Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эндогенные фитогормоны в этиолированных проростках кукурузы в норме и при температурном стрессе

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Эндогенные фитогормоны в этиолированных проростках кукурузы в норме и при температурном стрессе"

Г6 од

6 ДПР 1393 РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

БОТАНИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ ИМ. В.Л.КОМАРОВА

На правах рукописи

ПОЛЕВОЙ Анатолий Всеволодович

ЭНДОГЕННЫЕ ФКТОГОРШН В ЭТИОЛИРОВАННЫХ ПРОРОСТКАХ КУКУРУЗЫ В НОРМЕ И ПРИ ТЕМПЕРАТУРНОМ СТРЕССЕ

03.00.12 - физиология растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1993

Работа выполнена в Агрофизическом научно-исследовательском институте РАСХН и Биологическом научно-исследовательском институте С.-Петербургского государственного университета

Научный руководитель - академик РАСХН, доктор сельскохозяйственных наук, профессор Е.И.Ермаков.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Г.Б.Удовенко, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Г.В.Далецкая.

Ведущее учреждение - Институт биологии Карельского филиала РАН.

на заседании специализированного совета K.C02.46.0I в Ботаническом институте им. БД .Комарова РАН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. про£. Попова, д. 2. .

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ботанического института им. Б.Л.Комарова РАН.

Автореферат разослан

Защита состоится « /0 "

час.

Ученый секретарь специализированного совета канд.биол.наук

О.С .¡Сдина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение роли фитогормонов в жизнедеятельности растительных организмов - важнейшее направление в физиологии растений. Однако о значении гормональной системы для регуляции морфогенетической и функциональном активности растительных организмов приходится судить в основном по действию на растительные ткани экзогенных фитогормонов (дёр^линг, 1985; Муромцев и др., 1967). Лишь в последние годы, благодаря использованию нозых методических подходов (жидкостная хроматография высокого давления, иммуно]>ерментный. анализ и др.), появилась возможность изучать содержание эндогенных фитогормоков в отдельных тканях, зонах и органах (Кудоярова и др., 1986, 1990; Катаева VI др., 1990;'.УеПег , 1982, 1984) и сопоставлять результаты анализов с морфогенетической и функциональной активностью клеток (Кудоярова и др., 1986; Москалева, Каравайко, 1990; Р!.!^, Баи£у , 19&7). В настоящее время в литературе имеются лишь отдельные работы, посвякенные изучению градиентов.тех или друшх эндогенных фитогормоков в органах растений (Чкаников и др., 1985;. 'НепХ, ТМпапп , 1937; Н1у1ег, , 1974). Расшире-

ние работ в этом направлении позволит использовать в физиологии растении теорию позиционной информации ¿риша-оольперта, которая постулирует, что судьба каждой'клетки в развивающемся организме определяется ее положением в систем'.: физико-химических и гормо-нальнпх градиентов в этом организме ( Сагг , 1981)).

Большой интерес также вызывают исследования, посвяа.енные изучению сдгигов в содержании и балансе [)итогормонов при действии на растения неблагоприятных факторов внешней среды. Физио-ло'-оп растений, привлекла идея о гормонально;, природе неспецифи-чеслого адаптационного синдрома (стресса), разработанная для ■кивотннх организмов Г.Селье (1960), Для растений установлено, что при самых разнообразных стрессовых воздеЕхтвиях в растительных тканях возрастает концентрация АБК и биосинтез этилена, изменяется содержание и других фитогормоноз (Пустовойтова, 1978, [981; Гуревич, 1Л9; Титов, 1989; РШау, Веу1 , 1990; "агауапа е! я1., 1991; МгпЬяит , 1991 и др.). Однако в-статьях

1а эту тему, как правило, приводятся данные об изменении содер-<анич не более, чем одного-дэух [итогормонов, причем после длительного иоз^йстпия неблагоприятных условий. Робот, посвящен-

ных быстрым гормональным сдвигам при действии стрессора, крайне мало. Почти нет работ , связанных с изучением целостного ответа растительного организма на локальные стрессовые воздействия и роли гормональной системы в таком ответе.

Цель и задачи исследования. Целью работы является комплексное изучение распределения эндогенных фитогормонов б этиолирова! ных проростках кукурузы в нормальных условиях и сдвигов в содержании фитогормонов при высоко- и низкотемпературном стрессах. В задачу работы входило: ■

1) комплексное изучение распределения всех фитогормонов (кроме этилена) в свободной и связанной формах по растению и сопоставление этих данных с мор^огенетической и функциональной активностьи клеток для выяснения применимости теории позиционной информации для растительных объектов;

2) изучение сдвигов в содержании и соотношении свободных и связанных ИУК, зеатина и зеатинрибозида (З+ЗР), гибберелли-нов (ГА) и АБК в изолированных отрезках колеоптилей и корней при прямом кратковременном (4 с) действии высоко- (50°С) и низкотемпературного (^°С) стресса в связи с идеей о гормональном механизме стресса у растений;

3) исследование возможности быстрых гормональных сдвигов (в пределах 10 мин) в дистальной части корня проростков после-кратковременного (10 с) действия низко/, температуры (4°С) на побег в связи с идеей о целостном адаптационном ответе растительного организма.

