Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль фитогормонов во взаимодействии побега и корня

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Роль фитогормонов во взаимодействии побега и корня"



На правах рукописи

ВЫСОЦКАЯ ЛИДИЯ БОРИСОВНА

РОЛЬ ФИТОГОРМОНОВ ВО ВЗАИМОДЕЙСТВИИ ПОБЕГА И КОРНЯ

Специальность 03.00.12 - Физиология растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа-1998

Работа выполнена в Институте биологии Уфимского научного центра Российской Академии наук.

Научный руководитель:

доктор биологических наук Г.Р.Кудоярова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Э.М.Коф

кандидат биологических наук Ф.М.Шакнрова

Ведущая организация:

Ботанический сад Уфимского научного центра Российской Академии наук

Защита состоится "/У " ¡л. ¿ОН. Л 1998 г.в

¡,00

.часов

на заседании диссертационного совета К 064.13.09 в Башкирском государственном университете имени 40-летия Октября.

Адрес: 450074, г.Уфа, ул.Фрунзе, 32, биологический факультет Башкирского государственного университета, ауд.332

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Башкирского государственного университета.

Автореферат разослан

.1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

Г.Г.Кузяхметов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Растениям каждого вида на всех стадиях роста и развития свойственна способность поддерживать определенное соотношение массы по бег/корень, что обеспечивает сбалансированность фиксации побегом углекислого газа и усвоения корнями воды и элементов минерального питания. Предполагается, что наряду с трофическими факторами сбалансированный рост побега и корня регулируется эндогенными гормонами. По крайней мере, гормоны, введенные извне, способны повлиять на соотношение побег/корень (Бурханова и др., 1984; Kuiper, 1987; Jackson, 1997). Известно, что цитокинины синтезируются в основном в корнях (Кулаева, 1962; Short, Torrey, 1971), в то время как ауксины - в побегах (Goldsmith, 1977; Дерфлинг, 1985). Поскольку эти гормоны транспортируются из органа-продуцента в другие части растения, где они оказывают влияние на ростовые процессы, именно ауксинам и цитокининам отводится определяющая роль в регуляции сбалансированного роста побега и корней (Wareing, 1973). Нужно отметить, что в литературе недостаточно сведений об изменении концентрации эндогенных гормонов в связи с координацией роста побега и корня.

Удобная модель для изучения регуляции сбалансированного роста - это растения, у которых искусственно удаляется часть корневой системы. Вместе с тем, в такого рода экспериментах уделялось недостаточное внимание возможной роли гормонов в восстановлении соотношения массы побег/корень. Одним из механизмов гормональной регуляции этого процесса может быть взаимовлияние гормонов (Evans, 1985). В литературе есть данные о способности одних гормонов изменять концентрацию других. Однако именно взаимодействию цитоки-нины/ауксины уделялось меньше внимания по сравнению с другими парами гормонов, хотя, как указывалось выше, именно им, скорее всего, может принадлежать наиболее важная роль в регуляции соотношения побег/корень. В тоже время изучение возможной роли других гормонов (например, АБК) в регуляции соотношения побег/корень также представляет интерес.

Все сказанное определило цель данной работы, которая состояла в том, чтобы изучить роль изменения концентрации эндогенных гормонов в координации роста побега и корня.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить динамику содержания гормонов: цитокининов, АБК и ауксинов, - в корнях и побегах проростков пшеницы после частичного удаления корней.

2. Исследовать влияние различных концентраций экзогенных ауксинов на содержание цитокининов в побегах и корнях проростков пшеницы.

3. На модели изолированных листьев исследовать механизмы автономной регуляции концентрации цитокининов в условиях отсутствия экспорта данных гормонов из корней.

4. Оценить возможную роль АБК как модификатора действия цитокининов и ауксинов на соотношение побег/корень.

Научная новизна. Показано, что индукция роста корней в результате частичной редукции корневой системы проростков пшеницы, сопровождается и может быть обусловлена накоплением в них ауксинов, а сохранение высокой скорости роста побега - высоким уровнем содержания цитокининов. Обнаружено, что увеличение концентрации цитокининов у обработанных ауксином проростков пшеницы наблюдается только после снижения уровня индуцированного ауксином накопления АБК.

