Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение, характеристика и применение моноклональных антител для изучения цитокинин-связывающих белков

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Получение, характеристика и применение моноклональных антител для изучения цитокинин-связывающих белков"

ой о а

На правах рукописи УДК 581.1.

ЗАГРАНИЧНАЯ ТАТЬЯНА КОНСТАНТИНОВНА

ПОЛУЧЕНИЕ, ХАРАКТЕРИСТИКА И ПРИМЕНЕНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ЦИТОКИНИН-СВЯЗЬШАЮЩИХ БЕЛКОВ.

Специальность: 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ПУЩИНО - 1997

Работа выполнена в Филиале Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, PAR

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Ольга Николаевна КулаеЕ

доктор химических наук, профессор Валерий Михайлович Липки

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

кандидат биологических наук

Ярослав Иванович Бурьяне Александр Давидович Воподарск*

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита состоится: июня 1997 г. в '' час.; !. мин.

на заседании диссертационнго совета Д 200.29.01 в Институте почвоведения и

фотосинтеза РАН по адресу: Московская обл., г. Пущино.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института почвоведения и фотосинтеза РАН.

Автореферат разослан 22 мая 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Г.Н. Назарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Одним из основных классов растительных гормонов являются цитокинины - низкомолекулярные химические соединения. Ци-токинины совместно с ауксинами индуцируют деление клеток, активируют рост листьев и дифференцировку в них хлоропластов, задерживают старение листьев, индуцируют побегообразование, а также принимают участие в регуляции транспорта веществ по растению и в его антистрессовых реакциях (Кулаева, 1987). Цитокинины обнаружены практически во всех растениях и частях растений. Наиболее распространенными и активными цитокининами являются транс-зеа-тин и его производные (Кулаева, 1973, 1987; Skoog and Shmitz, 1979). Значительный научный и практический интерес представляет то, как такие простые по химическому строению вещества могут осуществлять регуляцию разнообразных процессов, происходящих на уровне отдельной клетки и на уровне ткани, органа и растения в целом. Механизмы рецепции и передачи гормонального сигнала в растении нуждаются в подробных исследованиях.

В этой связи очень важно изучение цитокинин-связывающих белков (ЦСБ), которые и должны определять все разнообразие действия цитокининов на растение. До сих пор не ясно, выполняют цитокинины эти разнообразные функции посредством одного или нескольких разных рецепторов.

В литературе описано множество ЦСБ, выделенных из разных растений (Brinegar, 1994), однако функциональная роль этих белков оставалась неустановленной. В настоящее время в Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН и в Институте биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН ведутся комплексные исследования ЦСБ из злаков - ячменя и кукурузы. Выделены в чистом виде и охарактеризованы ЦСБ с молекулярной массой 67 кД из зрелых листьев ячменя (ЦСБ-67) (Каравайко и др., 1995; Kulaeva et al., 1995; Kulaeva et al., 1996; Karavaiko et al., 1996) и ЦСБ с молекулярной массой 70 кД из этиолированных проростков кукурузы (ЦСБ-70) (Бровко и др., 1996; Karavaiko et al., 1996). Доказана рецепторная роль этих белков и выдвинуто предположение, что они являются представителями одного семейства высокогомологичных белков - рецепторов цитокининов (Karavaiko et al., 1996).

Продолжить структурно-функциональные исследования ЦСБ, окончательно прояснить механизм передачи цитокининового сигнала в растении можно будет только после установления первичной структуры этих белков. На пути к этой цели современная молекулярная биология располагает очень мощным инстру-

ментом, а именно, иммунохимии ее кими исследованиями рецепторных белков помощью моноклональных антител (МЛ). МА вырабатываются к отдельны небольшим участкам молекулы белка-антигена (эпитопам), представленнь несколькими аминокислотными остатками, и поэтому являются высокоспец фичными реагентами. С помощью МА можно получить гомогенные препарат белков-антигенов, пригодные для структурных исследований, отыскать гомол гичный или аналогичные белки в других объектах, установить клеточную и тк невую локализацию рецепторного белка, определить аминокислотную последов тельность, отвечающую за связывание рецептором гормона, а также провес: много других важных и весьма интересных исследований.

Цель н задачи исследования. Целью данной работы было получение М против ЦСБ-70 из кукурузы, характеристика этих антител и их применение д иммунохимических исследований ЦСБ. В соответствии с этим работа состояла следующих этапов:

I. Получение гибридом, продуцирующих высокоспецифичные антите против ЦСБ-70. Эта часть работы включала иммунизацию животных, тест рование антисывороток в ходе иммунизации, слияние иммунных спленоцит мыши с клетками плазмацитомы, тестирование получаемых гибридом, ] клонирование и ре клонирование, получение асцитных жидкостей мышей.

II. Характеристика МА, которая включала очистку МА и контроль * чесгва получаемых препаратов, определение классов и подклассов МА, ко сгант аффинности. Кроме того, проводили определение специфичности V по отношению к ЦСБ-70 методом иммуноблоттинга, эпитопный анал ЦСБ-70 и определение функциональной активности полученных МА и фрагментов.

Ш.Иммунохимические исследования ЦСБ с помощью МА включали рг работку метода выделения ЦСБ-70 с использованием иммуноаффинной хр матографии, создание тест-системы (сэндвич-ИФА) для обнаружения ЦСБ-в грубых растительных экстрактах, а также иммунохимическое обнаружен ЦСБ в других растениях.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые получ набор гибридом, продуцирующих МА к ЦСБ-70, проведена характеристика эт антител, определены константы связывания, класс и подкласс. Обнаруже функциональная активность МА в тесте активации транскрипции рецепторш белком (in vitro). Проведено эпитопное картирование молекулы ЦСБ-70.

