах. Оказалось, что распределение ЦСБ-70 в пластидах зависит от степени развития в них внутренней мембранной системы. В тех пластидах, где система внутренних мембран находится на начальном этапе развития, или напротив, уже образовалось проламеллярное тело, количество белка, реагирующего с антителами, меньше, чем в тех органеллах, где мембранная структура развивается активно. Полученные данные о локализации в пластидах белка, выявляемого антителами к ЦСБ-70, указывают на возможную способность исследуемого белка влиять на процессы, происходящие в этих органеллах на стадии развития внутренней мембранной системы. Как показано в нашей лаборатории, в пластидах этиолированных проростков кукурузы присутствует ЦСБ-70, обладающий способностью активировать в комплексе с т/?ш/с-зеатином синтез РНК in vitro в транскрипционной системе хлоропластов. Полученные нами данные показали, что пластидный ЦСБ обладает общими иммунодетерминантами с ЦСБ-70 ядерной и цитоплазматической локализации. Эти иммунодетерминанты узнаются моноклональными антителами второй группы. Вместе с тем, пластидный белок не узнается первой группой антител к ЦСБ-70. Это подчеркивает различие этих белков или различие в конформации и окружении, которые могли бы экранировать соответствующие эпитопы. Полученные данные позволяют утверждать, что в пластидах существует белок, родственный ЦСБ-70 ядра и цитоплазмы. Поскольку белок активирует транскрипцию в хлоропластной транскрипционной системе, он функционально близок ядерному ЦСБ, участвующему в цитокинин-зависимой активации транскрипции.

Таким образом, есть все основания заключить, что в клетках этиолированных проростков кукурузы есть 2 типа ЦСБ: ядерной локализации, который участвует в регуляции транскрипции в ядре, и, по-видимому, имеет отношение к регуляции цитокинином деления клеток, и пластидный белок, который участвует в регуляции транскрипции в пластидах и связан с формированием в пластидах внутренней мембранной системы. До нашей работы не существовало данных, позволяющих предполагать участие ядерного и пластидного ЦСБ-70 в одном из проявлений функциональной активности цитокининов. Полученные нами данные об аккумуляции ядерного ЦСБ-70 в зонах клеточной пролиферации позволяют ожидать участие этого белка в регуляции цитокинином деления клеток и открывают перспективу изучения механизма этого участия.

Соответствие накопления пластидного ЦСБ со стадией формирования системы внутренних мембран пластид указывает на связь ЦСБ с этими процессами и ставит задачу дальнейшего изучения этой связи.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Васильева, Виктория Сергеевна, Пущино

1. Аверина Н.Г. Механизмы регуляции и внутрипластидная локализация биосинтеза хлорофилла//Биол. мембраны. 1998. т. 15. № 5. с. 504-516.

2. Ананиев Е., Шакирова Ф.М., Клячко H.JL, Кулаева О.Н. Влияние цитокинина на образование полисом из предшествующих мРНК и рибосом // ДАН. 1980. т. 255. с. 508-510.

3. Бровко Ф.А., Шепеляковская А.О., Бурханова Э.А., Бозиев Х.М., Ламан А.С., Васильева B.C., Холл М.А., Кулаева О.Н. Преимущественная локализация цитокининсвязывающего белка (70 кД) в апикальной меристеме корня // ДАН. 2001. т. 381. №5. с. 684-686.

4. Бурханова Э.А., Федина А.Б., Дмитриева Г.Н., Кулаева О.Н. Влияние цитокинина на активность РНК-полимеразы в ядрах, выделенных из протопластов // ДАН. 1980. т. 252. вып. 2. с. 488-491.

5. Заграничная Т.К., Бровко Ф.А., Шепеляковская А.О., Бозиев Х.М., Липкин В.М. Моноклональные антитела к цитокинин-связывающему белку 70 кД из этиолированных проростков кукурузы // Физиология растений. 1997. т. 44. с. 5-10.