Научная новизна. В диссертационной работе впервые:

1) на одном и том же объекте (^-суточные этиолированные проростки кукурузы) показано, что вдоль оси растительного организма существуют градиенты содержания и соотношения основных групп фитогормонов: ИУК, цитокининоэ, гиббереллинов и АБК. Уста^ новлено соответствие этих градиентов с мор-пгенетическои и функциональной активностью клеток, что позволяет сделать вывод

о применимости теории позиционной инропиации к пастителъным объектам;

2) показано, что ухе чепез 1 мин после кратковременного (4 с) стресса (50° и в растительных тканях (в дистальных отрезках колеоптилей и корней) лооисходят резкие изменения в содержании и балансе ИУК, цитокининов, ГА и АЬК, из чего следу-

ет, что гормональная система непосредственно и немедленно включается в механизм стрессовых реакций у растений;

3) показано, что быстрый сигнал, передающийся по растению от места локального воздействия стрессором, индуцирует в пределах первых нескольких минут сдвиги в содержании и балансе не только йУК, но и цитокининов, ГА и АБК.

Георетическое и практическое значение заботы. Теоретические выводы о роли градиентов фитогормонов в органах растений, о гормональных механизмах стресса у растении, о быстрой распространяющейся гормональной реакции целого растения на стресс могут наити применение в исследовательских работах по онтогенезу, устоичивости растении.

модифицированная нами методика количественного комплексного анализа ПУК, цитокининов, ГА и АБК в свободной и связанной формах (с использоранием иммуноферментного анализа и чувствительной биопробы) в одной навеске растительного материала, не • превышающей г сырок массы, может найти применение в иссле-

довательских работах по многим направлениям Ьизиологии растений.

Апробация работы. Результаты работы докладывались в лаб. функционально.; активности мембран Биологического научно-исследовательского института С.-Петербургского государственного университета, на научной конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов С.-Петербургского государственного аграрного университета (Пушкин, 1993), в лаб. экологической физиологии растении института биологии Карельского филиала РАН (Петрозаводск, 1993), в лаб. -экологической генетики Всероссийского института растениеводства РАСХН (Пушкин, 1993)к на секции ['изиологии. растений С.-Петербургского общества естествоиспытателе!, (С.-Петербург, 1993).

Публикации. Ло результатам диссертационном работы опубликовано Ц и принято к публикации I статья и тезисы.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения; двух глав литературного обзора и четырех глав экспериментальной" части,.обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (239 источников, в том числе 1.61 иностранных). Она изложена на 188 страницах машинописного текста, .содержит 36 рисунков и'23 таблиц».

ОБЪЕКТ Ii МЕТОДУ ИССЛЕДОВАНИЙ

В качестве объекта исследования были использованы ^-суточные этиолированные проростки кукурузы (Одесская 80 и Молдавская 215). Использованные нами проростки кукурузы не подвергались стерилизации (зерновки лишь промывались теплой мыльной водой), для того, чтобы максимально приблизиться к естественным условиям роста проростков.

Для решения поставленное задачи была моди|ицирована методика экстракции и очистки экстоакга, позволявшая определять в одной небольшой навеске растительного материала (0,2-1 г сырок массы) содержание КУК. цктокининов, АБК, используя иммунофер-ментныи анализ, и гиббереллинов с помощью биопробы, значительно повысив ее чувствительность. Предложенная модификация биопробы на ГА (рост основания первого настоящего листа проростков кукурузы) позволяет определять содержание ГА, начиная с 10 пг ГА^ в пробе. После фиксации жидким азотом растительный материал растирали и экстрагировали охлажденным 60Й метанолом при в течение 18 ч. Экстракт очищали на колонке Sep-Pak Cj-g. ИУК, АБК, ГА экстрагировали из подкисленного (pH 2,6-3,0) водного раствора этилацетатом, а цигокинины - из водного раствора после его подщелачивания (pH 6-9) водонасыкенным бутанолом. Разделение фитогормонов проводили с помощью тонкослойной хроматографии. Концентрацию МУК, З+ЗР и АБК определяли иммунофермзнтным методом (Кудоярова и др., 1966, 1990; Катаева и др., ГЭЭС; ïieiler et al. , 1986),' а суммарную активность ГА - с помощью биопробы в эквивалентах ГА^. ЗР нами условно отнесен к фракции свободных цитокининов, так как его биологическая активность близка к активности 3. Для освобождения связанных форм фитогормонов из тканей, оставшихся после экстрагирования свободных [орм, проводили их гидролиз 1 н. NaOII з кипящей водяной бане в течение мин.

Для измерения разности биоэлектрических потенциалов ме-*ду концами отрезков колеоптилеи (20 мм) и корней (20 мм) использовали внеклеточные электроды (см. летодн изучения мембран растительных клоток, 1986). иацерация растительных тканей проводилась по Раиту ( Wricht , И61). Количество клеток в соответствующих зонах проростков определяли с помощью счетной камеры i/укса-Ро-зенталя. Количество, белка в растительных тканях определяли мик-робиуретовым мигодЬм ( Itzh^ki, Gill , 1964). 3 таблицах приведе-

ны средние арифметические значения величин и среднеквадратичес-кие ошибки. Для оценки достоверности различий между вариантами использовали критерий Стьвдента при уровне значимости 0,05,

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Содержание и распределение эндогенных фитогоомонов в органах и зонах этиолированных проростков кукурузы. В нашей работе впервые был проведен комплексный анализ содержания всех основных эндогенных фитогормонов (кроме этилена) в свободной и связанной формах в 13 органах и зонах (рис.) этиолированных ^-суточных проростков кукурузы Одесская 80.

Рис. Используемые для анализа части Ч-суточного этиолированного проростка кукурузы.