Разработана схема очистки ЦСБ-70 с помощью иммуноаффинной хроматографии на иммобилизованных МА. Разработана тест-система (сэндвич-ИФА) обнаружения ЦСБ-70 в грубом растительном экстракте. Показано иммунохими-ческое родство ЦСБ из кукурузы, ячменя, пшеницы и овса.

Полученные экспериментальные данные явились независимым подтверждением существования в злаках семейства близкородственных белков - рецепторов цитокинина. Панель МА против ЦСБ-70, а также методические подходы, разработанные в ходе выполнения работы, в частности, система обнаружения ЦСБ в грубых растительных экстрактах, характеристика антител по влиянию на рецептор ную функцию белков, могут быть с успехом применены при дальнейшем изучении молекулярных механизмов передачи цитокининового сигнала в растительной клетке. Таким образом, результаты представленной работы имеют несомненное фундаментальное значение.

Апробация полученных данных. Результаты настоящего исследования были неоднократно доложены на рабочих конференциях в рамках научной программы, финансируемой INTAS (13 февраля 1995 г., Пущино; 18 марта 1996 г., Москва; 6 февраля 1997 г., Москва), на 10-м конгрессе европейского общества физиологов растений (Флоренция, Италия, сентябрь 1996 г.), Вторых чтениях, посвященных памяти акад. Ю.А. Овчинникова (Москва-Пущино, 18 ноября 1996 г.), 1-й и 2-й Открытых городских конференциях молодых ученых г. Пущино (Пущино, май 1996 г., апрель 1997 г.).

Публикации. Основные материалы диссертации опубликованы в 6-ти печатных работах.

Объем а структура диссертации. Диссертационная работа состоит их введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 139 наименований. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста, содержит 23 рисунка и 5 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Объект исследования. Материалы и методы.

Для выделения ЦСБ-70 (антигена) и исследования его содержания в разных частях растения брали пятидневные этиолированные проростки кукурузы (Zea mays L.) сорта "Эльбрус", выращенные на влажной фильтровальной бумаге в темноте при +27°С. У проростков отделяли колеоптиль, заключенный в него первый лист, мезокотиль, узел, корень, который разрезали на части. Материал фиксировали, замораживая при -70°С. Для иммунохимических исследований ис-

пользовали также первые листья 10-дневных растений пшеницы {Tritic um aes tivum L.) сорта Одесская 51, овса (Avena saliva L.) сорта Викар и кукурузы ука занного выше сорта, выращенные в условиях оранжереи.

Гомогенизацию растительного материала проводили в буфере "А" (50 mN KCl, 2 мМ ЭДТА, 2 мМ MgCi2, 20 мМ Трис-HCI, pH 8,0), содержащем 0,5 м\ фенилметилсульфонилфторид и 8 мМ ß-меркаптоэтанол.

Выделение антигена проводили, как описано (Бровко и др., 1996).

Концентрацию белка определяли по методу Bradford (1976), используя бы чий сывороточный альбумин (БСА) в качестве стандарта. Концентрацию антнга и их фрагментов измеряли по поглощению на длине волны 280 нм, используя дд) пересчета коэффициент эксгинкции 1,4 (Дабре, 1989).

Аналитический гель-электрофорез проводили в системе Laemmli (1970) е градиенте (7 - 20%) ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН).

Для иммунизации и получения асцитных жидкостей использовали мыше{ линии BALB/c. Для слияния брали культуру мышиной плазмацитомы SP2/0-Agl4 (Shulman, 1978). Для выращивания культур клеток использовали среда RPMI-1640, селективную среду HAT (Gibco, США), эмбриональную сыворотку теленка (Flow Lab., Англия). Клетки выращивали в термостатируемом С02-инку-баторе при температуре +37°С и концентрации С02, равной 5,2%.

Слияние клеток проводили при помощи полиэтиленгликоля с молекулярной массой 3000 Д по методу Köhler и Milstein (1975) в модификации Fasekas (1980, 1985).

Класс и подкласс МА определяли методом ИФА с использованием кроличьих антител против подклассов иммуноглобулинов мыши по прилагаемой к набору (Amersham, Англия) инструкции.

Гидролиз IgG проводили папаином (20:1 w/w); смесь инкубировали при +37°С в течение 12 часов; р(аЬ)г-фрагменты очищали хроматографией на КМ-целлюлозе и ДЭАЭ-целлюлозе. Гидролиз IgM проводили трипсином (25:1 w/w); инкубировали в течение 2-4 часов при +5б°С; очищали Р(аЬ)2-фрагменты хроматографией на MonoQ (FPLC).

Мечение антител биотином проводили раствором эфира биотин-сукцин-имида в диметилсульфоксвде из расчета на 1 мг антител 250 мкг эфира. Инкубировали 4 часа при комнатной температуре. Биотинилированные антитела очищали хроматографией на Сефадексе G25.

Иммунохимические исследования ЦСБ проводили в основном методами иммуноферментного анализа (ИФА) и иммуноблоттинга (Feters and Baumgarten, 1992).

РЕЗУЛЬТЛТЫ РАБОТЫ.

1. Получение моноклопальных антител против ЦСБ-70 и их характеристика.