Выявлена способность изолированных листьев пшеницы накапливать активную форму цитокининов (зеатин), что может быть результатом гидролиза запасных форм или синтеза гормона in situ.

Практическая »снность. Изменение соотношения биомассы побег/корень является одним из механизмов реализации устойчивости растений к стрессам. Поэтому изучение гормональной регуляции этого соотношения открывает возможности для управления продуктивностью растений с помощью экзогенных гормонов, что имеет большое значение для решения практических задач растениеводства.

Апробация работы. Основные положения представлены на 14-ом международном симпозиуме "Корни растений - от клетки к системе" (Бристоль, 1995), симпозиуме "Физико-химические основы физиологии растений" (Пенза, 1996), IV-ом симпозиуме Международного Общества по исследованию корня (Клемсон, 1996), 10-ом конгресс Федерации Европейских обществ физиологов растений (Флоренция, 1996), четвертой международной конференции "Регуляторы роста и развития растений (Москва, 1997), на 3-ем ежегодном симпозиуме ВОФР "Физико-химические основы физиологии растений и биотехнология" (Москва, 1997).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и списка литературы. Объем основного текста работы составляет 134 стр., включает 16 рисунков и 3 таблицы. Список использованной литературы состоит из 378 наименований.

Автор выражает сердечную благодарность своему научному руководителю д.б.н. Кудояровой Г.Р. за постоянную помощь на всех этапах выполнения работы, а также к.м.н. Веселову С.Ю. за любезно предоставленные им иммунореагенты для ИФА. Особую признательность автор выражает друзьям и коллегам к.б.н. Фархутдинову Р.Г., к.б.н. Мустафиной А.Р., к.б.н. Тепловой И.Р., Митриченко А.Н. за всестороннюю поддержку и помощь.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проводили на растениях твердой яровой пшеницы {Triticum durum L., сорта Безенчукская 139) в лабораторных условиях в водной культуре. Семена проращивали в темноте на водопроводной воде при температуре 24 ° С. Через двое суток кювету помещали па све-топлощадку (освещенность 18 кЛк, продолжительность светового периода 14 часов), а через сутки переносили растения в кювету с 10% питательной средой Хогланда-Арнона 1. Температура воздуха и воды поддерживалась в пределах соответственно день/ночь 26/20° (воздуха) и 22/18" С (воды). Объектом исследования служили 8-дневные проростки.

У опытных растений удаляли часть корневой системы, оставляя на побеге один корень, контрольные - без удаления корней. В экспериментах по изучению влияния экзогенного ауксина на содержание цитокининов и АБК 8-дневные растения переносили на 10 %-ную питательную среду Хогланда-Арнона 1, содержавшую 2,4-Д в концентрациях 0,1, 1 и 10 мг/л. В качестве контроля, в тс же сроки, брали растения, которые росли в тех же условиях на среде без 2,4-Д. В экспериментах с изолированными листьями пшеницы отбирали растения средних размеров и отрезали под водой первый темно-зеленый завершивший рост неповрежденный лист. Изолированные листья помещали в стеклянные сосуды с дистиллированной водой и смачивали 20 мМ раствором ЫН^ЬЮз, содержащим 0,01 % твина 60. Обработку проводили четыре раза в день через равные промежутки времени. В качестве контроля брали листья, которые находились в этих же условиях и обрабатывались одновременно с опытными 0,01%-ным раствором твина 60.

Транспирацию определяли весовым методом. Сумму хлорофил-лов а и Ь определяли фотометрически в аликвоте спиртового экстракта, полученного из навески побегов, при длине волны 652 нм. Расчет вели по формуле Бруинзма и Холдена (Гродзинский, Гродзинский, 1973).

С„+л = 27,8 -Дб52,

где Дб52 - измеряемый коэффициент экстинкции в мг/л при длине волны 652 нм.

Результаты рассчитывали в нмоль/г сырой массы.