I - верхушка колеоптиля (4 мм), 2 - часть колеоптиля, прилегающая к верхушке (10 мм), 3 - часть колеоптиля, примыкающая к узлу (10 мм), Ь - первые листья, 5 - узел, 6 - часть мезокотиля, прилегающая к узлу (10 мм), 7 - честь мезокотиля, примыкающая к щитку (10 мм), 8 - щиток, 9 - часть корня, примыкающая к щитку (Ю мм), 10 - зона Функционирующих корнэвых волосков (10 мм),

II - зона -рормироэания метаксилемы и обра-зо?ания корневых волосков (5 мм), 12 - зона роста клеток растяжением (5 мм), 13 - кончик корня (2 мм).

Известно, что верхушка колеоптиля является местом синтеза ИУК, которая затем перемещается полярно в базипетальном направлении. Как видно из табл. 1 и 2, верхушка имеет наибольшую концентрацию ауксина, содержание которого градуально снижается к основанию колеоптиля. Б нашен работе показано, что для верхушки колеоптиля характерно высокое содержание и других фитогормонов, причем наиболее высок уровень АБК. В количественном отношении содержание свободных .[,ито"0рмонов в верхушке колеоптиля (4 мм) выглядит следующим образом: АБК - 208,5, ИУК - 152,6, З+ЗР -38,0 и ГА - 1,03, а связанных: АБК - 108,8, ПУК - Ш,7, З+ЗР -

ГА - 1,32 нг на г.сирой массы. Высокое содержание АБК в верхушке (табл. 1,2), по-видимому, необходимо для торможения роста кяеток в ото,| зоне колеоптиля, я присутствие повышенных концентрации цитокиннноо и ГА обеспечивает высокую метаболическую активность клеток верхушки колеоптиля. Содержание не только

Таблица I Содержание свободных фитогсрмонов в различных органах и зонах 4-суточных этиолированных проростков кукурузы (нг/г сырой массы"

Органы ; Зона - - КУК З+ЗР ГА • АБК

проростка

Колеоптиль I 152,6*41,6 38,0*12,6 1,03*0,21 208,5*48,9

2 24,6*4 ,7 21,0*5,5 0,34*0,11 32 ,9*10,9

3 . 17,1-1,б- 14,6*5,8 0,31*0,07 7,4*1,8

Листья 4 15,8*3,4 21,2*4 ,2 1,78*0,42 16 ,6*4,3

Узел 5 28,3*5,1 33,3*10,2 0,27*0,05 14,1*3,7

Мезокотиль 6 88 .3¿18 ,3 12,2*4,1 0,05*0,02 10,4*4,1

7 41,3*10,8 27 ,4*10,4 , 0,30*0,09 8,7*2,4

Щиток 6 71,8±13,8 12,0*3,5 0,26*0,01 11,2*2,4

Корень 9 65 ,4*12,3 18 ,9*7 ,2 0,32*0,06 9,6*3,3

10 160,1^53,3 35,9*8,5 - 1,66*0,53 127,6*38,2

II 290,3*48,1 188,8*18,0 2,54*0,22 240,9*40,7

12 197,4*39,9 144,0*14,1 3,16*0,99 142,5*21,6

13 176,6*40,7 275,2*33,9 4,26*0,35 360,6*68,0

Т а б л и ц а 2

Содержание связанных фитогормонов в различных органах и зонах

4~суточных этиолированных проростков кукурузы (нг/г сырой массы

Органы Зона МУК 3+-ЭР ГА АБК"

проростка

Колеоптиль I 140,7*46,8 49,9*12 ,4 1,32*0,36 188,8*38,8

2 28,9*6,4 25,4*6,4 0,82*0,28 6,6*4,0

3 19,3*2,9 22,9*7,0 С,59*0,19 34 ,8*11,7

Листья 38,0*16,7 31,9*12,8 • 1,96*0,49 24,9*12,9 ■

Узел 5 27,5-10,3 37,7*13,6 0,39*0,03 10,1*3 ,7

Мезокотиль 6 44,2*14,5 14,3*3,8 0,27*0,05 18,3*4,9

7 ,6 15,6*6 ,7 0,36*0,08 31,9*8,6

Щиток 8 17,2*4,5 16,4*4,8 0,22*0,04 27,4*5,0

Корень 9 ■ 14,9*5,3 13,8*2 ,8 0,70*0,23 23,1*6,8

10 178,5-38,6 22,5*3,9 1,51*0,50 43,0*10,6

II 183,3*27,6 247,6*31,4 4,19*1,30 204,9*36,4

12 241,9*23,2 138,4*29,0 5,90*1,77 222,5*33,0

13 322,6*38,1 302,8*60,3 14,25*5,50 275,0*48,5

ИУК, но и всех других фитогормонов имеет резко снижающийся градиент от верхушки к основанию колеоптиля. Б то же время интенсивный рост клеток растяжением происходит именно в этой, лежащей под верхуикой, части колеоптиля. Это кажущееся несоответствие, по-видимому, объясняется тем', что ИУК, в отличие от других гормонов перемещается по колеоптилю волнообразно, и в момент прохождения волны через клетку концентрация ИУК в ней значительно превышает усредненные значения. При сравнении интенсивности роста целого колеоптиля во времени обнаруживается высокая положительная корреляция между скоростью роста и суммарным содержанием эндогенной свободной ИУК (Кудоярова и др., 1988).