Из этиолированных проростков кукурузы в нашей лаборатории был выделен итокинин-связывающий белок с молекулярной массой 70кД (ЦСБ-70) (Бровко и р., 1996; Karavaiko et а!., 1996). Схема выделения этого белка включала аффин-уто хроматографию на зеатинрибозид-Тоуореаг1, то есть выделение было осно-то на сродстве белка к лиганду. Препарат ЦСБ-70 проверяли в нескольких ункциональных тестах, и было показано, что этот белок является рецептором итокинина. (Бровко и др., 1996; Karavaiko et al., 1996). Электрофоретический тализ ЦСБ-70 показал наличие в препарате двух полипептидов с молекулярны-и массами 65 и 70 кД (рис. 1).

Было решено иммунизировать животных полосками геля после электрофона в ПААГ-ДСН (7-20%), содержащими только полипептид 70 кД. Животным зодили 15-50 мкг белка (для одной инъекции) в смеси с равными количествами ю объему) вазелинового масла и полного адъюванта Фрейнда. Иммунизация ышей включала в себя пять стадий и длилась в общей сложности 95 дней.

— 94

Рис. I. Электрофореграмма (7-20% ПААГ-68 ДСН) препарата ЦСБ-70, полученного в результате аффинной хроматографии на зеатин-43 рибозид-ТоуореагК Стрелкой отмечен полипептид, использованный для иммунизации.

1. препарат ЦСБ-70,

2. белки-маркеры. Цифрами обозначены их молекулярные массы в кД.

22

Определение титра антисыворотки в процессе иммунизации проводили ме-эдом непрямого ИФА. Для слияния брали спленоциты мыши (чья сыворотка осле последней иммунизации в этом анализе работала в разведении 1:10000 или ыше) и клетки мышиной плазмацитомы SP2/0-Agl4, не продуцирующей собст-

Та блица 1.

Характеристика МА против ЦСБ-70._

Обозначение МА Класс, подкласс Аффинность, М"1

г-\ 1.25х106

2-2 18М, »с 1.3x109

г-ъ 1ёМ, к: 4.2x107

2-4 ^М, к 1.8x108

2-5 ^Оь Я 2,3x108

2-6 ^М, к 1,11 х 108

2-7 2,28x109

2-8 1.07x107

2-9 1ёМ, к 2,8x108

2-10 ДО!, К 3,4x108

2-11 1ёС,, к 1,12x108

2-12 к 3,1х108

2-13 ^Огь. < 1.1х107

2-14 1ёМ, к 1.6x108

2-15 1&А, к 1,31x10'

2-16 18М, к 1.6x108

2-17 ^мд 1.6x108

венные антитела. Соотношение спленоцитов и миеломных клеток при гибридизации составляло 10:1.

Первичный отбор клонов-продуцентов МА проводили методом непрямогс ИФА. В качестве антигена использовали препарат ЦСБ-70 после аффинной хроматографии на зеатинрибозид-Тоуореаг! в концентрации 5 мкг/мл. Этим методом было выявлено 28 положительных клонов, продуцирующих МА к ЦСБ-70. Семнадцать наиболее активных клонов были подвергнуты клонированию и реклони-рованию методом лимитирующих разведений. Из каждого клонирования былс выбрано по одному, наиболее активному клону.

Для получения препаративных количеств МА клетками соответствующих гибридом были заражены мыши линии ВА1.В/с для производства асцитных жидкостей. Мы придерживались оптимальной концентрации 6-32x105 клеток/мышь. Иммунную систему мышей подавляли путем предварительной инъекции внутри-брюшинно пристана в количестве 0,1-0,3 мл на мышь за 10-30 дней до заражения.

Использовали также неполный адъювант Фрейнда в количестве 0,3-0,5 мл на мышь за 3-5 дней до заражения. Рост асцита наблюдался в 95% случаев. В среднем нам удавалось получить от 4 до 8 мл асцитной жидкости от одной мыши.

Выделение МА из асцитных жидкостей проводили при помощи фракционирования белков методом преципитации сульфатом аммония и последующей ионообменной хроматографии на колонке Мопо-0 (РРЬС). Качество препаратов антител контролировали с помощью электрофореза в ПААГ-ДСН (7-20%). Полученные антитела имели около 98% чистоты. Выход МА в среднем составил 1-2 мг/мл асцита.

Для очищенных МА были установлены их класс и подкласс (см. табл. 1). Для этого использовали метод ИФА с применением коммерческого набора антител (АтегвИат, Англия) против различных подклассов мышиных иммуноглобулинов.

Важнейшей характеристикой МА является аффинность. Ей мерой служит константа связывания (К;,). Для определения К,;, антител с ЦСБ-70 использовали непрямой ИФА, а количественную оценку результатов проводили по методу, предложенному Веайу е1 а1. (1987). Результаты приведены в табл. 1. Оказалось, что все полученные антитела имеют Кс, от 106 до 109 М"1, то есть являются высокоаффинными.

2. Определение специфичности МА к ЦСБ-70 методом нммуноблоттинга.

Содержащие антитела культуральные жидкости всех положительных по ИФА клонов были проверены на взаимодействие с ЦСБ-70 методом имму-ноблоттинга еще на стадии клонирования. Для этого эксперимента брали препарат ЦСБ-70 после аффинной хроматографии на зеатинрибозид-Тоуореаг1 (см. рис. 1). Было показано, что антитела из культуральных жидкостей всех полученных гибридом взаимодействуют с двумя полипептидами: с молекулярными массами 65 и 70 кД (рис. 2). В дальнейшем было установлено, что те же антитела, но выделенные из асцитных жидкостей мышей и меченые биотином, узнают в грузом растительном экстракте (прошедшем только гомогенизацию и центрифуги-эование) также два полипептида (рис. 3).