6. Каравайко Н.Н., Мошков И.Е., Селиванкина С.Ю., Новикова Г.В., Кулаева О.Н. Выделение при помощи антиидиотииических антител белка со свойствами рецептора цитокининов // ДАН. 1990. т. 310. № 3. с. 765-767.

7. Кулаева О.Н. Гормональная регуляция физиологических процессов у растений на уровне синтеза РНК и белка. М.: Наука, 1982. 84 с.

8. Кулаева О.Н. Цитокинины, их структура и функция. М.: Наука, 1973. 264 с.

9. Кулаева О.Н., Кузнецов В.В. Новейшие достижения и перспективы в области изучения цитокининов // Физиология растений, 2002. Т. 49, № 4, с. 626-640.

10. Кулаева О.Н., Кузнецов В.В. Новейшие достижения и перспективы изучения механизма действия фитогормонов и их участия в сигнальных системах целого растения // Вестник РФФИ. 2004. № 2 (36). с. 12-36.

11. Кулаева О.Н., Прокопцева О.С. Новейшие достижения в изучении механизма действия фитогормонов // Биохим. 2004. т. 69. № 3. с. 233-247.

12. Курсанов А.Л., Кулаева О.Н., Свешникова И.Н., Попова Э.А., Болякина Ю.П., Клячко Н.Л., Воробьева И.П. Восстановление клеточных структур и обмена веществ в желтых листьях под действием 6-бензиламинопурина // Физиология растений. 1964. т. 11. с. 838-847.

13. Микулович Т.П., Хохлова В.А., Кулаева О.Н., Свешникова И.Н. Влияние 6-бензиламинопурина на изолированные семядоли тыквы // Физиология растений. 1971. т. 18. с. 98.

14. Миронов А.А., Комиссарчик Я.Ю., Миронов В.А. Методы электронной микроскопии в биологии и медицине. С-Пб.: Наука, 1994. 399 с.

15. Свешникова И.Н., Кулаева О.Н. Болякина Ю.П. Образование ламелл и гран в хлоропластах желтых листьев под дейетием 6-бензиламинопурина // Физиология растений. 1966. т. 13. с. 769.

16. Селиванкина С.Ю., Каравайко Н.Н., Земляченко Я.В., Маслова Г.Г., Кулаева О.Н. Регуляция транскрипции рецептором цитокинина в системах in vitro // Физиология растений. 2001. т. 48. с. 434-440.

17. Селиванкина С.Ю., Каравайко Н.Н., Черепнева Г.Г., Прищепова А.Е., Кузнецов В.В., Кулаева О.Н. Биологически активный зеатин-связывающий белок из хлоропластов листьев ячменя // ДАН. 1997. т. 356. № 6. с. 830-832.

18. Селиванкина С.Ю., Зубо Я.О., Зубкова Н.К., Кудрякова Н.В., Кулаева О.Н., Кузнецов В.В. Цитокинин контролирует Транскрипцию генов рРНК в зеленеющих листьях ячменя // Докл. биохим. биофиз. 2004. т. 397. с. 258-260.

19. Хохлова В.А., Свешникова И.Н., Кулаева О.Н. Влияние фитогормонов на формирование структуры хлоропластов в изолированных семядолях тыквы // Цитология. 1978. т. 20. с. 1033-1038.

20. Хохлова В.А., Каравайко Н.Н., Подергина Т.А., Кулаева О.Н. Антагонизм в действии абсцизовой кислоты и цитокинина на структуру и биохимическую дифференцировку хлоропластов в изолированных семядолях тыквы // Цитология. 1978. т. 29. с. 10331039.

21. Aloni R., Langhans M., Aloni E., Dreieicher E., Ullrich C.I. Root-synthesized cytokinin in Arabidopsis is distributed in the shoot by the transpiration stream // J. Exp. Bot. 2005. v. 56 pp. 1535-1544.

22. Allison L.A. The role of sigma factor in plastid transcription // Biochimie. 2000. v. 82. pp. 537548

23. Amador V., Monte E., Garci'a-Martinez J.-L., and Prat S. Gibberellins signal nuclear import of PHOR1, a photoperiod-responsive protein with homology to Drosophila armadillo // Cell. 2001. v. 106. pp. 343-354.