Комплексный анализ фитогормонов, проведенный нами, позволяет использовать теорию позиционной информации для объяснения поведения клеток в органах и зонах. Специфические условия физико-химических и физиологических градиентоз, в которые попадает клет-va, индуцируют иключение определенных генетических программ и функциональной активности. J этой точки зрения обращает на себя внимание четкий градиент величины отношения АБКД1УК+(3+ЗР) от .верхушки к основанию колеоптиля: 1,09, 0.72. 0,23, и отношения З+ЗР/ИУК: 0,25, 0,85, 0,85 (табл. 3). В связи с этим важно отметить, что в работе ¡Москалевой и Полевого (1989) цитокинин оказывает положительное действие на рост отрезков колеоптилей, особенно в молодом возрасте.

гормирующиеся молодые листья ^-суточных этиолированных проростков кукурузы характеризуются низким уровнем свободной ПУК, высоким отношением цитокиккна/ИУК (I.31*), высокой концентрацией ГА и самым низким отношением И УК/ГА (табл. 1-3). Высокий уровень зеатина относительно ¿'¡Ул характерен для зон с интенсивным делением клеток (Barlow , 1976). а низкое содержание ЙУК и высокое содержание ГА - обязательные условия для роста молодых листьев проростков кукурузы (Москалева, Половой, 1969).

В колеоптильном узл<- локализованы апекс побега, формирующий листья, и субапикальная меристема, обеспечивавшая рост мезокоти-лл. отношение З+ЗР/КУК в узле достаточно высоко (1,18), что соответствует высокой проли^ерзтивнои активности этого органа (табл. 3). Обращает ни'себя внимание относительно низкий уровень вспх ¡у.тогопчонов в колсоптильнои узле (табл. 1,2). Очевидно, ото обстоим льстро позволяет тонко регулировать функциональную

Таблица 3 Число, вес клеток и соотношение концентраций свободных Литогор-монов в органах и зонах 4-суточных этиолированных проростков кукурузы

Орган проростка Зона Число клеток в I г . сырой массы Сырая масса клетки г-КГ6 (З+ЗР)/ '/ПУК АБК/ АБК/ АБК/ /ИУК /(З+ЗР) /(ИУК+ +з+зр) ИУК/ГА

Колеоп- - I 7,61 0,131 0,25 , 1,37 5,49 1,09 148,1

тиль 2 3,73 0,268 0,65 1.34 1,57 0,72 72,4

3 4,61 0,208 0,85 0,43 0,51 0,23 55,1

Листья А 19 ,23 0,052 1,34 1,05 0,78 0,45 В,9

Узел 5 14,91 0,067 1,18 0,49 0,42 0,23 104,8

Мезоко- • 6 3,85 0,259 ОД4 0,12 0,65 .0,10 1766,0

тиль 7 3,99 0,250 0,66 0,21 0,32 0,13 137,7

Щиток 8 8,56 0,117 0,17 0,16 0,93 0,13 276,1

Корень 9 3,35 0,299 0,29 0Д5 0,51 о.п 204,4

10 4,74 0,211 0,22 0,79 -3,55 0,65 96,4

II 4,91 0,204 0.65 0,83 1,27 0,50 114,3

12 4.90 0,204 С,73 0,72 0,99 0,42 62,5

13 38,43 0.026 1,56 2,04 1,31 0,80 41,5

активность меристем узла с помощью фитогормонов, притекающих из других частей проростка. ИУК поступает главным образом из верхушки колеоптиля и в небольших количествах - из формирующихся листьев, а цитокинины - из кончико? корней. ГА у проростков кукурузы транспортируются в колеоптильный узел, по-видимому, из кончиков корней и формирующихся листьев.

Для этиолированных проростков характерен интенсивны;; рост мезокотиля, причем рост клгток растяжением происходит только в той его части, которая примыкает к узлу. Б этой зоне мезокотиля, по нашим данным, высок уровень свободной МУК, остальные ¡итогор-моны присутствуют в низких концентрациях, особенно, цитокинины и ГА. Для этой зоны характерна, сьмая низкая величина отношения АБК/ИУК (0,12). Такой гормональны и баланс способствует росту растяжением клеток мезокотиля. Отношение ИУК/ГА в верхней зоне мезокотиля достигает очень большой ьеличины (1766). Тем не менее приток ГА в эту зону способствует росту клеток (¡'¡оск№.-м, Поле-

вой, 1989). В мезокотиле в базипетальном направлении наблюдаются следующие изменения свободных фитогормонов: ИУК снижается в 2 раза, содержание З+ЗР и ГА несколько возрастает, а низкий уровень АБК не изменяется (табл. I).

Как известно, в кончиках корней осуществляется синтез цито-кининов и ГА, в корневом чехлике образуется АБК (Дёрфлинг, 1985; Itei, Birnheum , 1991). Ауксин транспортируется в корень из побега. 8 нашей работе показано, что в кончике корня (2 мм) ^»суточных этиолированных проростков кукурузы Одесская 80, включаю- . щем в себя корневой чехлик и апекс, эндогенные свободные и связанные фитого.рмоны присутствуют в высоких концентрациях: АБК -360,6 и 275,0, З+ЗР - 275,2 и 302,8, ИУК - 176,6 и 332,6, ГА -<4,26 и 14,25 нг на г сырой массы, соответственно (табл. 1,2). Для кончика корня характерны самые высокие у проростка отношения АБК/ИУК (2,04) и З+ЗР/ИУК (1,5б)(табл. 3). Значительное превыше- • ние содержания цитокининов над уровнем ИУК,по Барлоу'(Barlow, 1376) .является условием интенсивной митотической активности. Высокий уровень АБК, синтезирующейся в корневом чехлике, по-видимому, тормозит деление клеток в дистальной части апекса (в покоящемся центре)(см. Полевой, Саланатова, 1991).

