Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние цитокининов на рост корней и побегов растений пшеницы и табака при изменении температуры

ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Влияние цитокининов на рост корней и побегов растений пшеницы и табака при изменении температуры"

На правах рукописи

ДЕДОВА МАРИЯ АЛЕКСАНДРОВНА

ВЛИЯНИЕ ЦИТОКИНИНОВ НА РОСТ КОРНЕЙ И ПОБЕГОВ РАСТЕНИЙ ПШЕНИЦЫ II ТАБАКА ПРИ ИЗМЕНЕНИИ ТЕМПЕРАТУРЫ

Специальность 03.01.05 - Физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

11 МАР 2015

УФА-2015

005560465

005560465

Работа выполнена в лаборатории физиологии растений Уфимского Института биологии Российской академии наук

Научный руководитель доктор биологических наук

Кудоярова Гюзель Радомесовна

Официальные оппоненты:

Шишова Марта Федоровна, доктор биологических наук, профессор, ФГБОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный университет, профессор кафедры физиологии и биохимии растений

Безрукова Марина Валерьевна, кандидат биологических наук, доцент, ФГБУН Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН, старший научный сотрудник

Ведущая организация ФГБОУ Уральский федеральный университет имени первого президента России Б.Н. Ельцина

Защита диссертации состоится 9 апреля 2015 г. в 14-00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.013.11 при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждение Высшего профессионального образования «Башкирский государственный университет»

Адрес: 450076, г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32, биологический факультет, ауд. 332. Факс (347)2736778; e-mail: disbiobsii@inail.ru Официальный сайт университета http://www.bashedu.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения Высшего профессионального образования «Башкирский государственный университет»

Автореферат разослан « » 2015 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета /1 j J.

доктор биологических наук, 'l/^'1" j Шарипова Марина Юрьевна

I

Актуальность. Более полувека назад гормоны растений цитокинины были идентифицированы с помощью культуры тканей in vitro как соединения, необходимые для поддержания деления клеток. Вскоре после открытия этих гормонов, О.Н. Кунаевой (1962) были опубликованы первые свидетельства способности корней синтезировать цитокинины и описана задержка под их влиянием старения листьев. С тех пор цитокинины остаются объектом пристального внимания исследователей, но, несмотря на успехи в области их изучения, сведения о некоторых их свойствах противоречивы или недостаточны. Таким свойством цитокининов можно считать их влияние на рост корней. В опытах с обработкой растений синтетическими цитокининами эти гормоны, в основном, подавляли рост корней (Laplaze et al., 2007; Lee et al., 2007), а у трансгенных растений с искусственно пониженным уровнем цитокининов было зарегистрировано снижение роста побега и стимуляция роста корней по сравнению с исходными ^трансформированными растениями (Werner et al., 2010). В результате было сформулировано предположение о том, что цитокинины стимулируют рост побега, но ингибируют рост корней, что стало своего рода аксиомой. Вместе с тем, представлению о том, что цитокинины ингибируют рост корней, противоречат сведения о слабом развитии корневой системы у мутантных растений с нарушениями рецепции цитокининов (Higuchi et al., 2004; Nishimura et al., 2004). Эти сведения указывают на необходимость цитокининового сигналинга для обеспечения нормального роста корней.

Неоднозначность действия цитокининов может быть связана с тем, что на уровне целого растения их влияние на рост корней может быть не прямым, а обусловленным влиянием этих гормонов на функции побега. Это предположение было сформулировано в статье Beck еще в 1996 г. (Beck, 1996), но до сих пор не нашло экспериментального подтверждения. Для проверки этой гипотезы мы изучили воздействие температуры на рост и содержание цитокининов у растений пшеницы и табака. Выбор этого фактора связан с тем,

что повышение температуры влияет на приток цитокинннов из корней. Так, было показано изменение доставки щггокининов из корней пшеницы при этом воздействии (Веселова и др., 2006). Использование в качестве объекта исследований /р/-трансгенных растений табака, у которых накопление цитокининов индуцировалось тепловым шоком, позволяет искусственно изменять уровень цитокининов локально и в целом растении (Теплова и др., 2001; Ууяс^кауа е1 а1., 2010), что делает возможным уточнение представлений о регуляции роста побегов и корней растений под влиянием цитокининов.