Поскольку иммунизацию проводили электрофоретически очищенным поли-тептидом с молекулярной массой 70 кД, связывание антител с обоими полипеп-гндами подтверждает, что полипептид с молекулярной массой 65 кД является 1родуктом деградации белка 70 кД, сохранившим все или большинство из имму-юактивных эпитопов.

Рис. 2. Связывание МА некоторых клонов с препаратом ЦСБ-70, выделенным хроматографией на зеатин-рибозид-Тоуореаг!, подвергнутым электрофорезу и перенесенным на нитроцеллюлозу (иммуноблоттинг). 68 кД - молекулярная масса БСА -маркерного белка.

Рис. 3. Специфичность взаимоде! сгвия МА клона Ъ-1 с ЦСБ-70.

1. Электрофореграмма белков из эк< тракта этиолированных проростке кукурузы (ПААГ-ДСН, 7-20%).

2. Иммуноблоттинг этого же препар: та с МА клона Ъ-1.

Цифрами обозначены молекулярнь массы белков-маркеров.

3. Расположение эпитопов для МА на молекуле ЦСБ-70. Эпитопный анализ, проводимый с помощью МА, может дать большое кoл^ чество интересных данных об ориентации антигена на клеточной поверхносп структуре активного центра фермента или центра связывания рецептором лигаь да. Поскольку мы пока не располагаем данными о первичной структуре ЦСБ-7( то эпитопное картирование в данном случае означает и важную характеристик антител. В результате проделанной работы мы получили сведения о том, нг сколько близко располагаются эпитопы для различных МА на молекуле ЦСБ-70 Эпитопное картирование мы проводили методом прямого ИФА с использс ванием биотинилированных антител. Аффинно очищенный на ^О-ссфарозе иммобилизованными МА ЦСБ-70 (см. далее, раздел 5) сорбировали на поверх ность лунок иммунологического планшета в концентрации 0,5 мкг/мл. Препа раты антител попарно смешивали и затем вносили в лунки этого планшета.

В другие лунки вносили только по одному из тестируемых антител. Если оба антитела направлены против одного и того же эпитопа или если их эпитопы расположены близко друг от друга, то сигнал от смеси антител был незначительно выше, чем сигнал от индивидуального антитела. В случае, если антитела узнавали далеко отстоящие друг от друга эпитопы, сигнал от смеси антител был значительно выше. Рп§ие( е1 а1. (1983) предложили так называемый "индекс аддитивности" (А.1.) для вычисления возможной конкуренции между антителами за место связывания. Если А.1. меньше 50%, это значит, что антитела конкурируют за эдин и тот же или близкие центры связывания. Если А.!. больше 50% - антитела направлены против разных эпитопов. Вычисления проводили по формуле:

Л./.= | Т ^ _ 1 ] х 100, где Л / - оптическая плотность окрашенной Л2 ) лунки с антителом № 1,

А2 - оптическая плотность окрашенной лунки с антителом № 2, А(1+2) - оптическая плотность окрашенной лунки со смесью антител №1 и №2.

Таблица 2.

2-10 2-6 г-9 2-7 2-5 2-2 2-4 2-8 7гЗ

7Л 17%

г-9 71% 17%

Ъ-1 38% 0.98% 4%

2-5 41% 20% 5.6% 9.8%

2-2 32% 32% 3.6% 25,4% 27.7%

2-4 40% 47% 32,6% 47% 11.8% 28%

г-8 5,8% 32% 24% 15% 19% 6% 7%

ъ-ъ 4% 17% 12.6% 33,8% 54% 39% 36% 4.5%

Ъ-1 26% 20% 8.63% 25% 100% 23% 14% 14.6% 7%

Результаты определения индексов аддитивности приведены в таблице 2. !ожно видеть, что большинство полученных нами МА распознают близко распложенные эпитопы на молекуле ЦСБ-70. Некоторые сайты связывания лежат 1же очень близко (А. I. < 10%), например, для пар антител 2-6 и 2-7, 2-7 и 2-9, -3 и 2-10, 2-8 и 2-3, 2-2 и 2-9, 2-8 и 2-10. Другие же, напротив, расположены 1ень далеко. Например, пары антител 2-9 и 2-10, 2-3 и 2-6, 2-6 и 2-1 имеют

А./.>50%. Все остальные антитела имеют индекс аддитивности, промежуточны между 10 и 50%.

4. Функциональная активность МА против ЦСБ-70.

Важнейшей характеристикой специфичности антител является их влияние н биологическую функцию белка-антигена. Поскольку ЦСБ-70 - рецептор цитоки нина, то антитела, направленные против цитокинин-связывающего сайта молеку лы, должны влиять на цитокянин-связывающую способность ЦСБ-70. Кром того, воздействовать на рецепторную функцию белка могут и антитела, так изме няющие конформацию молекулы, что ее способность связывать гормон у луч шается или ухудшается.

Простейшим тестом д ля обнаружения влияния антител на рецептор нут функцию белка является ИФА, в котором антиген-рецептор сорбируют на план шет, а затем последовательно добавляют лиганд в разных разведениях и антите ла в концентрации, эквимолярной антигену.

Рисунки 4 и 5 демонстрируют несколько разных типов влияния транс-зеа тина на взаимодействие антигена с антителом в условиях прямого ИФА. На ри сунке 4 слева показан пример плавного вытеснения транс-ге&тта антитело!