В зоне растяжения' (5 мм) концентрация всех фитогормонов падает в пересчете на I г сырой массы', кроме свободной ИУК. Однако эти расчетные данные объясняются образованием большой центральной вакуоли в клетках, растущих растяжением, и не дают представления об истинной концентрации фитогормонов в цитоплазме. В пересчете на мг белка содержание Есех фитогормонов в зоне растяжения, по сравнению с кончиком корня, возрастает, что указывает на увели- . чение концентрации фитогормонов в цитоплазме клеток, растущих растяжением. Отношение АБК/ИУК в зоне растяжения, по сравнению с кончиком корня, снижается в 3 раза, а З+ЗР/ИУК - в 2 раза. Последнее, по Барлоу (Barlow , 1976), может быть причиной прекращения деления клеток, но из-за высокой концентрации ЙУК в зоне растяжения сохраняется процесс эндоредупликации. Действительно, содержание ДНК в клетках корней кукурузы, растущих растяжением, удваивается и продолжает возрастать в клетках зоны корневых Волосков (см. Обручева, 1565).

В зоне "дигрференцировки" в пересчете на I г сырой массы содержание свободных КУК, цитокининов и АБК увеличивается, что мо-

жет быть связано с ди£ференцировкой сосудов метаксилемы. Уровень свободной ИУК в этой зоне самый высокий, по сравнению со всеми другими органами и зонами проростка. В отой зоне индуцируются формирование корневых волосков и закладка в перицикле бокозых корней. Известно, что для индукции закладки боковых корней необходима повышенная концентрация ПУК.

В вышележащих зонах корня наблюдается быстрое градуальное уменьшение содержания всех фитогормонов, как свободных, так и связанных (табл. 1,2), Однако уровень ПУК в этой части корня превышает содержание других фитогормонов. Очевидно, большая часть этой ИУК сосредоточена в центральном цилиндре.

Таким образом, у 4-сугочных этиолированных проростков кукурузы наблюдаются четкие однонаправленные и разнонаправленные градиенты содержания эндогенных фитогормонов вдоль осевых органов. Это явление наблюдается в колеоптиле, мезокотиле и главном корне. Градиенты содержания и баланса фитогормоноз, в некоторых случаях, сопоставимы о поведением клеток вдоль этих органов-; что указывает на применимость теории позиционной информации для растительных организмов.

Влияние температурного стресса на содержание эндогенных фитогормонов в отрезках дистальних частей колеоптилей и корней проростков кукурузы 1

В нашей работе была поставлена задача исследопать изменения всех основных групп эндогенных фитогормонов (за исключением этилена) в свободной V связанной формах через I, 5, ЗС и ЭС 'пин после кратковременного (А с) действия высокотемпературного (50°С) или низкотемпературного (^°С) стресса на отрезки (20 мм) дистальных чаете?, колеоптилей и корней проростков кукурузы Молдавская 215, Процедура отсечения уже сама по себе создает стрессовую ситуацию (Пахомова, Пахомов, 1992), однако отделение лишае-, оогани коррелятивных взаимодействий, в том числе электрических, что позволяет более однозначно интерпретировать полученные результаты. Оба выбранных объекта автономны по синтезу тех или других фитогормонов: в диствльном отрезке колеоптиля с верхушкой синтезируются ИУК и АБК, а в дистальном-отрезке главного кооня с кончиком - цитокинины, ГА и АБК, В отрезках колеоптилей после отсечения к 5 и 30 мин наблюдается тенденция к возрастанию содержания свободных ПУК, З+ЗР, ГА и снижению уровня АБК; в отрезках корней в

контроле происходит уменьшение содержания свободной ИУК (табл.4).

Экспериментально выбранные температуры воды для импульсного воздействия на отрезки (50° и судя по элекгрофизиологичес-

ким реакциям, оказывали на них сильное стрессовое влияние. И в то же время рост отрезков в длину после частичной потери тургора в первую минуту (50°С) восстанавливался через 6-30 мин и в дальнейшем почти не отличался от контроля. Поэтому первичные стрессовые- реакции в пределах 1-5 мин можно рассматривать как фазу повреждения, а реакции за 6-90 мин-как фазу адаптации. '

Б опытах с отрезками колеоптилей было показано, что в первую минуту после воздействия 50°С в той или иной степени происходит снижение всех исследованных свободных фитогормонов относительно контроля: ИУК на 54%, З+ЗР на 41%, ГА на %% и АБК на 28%, Это снижение не сопровождается существенными изменениями в содержании связанных ИУК и.цитокининов, но количество связанных ГА и АБК за I мин имеет тенденцию к возрастанию (табл. 4). Поэтому падение уровня свободных фитогормонов через I мин после высокотемпературного кратковременного стресса в отрезках колеоптилей можно объяснить окислительны"! разрушением фитогормонов или потерей их в окружающую среду, а для ГА и АБК - еще и возможным превращением в связанные форми. пониженный уровень всех свободных фитогормонов сохраняется на 5 и ЗС мин, но к 90 мин наблюдается повышение содержания ИУК и АБК как в свободных, так и в связанных формах, причем суммарный уровень свободных и связанных форм каждого . из этих фитогормонов на 90 мин значительно превышает не только свои контроль, но и исходное содержание, что указывает на активацию синтеза ИУК и АБК в отрезках, подвергнутых стрессу.