24. Anantharaman V., Aravind L. The CHASE domain: a predicted ligand-binding module in plant cytokinin receptors and other eukaryotic and bacterial receptors // Trends Biochem. Sci. 2001. v. 26. pp. 579-582.

25. Aoyama Т., Oka A. Cytokinin signal transduction in plant cells // J. Plant Res. 2003. v. 116. pp. 221-231.

26. Avrameas S. Coupling of enzymes to proteins with glutaraldehyde. Use of the conjugates for the detection of antigens and antibodies // Immunochem. 1969. v. 6. pp. 43-47.

27. Barkan A., Goldschmidt-Clermont M. Participation of nuclear genes in chloroplast gene expression // Biochimie. 2000. v. 82. pp. 559-572.

28. Batt S., Venis M.A. Separation and localization of two classes of auxin-binding sites in corn coleoptile membranes // Planta. 1976. v. 130. pp. 15-21.

29. Benkova E., Witters E., van Dongen W., Kolar J., Motyka V., Brzobohaty В., van Onckelen H.A., Machackova I. Cytokinins in tobacco and wheat chloroplasts. Occurrence and changes due to light/dark treatment// Plant Physiol. 1999. v. 121. pp. 245-251.

30. Bligny M., Courtois F., Thaminy S., Chang Ch.-Ch., Lagrange Th., Baruah-Wolf J., Stern D., Lerbs-Maehe S. Regulation of plastid rDNA transcription by interactions of CDF2 with two different RNA polymerases // EMBO J. 2000. v. 19. pp. 1850-2000.

31. Bodescu G.O., Napier R.M. Receptors for auxin: will it all and in TIRs? // Tr. In PI. Sci. 2006. v. 11, pp. 217-223.

32. Bradford M.M. A rapid and sensitive method of the quantitation of microgram quantities of protein using the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. v. 72. № 1. pp.248-254.

33. Bronsema F.B.F., van Oostveen W.J.F., van Lammeren A.A.M. Immunocytochemical localization of auxin-binding proteins in coleoptiles and embryos of lea mays L. II Protoplasma. 1998. v. 202. pp. 65-75.

34. Che P., Gingerich D.J., Lall S., Howell S.II. Global and hormone-induced gene expression changes during shoot development in Arabidopsis I/ Plant Cell. 2002. v. 14. pp. 2771-2785.

35. Chen J.G., Ullah H., Young J.C., Sussman M.R., Jones A.M. ABP1 is required for organized cell elongation and division in Arabidopsis embryogenesis 11 Genes Dev. 2001. v. 15. pp. 902911.

36. Chen Yi-F., Randlett M.D., Findell J.L., Schaller G.E. Localization of the Ethylene Receptor ETR1 to the Endoplasmic Reticulum of Arabidopsis II J. Biol. Chem. 2002. v. 277. pp. 19861-19866.

37. Craig S., Goodchild D.J. Post-embedding immunolabelling. Some effects of tissue preparation on the antigenicity of plant proteins // Eur. J. of Cell Biol. 1982. v. 28. pp. 251-256.

38. D'Agostino I.B., Deruere J., Kieber J.J. Characterization of the response of the Arabidopsis response regulator gene family to cytokinin // Plant Physiol. 2000. v. 124. pp. 1706-1717.

39. Dill A., Jung H.-S., Sun T.-P. The DELLA motif is essential for gibberellin-induced degradation of RGA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. v. 98. pp. 14162-14167.

40. Dill A., Thomas S.G., Hu J., Steber C.M., Sun T.-P. The Arabidopsis F-box protein SLEEPY 1 targets gibberellin signaling repressors for gibberellin-induced degradation // Plant Cell. 2004. v. 16: pp. 1392-1405.

41. Dodds J.H. Experiments in plant tissue culture. Cambridge University Press, 1995.231 p.

42. Dubell A.N., Mullet J.E. Differential transcription of Pea chloroplast genes during light-induces leaf development// Plant Physiol. 1995. v. 1995. pp. 105-112.