причем добавление гормона уже в концентрации 10'9 М снижало уровен связывания ЦСБ-70 антителом Ъ-1 наполовину. Такой тип конкуренции с транс зеатином наблюдался также у антител Ъ-2 и Ъ-Ъ. На рис. 4 справа представ лен другой тип взаимодействия. В данном случае можно говорить о полной блс каде /лранс-зеатином в концентрации 10'8М взаимодействия антитела 2-8 с анти геном. Так же проявляло себя в этом тесте и антитело Ъ-Ъ.

На рисунке 5 слева показана картина, характерная для тех антител, которы не конкурируют с гормоном за взаимодействие с ЦСБ-70.

На рис. 5 справа приведен очень интересный случай влияния гормона н взаимодействие антитела Ъ-1 с ЦСБ-70. Здесь увеличение связывания МА нг блюдалось при повышении концентрации отраис-зеатина, а не наоборот, как н рис. 4. Можно предположить, что в данном случае имеют место некие конформг ционные изменения молекулы рецептора при низкоаффинном связывании зеа™ на. В результате таких изменений может происходить облегчение доступа атт тела 7Л к его антигенной детерминанте.

Таким образом, результаты экспериментов, представленные на рис. 4 и : свидетельствуют о наличии на молекуле ЦСБ-70 таких сайтов, которые одновр< менно участвуют и в связывании гормона, и во взаимодействии с антителами.

Ъ-1

л т

0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0.2 ОИ О

0 -9-8-7-6-5 Концентрация транс-зеатння, ^М

I I г

О -9-8-7-6-5 Концентрация транс-зеатина,

1С. 4. Ингибирование транс-зеатином взаимодействия МА клона Ъ-\ (слева) и кло-Ъ-% (справа) с ЦСБ-70 в условиях прямого ИФА. По оси ординат - оптическая [отность продукта ферментативной реакции пероксидазы с ортно-фенил ендиам и-1М. "Поглощение без гормона" - оптическая плотность в контрольных лунках, в ко-рые были добавлены только антитела, "неспецифическое окрашивание" - оптиче-ая плотность в контрольных лунках (без антигена).

г-14

Л ,92 0,6-

г- 7

О -9-8-7-6-5 Концентрация транс- зеатина, ^М

0-9-8-7-6-5 Концентрация транс-зеатина, (¡»Л/

1С 5. Влияние /яраис-зеатина на взаимодействие МА клона Ъ-14 (слева) и МА кпо-I Ъ-1 (справа) с ЦСБ-70 в условиях прямого ИФА. Обозначения'те же, что и на едыдущем рисунке.

Другие эксперименты по подтверждению влияния антител на рецепторнук функцию ЦСБ-70 были проведены совместно со с.н.с. С.Ю. Селиванкиной в лаборатории Экспрессии генома растений (под руководством проф. О.Н. Кунаевой^ Института физиологии растений РАН. Ранее в этой лаборатории была разработана система тестирования активности цитокинин-рецепторного комплекса в регуляции транскрипции in vitro (Кулаева и др., 1979; Селиванкина и др., 1979). В этой системе было показано, что ЦСБ-67 из листьев ячменя при добавлении ци-токинина активирует синтез РНК in vitro в присутствии хроматина и РНК-поли-меразы-I из листьев ячменя (Kulaeva et al., 1995; 1996; Karavaiko et al., 1995; 1996).

Как выяснилось, ЦСБ-70 из этиолированных проростков кукурузы также обладает способностью в присутствии цитокинина активировать синтез РНК in vitro в системе транскрипции из листьев ячменя (Karavaiko et al., 1996, Бровко и др., 1996). На основании этих данных был сделан вывод о том, что ЦСБ-67 и ЦСБ-70, возможно, являются представителями одного семейства цитокининовых рецепторов в злаках.

Этот вывод был подтвержден в эксперименте по иммуноблотгингу ЦСБ-67 ячменя с МА против ЦСБ-70 кукурузы (см. рис. 11). Следовательно, было бы интересно изучить влияние МА против ЦСБ-70 на процесс активации транскрипции гормон-рецегггорным комплексом in vitro. Такие эксперименты были проделаны, причем в качестве рецепторного белка был взят ЦСБ-67.

Данные о влиянии МА и их фрагментов на активацию транскрипции рецептором in vitro в присутствии 10"8М транс-зеатина, хроматина и РНК-полимера-зы-1 из листьев ячменя обобщены в таблице 3. Все проверенные в этом тесте МА можно разделить на несколько групп по характеру их воздействия на активацию транскрипции рецепторным белком:

1. Антитела, которые не влияют или слабо влияют на протекание этой реакции - Z-3, Z-4, Z-9, Z-8, Z-16 и Z-l 1. В ряде случаев слабое влияние антитела на активацию транскрипции объясняется, по-видимому, сгерическими затруднениями, вызванными большим размером молекулы МА по сравнению с молекулой гормона. Например, для антитела Z-3 класса IgM были получены Р(аЬ)2.фрагменты и также испытаны в этом тесте. Обнаружено, что в то время как целая молекула антитела ингибирует реакцию менее чем на 9%, ее Р(аЬ)2.фрагмент ингибирует активацию транскрипции уже на 46%. Это можно объяснить меньшими сгерическими затруднениями для небольших по сравнению с целой молекулой IgM Р(аЬ)2-фрагментов. По-видимому, данное антитело распознает эпитоп, влияющий на связывание белком гормона.