Через I мин поолг низкотемпературного воздействия С4°С) содержание свободных фитогормонов не изменяется, однако достоверно возрастает уровень связанных ИУК, ГА и АБК. Но на 5 и 30 мин происходит значительное падение всех основных фитогормонов, причем в большинстве случаев уменьиает$я,5иайхесвязанных форм. Как видим, гормональная реакция на низкотемпературный стресс начинается с некоторым запозданием (если не считать возрастания связанных форм ИУК и АБК). К 90 мин также, как и в случае с высокотемпературным стрессом, в отрезках колеоптилей возрастает уровёнь сео6од?шх и связанных НУК и АБК (табл.

Таким образом, гормональный ответ отрезков колеоптилей на

Таблица 4

Изменение эндогенных свободных и связанных фитогормонов в отрезках колеоптилей проростков кукурузы после кратковременного (4 с) температурного стресса в пг на отрезок

Время после стресса, мин Температура, °С ИУК З+ЗР АБК ГА

своб. связ. своб. связ. своб. связ. своб. связ.

I 25 . 50 .4 347*98 161*62 325*301 274-59 324*95 594*132 553*90 328*58 427*114 752*143 722*109 628*112 979*143 712*167 797*220 557*90 1069*268 1589*219 28*7 18*4 22*7 6*2 10*3 18*6

5 25 50 4 * 400*159 192*62 249*51 754-172 576*121 357*76 672430 749*122 759*159 1005*202 ~ 876*149 704*108 1055*242 588*73 • 292*54 609*180 812*142 592*116 4*1 11*3 -26*9 20*5 15*4 9*3

30 25 50 4 523*114 3754 91 231-100 412*68 329*69 310*106 1066-229 756*173 596*141 873*208 841*189 755*187 763*169 432*75 526*143 841*127 702*223 913*197 41*11 4*1 23*6 14*4 46*11 26*9

90 25 50 4 208*48 398*106 402*133 468*156 928*207 930-163 585*140 545*117 802*140 505*98 720*160 1002*155 934*238 1952*489 1238*299 656*173 1088*214 1509*229 29*9 15*4 33*10 63*20 14*4 64*20

Таблица 5

Изменение эндогенных свободных и связанных фитогормонов в отрезках корней проростков кукурузы посла кратковременного (4 с) температурного стресса в пг на отрезок

Зремя пос те Температура, °С ИУК 3+ЗР АБК ГА

стоес-са, мин своб. связ. своб. связ. своб. связ. своб. связ.

I 25 50 4 502*85 308*96 4б4±10б 765*103 605*124 496*97 ■ 912* 165 419*103 ■ 994*200 1007*95 569195 755*131 992*131 706*151 1068*249 901*152 722*183 555*131 20*6 .8*3 32*7 34*11 23*6 7*2

5 25 50 4 243*65 223*63 252*72 268*86 685*161 612*111 613*238 644-123 638*132 1111*212 431*110 455*106 1154*235 1004*230 1180*250 966*193 619*162 1111*248 27*3 19*5 27*8 27*9 6*1 12*4

30 25 50 4 231*68 162*52 310*93 701*96 518*110 449*89 791*184 361*61 865*214 778*176 914*152 . 867*207 1170*203 656*114-1228*262 1086*215 532*133■ 761*159 43*11 51*15 12*3 44*12 48*15 6*2

90 25 50 V 377*78 373*76 341*87 594*143 '482*78 447*135 798*189 801*200 1059*247 917*160 951*189 1075*243 908*183 800*151 1620*300 845*191 698*106 1117*224 34*12 19*5 18*5 . 7*2 3*1 5*1

низко- и высокотемпературный стресс имеет много общего: вначале наблюдается снижение всех свободных форм фитогормонов (фаза повреждения) , а к 90 мин уровни ИУК и АБК относительно контроля возрастают.

В опытах с дистальньми отрезками корней через I мин после кратковременного высокотемпературного стресса (50°С) также, как в колеопгилях, падает содержание всех фитогормонов в свободной форме: ПУК на 395?, 3+ЗР на ГА на 60£ и АБК на 28$. Однако при этом, в отличие от колеоптилей, содержание всех связанных форм также имеет тенденцию к уменьшению (табл. 5). В течение 5 и 30 мин уровень свободных фитогормонов в большинстве случаев оставался более низким, чем в контроле, а к 90 мин приближался к уровню контроля. Связанные формы фитогормонов в варианте с 50°С к 90 мин также количественно не отличались от контроля. Следовательно, в случае с отрезками корней мы имеем сходную с колеопти-лями гормональную реакцию, но выраженную более сильно, судя по нарушению гормонального статуса.

В то же время отрезки корней слабо реагируют на низкотемпературный стресс (4°С). Уровень свободных фитогоочонов, как правило, за все время опыта не отличается от контроля (табл. 5). К 90 мин после в отрезках корней возрастает только уровень свободной АБК. Однако содержант связанных форм всех исследованных фитогормонов через I мин после импульса низкотемпературного стресса имеет тенденций к уменьшению, также .как и в вариантах с высокотемпературным стрессом.

Таким образом", в реакциях отрезков колеоптилеи и корней на высоко- и низкотемпературный стресс имеются элементы как сходства, так и различия. Во всех случаях изменения в содержании фитогормонов носят колебательный характер и обусловлены раслгиом, синтезом и взаимопревращениями свободных и связанных форм. Б нашей работе впервые показано, что сдвиги в содержании всех исследованных фитогормоноз в растительных тканях происходят у*е в первую минуту после кратковременного (4 с) высоко- и низкотемпературного стресса. Понижение уровня ПУК, цитокининов, ГА и АБК в пределах 30 мин - общая реакция длч отрезков колеоптилей и корней. К 90 мин после стресса возрастает уровень свободной АБК (за исключением корней после 50°С). Принципиально сходные данные по . отдельным фитогормонам Имеются и .о литературе, однако за более длительный период (Пустовойтова, 197?; Г>олко!-а и др., 1981,1991;

Акимова. 1988; Сгее1шап et о1. , 1987; Р111ау, Веу1 , 1990; Ногтап et а1. , 1990 И Др.).