Ранее в лаборатории Уфимского института биологии РАН совместно с БашГУ и СПбГУ было показано, что ингибирование вторично активного (поддерживаемого градиентом водорода) трансмембранного переноса с помощью протонофора карбонил-цианид-м-хлор-фенилгидразона (КЦХФ) одновременно снижает накопление цитокининов в клетках корней и повышает их отток в побег растений пшеницы (Коробова и др., 2013; Ки<1оуагоуа е1 а1., 2014). Важно было проверить предположение о том, что снижение оттока цитокининов из корней при тепловом шоке связано с активацией их поглощения из апопласта клетками корней.

Цель данной работы состояла в проверке гипотезы о влиянии цитокининов на рост корней путем регуляции функций побега. Достижение данной цели было связано с решением следующих задач:

1. Анализ содержания цитокининов и массы побегов и корней растений пшеницы, выращенных при разных температурах.

2. Оценка влияния локальной индукции /р*-гена в корнях трансгеиных растений табака на транспирацию и уровень цитокининов в клетках листьев.

3. Сравнительное исследование влияния локального (нагрев только корней) и тотального (нагрев всего растения) теплового шока на содержание цитокининов и рост побегов и корней термоиндуцируемых 1р1-трансгенных растений табака и их исходной формы.

4. Сравнительная оценка уровня цитокининов в апексе и листьях трансгенных растений табака при локальной и тотальной индукции гр1-гена и их связи с ростом побега.

5. Изучение влияния ингибитора вторично активного трансмембранного переноса на содержание цитокининов в корнях растений табака при действии теплового шока.

Научная новизна. Изучение влияния температурного воздействия на растения пшеницы и трансгенные растения табака с контролируемым синтезом цитокининов показало, что причиной подавления роста корней может быть активация роста побега в результате накопления цитокининов в апексе побега, а активация роста корней связана со снижением содержания цитокининов в побеге и торможением его роста. Впервые получены данные об уровне иммунного окрашивания на цнтокинины в листьях /рМрансгенных растений табака при локальной индукции синтеза цитокининов в корнях. Показано повышение содержания цитокининов как в клетках мезофилла, так и замыкающих клетках устьиц. Тем самым получены аргументы в пользу того, что известный эффект действия цитокининов на транспирацию может быть обусловлен как прямым влиянием цитокининов на уровне устьиц, так и опосредованным, т.е. через фотосинтез в мезофилле. В экспериментах с ингибитором вторично активного транспорта получены приоритетные сведения о значении активации поглощения цитокининов клетками корней для ингибирования их оттока в побег и регуляции роста побега и корня при тепловом шоке.

Научно-практическое значение.

Полученные результаты способствуют более полному пониманию механизмов регуляции соотношения массы побега и корня растений. Поскольку активация роста корней обеспечивает устойчивость растений к засухе, информация о механизмах регуляции соотношения массы побега и корня цитокининами может быть использована для повышения эффективности

биотехнологий, направленных на увеличение засухоустойчивости и урожайности растений (например, для разработки биотехнологии применения цитокининпродуцирующих микроорганизмов в качестве биоудобрений).

Апробация работы. Основные положения работы были представлены на Всероссийской научной конференции с международным участием «ЭКОБИОТЕХ-2011», II Всероссийской школе-конференции молодых ученых «Современные методы и подходы в биологии и экологии», посвященные 60-летию Института биологии Уфимского научного центра РАН (11-15 октября 2011 года, г. Уфа, Россия), годичном собрании Общества физиологов растений России «Физиология растений - теоретическая основа инновационных arpo- и фитобиотехнологий» (Калининград, 2014) и конференции с международным участием "Биотехнология — от науки к практике", Уфа, 23-26 сентября 2014 г.

Поддержка исследования. Работа была выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ 09-04-00942-а «Гормональная регуляция соотношения массы побега и корня как важного адаптивного признака растений».

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 работы, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК.

Личное участие автора. Автор принимал непосредственное участие в постановке задач и проведении экспериментов, в статистической обработке и анализе полученных данных.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 257 наименований, в том числе 217 на иностранных языках. Работа изложена на 126 страницах машинописного текста, содержит 19 рисунков и 2 таблицы.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Семена растений пшеницы (Triticiim durum Desf.) сорта Безенчукская 139 проращивали при комнатной температуре в темноте на водопроводной воде. Проростки переносили на 10 % раствор Хогланда-Арнона и помещали в

климатическую камеру (MLR-351 H, Sanyo), в которой поддерживали температуру 21 или 25 °С, освещенность (250-300 мкмоль м"2с' ФАР) и относительную влажность воздуха 60%. Показатели роста растений и содержание гормонов оценивали на пятые сутки после прорастания семян.

Исследования также проводили на трансгенных растениях табака (Nicotiana tabacum L.). Трансгенная HS//T линия была получена путем трансформации растений сорта Petit Havana SR-1 бактериальным //;/-геном, находящимся под контролем HS-протенн 70 промотора дрозофилы (Drosophila melanogaster) (Schmulling et al., 1989). Семена трансформированных и нетрансформированных растений табака проращивали в лотках с хорошо увлажненной почвой в темноте в течение 7 дней. Проростки с одним настоящим листом пересаживали в горшки с песчано-почвенной смесью (1:2) и выращивали при 14-часовом фотопериоде, освещенности 400-500 мкмоль м"2с_1 ФАР (лампы ZN-500 и DNAT-400) и температуре 24/18 °С (день/ночь). Растения поливали дважды в день. Во время утреннего полива проводили подкормку растений раствором Хогланда-Арнона. Тотальную термообработку целого растения (в термостате) или локальную обработку корней растений в горшках с почвенной смесыо (в водяной бане) продолжительностью 1 ч при 40° С проводили один раз в сутки в одно и то же время в течение 6 дней. Контролем служили растения, которые находились в тех же условиях произрастания, но не подвергались нагреванию. Колебания температуры у поверхности листьев нижнего яруса составляли не более 2°С. Устьичную проводимость листьев измеряли при помощи порометра (Mk3, Delta-T Devices, UK). В конце эксперимента определяли сырую массу побегов и корней. Для определения содержания гормонов отбирали активно росшие листья и корни контрольных и опытных растений через час после применения последнего теплового шока.

Для оценки влияния ингибитора вторично активного транспорта сразу после термообработки в почву вносили раствор протонофора карбонил-цианид-м-хлор-фенилгидразона (КЦХФ) до конечной концентрации 10 мкМ, в горшки

необработанных протонофором растений вносили равный объем воды. В конце эксперимента через 40 мин после начала воздействия ингибитора фиксировали образцы в жидком азоте для оценки содержания в них цитокининов.

Для очистки и концентрирования фитогормонов растительный материал экстрагировали 80 %-ным этанолом в соотношении 1:10 в течение ночи при 4°С. После фильтрации экстракт упаривали до водного остатка. Очистку и разделение цитокининов с помощью тонкослойной хроматографии и абсцизовой кислоты (АБК) — с помощью модифицированной экстракционной очистки и их иммуноферментный анализ с помощью соответствующих специфических антител проводили как описано (Vysotskaya et al., 2009).

Для иммуногистохимической локализации цитокининов сегменты апикальной части десятого листа размером 3x7 мм фиксировали в течение 24 ч в растворе 4 % параформальдегида (Riedel de Haen, Германия) и 0,1 % глютаральдепща (Sigma, Германия), приготовленном на фосфатном буфере (ФБ). На следующем этапе образцы отмывали 1 ч в 0,1 М ФБ (pH 7,2-7,4). Дегидратацию образцов проводили в серии разведений этанола (20, 30, 50, 60, 70, 80 и 96 %), выдерживая по 30 мин в каждом разведении. Затем образцы заливали в метакрилатную смолу JB4 (Electron Microscopy Sciences, США). Гистологические срезы толщиной 1,5 мкм готовили с помощью ротационного микротома (НМ 325, MICROM Laborgerate, Германия). Иммуногистохимическое выявление цитокининов проводили, как описано ранее (Веселов и др., 1999; Kudoyarova et al., 2014) с помощью тех же антител против рибозида зеатина, которые использовали для иммуноферментного анализа. На срезы наносили по 50 мкл раствора 0,1 М ФБ, содержащего 0,2 % желатина и 0,05 % Tween-20 (ФЖТ) и выдерживали в течение 30 мин во влажной камере при комнатной температуре. Разведения сыворотки кролика и вторых антител, меченных коллоидным золотом, готовили на ФЖТ. На следующем этапе срезы промывали дистиллированной водой, часть срезов обрабатывали иммунной сывороткой, содержащей антитела к цитокининам, и

помещали во влажную камеру на 2 ч. Контролем служили образцы тканей, обработанные неиммунной сывороткой кролика, не содержащей специфических антител к цитокининам. Для выявления антител, связавшихся с зеатином, срезы инкубировали с меченными коллоидным золотом антителами против иммуноглобулинов кролика (Aurion, США) в течение 1 ч во влажной камере. После 3-кратной промывки раствором ФБ, содержащим 0,05 % Tween-20 (ФТ), проводили постфиксацшо тканей раствором 2 % глютаральдегида (Sigma, Германия). На следующем этапе срезы инкубировали с серебряным усилителем (Aurion, США) в течение 20-30 минут. Срезы промывали дистиллированной водой. Препараты анализировали с помощью светового микроскопа Axio Imager.AI (Carl Zeiss Jena, Германия), оборудованного цифровой камерой AxioCam Mrc5 (Carl Zeiss Jena, Германия).

Рассчитывали описательную статистику, проводили ¿-тест и корреляционный анализ из данных трех независимых экспериментов по пять биологических повторений в каждом, используя встроенные функции программы MS Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Роль цитокининов в регуляции соотношения корень/побег у растений пшеницы при изменении температуры

На первом этапе наших исследований мы проанализировали влияние температуры на рост и содержание цитокининов в растениях пшеницы. Выбор этого объекта связан с тем, что C.B. Веселовой с соавторами (2006) было показано увеличение притока цитокининов из корней пшеницы под влиянием повышенной температуры. Участие цитокининов в регуляции роста побега и корня растений не при стрессовых, а при фоновых изменениях внешних условий представляет интерес. Поэтому в данном исследовании мы поставили задачу изучения роли перераспределения цитокининов между полярными органами в регуляции соотношения корень/побег у растений пшеницы при температуре воздуха 21 и 25 °С.

Рис. 1. Масса побега и корней и их соотношение у 5-суточных растений пшеницы сорта Безенчукская 139, росших при 21° или 25° С (п=50). Различия по показателям между растениями, росшими при разной температуре, достоверны при р < 0,05.

При повышении температуры одновременно возрастала масса побега и снижалась масса корней растений пшеницы, в результате чего соотношение

массы корня к массе побега было максимальным при 21°С и уменьшалось при более высокой температуре (рис. 1). Таким образом, повышение температуры приводило к снижению относительной скорости роста корней по сравнению с изменением роста побега.

Рис. 2. Содержание цитокининов (3- зеатин, ЗР - рибозид зеатина, ЗН - нуклеотид зеатина) в побегах и корнях 5-суточных растений пшеницы сорта Безенчукская 139, росших при 21° или 25° С (п=5).

* - Различия по показателям между растениями, росшими при разной температуре, достоверны при р < 0,05

Важно было сопоставить различия в массе побегов и корней растений пшеницы при разной температуре с содержанием в растениях цитокининов. Основное внимание мы уделяли производным зеатина, поскольку именно эти формы цитокининов накапливаются у проростков пшеницы в наибольшем количестве (Киёоуагоуа й а1., 2014).

Под влиянием повышения температуры содержание свободного азотистого основания зеатина резко возрастало в побеге (в 3 раза по сравнению с растениями, которые росли при 21°) (рис.. 2). При этом содержание зеатина в корнях при 21° и 25° С достоверно не различалось. Изменение содержания рибозида зеатина напоминало картину, полученную для зеатина (рис. 2), хотя

реакция была более сглаженной по сравнению с зеатином. Можно предполагать, что повышение уровня зеатина в побеге могло быть следствием его освобождения из нуклеотида в результате его дефосфорилирования и дерибозилирования, что объясняет обнаруженное падение уровня нуклеотида зеатина (рис. 2).

Таким образом, стимуляция накопления цитокининов в побегах сопровождалась активацией их роста и подавлением роста корней.

Влияние локальной индукции /р/-гена в корнях на содержание цитокининов в клетках листьев трансгенных растений табака

Важно было доказать, что связь подавления роста корней с повышением уровня цитокининов в побеге не было случайным совпадением. Для этого нужно было целенаправленно модулировать содержание цитокининов в побегах и корнях. С этой целью мы использовали /йТРГ-трансгенные растения табака, экспрессирующие бактериальный ¡р1- ген. Этот ген кодирует фермент, необходимый для синтеза цитокининов. В нашем случае он поставлен под контроль промотора белка теплового шока дрозофилы, и поэтому его экспрессия запускается при температуре 40°С. В одном из вариантов опытов экспрессию гр1-гена индуцировали локальным тепловым шоком, прогревая только корни. Поскольку по некоторым данным литературы (см. ссылки обзора Ка1ато1о, 2003) предполагается, что цитокинииы оказывают свое действие, в основном, там, где они синтезируются (так называемое паракринное действие цитокининов (Тмбз е1 а1., 1997), важно убедиться, что индукция //Я-гена в корнях приводит к повышению уровня цитокининов в побеге и что эти изменения в уровне цитокининов сказываются на функциональной активности листьев.

<и са К о

Ж

ЕЗ *

о.

си «: о

о

500

450

_ 400

8 350

I 300

о 250

3 200 о

ти 150 £ 100

50 -

□ Контроль Я Лок ТШ

3 6 9 10

Номер листа от основания побега

л —

5 о

о

£ ^

* ¡2 § |

I

с

450 400 350 300 -250 ^ 200 -1 150 -100 -50 -

□ Контроль И Лок ТШ

3 6 9 10

Номер листа от основания побега

Рис. 3. Содержание цитокининов (сумма зеатина, его рибозида и нуклеотида) (а, п = 5) и устьичная проводимость (б, п = 10) листьев трансгенных растений табака через час после локальной индукции фг-гена тепловым шоком (лок ТШ).

Из рисунка За видно, что при индукции синтеза цитокининов в корнях, их содержание возрастало в побеге, что было более заметно в верхних дифференцированных листьях, куца, судя по повышенной устьичной проводимости этих листьев (рис. 36), направлялась основная часть

транспирационного потока из корней. Индукция /рг-гена в корнях, в свою очередь, повышала устьичную проводимость. Эта закономерность была ранее описана в статье Л.Б. Высоцкой с соавторами (Ууз^Бкауа е1 а1., 2010). Новизна настоящих результатов в том, что с помощью иммуногистохимического подхода на этой модели мы впервые изучили распределение нитокининов между клетками листа (рис. 4).

Рис. 4. Влияние локальной индукции г/?/-гена на иммуногистохимическую локализацию цитокининов в клетках листьев растений табака (а, в - через час после индукции, б, г - контроль). 1 - замыкающие клетки устьиц, 2 -клетки мезофилла.

Из рисунка 4 видно, что индукция 7^-гена в корнях повышала уровень цитокининов как в клетках мезофилла, так и устьичных клетках. Влияние гормонов на устьичные клетки важно для адаптации растений к условиям обитания. Механизм действия гормона абсцизовой кислоты (АБК) на клеточном уровне хорошо изучен (5!пс1тпс1га е1 а1., 2009). В отличие аг АБК, сведения о цитокининах сводятся, в основном, к данным о влиянии экзогенных гормонов

на транспирацию и к выявлению связи между этим процессом и суммарным содержанием цитокининов в листе. Для более глубокого проникновения в механизм действия цитокининов на устьица важно изучать распределение этого гормона между клетками листа. Есть основание предполагать, что влияние цитокининов на устьица связано со способностью этого гормона активировать фотосинтез. При этом снижение концентрации углекислого газа в межклетниках должно поддерживать устьица открытыми. Некоторые исследователи декларируют важность фотосинтеза замыкающих клеток в контроле устьичной проводимости (ВагоН а а1., 2008; Ьа\теоп, 2009), в то время как другие предполагают, что приоритет принадлежит фотосинтезу клеток мезофилла (ЯоеШета е1 а1., 2002). Обнаруженное нами накопление цитокининов как в клетках мезофилла, так и устьиц свидетельствует в пользу того, что в растении могут функционировать механизмы как прямого, так и непрямого контроля цитокининами устьичной проводимости.

Таким образом, индукция 1р1- гена в корнях повышала уровень цитокининов как в клетках мезофилла, так и устьичных клетках, что способствовало их открытию, повышению газообмена и фогосинтеза, т.е. повышенный синтез цитокининов в корнях увеличивал их приток в побег и сказался на его функциях. Важно было проверить, как изменение уровня цитокининов при тепловом шоке влияет на рост побегов и корней.

Влияние тотального и локального теплового шока на соотношение массы побега и корня у /р/-трансгенных и нетрансформированных растений табака

Для того чтобы проверить, как изменение уровня цитокининов влияет на рост побегов и корней, наряду с прогревом корней, мы также нагревали растения целиком, чтобы вызвать тотальную экспрессию ¡р/-гена и накопление цитокининов во всем растении.

» 7

6 "

и 5

й 2 4 -

§ Си з -

Л

и 2 и

1

о -

□ побег Я корень ® корень/побег;

Т.

Контроль

Тот

Лок

X

о. о

X

0,4 £

о

0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0

Рис. 5. Влияние тотального (Тот) и локального (Лок) тепловых шоков на массу (ш) побегов и корней и их соотношение (т корень/побег) у трансгенных растений табака (п=50).

и о г

5

х

5

а

2 =

я

о =

х

я

Щ

с.

о ч о

и

250

3 200 У

с«

г

« 150

о

е.

100

'и и Е

50

□ Побеги ■ Корни

Контроль

Тот

Лок

Рис. 6. Влияние тотального (Тот) и локального (Лок) тепловых шоков на содержание цитокининов (сумма зеатина, его рибозида и нуклеогида) в побегах и корнях у /р^-трансгенных растений табака (п=5).

Из рисунка 5 видно, что эти воздействия приводили к диаметрально противоположной ростовой реакции корней. При тотальном тепловом шоке относительная скорость роста корней снижалась, что проявлялось в уменьшении соотношения массы корня и побега. Этот ответ был связан с резкой активацией роста побега. При локальной индукции синтеза цитокининов в корнях происходила относительная активация роста корней, т.е. увеличение соотношения массы корня и побега за счет менее выраженного торможения роста корней по сравнению с побегом.

900

т

0

1 з 6°0

3 о ■х. о

0 я

II

Ф о.

1 з

то " X а. о

4 о о

300

ш диф лист

а апекс

контроль

лок

тот

Рис. 7. Содержание цитокининов (п=5; сумма зеа гина, его рибозида и нуклеотида) в верхних сформированных листьях и апексах 1р1-трансгенных растений табака после последнего воздействия теплового шока на целое растение (Тот) и локально на корень (Лок).

Ростовую реакцию корней не удалось связать с корневыми цитокининами, поскольку их содержание возрастало по сравнению с контролем как при тотальном, так и локальном тепловом шоке (рис. 6). В какой-то мере можно было проследить связь ростового ответа корней с изменением содержания цитокининов в побеге: резкое возрастание уровня цитокининов в побеге по сравнению с контролем сопровождалось торможением роста корней. Тем не менее, при локальном тепловом шоке эту связь выявить не удалось, поскольку небольшое накопление цитокининов в побегах в этом случае приводило не к

торможению, а относительной (по сравнению с побегом) активации роста корней.

Мы предположили, что оценка общего содержания цитокининов в побеге недостаточно информативна, и провели анализ цитокининов отдельно в сформированных листьях и апексе побега с активно растущими листовыми зачатками. Из рисунка 7 видно, что при локальной индукции синтеза цитокининов в корнях их содержание возрастало только в сформированных листьях, но не в апексе. Это легко объяснить тем, что, в отличие от дифференцированного листа, в апексе плохо развиты ксилемные сосуды и сюда может не доходить поток цитокининов из корней. В результате, видимо, нарушался нормальный градиент цитокининов между растущими и дифференцированными листьями, что было одной из причин зарегистрированного ингибирования роста побега.

При тотальной индукции синтеза цитокининов их уровень резко возрастает именно в апексе. Благодаря известной аттрагирующей способности цитокининов (Roitsch, Gonzalez, 2004) это должно обеспечить зарегистрированную активацию роста побега и подавлять отток ассимилятов в корни, ингибируя их рост. Таким образом, на росте корней сказывается не просто уровень цитокининов в побеге, но их распределение между его донорной и акцепторной частями.

Влияние вторично активного транспорта на содержание цитокининов в побегах и корнях растений габака в норме и после действия теплового шока.

После анализа опытов с искусственной модификацией уровня цитокининов в трансгенных растениях важно вернуться к нормальным нетрансформированным растениям табака.

6 -

4 -

к и и

в}

г

к

я

I

и

Я корень/побег т , И корень □ побег

0.2

ОД

л у

и «

<и X X

<и

3

о

X

н о о

и

-

о Ю о

.в

X <и с.

о X

Контроль

ТШ

Рис. 8. Влияние тотального теплового шока на массу (т) побега и корней и их соотношение (т корень/побег) у нетрансформированных растений табака (п=50).

На рисунке 8 показано изменение массы побега и корня у нетрансформированных растений табака при тотальном воздействии теплового шока. Из рисунка видно, что тепловой шок подавлял рост побега нетрансформированных растений табака. Рост корней подавлялся в меньшей степени, и относительное накопление биомассы корня было выше, чем в контроле. При этом содержание иитокининов возрастало в корнях и резко снижалось в побеге, что указывает на снижение оттока цитокининов из корня в побег (рис. 9). Опять мы видим, что снижение содержания цитокининов в побеге способствовало подавлению его роста и могло быть предпосылкой для относительной активации роста корней. Важно было понять, как регулируется отток цитокининов из побега в корень.

В

0 X

a 3

о

1 S

I 1

Я á

я _

«

о.

at

о U

220 -200 180 160 140 120 100 80 -60 40 -20 -0 4

□ побег М корень

Контроль

ТШ

Рис. 9. Влияние тотального теплового шока (ТШ) на содержание цитокининов (сумма зеатина, его рибозида и нуклеотида) в корнях и побегах (п= 5) ^трансформированных растений табака (п=50).

При ряде стрессовых воздействий (дефицит макроэлементов (Черкозьянова и др., 2005) и воды (Kudoyarova et al., 2007), засоление (Albacete et al., 2008) и тепловой шок (Itai et al., 1978)) было зарегистрировано снижение концентрации цитокининов в ксилемном соке и их притока из корней, что сопровождалось ингибированием роста листьев (Kudoyarova et al., 2007) и их преждевременным старением (Alvarez et al., 2008; На et al., 2012). Тот факт, что эти отрицательные последствия стрессовых воздействий удавалось нивелировать, обрабатывая листья экзогенными цитокининами (Кулаева, 1962; Itai et al., 1978; Albacete et al., 2008), указывал на роль цитокининов в регуляции роста и предотвращении старения листьев растений. В ряде экспериментов была убедительно продемонстрирована решающая роль корневых цитокининов в индукции экспрессии в листьях ряда генов, участвующих в ответе растений на добавление нитратов в питательную среду (Forde, 2002). На основании этих и других подобных наблюдений сформировалась концепция о сигнальной

функции корневых цитокининов, что объясняет интерес к изучению механизмов, обеспечивающих регуляцию притока цитокининов из корней. Основное внимание в этом плане уделялось метаболизму цитокининов в корнях (их синтезу (Takei et al., 2002) и распаду (Brugiere et al., 2003)). Вместе с тем, при действии засоления на растения томатов одновременно со снижением концентрации цитокининов в ксилемном соке и листьях было выявлено их накопление в корнях (Albacete et al., 2008). Эти результаты указывали на то, что уровень экспорта цитокининов может зависеть не только от их метаболизма, но и от неких процессов, способных повлиять непосредственно на транспорт цитокининов из корней в побег. В клеточных мембранах было выявлено присутствие переносчиков, способных обеспечивать активное поглощение цитокининов против градиента их концентрации как в форме свободных азотистых оснований (Burkle et al., 2003), так и рибозидов (Hirose et al., 2005).

Рис. 10. Влияние ингибитора вторично активного трансмембранного переноса КЦХФ на содержание разных форм цитокининов (п=5; ЗН -зеатиннуклеотид, ЗР - зеатинрибозид, 3 - зеатин) в корнях ^трансформированных растений табака, подвергнутых тотальному теплому шоку (ТШ).

В нашей лаборатории совместно с сотрудниками Башкирского государственного университета получены приоритетные данные о том, что активное поглощение цитокининов клетками корней из апопласта снижает их отток в побеги растений пшеницы (Киёоуагоуа еЧ а1., 2014). Важно было проверить, не этот ли механизм обеспечивает накопление цитокининов в корнях нетрансформированных растений табака при тотальном тепловом шоке.

Из рис. 9 видно, что обработка корней ингибитором активного трансмембранного переноса снижала накопление цитокининов корнями и нивелировала разницу между контрольными и подвергнутыми тепловому шоку растениями. Эти результаты подтверждают предположение о том, что снижение оттока цитокининов при тепловом шоке могло быть связано с активацией их поглощения клетками корней. Результаты, полученные нами в экспериментах с подвергнутыми тепловому шоку растениями табака, соответствуют данным о том, что ингибирование активного трансмембранного переноса предотвращает накопление цитокининов в корнях растений пшеницы при действии засоления (Коробова, 2014). Обнаруженное сходство в реакции растений табака и пшеницы указывает на универсальность механизма регуляции оттока цитокининов из побега в корень при стрессе у однодольных и двудольных растений.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в серии экспериментов получено экспериментальное подтверждение роли цитокининов побега в регуляции роста корней. Изменение соотношения массы корней и побегов соответствовало изменениям содержания цитокининов в побегах, в то время как связь уровня цитокининов в корнях с изменением относительной скорости их роста выявлялась гораздо реже. Наши результаты подтверждают предположение о том, что цитокинины, стимулируя рост побега, снижают отток ассимилятов в корни и тем самым тормозят их рост (Веек, 1996). Наши результаты не могут служить основанием для утверждения, что цитокинины не влияют непосредственно на рост корней. Тем не менее, они

указывают на важность зависимых от цитокининов процессов, которые происходят в побегах, для регуляции роста корней.

ВЫВОДЫ

1. Обнаружено, что при повышении температуры выращивания растений подавление роста корней пшеницы связано с накоплением цитокининов в побеге, а не с изменением их содержания в корнях.

2. Выявлено повышение уровня цитокининов в клетках мезофилла и устьиц листьев при локальной индукции 1р1-гена в корнях трансгенных растений табака, что сопровождается повышением устьичной проводимости и свидетельствует о способности корневых цитокининов влиять на процессы в побегах.

3. Показано, что тотальная (во всем растении) и локальная (в корнях) индукция синтеза цитокининов противоположным образом влияет на рост корней: относительная скорость роста корней снижается при тотальном воздействии за счет активации роста побега и возрастает при локальном за счет меньшей степени подавления роста корней по сравнению с побегом. Это свидетельствует против определяющей роли уровня цитокининов в корнях в регуляции их роста.

4. Обнаружено, что активация роста побега и одновременное снижение относительной скорости роста корней при тотальной индукции синтеза цитокининов связана с накоплением цитокининов в апексе побега, а торможение роста побега при локальной индукции синтеза цитокининов в корнях - с отсутствием их накопления в апексе и нарушением градиента гормонов между верхним дифференцированными листом и апексом.

5. На примере растений табака, подвергнутых воздействию теплового шока, выявлена роль активного поглощения цитокининов клетками корней в регуляции их оттока в побег, в результате чего подавляется рост побега и происходит относительная активация роста корней.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Дедова М.А., Высоцкая Л.Б., Иванов И.И., Кудоярова Г.Р. Влияние тотального и локального теплового шока на соотношение массы побега и корня у грг-трансгенных и нетрансформированных растений табака. Известия Самарского научного центра РАН. 2011. Т.13, № 5(3). С. 136-139.

2. Л.Б. Высоцкая, Г.Р. Ахиярова, Г.В. Шарипова, М.В.Дедова, С.Ю. Веселов, Д.Ю. Зайцев, Г.Р. Кудоярова. Влияние локальной индукции ipt- гена в корнях на иммунолокализацшо шггокининов в клетках листьев трансгенных растений табака. Цитология 2014, Т. 56, С. 816-821.

3. Дедова М. А., Высоцкая Л. Б., Кудоярова Г. Р., Веселов С. Ю. Влияние вторично активного транспорта на содержание цитокининов в побегах и корнях растений пшеницы в норме и после действия теплового шока. Вестник БашГУ. - 2014. - Т. 201, - С. 449-452.

4. Дедова М.А., Высоцкая Л.Б., Кудоярова Г.Р. Роль цитокининов в регуляции соотношения корень/побег у растений пшеницы при изменении температуры. Материалы годичного собрания Общества физиологов растений России «Физиология растений - теоретическая основа инновационных arpo- и фитобиотехнологий». (Калининград, 2014). Т.2. С. 152-154.

Подписало в печать 10.02.15 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать ризографическая. Тираж 100 экз. Заказ 046. Гаршггура «Ттс^ЫеиКотал». Отпечатано в типография «ПЕЧАТНЫЙ ДОМЪ» ИП ВЕРКО. Объем 1 п.л. Уфа, Карла Маркса 12 корп. 5, т/ф: 27-27-600, 27-29-123