Экстракция, очистка и концентрироваиис гормонов. Растительный материал гомогенизировали в жидком азоте и экстрагировали 80%-ным этанолом в соотношении 1:10 (на 1 г сырой растительной массы брали 10 мл спирта) в течение 14 часов при 4° С. Супернатант отделяли центрифугированием (15000 об/мин, 10 минут) при охлаждении, упаривали до водного остатка. Отбирали апиквоту для определения цитокининов. Оставшийся водный остаток разбавляли дистиллированной водой и подкисляли 1н НС1 до рН 2-3, после чего ИУК и АБК дважды экстрагировали диэтиловым эфиром при соотношении органической и

неорганической фазы 1:3. Из объединенной органической фазы гормоны реэкстрагировали 1%-ным гидрокарбонатом натрия при соотношении 1:3 (водная фаза/органическая фаза). Органическую фазу отделяли и отбрасывали, а из водной фазы после подкисления до рН 2-3 дважды извлекали фитогормоны диэтиловым эфиром. Находящиеся в диэти-ловом эфире И У К и АБК метилировали диазометаном для стабилизации (Кудоярова и др.,1986).Для очистки и концентрирования цитоки-нинов на картридже Cis водный остаток, предварительно осветленный центрифугированием, наносили на колонку, которую затем промывали 20 мл дистиллированной воды. Цитокинины эшоировали 70%-ным спиртом, упаривали досуха и, растворив в минимальном количестве 80%-ного спирта, наносили на силуфоловую пластину для ТСХ. Разделение цитокининов проводили в системе растворителей бутанол: аммиак: вода (6:1:2). После детекции в УФ свете положения метчиков, которые добавляли к половине экстракта, содержимое зон элюировали 0,1 М фосфатным буфером (рН 7). После удаления сшшкагеля путем центрифугирования в надосадочной жидкости определяли содержание цитокининов с помощью иммуноанализа. Количество О-глюкозидов оценивали но разнице иммунореактивности до и после обработки водного остатка образца р-глюкозидазой (1мг фермента фирмы "Sigma" на 1мг образца) при рН 5. Смесь инкубировали в термостате при 37° С в течение четырех часов. Фермент инактивировали добавлением этилового спирта и после отделения центрифугированием упаривали спирт до водного остатка, в котором определяли цитокинины с помощью иммуноферментного анализа. Гидролиз спиртонерастворимых коныогатов цитокининов проводили 1н NaOH при 70° С в течение двух часов.

Иммуноферментпый анализ проводили в лунках полисгиролово-го планшета (Linbro, Flow Laboratories, Англия). На первом этапе конъюгаг гормона с белком сорбировали на твердой фазе (полистирол) в течение 1,5 часов при 37° С. По окончанию времени инкубации трехкратно промывали физиологическим раствором (рН 6,8-7,0), содержащим 0,05 % поверхностно активног о вещества Tween-20 (ФТ). Этот же

раствор использовали на всех последующих стадиях промывки. Связывание гормонов (ИУК, АБК и цитокининов) с антителами проводили в лунках. Кроличью сыворотку, содержащую антитела к соответствующему гормону (ИУК, АБК, зеатинрибозиду и изопентениладенозину), разводили в ФТО (0,5 %-ный раствор овальбумина в физиологическом растворе, содержащем 0,05 % поверхностно активного вещества Tween-20) и приливали по 100 мкл в лунку. Инкубировали при 37° С в течение 1 часа, затем промывали лунки раствором ФТ. Для определения количества сорбированных на твердой фазе антител к гормонам, использовали препарат антикроличьих бараньих антител, меченых пероксида-зой. Количество нммуносорбированных антител определяли по цветной реакции субсграта (0,4 мг/мл ортофенилендиамина в 0,06 М фосфатном буфере рН 5,0, содержащем 0,006 % перекиси водорода). Цветная реакция развивалась в течение 10-15 мин, затем ее останавливали 4 н серной кислотой (по 50 мкл в лунку). Оптическую плотность измеряли на фотометре Titertek-Uniskan при длине волны 492 нм. При детекции концентрации цитокининов в растительном материале определяли как общую иммунореактивность зеатинподобных веществ (из водного остатка), так и содержание зеатина, зеатиннуклеотида, зеатинрибозида после концентрирования на картридже и разделения на ТСХ.

Статистическая обработка. Статистическую обработку проводили по оригинальным программам. Достоверность различий оценивали по критерию Стыодента. На рисунках и в таблицах представлены средние значения и ошибки средней.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Дннамика содержания гормонов п проростках пшеницы в ответ на частичное удаление корневой системы

Литературные данные свидетельсвуют об участии гормонов в поддержании баланса между ростом побега и корня (Jackson, 1993; 1997). В связи с этим мы провели анализ динамики содержания ИУК, цитокининов и АБК в побегах и корнях проростков пшеницы после частичного удаления их корневой системы. Выбор данных гормонов

определялся тем, что они, по-видимому, играют определяющую роль в координации роста этих органов.

Рис. 1. Содержание (а) н концентрация (б) ИУК в корнях интактных растений (контроль) и после частичного удаления корней (опыт).

Как видно из рисунка 1а, в первые двое суток после удаления части корней содержание ИУК во всей массе оставшихся корней одного растения было не меньше, чем у интактных. Затем было обнаружено увеличение содержания ИУК как в корнях растений, подвергавшихся воздействию, так и контрольных, а начиная с 4-х суток у растений с редуцированной корневой системой наблюдался спад содержания гормона. Концентрация ИУК в 1 г сырой массы корней (рис. 16) была выше у растений с частично удаленными корнями по сравнению с контрольными в течение трех дней после воздействия, а затем уменьшалась до уровня ниже контрольного.

Удаление части корней сопровождалось первоначальным накоплением и резкими колебаниями концентрации АБК п корнях растений (рис. 2), в то время как в побегах явного накопления АБК, по сравнению с контролем, не было обнаружено.

Рис. 2. Концентрация АБК в корнях (а) и побегах (б) шпгактных растений (контроль) и после частичного удаления корней (опыт).

50 т

120 т

б

2 3 4 Сутки

2 3 4 Сутки

а

Рис. 3. Концентрации цитокининов в корнях (а) и побегах (б) иитактных растений (контроль) и нодвер^вшихся удалению части

корней (опыт)

Данное воздействие вызывало резкие колебания концентрации в корне не только АБК (рис. 2), но и цитокишшов (рис. 3). Интересно, что максимумы концентрации цитокининов в корнях растений, подвергнутых воздействию, совпадали по времени с минимальным содержанием АБК. В побегах через день после удаления корней наблюдалось резкое увеличение содержания цитокининов по сравнению с контролем, в след за которым уровень гормона снижался. Несмотря на уменьшение содержания цитокининов в побеге опытных растений в течение трех суток после начала воздействия, их уровень до четвертых суток был не ниже, чем у контрольных растений. В последующем вновь начиналось накопление цитокининов в побеге.

Относительная скорость роста корней растений с редуцированной корневой системой была выше, чем в контроле спустя 2 суток (рис. 4а), тогда как различий по скорости прироста биомассы побега не было (рис. 46), а скорость транспирации была на 10 % выше у опытных растений по сравнению с контрольными.

Рис. 4. Влияние удаления части корней на рост растении.

Анализируя полученные результаты, прежде всего обращает на себя внимание, что удаление части корней приводило к компенсаторному увеличению скорости накопления биомассы корневой системы растений. Увеличение концентрации ИУК могло быть причиной наблюдаемой индукции роста корней, поскольку по данным литературы этот процесс, прежде всего, связан с ауксином (Blakesley et al., 1991). Вслед за увеличением происходило снижение концентрации ауксинов в корнях опытных растений, что также соответствует данным литературы (Weigel et al., 1984; Maldiney et al., 1986). Как известно, ауксины в основном продуцируются в побеге (Дерфлинг, 1985; Kawaguchi, Syono, 1996), откуда они поступают в корни. В наших опытах как в контроле, так и в опыте доля корневой ИУК составляла 50 % от общего содержания гормона во всем растении. В тоже время, концентрация ИУК в корнях опытных растений первоначально возрастала. Причиной увеличения концентрации гормона могло быть просто концентрирование поступающей в корень ИУК в уменьшенную по объему корневую систему. Такое объяснение может быть применимо к первой фазе ответа на воздействие. Однако на третий день доля корневой ИУК возрастала и превышала контрольные значения на 40 %, что указывает на усиление оттока гормона из побега в корень.