43. Fasulo M.P. Kinetin counteracts the myomycin inhibitory effect on plastid differentiation in excised cucumber cotyledons // Biohem. Physiol. Pflanzen. 1980. v. 175. pp. 322-326.

44. Flores S., Tobin E.M. Cytokinin modulation of LHCP mRNA levels: the involvement of posttranscriptional regulation // Plant Mol. Biol. 1988. v. 11. pp. 409-417.

45. Gaudino R.J., Pikaard C.S. Cytokinin induction of RNA polymerase I transcription in Arabidopsis thaliana II J. Biol. Chem. 1997. v. 272. № 10. pp. 6799-6804.

46. Golovko A., Sitbon F., Tillberg E., Nicander B. // Plant Mol. Biol. 2002. v. 49. pp. 161-169.

47. Grefen Ch., Harter K. Plant two-component systems: principles functions, complexity and cross talk // Planta. 2004. v. 219. pp. 733-742.

48. Haberer G., Kieber J.J., Cytokinins: new insights into a classic phytohormone // Plant Physiol. 2002. v. 128. pp. 359-362.

49. Hall A.E., Findell J.L., Schaller G.E., Sisler E.C., Bleecker A.B. Ethylene perception by the ERS1 protein in Arabidopsis // Plant Physiol. 2000. v. 123. pp 1449-1458.

50. Hall J.M., Couse J.F., Korach K.S. The multifaceted mechanisms of estrogen receptor signaling // J. Biol. Chem. 2001. v. 276. pp. 36869-36872.

51. Hare P.D., van Staden J. The molecular basis of cytokinin action // Plant Growth Regul. 1997. v. 23. pp. 41-78.

52. Hess W.R., Borner Th. Organellar RNA polymerases of higher plants // Int. Rev. Cytol.1999. v. 190. pp. 1-59.

53. Hua J., Sakai H., Nourizadeh S., Chen Q.G., Bleecker A.B., Ecker J.R., Meyerowitz E.M. EIN4 and ERS2 are members of the putative ethylene-receptor gene family in Arabidopsis // Plant Cell. 1998. v. 10. pp. 1321-1332.

54. Hutchison C.E., Kieber J.J. Cytokinin Signaling in Arabidopsis II The Plant Cell. 2002. v. 14. pp. 47-59.

55. Jacobs M., Connell L., Cattolico R.A. A conserved His-Asp signal response regulator-like in Heterosigma akashiwo chloroplasts // Plant Mol. Biol. 1999. v. 41, pp. 645-655.

56. Jacobsen S.E., Olszewski N.E. Mutations at the SPINDLY locus of Arabidopsis alter gibberellin signal transduction // Plant Cell. 1993. v. 5. pp. 887-896.

57. Jensen E.V. Overview of Nuclear Receptor Family. In: Nuclear hormone receptors molecular mechanisms, cellular functions and clinical abnormalities/ ed. Parker M. London: Academic Press. 1991. pp. 1-13.

58. Jones A.M., Herman E.M. KDEL-containing auxin-binding protein is secreted to the plasma membrane and cell wall//Plant Physiol. 1993. v. 101. pp. 595-606.

59. Johnstone A., Thorpe R. Immunochemistry in Practice. N.-Y.: Blackwell Science Publications. 1982. 394 p.

60. Kakimoto T. CKI-1 a histidine kinase homologue implicated in cytokinin signal transduction // Science. 1996. v. 274. pp. 982-985.

61. Kakimoto T. Plant cytokinin biosynthetic enzymes as dimethylallyl diphosphate: ATP/ADP isopentenyltransferases // Plant Cell Physiol. 2001. v. 42. pp. 677-685.

62. Kasahara H., Takei K., Ueda N., Hishiyama Sh., Yamaya Т., Kamiya Yu., Yamaguchi Sh., Sakakibara H. Distinct isoprenoid origins of cis- and trans-zzatin biosyntheses in Arabidopsis II J. Biol. Chem. 2004. v. 279. № 14. pp. 14049-14054.