Накую же роль, исходя из полученных нами данных, играют эндогенные фитогормоны при прямом кратковременном действии высоко-и низкотемпературного стресса на отрезки колеоптилей и .корней проростков кукурузы? Как видно из табл. 4,5, к 5 мин уровень свободных цитокининов восстанавливается (достигает уровня контроля), а к 30 мин отношение АБК/ИУК (50°С) снижается, что и может быть причиной восстановления интенсивности роста. Возрастание уровня . ПУК к 90 мин в стрессовых вариантах должно способствовать дальнейшему росту отрезков колеоптилей. Увеличение содержания АБК, возможно, происходит в верхушке колеоптиля и корневом чехлике. Эти явления можно рассматривать как гормональные звенья фазы адаптации.

Быстрые гормональные сдвиги в корнях проростков кукурузы после кратковременного действия низко,- температуры на побег. Опыты с изолированными частями растений позволяют изучить непосредственный ответ этих частей на прямое дейотвие стрессора. ' Однако в целом растении все его ткани и органы взаимодействуют между собой, и на локальное стрессовое воздействие растение отвечает как единое целое. Тем не менее, механизм этих взаимодействий в стрессовых условиях почти не изучен. Этой теме посвящены лишь единичные работы (Кудоярова и др., 1990; Акимова и др.,1991).!

В нашей работе с целыми 4-суточкыми этиолированными пророст- ; ками кукурузы локальному низкотемпературному воздействию (вода 10 с) подвергали побеги, а комплексный анализ фитогормонов через 10 и 90 мин проводили в дистальной части корней (10 мм), удаленных от места воздействия стрессоря на 10 см. Было показа-но(табл. б), что через 10 мин в дистальной части корней возрастает содержание свободных цитокининов на 110?, АБК на 107?, ГА на 80$ и ПУК на кЪ% относительно контроля. Увеличивается также содержание связанных ИУК и цитокининов. К 90 мин количество свободных КУК и ГА снижается, а содержание З+ЗР и АБК резко превышает контроль, особенно АБК (на 216$). Значительно возраста'ет отношение АБК/ИУК (3,2). Полученные данные свидетельствуют о том, что растительные организмы действительно способны быстро передавать сигнал о стрессовых воздействиях из одних частей в другие, и что этот сигнал индуцирует резкие изменения в гормональной

Таблица 6 Изменение содержания свободных и связанных фитогормонов в дис-тальной части корней (10 мм) проростков кукурузы после низкотемпературного (4°С) кратковременного (10 с) стрессового воздействия на побеги этих проростков (пг/отрезок)

Варианты Время МУК З+ЗР

стресса (мин) 1 . своб. СБ ЯЗ. своб. связ.

Контроль 10 90 303*39 451*60 60*1*93 657*80 688*72 820*144 802*101 1540*240

Опыт 10 448±ез 931*136 1449*151 1733*187

90 379¿50 1477*176 1176*156- 1224*177

АБК ГА

своб. связ. своб. связ.

Контроль 10 90 465*77 -627*83 1221*144 1684*174 10,8*2,0 11,2*1,0 37,2*10,0 10,4*1,2

Опыт 10 965*103 1207*131 19,4*6,0 8,5*0,7

90 1982*143 1604*174 18,0*2,3 1 10,9*1,4

системе. Эти изменения принципиально иные, чем при прямом воздействии стрессора на дистальную часть корня: наблюдается не снижение содержания фитогормонор, а их поиыиение. Очевидно, таким- образом части растений, испытывающие влияние стрессора, побуждают другие органы "придти к ним на помощь".

Какова же природа сигнала, передающего по всему растению информацию о локальном стрессовом -воздействии? Судя по скорости передачи .таким сигналом может быть электрически'/, импульс. Электрические импульсы типа потенциала действия индуцируются у растений под влиянием различных стрессовых факторов (Опритов и др., 1991; иау±ея еЪ а1. , 1991; 3«1а1Ъеге, Соеягоуе , 1992). и работе Кудояровой с соавт. (1990), в которой регистрировались быстрые изменения свободной и связанной ИУК, были записаны и распространяющиеся электрические потенциалы действия. Таким образом, целостная, реакция растительного организма на локальное действие стрессора вклрчает з себя- быстрые изменения гормонального статуса в других частях растения, причем в качестве индуктора этих изменений, возможно, выступает потенциал действия.

вывода

1. Модифицирована методика, позволяющая определять с использованием иммуноферментного анализа и чувствительной биопробы содержание ИУК, цитокининов (З+ЗР). гиббереллинов (ГА) и АБК в свободной и связанной формах в одной навеске (0,2-1 г сырой массы).

2. Проведен анализ эндогенных фитогормонов в 13 органах и зонах 4-суточных этиолированных'проростков кукурузы, показавший, что вдоль осевых органов существуют четкие градиенты содержания и баланса ИУК, З+ЗР, ГА и АБК, которые в ряде случаев сопоставимы с поведением клеток вдоль этих органов, что указывает на при-' мгнимость теории позиционной информации для растительных организмов.

3. Установлено, что у колеопт'иля наблюдается нисходящий — градиент всех свободных и связанных фитогормонов от верхушки, где осуществляется синтез ИУК, к основанию, причем содержание свободных фитогормонов в верхушке (4 мм) составляет для ИУК 152,6, З+ЗР - 38,0, ГА - 1,03 и АБК - 208,5 нг на г сырой массы. Высокая концентрация АБК в верхушке, по-видииому, необходима для торможения роста клеток в этом органе.

А. для формирующихся настоящих листьев характерны высокая концентрация свободных ГА (1,76 нг на г сырой массы) и очень низкое содержание свободной ИУК (15,8 нг на г сырой массы ), что согласуется с активируюким действием ГА и тормозящим влиянием ауксина на рост основания листа проростков кукурузы. Отношение З+ЗР/ЙУК в листьях высоко, что необходимо для пролиферативной активности клеток в интеркалярной меристеме.

5. Б колеоптильном у'зле, где активно идет деление клеток, также высоко отношение свободных З+ЗР/ИУК, но концентрации всех фитогормонов относительно невелики, что позволяет фитогормонам, притекающим из других органов, оказывать влияние на функциональную активность апикальной и субапикальной меристем.

6. для апикальное части мезокотиля, где в условиях темноты идет интенсивный рост клеток, характерно относительно высокое содержание свободной ИУК и самое низкое в проростке отношение АБК/КУК.

7. В кончике корня (2 мм), где осуществляется деление клеток и синтез цитокининов, ГА и АБК, концентрации всех свободных 'и связанных фитогермонов высоки: ИУК - 176,6, З+ЗР - 275,2, ГА - 4,26

и АБК - 360,6 нг на г сырой массы (свободные формы), а отношения

свободных З+ЗР/ИУК и АБК/ИУК самые высокие из всех органов проростка. Высокий уровень АБК, возможно, тормозит деление клеток в покоящемся центре.

8. Концентрации свободных З+ЗР, ГА и особенно АБК в зоне растяжения корня в пересчете на I г сырой массы снижаются (из-за образования в клетках центральной вакуоли), а уровень свободной ИУК имеет тенденцию к повышению.

9. для зоны "дифференцировки" характерны самый высокий уровень свободной ИУК (290,3 нг на г сырой массы), что необходимо для закладки боковых корней, и повышение концентраций З+ЗР и АБК.

10. При действии кратковременного (А с) высоко- (50°С) и низкотемпературного (4°С) стресса на дистальные отрезки колеопти-лей и корней (20 мм) 4-суточных этиолированных проростков кукурузы сдвиги в содержании ИУК, З+ЗР, ГА .и АБК в растительных тканях происходят уже в персую минуту. Изменения в содержании фитогормонов носят колебательный характер.

11. У отрезков колеоптилеи при том и другом видах стресса за период 1-30 мин происходит снижение всех свободных ^орм ^итогормо нов, а к 90 мин уровни свободных и связанних ИУК и АБК возрастают У отрезков корней после 50°С наблюдается сходная с колесптилями гормональная ртмя. но рыраженная более сильно. Однако после низкотемпературного стресса содержание свободных фитогормонов у корней, как правило, не отличается от контроля, за исключением свободной АБК, уровень которой к 90 мин возрастает.

12. При действии импульсного (10 с) низкотемпературного стресса С4°С) на побэги 4-суточных этиолированных проростков кукурузы в дистальной части корней в пределах 10 мин возрастает содержание свободных'и связанных ИУК, З+ЗР и свободных ГА и АБК. Предполагается электрическая передача сигнала. Таким образом, стрессовое воздействие на одну часть интактногб растения ичдуци-рует быстрые гормональные сдвиги в другой ее части, причем иного характера, чем при прямом действии стрессора. Полученные данные указывают, что растительный организм отвечает на стрессовое воздействие как единое целое.

Список работ, опубликованных по теме диссертации,

1. Полевой A.B. Активность гибберелликов в органах проростка кукурузы//Вестник С.-ПбГУ. Биология. Сер.3.-1992.-Вып.

24. -С .70-73.

2. Полевой В.В., Полевой A.B. Эндогенные фитогормоны этиолированных проростков кукуруэы//$изиология растений.-1992.-Т.39. -Вып.б.-€.1165-1174,

3. Полевой A.B. Биоэлектрическая реакция отрезков колеопти-лей и корней кукурузы на кратковременный температурный стресс //Вестник С.-ПбГУ. Биология. Сер.3.-1993.-Вып.1.^.'^/^/-/^

4. Ермаков E.H., Полевой A.B. Изменение баланса эндогенных ИУК и АБК в корнях проростков кукурузы при прямом и опосредован-, ном низкотемпературном стрессе//Докл. Россельхозакадемии.-1993,-* 3.

5. Полевой A.B. Изменения эндогенных фитогормонев в колеоп-тилях и корнях проростков кукурузы после кратковременного температурного стресса//Физиология растений.-1993.-Т.40 (в печати).

6. Полевой А.Б. Быстрые гормональные сдвиги в корне проростка кукурузы после кратковременного действия низкой температур«

на побег//Тезисы 111 Всероссийского съезда физиологов растений. Санкт-Петербург, 1993 (в печати). 1 ' ■ ,

Подписано к печати 25.03.93. Заказ 356. Формат 60x84/1.0. Объем 1 п. л. Тираж 150.

Ломоносовская типография-189510, г. Ломоносов,- пр. Юного ленинца, 9.