Второй класс гормонов, изменение концентрации которых представляет интерес - это цитокинины. Эти гормоны продуцируются в основном корнями (Кулаева, 1962; Horgan, 1992). Поэтому не удивительно, что удаление части корневой системы сопровождалось снижением уровня цитокининов в побеге на протяжении всего эксперимента (кроме последнего дня). Обнаруженное в конце эксперимента возрастание концентрации цитокининов в побегах опытных растений вполне можно объяснить тем, что к этому периоду увеличивалась масса корневой системы. Однако совершенно неожиданным был эффект повышения содержания цитокининов по сравнению с контролем через сутки после удаления корней. Учитывая данные литературы о роли цитокининов в регуляции роста растений и водного обмена, можно предполагать, что цитокинины играют важную роль в поддержании уровня этих

процессов у растений с частично удаленными корнями. Поддержание высокой скорости роста у растений с редуцированной корневой системой, по-видимому, определяется первоначально высоким уровнем содержания цитокининов. Этому также могло способствовать отсутствие накопления АБК в побегах растений с частично удаленными корнями.

Но откуда же получали дополнительные цитокинины растения с частично удаленными гормон-продуцирующими органами? Одно из возможных объяснений - резкая активация продукции цитокининов оставшимися корнями, второе - освобождение гормона из пула запасных форм в самом побеге. Если верно первое предположение, то важно выяснить, что могло быть сигналом для активации продукции цитокининов в корнях. Поскольку известна способность одних гормонов влиять на синтез других, а концентрирование ауксинов в оставшихся корнях, очевидно, являлось прямым следствием редукции корневой системы, представляло интерес исследовать способность ауксинов влиять на уровень цитокининов в проростках пшеницы.

Влияние экзогенного ауксина на содержание цитокинииов и АБК в проростках пшеницы

В качестве экзогенного ауксина использовали 2,4-Д. Ее добавляли в концентрации 0,1, 1 и 10 мг/л в питательный раствор, на котором инкубировали целые проростки. Мы проводили анализ концентрации АБК, суммы цитокининов и зеатина в проростках на протяжении трех суток от момента внесения ауксина. Через день после внесения 2,4-Д в питательный раствор наблюдалось возрастание уровня АБК в побегах проростков пшеницы по сравнению с контролем (рис. 5а). При этом максимальное значение концентрации эндогенного гормона в первые сутки соответствовало наибольшему содержанию 2,4-Д в питательной среде, в то время как на фоне промежуточной концентрации экзогенного ауксина уровень накопления АБК был самым низким, хотя и превосходил контрольное значение. На вторые сутки содержание АБК на фоне высокой и промежуточной концентраций 2,4-Д снижалось но

2 о о га 2

О

а. 2 о

600

500

400

300 -

3" го

о. >-

X

ф

3" X

о

200

100

0,1

120

100

140 600

500

400

300

200

100

140 600

120

100

О 0,1 1 10 Концентрация 2,4-Д, мг/л

500

400

300 -

200

100

[ - '-ьг -АБК...... ]

- сумма ^токининоа

- зеатуш

О 0,1

10

б

о

Рис. 5. Содержание цитокининов и АБК в побегах проростков пшеницы после внесения 2,4-Д в питательный раствор (а- через одни, б- двое, в- трое суток)

сравнению с первыми, но продолжало возрастать в побегах растений, растущих на среде с самой низкой концентрацией экзогенного ауксина (рис. 56). В конце эксперимента слабое накопление АБК по сравнению с контролем было обнаружено лишь на фоне промежуточной концентрации 2,4-Д.

Наблюдаемый в наших эксперимеЕггах эффект быстрого накопления АБК в побегах проростков пшеницы, обработанных 2,4-Д, согласуется с данными литературы (Мелехов, Лаврентьев, 1989).

Анализ суммарного содержания цитокининов через день после введения ауксина показал отсутствие его действия в низкой и промежуточной концентрациях, в то время как при высокой - содержание цитокининов снижалось относительно контроля (рис. 5а). Следует отметить, что при этой же концентрации 2,4-Д уменьшалось содержание зеатина, в то время как под влиянием промежуточной - уровень данного эндогенного гормона даже увеличивался по сравнению с контролем.

Через двое суток концентрация цитокининов в побегах растений значительно повышалась при действии 1 и 10 мг/л 2,4-Д (рис. 56). Сходным образом ауксин изменял содержание зеатина. На третий день также можно было отметить тенденцию превышения уровня контроля по содержанию суммы цитокининов в побегах обработанных растений, которая однако была максимальной при минимальной концентрации ауксина (рис. 5в). В то же время никаких изменений содержания зеатина обнаружено не было.

Проводя сравнение между изменением содержания АБК и цитокининов, можно сказать, что уровень накопления АБК в значительной степени зависел от концентрации синтетического ауксина и продолжительности его действия на растения. Что касается влияния синтетического ауксина на содержание цитокининов, то его характер также менялся на протяжении эксперимента. Сначала мы наблюдали тенденцию уменьшения, а затем возрастание концентрации цитокининов в побегах, обработанных 2,4-Д растений по сравнению с контрольными.

Сравнение кривых, отражающих динамику концентрации гормонов, выявило связь между индуцированными 2,4-Д изменениями содержания АБК и цитокининов (рис. 5). В первые сутки опыта содержание цитокининов было минимальным в случае максимальной концентрации синтетического ауксина, при которой уровень накопления АБК был самым высоким. Напротив, на фоне промежуточной концентрации 2,4-Д, при которой накопление АБК было выражено в наименьшей степени, суммарное содержание цитокининов не отличалось от контроля, в то время как свободного зеатииа было даже больше, чем у необработанных растений. В следующие дни также можно было проследить некую связь между содержанием АБК и цитокининов. Так, на второй день снижение уровня АБК у растений, обработанных ауксином в максимальной концентрации, сопровождалось накоплением цитокининов в побеге. В то же время на фоне минимальной концентрации 2,4-Д, при которой дольше (не 1, а 2 дня) продолжалось накопление АБК, увеличение уровня цитокининов было зарегистрировано лишь на третий день, когда содержание АБК снижалось. Следовательно, повышение содержания цитокининов под влиянием ауксина проявлялось только после снижения содержания АБК до порогового уровня, соответствующего 250 нг/г сырой массы.

В литературе имеются данные о влиянии АБК на содержание цитокининов. Так АБК снижала уровень эндогенных цитокининов (Теплова и др., 1990), влияла на метаболизм экзогенного зеатина (Sondheimer, Tzou, 1971) и предотвращала накопление синтетического цитокинина - 6-бензиламинопурина (Кудоярова и др., 1993). Это позволило предположить, что первоначгитьное снижение уровня цитокининов у обработанных растений связано с индуцированным 2,4-Д накоплением АБК.

Таким образом, обнаруженное нами влияние ауксинов на концентрацию цитокининов и, возможное участие АБК в модификации этого эффекта, может быть важным для понимания множественной гормональной регуляции взаимодействия корень-побег.

Содержание метаболитов цитокининов в изолированных листьях пшеннцы.

Для проверки предположения, которое мы высказали при анализе данных на рис. 36 о способности побега поддерживать уровень эндогенных цитокининов, провели следующую серию экспериментов на изолированных листьях проростков пшеницы, которые были полностью лишены притока цитокининов из других органов. Известно, что изоляция листьев приводит к их преждевременному старению (Кулаева 1962; Balz, 1966), что проявляется, в частности, в уменьшении концентрации хлорофилла (Leopold, 1964; Lazar et al., 1969). Обработка изолированных листьев растворами солей азота и синтетическим цитокинином 6-бензиламинопурином (БАП) замедляет эти процессы (Mothes, Baudisch, 1958; Singh, 1992). Поэтому мы также обрабатывали изолированные листья проростков пшеницы раствором нитрата аммония и БАП.

Рис. 6. Изменение содержания хлорофилла и цитокининов в листьях проростков пшеницы через 4 дня после изоляции но сравнению с

исходным уровнем.

В контрольных, необработанных препаратами, листьях содержание хлорофилла снижалось на четвертый день после изоляции, а обработка БАП или нитратом аммония обеспечивала к этому сроку повышенный, в сравнении с контролем, уровень хлорофилла (рис. 6). Параллельно содержанию хлорофилла изменялось содержание цитокининов, что соответствует данным о роли этих гормонов в регуляции старения (Кулаева, 1973).

В дальнейшем были проведены опыты по изучению детальной динамики отдельных форм цитокининов в изолированных контрольных листьях и обработанных нитратом аммония. Как видно из рисунка

Рис. 7. Динамика содержании свободного зеатина (а) и его нуклео-тида (б) в изолированных листьях проростков пшеницы (опыт - обработка нитратом аммония).

7а, вслед за снижением содержания зеатина в контрольных листьях происходило транзигорное увеличение его уровня, и накоплению свободного гормона в листьях, обработанных нитратом аммо.чия, предшествовало резкое его снижение. Таким образом, действие нитрата

аммония, вероятно, не сводится к задержке распада зеатина, и даже контрольные изолированные листья способны к кратковременному накоплению гормона.

IX

=г го о.

I

0 =г

1

о

о

1_ о х га - 2

250

200

150 --

100

I О-глкжозилированные -Неглкжозилированные

350 300 --

£ § 'о 200

т -г ^

" 150

I О о ь

100 --

I ЕЯ О-глгакозилированные | —о-Ногнюкозилировлнные

Рис. 8. Динамика содержания цитокннинов в контрольных (а) и обработанных раствором нитрата аммония (б) изолированных листьях проростков пшеницы.

Что же является источником накопления зеатина в изолированных листьях пшеницы? Как видно из рис. 7, уровень запасной формы зеатина (его нуклеотида) снижался быстрее, по сравнению со свободной формой. Следовательно, какое-то время уровень зеатина мог поддерживаться за счет высвобождения гормона в результате гидролиза его связанной формы. Однако в последующие дни содержание нуклеотида было уже слишком низким, чтобы обеспечить восполнение пула свободного гормона и увеличение концентрации цитокининов, которое наблюдали в контроле на третьи сутки после изоляции и в варианте с нитратом аммония - на 4-5 сутки.

Другим источником поддержания уровня зеатина могло быть его освобождение из другой запасной (О-глюкозилированной) формы. Как видно из рисунков 7а и 8, содержание О-глюкозидов цитокининов в контрольных листьях увеличивалось сразу же после их изоляции, а затем снижалось, причем это снижение совпадало с транзиторным накоплением зеатина. Результаты указывают на то, что причиной временного накопления цитокининов в контрольных изолированных листьях могло быть их освобождение из О-глюкозилированной формы. Вместе с тем у обработанных нитратом аммония изолированных листьев данный источник, по-видимому, не мог обеспечивать накопления цитокининов, которое было обнаружено в конце эксперимента, т.к. перед этим (на вторые-трегьи сутки) запас О-глюкозидов цитокининов у них истощался (рис. 86).

Судя но результатам анализа гормонов, спиртонерастворимые связанные цитокинины также не могли быть источником накопления спирторастворимых цитокининов в изолированных листьях, обработанных нитратом аммония, т.к. у них наблюдалось параллельное возрастание тех и других форм (рис. 9).

1200

ш

X о

3 о

X го

5 5

О 15

I- О

5 О.

=Г 3 к "

О. N1 ь-

х га

-я 1000 --

о =г

X

о

800

600 --

400

200

□ 1^гежинины, растворимые в этаноле

Н циокинины, нерастворимые в этаноле

2

Сутки

Гис. 9. Содержание цитокининов в обработанных раствором нитрата аммония изолированных листьях проростков пшеницы

Рис. 10. Динамика содержания изопентеннлаленина в контрольных и обработанных раствором нитрата аммония (опыт) изолированных листьях проростков пшеницы.

I

О

Изучение динамики концентрации изопентениладенина (рис. 10) как первого продукта синтеза цитокинина показало в конце эксперимента увеличение его концентрации в изолированных листьях, обработанных нитратом аммония, т.е. в тех же временных точках, когда наблюдалось повышение концентрации зсатина (рис. 7а) и суммы цито-кининов (рис. 86). Эти данные позволяют предполагать возможность синтеза цитокннинов в изолированных листьях проростков пшеницы при обработке их раствором нитрата аммония, что соответствует некоторым данным литературы (Singh et al, 1992).

Таким образом, результаты экспериментов с растениями, у которых удаляли часть корневой системы, соответствуют постулату о ре-гуляторной роли концентрации эндогенных гормонов в координации роста побега и корня. Увеличение концентрации ауксинов в корнях могло быть связано с их накоплением в редуцированной по объему корневой системе (на начальных стадиях гормонального ответа) или с активацией оттока гормона из побега в корень (на более поздних стадиях). Поскольку участие ауксинов в процессах коркеобразования не вызывает сомнений, повышенный уровень данного гормона в корнях обработанных растений вполне мог выступать в роли фактора, активирующего компенсаторный рост корней в ответ на их частичное удаление.

Высокое содержание цитокининов и отсутствие накопления АБК в побегах растений с частично удаленными корнями могли играть важную роль в поддержании их роста, водного обмена и метаболических процессов у растений. Источником накопления цитокининов у растений с редуцированным гормон-продуцирующим органом могло быть как более активное образование цитокининов в оставшихся корнях, так и их мобилизация из запасных пулов в самом побеге.

Опыты с обработкой корней проростков пшеницы 2,4-Д показали, что накопление в растениях цитокининов может быть вызвано но-

вышением уровня ауксинов. Однако проявлению этого эффекта в опытах с экзогенным гормоном, очевидно, мешало накопление АБК в побегах обработанных 2,4-Д растений. Вместе с тем, в экспериментах с удалением части корней растений, АБК не накапливалась. Вероятно, поэтому в последнем случае могло проявиться влияние повышенного содержания ауксинов в корнях на накопление цитокининов в побегах растений с редуцированной корневой системой.

Кроме того, повышенное содержание цитокининов в побегах растений с частично удаленными корнями могло быть следствием процессов, которые происходят в самом побеге. На такую возможность указывают результаты опытов с изолированными листьями: уровень зеатина поддерживался в них как за счет его освобождения из запасных форм (нуклеотидов и О-глюкозидов), так и синтеза гормонов in situ.

ВЫВОДЫ

1. Удаление части корневой системы вызывает увеличение концентрации ауксинов в корнях проростков пшеницы, которое может выступать в качестве фактора, стимулирующего корнеобразование, и приводить к компенсаторному увеличению биомассы корней.

2 Проростки пшеницы с частично удаленными корнями способны сохранять стабильность ростовых процессов, что по-видимому обеспечивается поддержанием в них высокого уровня цитокининов.

3. Сохранению активности роста побега проростков пшеницы с частично удаленной корневой системой могло способствовать обнаруженное отсутствие накопления в них "гормона стресса" АБК.

4. Обработка корней проростков пшеницы экзогенным ауксином вызывает в побегах увеличение концентрации АБК и цитокининов. При этом накопление АБК является временным, и только после снижения ее уровня происходит рост содержания цитокининов, что указывает на участие АБК в модификации влияния ауксинов на концентрацию цитокининов.

5. Изолированные листья активно регулируют уровень цитоки-

нинов как за счет высвобождения их из запасных форм, так и синтеза in

situ.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Vysotskaya L.B., Veselov S.U., Kudoyarova G.R The influence of auxin on cytokinins and ABA content in roots and shoots of wheat seedlings//

• Plant Roots - from Cells to Systems (Abstracts of 14th Long Ashton International Symposium, September 13-15 1995, Bristol, England).

2. Vysotskaya L.B. Exogenous auxin-induced accumulation of ABA and cytokinins in wheat seedlings// Annual symposium. Physical-chemical basis of plant physiology, 5-8 February, 1996, Penza. Pushchino, 1996, p.60

3. Vysotskaya L., Veselov S. and Kudoyarova G. Effect of mineral nutrients on cytokinin levels and chlorophyll content of detached wheat leaves// Plant Physiology and Biochemistry, 1996, special issue, 10 th FESPP Congress, Florence, Italy, September 9-13, 1996, From molecular mechanisms to the plant: an integrated approach, p. 75-76.

4. Высоцкая Л. Б., Тимергалина JI.H., Кудоярова Г.Р. Содержание гормонов в проростках пшеницы после деризоидации// Физико-химические основы физиологии растений и биотехнология. 3-й ежегодный симпозиум. Июнь 1997 г. - М.: ИФР, 1997. - С. 111.

5. Высоцкая Л.Б., Валке Р., Кудоярова Г.Р. Влияние минерального питания на содержание цитокининов в изолированных листьях пшеницы// Регуляторы роста и развития растений. 4-та'я международная конференция. Июнь 1997 г. - М.: ТСХА, 1997. -С.44.

6. Высоцкая Л.Б., Веселов С.Ю., Кудоярова Г.Р. Ауксин-ипдуцированное накопление АБК и цитокининов в проростках пшеницы. Агрохимия 1998, №2, с.71-74.

7. Vysotskaya L. and Kudoyarova G. Auxin induced changes in ABA and cytokinins concentration in wheat seedlings.// Proceedings of the 5-th

Symposium of the International Society of Root Research. Kluwer Acad. Publ. : Dorecht, 1998.