63. Kende H., Zeevaart A.D. The five "classical" plant hormones // The Plant Cell. 1997. v. 9. pp. 1197-1210.

64. Kim M., Christopher D.A., Mullet J.E. ADP-dependent phosphorylation regulates association of a DNA-binding complexwith the Barley chloroplast psbD blue-ligt-responsive promoter // Plant Physiol. 1999. v. 119. pp. 663-670.

65. Kim Y.S., Kim D.H., Jung J. Isolation of a novel auxin-receptor from soluble fractions of rice (Oryza sativa L.) shoots // FEBS Lett. 1998. v. 438. pp. 241-244.

66. Kulaeva O.N., Karavaiko N.N., Moshkov I.E., Selivankina S.Yu., Novikova G.V. Isolation of a protein with cytokinin-receptor properties by means of anti-idiotype antibodies // FEBS Lett. 1990. v. 261. № 1. pp. 410-412.

67. Kulaeva O.N., Karavaiko N.N., Selivankina S. Yu., Zemlyachenko Ya.V., Shipilova S.V. Receptor of trans-zeatin involved in transcription activation by cytokinin // FEBS Lett. 1995. v. 366. pp. 26-28.

68. Kulaeva O.N., Karavaiko N.N., Selivankina S.Yu., Moshkov I.E., Novikova G.V., Zemlyachenko Ya.V., Shipilova S.V., Orudgev E.M. Cytokinin signaling systems // Plant Growth Regul. 1996. v. 18. pp. 29-37.

69. Kulaeva O.N., Zagranichnaya Т.К., Brovko F.A., Karavaiko N.N., Selivankina S.Yu., Zemlyachenko Ya.V., Hall M., Lipkin V.M., Boziev Kh.M. A new family of cytokinin receptors from Cereales // FEBS Lett. 1998. v. 423. pp. 239-242.

70. Maliga P. Two plastid RNA-polymerases of higher plants: a evolving story // Trends Plant Sci. 1998. v. 3. pp. 4-6.

71. McGinnis K.M., Thomas S.G., Soule J.D., Strader L.C., Zale J.M., Sun T.-P., Steber C.M. The Arabidopsis SLEEPY 1 gene encodes a putative F-box subunit of an SCF E3 ubiquitin ligase //Plant Cell. 2003. v. 15: pp. 1120-1130.

72. Melan M.A. Overview of cell fixation and permeabilization // Methods Mol. Biol. 1994. v. 34. pp. 55-66.

73. Mendel D.D., Bodwell J.E., Gametchu B. The role of Heat Shock proteins in regulation of the function of the glucocorticoid receptor//J. Biol. Chem. 1986. v. 261. pp. 3758-3763.

74. Miyawaki K., Matsumoto-Kitano M., Kakimoto T. Expression of cytokinin biosynthesis isopentenyltransferase genes in Arabidopsis: tissue specificity and regulation by auxin, cytokinin and nitrate // The Plant J. 2004. v. 37. pp. 128-138.

75. Мок M.C. Cytokinins and plant development An overview // Cytokinins: Chemistry, activity and functions. Boca Raton: CRC Press, 1994. p. 155-166.

76. Мок D.W., Мок M.C. Cytokinin metabolism and action // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 2001. v. 52. pp. 89-118.

77. Monte E., Amador V., Russo E., Martinez-Garcia J., Prat S. PHOR1: a U-box GA signaling component with a role in proteasome degradation? // J. Plant Growth Regul. 2003. v. 22. pp.152-162.

78. Napier R.M., Venis M.A. Epitope mapping reveals conserved regions of an auxin-binding protein // Biochem. J. 1992. v. 284. pp. 841-845.

79. Oelmiiller R. Photooxidative destruction of chloroplasts and its effect on nuclear gene expression and extraplastidic enzyme levels // Photochem. Photobiol. 1989. v. 49. pp. 229-239.

80. Ogawa M., Kusano Т., Katsumi M., Sano H. Rice gibberellin-insensitive gene homolog, OsGAI, encodes a nuclear-localized protein capable of gene activation at transcriptional level // Gene. 2000. v. 245. pp. 21-29.