2. Сильное ингибирование реакции активации синтеза РНК цитокинин-ре-цепторным комплексом вызывало антитело 2-1. Были получены как Р(аЬ)г, так и РаЬ-фрагменты этого антитела, которые ингибируют реакцию на 67,65% и на 74,9%, соответственно. Очевидно, эпитоп для этого антитела расположен еще ближе к рецепторному центру, чем для антитела 2-3.

3. Для антитела 2-6 обнаружено достоверное усиление действия гормон-рецепторного комплекса на синтез РНК.

Таблица 3. *

Влияние МА против ЦСБ-70 на синтез РНК в присутствии ЦСБ-67,

траис-зеатииа, хроматина и РНК-полимеразы I из листьев ячменя.

ЦСБ-67 транс-зеатн Моноклональное антитело Активация транскрипции, %

+ + - 100,0

+ + 2-4 102,0

+ + 2-3 91,6

+ + Р(аЬ)2 2-3 54,8

+ + 2-9 71,5

+ + 2-г 62,5

+ + г- и 87,2

+ + г-1б 85,0

+ + г-1 43,0

+ + Р(аЬ)2 2-1 32,4

+ + РаЬг-1 25,1

+ + 2-6 162,0

*Примечание: Условия проведения эксперимента см.: Селиванкина и др., 1982. Антитела добавляли в концентрации 50 нг/мл. За 100% принято включение [3Н]-АМФ в РНК, равное 1б700±660 сргп / 50 мкг ДНК, которое осуществлялось в результате транскрипции в присутствии 64 нг/мл ЦСБ-67 и 10'8М транс-зеатина.

Таким образом, можно заключить, что МА против ЦСБ-70 являются высокоспецифичными по отношению к антигену, а также по отношению к родственному ему ЦСБ-67 из первого листа ячменя, и это отражается особенно ярко в их способности влиять на рецепторную функцию этих белков.

5. Разработка метода выделения ЦСБ-70 с использованием иммуноаффинной хроматографии.

Одним из наиболее результативных подходов к выделению индивидуальных белков по праву считают иммуноаффинную хроматографию. МА являются очеш выигрышными для этого метода ввиду их высокой специфичности. Для выделения ЦСБ-70 методом иммуноаффинной хроматографии мы использовали антитела подкласса двух клонов с аффинностью 1,07x107 М"1 (2-8) и 1,25x106 М"1 (2-1). Антитела были иммобилизованы на ВгСМ-активированную сефарозу 4В. Эффективность иммобилизации составила 90%. Исходная схема выделения ЦСБ-70 (Бровко и др., 1996) после включения в методику иммуноаффинной хроматографии была изменена таким образом, как это представлено на рис. б.

Для удаления неспецифически связавшихся белков перед элюцией сорбент промывали 1 М №С1. В связи с относительно высокой аффинностью используемых антител для элюции были необходимы достаточно жесткие условия. Нам не удалось элюировать белок ни 4 М, ни 6 М мочевиной. Использование 4 М гуани-дингидрохлорида оказалось удачньм, но выход белка при его применении был очень низок. Элюция ЦСБ-70 в кислом буфере (рН 2.4) необратимо денатурировала сорбент (антитела утрачивали свою связывающую способность). В результате мы остановились на элюции 8 М мочевиной. После хроматографии белок концентрировали в том же растворе мочевины. ЦСБ-70 был стабилен при хранении в 8 М мочевине в течение месяца при +4°С. Цитокинин-связывающая активность выделенного таким образом белка была аналогична таковой в препарате ЦСБ-70, полученном после хроматографии на зеатинрибозид-Тоуореаг1 (Бровко и др., 1996).

По данным электрофоретического анализа препарат ЦСБ-70, выделенный методом иммуноаффинной хроматографии, содержал два полипептида с молекулярными массами 65 и 70 кД (рис. 7) и не отличался от препарата ЦСБ-70, выделенного при хроматографии на зеатинрибозид-Тоуореаг1 (см. также рис. 1).

Новая схема выделения ЦСБ-70 с использованием иммуноаффинной хроматографии на конечной стадии, кроме существенного упрощения процедуры, имела и другое важное преимущество перед используемой ранее схемой. Так, в препарате ЦСБ-70, выделенном аффинной хроматографией на иммобилизованном гормоне с элюцией 50 мМ ИаОН, не удавалось установить Ы-концевую аминокислотную последовательность. Мы предположили, что его Ы-концевая аминокислота блокирована. При определении Ы-концевой аминокислотной последовательности ЦСБ-70, выделенного на 1£0-сефарозе, был получен положительный

Гомогенизация растительного материала

Ультрацентрифуги|ювание (150 ООО g)

Хроматография на Сефадексе G-25

Хроматография на ДЭАЭ-Сефарозе => Гель-фильтрация

U на Сефакриле S-200

U U

Иммуноаффинная хроматография

-:-ц

ЦСБ-70

Рис. 6. Схема выделения ЦСБ-70 с использованием иммуноаффинной хроматографии.

I

94 68 43

22

Рис. 7. Электрофореграмма (7-20% ПААГ-ДСН) препарата ЦСБ-70 после иммуноаффинной хроматографии.

1. Белки-маркеры. Цифрами обозначены их молекулярные массы в кД.

2. Препарат ЦСБ-70.

результат. В препарате, содержащем два полипептида (рис. 7), была обнаружена эдна М-концевая аминокислотная последовательность.

Необходимо отметить, что выделенный в лаборатории О.Н. Кунаевой ДСБ-67 из первого листа ячменя, по данным электрофореза в ПААГ-ДСН, также содержал два полипептида близкой молекулярной массы (Каравайко и др., 1996). Это, возможно, общее свойство рецепторных белков данного типа.

В настоящее время проводятся интенсивные структурные исследования ДСБ-70, выделенного иммуноаффинной хроматографией с использованием МА.

6. Разработка тест-системы (сэндвич-ИФА) для обнаружения ЦСБ-70 в грубых растительных экстрактах.

Одной из целей получения МА было их применение для анализа ЦСБ-70 с помощью ИФА и иммуноблоттинга в грубых растительных экстрактах и для им-муноскрининга экспрессирующих библиотек кДНК, где содержание белка очень невелико. Для повышения чувствительности этих методов мы использовали ме-чение антител биотином. Для мечения биотином брали десять МА классов ^М и 1дА. Биотинилированные антитела очищали при помощи гель-фильтрации на Сефадексе 0-25.

Чувствительность методов с использованием меченых биотином антител возросла на 3-4 порядка. Одновременно сильно снизился фон неспецифического окрашивания, поскольку при использовании биотинилированных МА не требовались вторые антитела. Продолжительность анализа также сократилась.

Мы разрабатывали тест-систему на содержание ЦСБ-70 на основе сэндвич-варианта ИФА с использованием верхнего биотинилированного антитела. Схема метода сэндвич-ИФА представлена на рис. 8. Было установлено, что в качестве верхних антител более чувствительными оказались IgM. Несмотря на то, что ^М обычно считаются менее удобными, полученные нами биотинилированные ^М достаточно устойчивы в работе и могут храниться в 50% глицерине при -20°С более года, не образуя осадка или агрегатов и не теряя активности.

При подборе пар антител для создания высокочувствительного сэндвич-ИФА мы учитывали приведенные выше данные эпитопного анализа. Однако выяснилось, что лучшими для этого анализа оказались пары 2-5/2-2 и 2-4/2-3, которые имеют индексы ад дитивности 27,7% и 36%, соответственно. Это сравнительно небольшая степень удаленности эпитопов для данных антител на поверхности белка (см. табл. 2). Следует отметить, что применявшийся для определения индексов аддитивности метод (прямой ИФА) не позволяет белку представить все свои антигенные детерминанты в нативной конформации (поскольку антиген сорбируется на планшет). В то же время, в сэндвич-ИФА антиген находится именно в нативной конформации. Видимо, поэтому даже достаточно близко расположенные сайты связывания антител позволяют получить хороший результат.

Несмотря на то, что благодаря высокой чувствительности сэндвич-ИФА (рис. 8 и 9) можно определить содержание ЦСБ-70 непосредственно в грубом растительном экстракте сразу после гомогенизации и центрифугирования, мы проводили еще один этап очистки - хроматографию на Сефадексе й25. Это было вызвано необходимостью удалить из раствора продукты вторичного метаболизма

Рис. 8. Схема сэндвич-ИФА. МА1-моноклональное антитело, сорбируемое на планшет (нижнее). МА2 - меченое биотипом моноклональное антитело (верхнее, в данном случае класса ^С). При использовании в качестве МА2 антител класса происходит дополнительная амплификация сигнала за счет размера молекулы антитела, с которой связано больше молекул биотина (Б), взаимодействующих, соответственно, с ббльшим количеством молекул конъюгата стрептавидина (С) с пероксидазой (П). Белые и черные кружки - соответственно, субстраты и продукты катализируемой пероксидазой цветной реакции.

растительных клеток - фенольные соединения, которые не позволяют проводить ИФА с необходимой степенью воспроизводимости, так как взаимодействуют с полистиролом (из которого изготовлены планшеты для ИФА), изменяя тем самым его сорбирующие свойства.

Один из критериев рецепторной роли исследуемого белка - соответствие его концентрации в органах и тканях растения функциональным процессам, опосредуемым лигандом (Кулаева, 1982). Поэтому важно исследовать распределение ЦСБ-70 по различным органам и тканям растения.

Содержание ЦСБ-70 в разных частях 5-дневных этиолированных проростков кукурузы определяли в замороженном при -70°С растительном материале. На рис. 10 представлены результаты анализа содержания ЦСБ-70 разработанным методом с использованием пары антител 2-5/2-2. Необходимо отметить, что представленные данные отражают только содержание цитоплазматического ЦСБ-70. Исходя из результатов этого эксперимента, можно сделать вывод, что большая часть рецепторного белка присутствует в активно растущих тканях -

А492

Концентрация ЦСБ-70, нг/мл

Рис. 9. Калибровочная кривая определения содержания ЦСБ-70 метода сэидвич-ИФА с использованием антител Ъ-5 (нижнее) и 2/1 (верхнее). ЦСБ-7 был выделен имуноаффинной хроматографией. По оси ординат - опгическа плотность продукта ферментативной реакции пероксидазы с орте фенилендиамином. "Уровень неспецифического связывания" - оптическая плоп ность в контрольных лунках (без антигена).

Первый лист Колеоптиль Узел Мезокотиль Корень, 50-100 мм Корень, 4-50 мм Корень, 0-4 мм

Содержание ЦСБ-70, нг/г сирого материала

Рис. 10 Содержание ЦСБ-70 в цитоплазме некоторых тканей 5-дневных этиол рованных проростков кукурузы. Длина корня дана в миллиметрах, начиная I кончика.

первом листе и кончике корня. Можно предположить, что ЦСБ-70 не имеет транспортной функции, поскольку практически отсутствует в проводящей зоне -мезокотиле.

7. Иммуиохнмическое обнаружение ЦСБ в других растениях.

Как уже упоминалось выше, ранее было установлено тесное родство ЦСБ-70 из этиолированных проростков кукурузы и ЦСБ-67 из ячменя (Кагауа1ко й а)., 1996; Бровко и др., 1996). С помощью МА против ЦСБ-70 это было подтверждено иммунохимически (рис. 11). Все полученные нами МА против ЦСБ-70 распознавали в иммуноблстгинге ЦСБ-67 из листьев ячменя, что свидетельствует об очень высокой гомологии между этими белками. ЦСБ-67 для этого эксперимента был выделен хроматографией на иммобилизованном зеатинрибозиде (Кагауа1ко е1 а1., 1996) и любезно предоставлен нашими коллегами из Института физиологии растений РАН.

68 «Д

М

94

68

43

22

1

Рис. 11. Иммуноблоттинг ЦСБ-67 из листьев ячменя с разными МА против ЦСБ-70.

68 кД - маркерный белок (БСА).

Рис. 12. Иммуноблоттинг препаратов растительного экстракта первых листьев пшеницы (1) и овса (2) с антителом 7/2 против ЦСБ-70 кукурузы. М - маркерные белки (стандарты молекулярных весов).

С помощью биотинилированных МА клона 2-2 методом иммуноблоттинга в грубом экстракте из первых листьев пшеницы и овса нами также были обнару-

жены ЦСБ с молекулярной массой 68 кД (рис. 12). В связи с тем, что антите Z-2 имеет очень высокую аффинность (1.3х109 М'1) и использовалось в hmv ноблоттинге в концентрации 50 нг/мл, следует, очевидно, исключить возмо ность неспецифического взаимодействия. Кроме того, для первого листа пшек цы показано окрашивание в иммуноблотгинге еще пятью другими МА.

Таким образом, можно считать установленным факт существования в 3J ках семейства рецепторов цитокинина, имеющих тесную функциональную иммунохимическую гомологию. Это позволяет надеяться, что исследуемый n ханизм передачи цитокининового сигнала является общим для всех растений.

ВЫВОДЫ.

1. Получены 17 клонов гибридом, продуцирующих моноклональные антитеи (МА) против цитокинин-связывающего белка с молекулярной массой 70 к (ЦСБ-70) из этиолированных проростков кукурузы.

2. Проведена всесторонняя характеристика полученных МА: а) определен классы и подклассы антител; б) установлены константы аффинности МА i отношению к антигену; в) проведено определение индексов аддитивное для десяти МА; г) доказана высокая специфичность МА против ЦСБ-70.

3. Показана функциональная активность МА двумя методами: а) в тесте акт вации гормон-рецепторным комплексом транскрипции in vitro и б) п[ конкуренции с гормоном в условиях прямого ИФА.

4. Разработана схема выделения ЦСБ-70 с помощью иммуноаффинной хром тографии на иммобилизованных монооональных антителах.

5. Разработана тесг-система (сэндвич-ИФА) с использованием биотинилир ванных МА для анализа содержания ЦСБ-70 в грубом растительном эк тракте. Определено относительное содержание цитоплазматическо ЦСБ-70 в различных органах 5-дневных этиолированных проростков кук рузы.

6. Доказано иммунохимическое родство ЦСБ-70 из этиолированных пророс ков кукурузы, ЦСБ-67 из первого листа ячменя и ЦСБ из первых листь пшеницы и овса, что подтверждает наличие в злаках семейства высоког мологичных белков - рецепторов цитокинина.

СПИСОК РАБОТ АВТОРА, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ.

Заграничная Т.К., Бровко Ф.А., Шепеляковская А.О., Бозиев Х.М., Липкин В.М. Моноклональные антитела против цитокинин-связывающего белка 70 кД из этиолированных проростков кукурузы. Физиология растений, т.44, №1,сгр. 1-5, 1997.

Zagranichnaya Т.К., Brovko F.A., Lipkin V.M. Karavaiko N.N., Selivankina S.Yu., Kulaeva O.N. Monoclonal antibodies against new cytokinin-binding protein 70 kD from etiolated maize coleoptiles. J. Plant Physiology and Biochemistry, Special issue (10th FESPP congress, Florence, Italy, September 913,1996), стр. 200,1996.

Бровко Ф.А., Заграничная Т.К., Бозиев Х.М., Липкин В.М., Каравайко Н.Н., Селиванкина С.Ю., Кулаева О.Н. Выделение и характеристика цитокинин-связывающего белка молекулярной массой 70 кД из этиолированных проростков кукурузы. Физиология растений, т.43, № 4, стр. 533-540,1996.

Karavaiko N.N., Selivankina S.Yu., Brovko F.A., Zemlyachenko Ya. V., Shipilova S.V., Zagranichnaya Т.К., Lipkin V.M., Kulaeva O.N. Zeatin-binding proteins participating in cytokinin-dependent activation of transcription. In: R. Smith et al (eds), Plata Hormone Signal Perception and transduction. Kluwer Acad. Publisher, pp 67-75, 1996.

Шепеляковская A.O., Заграничная Т.К. Моноклональные антитела против цитокинин-связывающего белка 70 кД (ЦСБ-70) - рецептора цитокинина. 1-я открытая городская научная конференция молодых ученых (май 1996, Пущине), тезисы докладов, стр. 100,1996.

Шепеляковская А.О., Заграничная Т.К. Характеристика монокловальных антител против цитокинин-связывающего белка 70 кД (ЦСБ-70) - рецептора цитокинина. 2-я открытая городская научная конференция молодых ученых (апрель 1997, Пущино), тезисы докладов, стр. 37, 1997.