81. Parthier В. The role of phytohormones (eytokinins) in ehloroplast development // Biochem. Physiol. Pflanz. 1979. v. 174. pp. 173-214.

82. Pelletier G., Morel G. Immunoenzyme techniques at the electron microscopical level // Immunolabelling for electron microscopy.: Amsterdam: Elsevier, 1984. pp. 83-93.

83. Peng J., Carol P., Richards D.E., King K.E., Cowling R.J., Murphy G.P., Harberd N.P. The Arabidopsis GAI gene defines a signaling pathway that negatively regulates gibberellin responses // Genes Dev. 1997. v. 11. pp. 3194-3205.

84. Pischke M.S., Jones L.G., Otsuga D., Fernandez D.E., Drews G.N., Sussman M.R. An Arabidopsis histidine kinase is essential for megagametogenesis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. v. 99. pp. 15800-15805.

85. Rashotte A.M., Carson S.D.B., To J.P.C., Kieber J.J. Expression profiling of cytokinin action in Arabidopsis II Plant Physiol. 2003. v. 132. pp. 1998-2011.

86. Razem F.A., Luo M., Liu J.-H., Abrams S.R., Hill R.D. Purification and characterization of a barley aleurone abscisic acid-binding protein // J. Biol. Chem. 2003. v. 279. pp. 9922-9929.

87. Razem F.A., El-Kereamy A., Abrams S.R., Hill R.D. The RNA-binding protein FCA is an abscisic acid receptor//Nature. 2006. v. 439. pp. 227-228.

88. Ritchie S., Gilroy S. Abscisic acid signal transduction in the barley aleurone is mediated by phospholipase D activity // Plant Biol. 1998. v. 95, pp. 2697-2702.

89. Rodermel S. Pathways of plastid-to-nucleus signaling // Trends Plant Sci. 2001. v. 6. pp. 471478.

90. Roland J.C., Vian В. General preparation and staining of thin sections // Electron microscopy of plant cells. London: Academic Press, 1991. pp. 1-66.

91. Sakakibara H., Suzuki M„ Takei K., Deji A., Taniguchi M., Sugiyama T.A. Response-regulator homologue possibly involved in nitrogen signal transduction mediated by cytokinin in maize // Plant J. 1998. v. 14. pp. 337-344.

92. Schaller G.E., Ladd A.N., Lanahan M.B., Spanbauer J.M., Bleecker A.B. The ethylene response mediator ETR1 from Arabidopsis forms a disulfide-linked dimmer // J. Biol. Chem. 1995. v. 270. pp. 12526-12530.

93. Silverstone A.L., Мак P.Y.A., Casamitjana Martinez E., and Sun T.-P. The new RGA locus encodes a negative regulator of gibberellin response in Arabidopsis thaliana II Genetics. 1997. v. 146. pp. 1087-1099.

94. Sossountzov L., Maldiney R., Sotta В., Subbagh I., Habricot Y., Bonner M., Miginias E. Immunocytochemical localization of cytokinins in Graigella tomato and a side-shoot less mutant // Planta. 1988. v. 175. pp. 291-304.

95. Spurr A.R. A low viscosity epoxy resin embedding medium for electron microscopy // J. Ultrastruc. Res. 1969. v. 26. pp. 31-43.

96. Sternberger L.A., Sternberger N.H. The unlabelled antibody method: comparison of peroxidase-antiperoxidase with avidin-biotin complex by a new method of quantification // J. Histohem. Cytochem. 1986. v. 34. pp. 599-602.

97. Stock A.M., Robinson V.L., Goudreau P.N. Two-component signal transduction // Annu. Rev. Biochem. 2000. v. 97. pp. 14778-14788.

98. Suzuki Т., Imamura A., Ueguchi C., Mizuno T. Histidine-containing phosphotransfer (HPt) signal transducers implicated in His-to-Asp phosphorelay in Arabidopsis И Plant Cell Physiol. 1998. v. 39. pp. 1258-1268.

99. Suzuki Т., Miwa К., Ishikawa К., Yamada H., Aiba H., Mizuno Т. The Arabidopsis sensor His-kinase, AHK4, can respond to cytokinins // Plant Cell Physiol. 2001. v. 42. pp. 107-113.

100. Swain S.M., Tseng T.-S., Thornton Т., Gopalraj M., Olszewski N.E. SPINDLY is a nuclear-localized repressor of gibberellin signal transduction expressed throughout the plant // Plant Physiol. 2002. v. 129. pp. 605-615.

101. Takei K., Sakakibara H., Sugiyama T. Identification of genes encoding adenilate isopentenyltransferase, a cytokinin biosynthesis enzyme, in Arabidopsis thaliana II J. Biol. Chem. 2001. v. 276. pp. 26405-26410.

102. Takei K., Yamaya Т., Sakakibara H. Arabidipsis CYP735A1 and CYP735A2 encode cytokinin hydroxylases that catalyze the biosynthesis of trans-zeatin // J. Biol. Chem. 2004. v. 279. pp. 41866-41872.

103. Taniguchi M., Kiba Т., Sakakibara H., Ueguchi C., Mizuno Т., Sugiyama T. Expression of Arabidopsis response-regulator homologies is induced by cytokinin and nitrate // FEBS Lett. 1998. v. 429. pp. 259-262.

104. Thornton T.M., Swain S.M., Olszewski N.E. Gibberellin signal transduction presents ellipsis the SPY who O-GlcNAc'd me // Trends Plant Sci. 1999. v. 4. pp. 424^128.

105. Timms B.G. Postembedding immunogold labeling for electron microscopy using "LR White" resin // Am. J. Anat. 1986 v. 175. v. 267-275.

106. Tsai M.J., O'Malley B.W. Molecular mechanisms of action of steroid. Thyroid receptor super family members//Annu. Rev. Biochem. 1994. v. 63. pp. 451-486.

107. Ueguchi C., Koizumi H., Suzuki Т., Mizuno T. Novel family of sensor histidine kinase genes in Arabidopsis thaliana IУ Plant Cell Physiol., 2001. v. 42, pp. 231-235.

108. Ueguchi-Tanaka M., Ashikari M., Nakajina M, et al. Gibberellin insensitive dwarfl encodes a soluble receptor for gibberellin // Nature. 2005. v. 437. pp. 627-628.

109. Wang X. The role of phospholipase D in signal cascades // Plant Physiol. 1999. v. 120. pp. 645651.

110. Werner Т., Motyka V., Strnad M., Schmiilling T. Regulation of plant growth by cytokinin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. v. 98. pp. 10487-10492.

111. Wilchek M., Bayer E.A. The avidin-biotin complex in bioanalytical applications // Anal. Biochem. 1988. v. 171. pp. 1-32.

112. Yakovleva L.A., Kulaeva O.N. The effect of phytohormones on phosphorylation of ribosomal proteins in detached pumpkin cotyledons // Biochem. Physiol. Pflanz. 1987. v. 182. pp. 359365.

113. Yonekura-Sakakibara K., Kojima M., Yamaya Т., Sakakibara H. Molecular characterization of cytokinin-responsive histidine kinases in maize. Differential ligand preferences and response to c/j-zeatin // Plant Physiol. 2004. v. 134, pp. 1654-1661.

114. Zhang D.-P., Wu Z.-Y., Li X.-Y., Zhao Z.-X. Purification and identification of a 42-kilodalton abscisic acid-specific-binding protein from epidermis of broad bean leaves // Plant Physiol. 2002. v. 128. pp. 714-725.

115. Zheng Z., Nafisi M., Tam A. Plasma membrane-associated ROPIO small GTPase is a specific negative regulator of abscisic acid responses in Arabidopsis II The Plant Cell. 2002. v. 14. pp.2787-2797.

Информация о работе

Васильева, Виктория Сергеевна
кандидата биологических наук
Пущино, 2007
ВАК 03.00.04

Диссертация

Изучение иммуноцитохимическими методами локализации цитокинин-связывающего белка 70 кД в тканях и клетках этиолированных проростков кукурузы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы