Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эндогенные фитогормоны в этилированных проростках кукурузы в норме и при температурном стрессе

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Эндогенные фитогормоны в этилированных проростках кукурузы в норме и при температурном стрессе"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК БОТАНИЧЕСКИЕ ИНСТИТУТ ИМ. В.1.КОМАРОВА

На правах рукописи

ПОЛЕВОЙ Анатолий Всеволодович

ЭНДОГЕННЫЕ Й1ТОГОРМОНЫ В ЭТИОЛИРОВАНИЯХ ПРОРОСТКАХ КУКУРУЗЫ Б НОРМЕ 11 ПРИ ТЕМПЕРАТУРНОМ СТРЕССЕ

03.00.12 - физиология растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1993

Работа выполнена в Агрофизическом научно-исследовательском институте РАСХН и Биологическом научно-исследовательском институте С.-Петербургского государственного университета

Научный руководитель - академик РАСХН, доктор сельскохозяйственных наук, профессор Е.И.Ермаков.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Г .Б.Удовенко, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Т.В .Далецкая.

Ведущее учреждение - Институт биологии Карельского филиала РАН.

на заседании специализированного совета К.002.^6.01 в Ботаническом институте им. В.Л.Комарова РАН по адресу: 197376, Санкт-Летербург, ул. npof. Попова, д. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ботанического института им. Б.Л.Комарова РАН.

Автореферат разослан " ÚJyU^ltA 1993 г.

Защита состоится 49 "

час.

Ученый секретарь специализированного совета канд.биол.наук

0.С .Юдина

ОБШ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение роди фитогормонов в жизне-(еятельности растительных организмов - важнейшее направление в изиологии растений. Однако о значении гормональной системы ,ля регуляции морфогенетической и функциональном активности мстительных организмов приходится судить в основном по дейст-ию на растительные ткани экзогенных фитогормонов (дёр^линг, 965; муромцев и др., 1967). Лишь в последние годы, благодаря спользованию ноэых методических подходов (жидкостная хромато-рация высокого давления, иммуно.^ерментный анализ и др.), появи-ась возможность изучать содержание эндогенных фитогормонов в тдельных тканях, зонах" и органах (Кудоярова и др., 19Б6, 1990; атаева и др., 1990;'.Veiler , 1982, 1984) и сопоставлять реэуль-ати анализов с мор^югенегическои и .рункциональной активностью леток (Кудоярова и др., 1968; Москалеве., Каравайко, 1990; 'ilet, Saugy , 1967). В настоящее время в литературе имеются ишь отдельные работы, посвякеннье изучению градиентов,тех или pvmx эндогенных .¡¡игогорионов в органах растений.(Чкаников и р., 1985; Went, Thimann , 1937; Rivler, Pilet , 1974). Расширено работ в этом направлении позволит использовать в физиологии астении теорию позиционной информации Дриша-Вольперта, которая эстулирует, что судьба каждой'клетки в развивающемся организме тределяется ее полоуением^в системе физико-химических и гормо-альних градиентов в этом организме ( Сагг , 1984).

Больно г. интерес такче вызывают исследования, посвяг.енные зучению сдгигов в содержании и балансе 1>итогормонов при дейст-U! на растения неблагоприятных факторов внешней среды. Физио-уов растении привлекла идея о гормонально;, природе неспеци^и-:с;сого адаптационного синдрома (стресса), разработанная для портних организмов Г.Селье (I960), для растений установлено, го пои самых разнообразных стрессовых воздействиях в раститсль-jx тканях возрастает концентрация АБК и биосинтез этилена, меняется содержание и других ч'итогормоноа (Пустовойтова, 1978, •BI; Гурепич, 1979; Титов, Í989; Pillay, Beyl , 1990; Uarayana t al., 1991; Itai, Birtibauiu , 1991 и др.). Однако в'статьях i эту тему, как правило, приводятся данные об" изменении содержи* не более, чем одного-двух 1'итогормонов, причем после дли-льного не? д^меттм ¡гб^огоприятних условий. Работ, посвящен-

них быстрым гормональным сдвигам при действии стрессора, крайн мало. Почти нет работ , связанных с изучением целостного ответ растительного организма на локальные стрессовые воздействия и роли гормональной системы в таком ответе.

Цель и задачи исследования. Целью работы является комплек ное изучение распределения эндогенных фитогормонов в этиолиров ных проростках кукурузы в нормальных условиях и сдвигов в соде жании фитогормонов При высоко- и низкотемпературном стрессах. В задачу работы входило: ' ■ ■

1) комплексное изучение распределения всех фитогормонов (кроме этилена) в свободной и связанной формах по растению и сопоставление этих данных с мор;югенетической и функциональной активностью клеток для выяснения применимости теории позиционной информации для растительных объектов;

2) изучение сдвигов в содержании и соотношении свободных и связанных ИУК, зеатина и зеатинрибозида (З+ЗР), гибберелли-нов (ГА) и АБК в изолированных отрезках колеоптилей и корней при прямом кратковременном с) действии высоко- (50°С) и низкотемпературного (А°С) стресса в связи с идеей о гормональном механизме стресса у растении;

3) исследование возможности быстрых ^рмональных сдвигов (в пределах 10 мин) в дисгальной части корня проростков после кратковременного (10 с) действия низкое температуры (4°С) на побег в связи с идеей о целостном адаптационном ответе растительного организма.

Научная новизна. В диссертационной работе впервые:

1) на одном и том же объекте (¿♦-суточные этиолированные проростки кукурузы) показано, что вдоль оси растительного оргг низма существуют градиенты содержания и соотношения основных групп фитогормонов: КУК, цитокининов, гиббяреллинов и АБК. Уст новлено соответствие этих градиентов с мор'-огснетическои и функциональной активностью клеток, что позэо.-яет сделать выво; о применимости теории позиционной информации к пастителъным объектам;

2) показано, что ухе чеоез 1 мин после кратковременного с) стресса (50° и 4°С) в растительных тканях (б дистальных

отрезках колеоптилей и корней) происходят резкие изменения в содержании и балансе 'ЛУК, цитокининов, ГА и АЬК, из чего след;

¡т, что гормональная система непосредственно и немедленно вклю-1ается в механизм стрессовых реакция у растений;

3) показано, что быстрый сигнал, передающийся по растению >т места локального воздействия стрессором, индуцирует в преде-1эх первых нескольких минут сдвиги в содержании и балансе не •олько ИУК, но и цитокининов, ГА и АБК.

Теоретическое и практическое значение заботы. Теоретичес-:ие выводы о роли градиентов фитогормонов в органах растений, | гормональных механизмах стресса у растений, о быстрой распро-триняющекся гормональной реакции целого растения на стресс югут нвити применение в исследовательских работах по онтогене-|у, устойчивости растеши..

Модифицированная нами методика количественного комплексно-'0 анализа ПУК, цитокининов, ГА и АБК в свободной и связанной ормах (с использованием иммуно^ерментного анализа и чувстви-ельной биопробы) в одной навеске растительного материала, не • ревншающей 0,2-1 г сыро»; массы, может найти применение в иссле-,онательских работах по многим направлениям иИзиологии растений.

Апробация работы. Результаты работы докладывались в лаб. «ункционально.; активности мембран Биологического научно-иссле-,овательского института 0.-Петербургского государственного уни-ерситета, на научной конференции профессорско-преподаватель-кого состава и аспирантов С.-Петербургского государственного грарного университета (Пушкин, 1993), в лаб. экологической 'изиологии растении института биологии Карельского филиала РАН Петрозаводск, 1993), в лаб. экологической генетики Зсероссий-чого института растениеводства РАСХН (Пушкин, 1993), на секции изиологии растений С.-Петербургского общества естествоиспытате-ей (С.-Петербург, 1993).

Публикации. По результатам диссертационной работы опублико-ано 4 и принято к публикации I статья и тезисы.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, вух глав литгратурного обзора и четырех глав экспериментальной асти, обсуждения, бнводоп и списка цитируемой литературы (239 сточников, в том числе 161 иностранных). Она изложена на 188 траницах машинописного текста, содержит 36 рисунков и 23 таб-

ицн;

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ В качестве объекта исследования были использованы 4-суточ ные этиолированные проростки кукурузы (Одесская 80 и Молдавска 215). Использованные нами проростки кукурузы не подвергались стерилизации (зерновки лишь промывались теплой мыльной водой), для того, чтобы максимально приблизиться к естественным услови ям роста проростков.

Для решения поставленное задачи была модифицирована методика экстракции и очистки экстракта, позволявшая определять в одной небольшой наЕеске растительного материала (С,2-1 г сырой массы) содержание ПУК, цитокининов, АБК, используя иммунофер-ментныи анализ, и гиббереллинов с помощью биопробы, значительн повысив ее чувствительность. Лредложенная модификация биопробы на ГА (рост основания певвого настоящего листа проростков куку рузы) позволяет определять содержание ГА, начиная с 10 пг ГА-j в пробе. После фиксации жидким азотом растительный материал растирали и экстрагировали охлажденным 8С5» метанолом при в течение 18 ч. Экстракт ячищали на колонке Sep-Pak Cjg. ИУК, АБК, ГА экстрагировали из подкисленного (рН 2,6-3,0) водного раствора этилацетатом, а цитоки.нини - из водного раствора поел* его подщелачивания (рН 8-9) водонасышенным бутанолом. Разделение фитогормонов проводили о помощью тонкослойной хроматографа Концентрацию ИУК, З+ЗР и АБК определяли иммунофермзнтным методом (Кудоярова и др., 1986, 1990; Катаева и др., 1990; Tíeiler et al. , 1986), а суммарную активность ГА - с помощью биопроб! в эквивалентах ГА^. ЗР нами условно отнесен к фракции свободны: цитокининов, так как его биологическая активность близка к активности 3. Для освобоздения связанных норм фитогормонов из тю ней, оставшихся после экстрагирования свободных торм, проводил! их гидролиз I н.ИаОН в кипящей водяной бане в течение 40 мин Для измерения разности биоэлектрических потенциалов мечу концами отрезков колеоптилеи (20 мм) и кошек (20 мм) использовали внеклеточные электроды (см. Методы изучения мембран растительных клеток, 1966). Мацерация растительных тканей проводилас по Раиту ( Wricht , 1^61). Количество клеток в соотзетстгувних зонах проростков определяли с помощью счетной камеры :.'ук.оа-Ро-зенталя. Количество, белка е растительных ткянях определяли ми к-робиуретовым методом (itzheki, Gil], , 1964). В таблицах привод!

ни средние арифметические значения величин и среднеквадратичес-кие ошибки. Для оценки достоверности различий между вариантами использовали критерии Стыодента при уровне значимости 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Содержание и распределение эндогенных фитоговмонов в органах и зонах этиолированных проростков кукурузы. В нашей работе впервые был.проведен комплексный анализ содержания всех основных эндогенных фитогормонов (кроме этилена) в свободном и связанной формах в 13 органах и зонах (рис.) этиолированных ^-суточных проростков кукурузы Одесская 80.

Рис. Используемые для анализа части суточного этиолированного проростка кукурузы.

I - верхушка колеоптиля (4 мм), 2 - часть колеоптиля, прилегающая к верхушке (10 мм), 3 - часть колеоптиля, примыкающая к узлу (10 мм), 4 - первые листья, 5 - узел, 6 - часть мезокотиля, прилегающая к узлу (10 мм), 7 - часть мезокотиля, примыкающая к щитку (10 мм), 8 - щиток, S - часть корня, примыкающая к щитку (10 мм), 10,- зона Функционирующих корневых волосков (10 мм),

II - зона нормирования метаксилемы и образования корневих волосков,(5 мм), 12 - зона роста клеток растяжением (.5 мм), 13 - кончик корня (2 мм).

Известно, что верхушка колеоптиля является местом синтеза ИУК, которая затем перемещается полярно в базипетальном направлении. лак видно из табл. I и 2, верхушка имеет наибольшую концентрацию ауксина, содержание которого градуально снижается к основанию колеоптиля. Б нешек. работе показано, что для верхуоки колеоптиля характерно высокое содержание и других фитогормонов, причем наиболее высок уровень АБК. В количественном отношении зодержание свободных фитогормонов в верхушке колеоптиля (4 мм) выглядит следующим образом: АБК - 206,5, ИУК - 152,6, З+ЗР -38,0 и ГА - 1,03, а связанных: АБК - 188,8, ИУК - 140,7, З+ЗР -

,-), ГА - 1,32 нг на г сырок массы. Высокое содержание АБК в зерхушке (тзбл. 1,2), по-видимому, необходимо для торможения эоста клеток и этои зоне колеоптиля, а присутствие повышенных <онцентрации цитокининов и ГА обеспечивает высокую метаболичес-сую активность клеток верхушки колеоптиля. Содержание не только

Таблица I Содержание свободных $итогсрмонов в различных органах и зонах 4-суточных этиолированных проросткоЕ кукурузы (нг/г сырой МаСС1

Органы ! Зона ПУК . З+ЗР ГА АБК

проростка

Колеоптиль I 152,6-41,6 38,0*12,6 1,03*0,21 208,5*48,9

2 24 ,6*4 ,7 21,0*5,5 0,34*0,11 32,9*10,9

3 17 ,1*1,6 14,6*5 ,8 0,31*0,07 7,4*1,8

Листья 4 15,6*3,4 21,2*4 ,2 1,76*0,42 16,6*4,3

Узел 5 26,3-5,1 33,3*10,2 0,27*0,05 14,1*3,7

Мезокотиль 6 88,3-18,3 12,2*4,1 0,05*0,02 10,4*4,1

7 41,3*10,8 27 ,4*10,4 0,30*0,09 - 8,7*2,4

Щиток 8 71,8-13 ,8 12,0*3,5 0,26*0,01 11,2*2,4

Корень 9 65,4*12,3 18,9*7,2 0,32*0,06 9,6*3,3

10 160,1-53,3 35,9*8,5 1,66*0,53 127,6*38,2

II 290,3*48,1 188,8*18,0 2,54*0,22 240,9*40,7

12 197,4*39,9 144,0*14,1 3,16*0,99 142,5*21,6

13 176,6*40,7 275,2*3? ,9 4,26*0,35 360,6*68,0

Т а б л и ц а 2

Содержание связанных фитогормонов в различных органах и зонах

4-суточных этиолированных проростков кукурузы (нг/г сырой масс

Органы • Зона ПУК З+ЗР ГА АБК"

проростка

Колеоптиль I 140,7*46,8 49,9*12,4 1,32*0,36 188,8*38,8

2 28,9*6,4 25,4*6,4 0,82*0,28 6,6*4,0

3 19,3*2 ,9 22,9*7,0 0,59*0,19 34,8*11,7

Листья 4 38,0*16 ,7 31,9*12,8 1,96*0,49 24,9*12,9

Узел 5 27,5*10,3 37,7*13,6 0,39*0,03 • 10,1*3,7

Мезокотиль б 44,2*14,5 14,3*3 ,8 0,27*0,05 16 ,3*4,9

7 36,9*14,6 15,6*6 ,7 0,36*0,08 31,9*8,6

Щиток 8 17,2*4,5 16,4*4,8. 0,22*0,04 27,4*5,0

Корень 9 .. 14,9*5,3 13,8*2,8 0,70*0,23 23,1*6,8

10 178,5*38,6 • 22,5*3,9 1,51*0,50 43,0*10,6

II 183,3*27,6 247,6*31,4 4,19*1,30 204,9*36,4

12 241,9*29,2 138,4*23,0 5,90*1,77 222,5*33,0

13 322,6*38,1 302,6*60,3 14,25*5,50 275,0*48,5

1УК, но и всех других фитогормонов имеет резко снижающийся градиент от верхушки к основанию колеоптиля. Б то же время интенсивный рост клеток растяжением происходит именно в этой, лежа-цей под верхушкой, части колеоптиля. Это кажущееся несоответст-зие, по-видимому, объясняется тем, что ИУК, в отличие от других гормонов перемещается по колеоптилю волнообразно, и в момент трохождения волны через клетку концентрация ИУК в ней значительно превышает усредненные значения. При сравнении интенсивности роста целого колеоптиля во времени обнаруживается высокая положительная корреляция между скоростью роста и суммарным содержанием эндогенной свободной ИУК (Кудоярова и др., 1988).

Комплексный анализ фитогормонов, проведенный нами, позволяет использовать теории позиционной информации для объяснения поведения клеток в органах и зонах. Специфические условия физико-химических и физиологических градиентов, в которые попадает клетка, индуцируют включение определенных генетических программ и функционально!-, активности. J этой точки зрения обращает на себя внимание четкий градиент величины отношения АБКД1УК+(Э+ЗР) от верхушки к основанию колеоптиля: 1,09, 0,72, 0,23, и отношения З+ЗР/ИУК: 0,25, 0,65, 0,65 (табл. 3). В связи с этим важно отметить, что в работе Москалевой и Полевого (1989) цитокинин оказывает положительное действие на рост отрезков колеоптилей, особенно в молодом'возрасте.

Гормирующиесч молодые листья ^-суточных этиолированных проростков кукурузы характеризуются низким уровнем свободной ИУК, высоким отношением цитокинино/ИУК (1,ЗА), высокой концентрацией ГА и самым низким отношением ИУК/ГА (табл. 1-3). Высокий уровень зептина относительно ПУК характерен для зон с интенсивным делением клеток (Barlow , 1976). а низкое содержание ПУК и высокое содержание ГА - обязательные условия для роста молодых листьев проростков кукурузы (Москалева, Половой, 1969).

В колеоптильном уялг локализованы апекс побега, формирующий листьн, и субапикпльная меристема, обеспечивающая рост мезокоти-ля. отношение З+ЗР/НУа в узле достаточно высоко (1,18), что со-ответстиуст высокой пролиферзтивнои активности этого органа (табл. 3). Обращает на себя внимание относительно низкий уровень всех фп'.тогопчонов в колгоптильнои узле (табл. 1,2). Очевидно, ото обстоит!лъстро позволяет тонко регулировать функциональную

Таблица 3 Число, вес клеток и соотношение концентраций свободных Литогор-монов в органах и зонах '♦-суточных этиолированных проростков кукурузы

Орган проростка

Зона Число клеток в I г сырой массы

•Ю6

Сырая (З+ЗР)/ масса д1УК клетки '

Г'КГ6

АБК/ АБК/ АБК/ ИУК/ГА /ИУК /(З+ЗР) /(ИУК+ +3+ЭР)

Колеоп- I 7.61 0,131 0,25 1,37 5,49 - 1,09 148,1

тиль 2 3,73 0,268 0,85 1.34 1.57 0,72 72,4

3 4,81 0,208 0,85 0,43 0,51 0,23 55,1

Листья 4 19,23 0,052 1.34 : 1,05 0,78 0,45 8,9

Узел 5 1*4,91 0,067 1,18 0,49 0,42 0,23 104,8

Мезоко- 6 3,85 0,259 0,14 0,12 0,85 0,10 1766,0

тиль 7 3,99 0,250 0,66 0,21 0,32 0,13 137,7

Щиток 8 8,56 0,117 0,17 0,16 0,93 . 0,13 276,1

Корень 9 3,35 0,299 0,29 0,15 0,51 о.н 204,4

10 4,74 0,21!. 0,22 0,79 3,55 0,65 96,4

II 4,91 0,204 0,65 0,83 1,27 0,50 П4,3

12 4,90 0,204 0,73 0,72 0,99 0,42 62,5

13 38,43 0,026 1,56 2,04 1.31 0,80 41,5

активность меристем узла с помощью фитогормонов, притекающих из других частей проростка. ИУК поступает главным образом из верхушки колеоптиля и в небольших количествах - из формирующихся листьев, а цитокинины - из кончико? корней. ГА у проростков кукурузы транспортируются в колеоптильный узел, по-видимому, из кончиков корней и формирующихся листьев.

Для этиолированных проростков характерен интенсивна»; рост мезокотиля, причем рост клеток растяжением происходит только в той его части, которая примыкает к узлу. Б этой зоне мезокотиля по нашим данным, высок уровень свободной ЙУК, остальные фитогор-моны присутствуют в низких концентрациях, особенно, цитокинины и ГА. Для этой зоны'характерна самая низкая Ееличина отношения АБК/ИУК (0,12). Такой гормональный баланс способствует росту растяжением клеток мезокотиля. Отношение ИУК/ГА в верхней зоне мезокотиля достигает очень большой величины (1766), Тем не мене' приток ГА в эту зону способствует росту клеток (ноекмл'.ва, Лоле-

вой, 1989). В меэокотиле в базипетальном направлении наблюдаются следующие-изменения свободных фитогормонов: ИУК снижается в 2 раза, содержание З+ЗР и ГА несколько возрастает, а низкий уровень АБК не изменяется (табл. I).

Как известно, в кончиках корней осуществляется синтез што-кининов и ГА, в корневом че'хлике образуется АБК (Дёрфлинг, 1985; Itei, Birnbaum , 1991). Ауксин транспортируется в корень из побега. В нашей работе показано, что в кончике корня (2 мм) 4-су-точных этиолированных проростков кукурузы Одесская 80, включав- . щем в себя корневой чехлик и апекс, эндогенные свободные и связанные фитого,рмоны присутствуют в высоких концентрациях: АБК -360,6 и 275,0, З+ЗР - 275,2 и 302,8, ИУК - 176,6 и 332,6, ГА - ' 4,26 и 14,25 нг на г сырой массы, соответственно (табл. 1,2). Для кончика корня характерны самые высокие у проростка отношения АБК/ИУК (2,04) и З+ЗР/ИУК (1,5б)(табл. 3). Значительное превышение содержания цитокининов над уровнем ИУК ,по Барлоу'(Barlow, 1976) .является условием интенсивной митотической активности. Высокий уровень АБК, синтезирующейся в корневом чехлике, по-видимому, тормозит деление клеток в дисгальной части апекса (в покоящемся центре)(см. Полевой, Салакатова, 1991).

В зоне растяжения (5 мм) концентрация всех фитогормонов падает в пересчете на I г сырой массы, кроме свободной ИУК. Однако эти расчетные данные объясняются образованием большой центральной вакуоли в клетках, растущих растяжением, и не дают представления об истинной концентрации фитогормонов в цитоплазме. В пересчете на мг белка содержание всех фитогормонов в зоне растяжения, по сравнению с кончиком корня, возрастает, что указывает на увели- . чение концентрации фитогормонов в цитоплазме клеток, растущих растяжением. Отношение АБК/ИУК в зоне растяжения, по сравнению с . кончиком корня, снижается в 3 раза, а-З+ЗР/ИУК - в 2 раза.' Последнее, по Барлоу (Barlow , 1976), может быть причиной прекращения деления клеток, но из-за высокой концентрации ИУК в зоне растяжения сохраняется процесс эндоредупликации. Действительно, содержание ДНК в клетках корней кукурузы, растущих растяжением, удваивается и продолжает возрастать в клетках зоны корневых ьо-лосков (см. Обручева, 1^65).

В зона "дифференцировки" в пересчете на I г сырой массы содержание свободных ИУК, цитокининов и АБК увеличивается, что мо-

жет бить связано с дифференцировкой сосудов метаксилемы. Уровен! свободной ИУК в этой зоне самый высокий, по сравнению со всеми другими органами и зонами проростка. В этой зоне индуцируются формирование корневых волосков и закладка в перицикле бокозых корней. Известно, что для индукции закладки боковых корней необходима повышенная концентрация ИУК.

В вышележащих зонах корня наблюдается быстрое градуальное уменьшение содержания всех фитогормонов, как свободных, так и связанных (табл. 1,2). Однако уровень ИУК в этой части корня пр< вышает содержание других фитогормонов. Очевидно, большая часть этой ИУК сосредоточена в центральном цилиндре.

Таким образом, у '»-суточных этиолированных проростков кукурузы наблюдаются четкие однонаправленные и разнонаправленные rpi диенты содержания эндогенных фитогормонов вдоль осевых органов. Это явление наблюдается в колеоптиле, мезокотиле и главном корн Градиенты содержания и баланса фитогормоноз, в некоторых случая: сопоставимы с поведением клеток вдоль этих органов, что укаэыва' ет на применимость теории позиционной информации для растительных организмов.

Влияние температурного стресса на содержание эндогенных фитогормонов в отрезках дистальних частей колеоптилеи и корней проростков кукурузы.

В нашей работе была поставлена задача исследовать изменени всех основных групп эндогеннпх фитогормонов (за исключением эти лена) в свободной и связанной формах через I, 5, ЗС~и 9С мин после кратковременного (4 с) действия высокотемпературного (50° или низкотемпературного (4°С) стресса на отрезки (20 мм) дистал ных частей колеоптилей и корней проростков кукурузы Молдавская 215. Процедура отсечения уже сама по себе создает стрессовую си туацию (Пахомова, Пахомов, 1992), однако Отделение лишае', поган коррелятивных взаимодействий, в том числе электрических, что пс зволяет более однозначно интерпретировать полученные результата Оба выбранных объекта автономны по синтезу тех или других фитогормонов: в дистельном отрезке колеоптиля с верхушкой синтезиру ются ИУК и АБК, а в дистальном. отрезке главного корня с кончике ~ цитокинины, ГА и АБК. В отрезках колеоптилей после отсечения к 5 и 30 мин наблюдается тенденция к возрастанию содержания eue бодных КУК, З+ЗР, ГА и снижению уровня АБК; в отрезках корней т

контроле происходит уменьшение содержания свободной ИУК (табл.4).

Экспериментально выбранные температуры воды для импульсного воздействия на отрезки (50° и 4°С), судя по электрофизиологическим реакциям, оказывали на них сильное стрессовое влияние. И в то же время рост отрезков в длину после частичной потери тургора в первую минуту (50°С) восстанавливался через 6-30 мин и в дальнейшем почти не отличался от контроля. Поэтому первичные стрессовые реакции в пределах 1-5 мин можно рассматривать как фазу повреждения, а реакции за 6-90 мин-как фазу адаптации.

В опытах с отрезками колеоптилей было показано, что в первую минуту после воздействия 50°С в той или иной степени происходит снижение всех исследованных свободных фитогормонов относительно контроля: ИУК на 5k%, З+ЗР на Щ, ГА на Зб£ и АБК на 2Ъ%. Это снижение не сопровождается суг(ественными изменениями в содержании связанных ИУК и цитокининов, но количество связанных ГА и АБК за I мин имеет тенденцию к возрастанию (табл. 4). Поэтому падение уровня свободных фитогормонов через I мин после 'высокотемпературного кратковременного стресса в отрезках колеоптилей можно объяснить окислительнич разрушением фитогормонов или потерей их в окружающую среду, а для ГА и АБК - еще и возможным превращением в связанные формп. пониженный уровень всех свободных фитогормонов сохраняется на 5 я 30 мин, но к 90 мин наблюдается повышение содержания ИУК и АБК как в свободных, так и в связанных формах, причем суммарный уровень свободных и связанных форм каждого , из этих фитогормонов на 90 мин значительно превышает не только свой контроль, но и исходное содержание, что указывает на активацию синтеза ИУК и АБК в отрезках, подвергнутых стрессу.

Через I мин послг низкотемпературного воздействия (4°С) содержание свободных фитогормонов не изменяется, однако достоверно возрастает уровень связанных ИУК, ГА и АБК. Но на 5 и 30 мин происходит значительное падение всех основных фитогормонов, причем в большинстве случаев уиеньшаетйгйРихСвязанных форм. Как видим, гормональная реакция на низкотемпературный стресс начинается с некоторый запозданием (если не считать возрастания связанных форм ИУК и АБК). К 90 мин также, как и в случае с высокотемпературным стрессом, в отрезках колеоптилей возрастает уровень свободных и связанных ИУК и АБК (табл. 4). .

Гаким образом, гормональный ответ отрезков колеоптилей на

Таблица 4

Изменение эндогенных свободных и связанных фитогормонов в отрезках колеоптилей проростков кукурузы после кратковременного (4 с) температурного стресса в пг на отрезок

. Время Тем- ИУК зТзР АБК ГА"

после пера- -■-----

стрес- тура, своб. связ. своб. связ, своб, связ. своб. связ. са,мин

25 . 347*98 274*59 553*90 752*143 979*143 557*90 28*7 6*2

I 50 161±62 324*95 328*58 722*109 712*167 1069*266 18*4 , 10*3

4 325-101 594*132 427И14 628*112 797*220 1589*219 22*7 18*6

25 ' 400*155 754*172 672*130 1005*202 1055*242 809*180 4*1 20*5

5 50 192*62 576*121 749*122 876*149 588*73 • 812*142 11*3 15*4

4 " 249*51 367*76 759*159 704*108. 292*54 592*116 -26*9 9*3

25 523*114 412*88 1066*229 873*208 763*169 841*127 41*11 14*4

30 50 375* 91 329*69 756*173 841*189 432*75 702*223 4*1 46*11

4 231*100 310*106 596*141 755*187 526*143 913*197 23*6 26*9

25 208*48 468*156 585*140 505*98 934*238 656*173 29*9 63*20

90 50 " 398*106 928*207 545*117 720*160 1952*489 1088*214 15*4 14*4

4 402*133 930*163 802*140 1002*155 1238*299 1509*229 33*10 64*20

Таблица 5

Изменение эндогенных свободных и связанных фитогормонов в отрезках корней проростков кукурузы послз кратковременного (4 с) температурного стресса в пг на отрезок

Время посте Температура, °С 'ЛУК З+ЗР АБК ГА

стсес-са,мии своб. связ. сгоб. связ. своб. связ. своб. связ.

I 25 50 4 502*85 зое*9б чб4*10б 765*103 605*124 496*97 912* 165 419*103 994*200 1007*95 569*95 755*131 992*131 706*151 1068*249 901*152 722*183 555*131 20*6 8*3 32*7 34*11 23*6 7*2

5 25 50 4 243*65 223*63 252*72 266*86 685*161 612*111 813*238 6441123 638*132 1111*212 431*110 455*106 1154*235 1004*230 1180*250 966*193 619*162 1111*248 27*3 19*5 27*8 27*9 6*1 12*4

30 . 25 50 4 231*68 182-52 310*93 701*96 518*110 449*89 791*184 361*61 865*214 778*176 914*152 867*207 1170*203 656*114-1228*262 1086*215 '532*133• 761*159 43±П 51*15 12*3 44*12 48*15 6*2

90 25 50 4 377±78 373*76 341*87 594*143 '482*78 447*135 798*189 801*200 1059*247 917*160 951*189' 1075*243 908*183 800*151 1620*300 845*191 698*106 1117*224 34*12 19*5 18*5 7*2 3*1 5*1

ниэко- и высокотемпературный стресс имеет много общего: вначале наблюдается снижение всех свободных форм фитогормонов (фаза повреждения), а к 90 мин уровни ПУК и АБК относительно контроля возрастают.

В опытах с дистальньми отрезками корней через I мин после кратковременного высокотемпературного стресса (50°С) также, как в колеоптилях, падает содержание всех фитогормонов в свободной форме: ИУК на 39%, З+ЗР на 55%, ГА на 60% и АБК на 2Ь%. Однако при этом, в отличие от колеоптилей, содержание всех связанных форм также имеет тенденцию к уменьшению (табл. 5). В течение 5 и 30 мин уровень свободных фитогормонов в большинстве случаев оставался более низким, чем в контроле, а к 50 мин приближался к уровню контроля. Связанные формы фитогормонов в варианте с 50е к 90 мин также количественно не отличались от контроля. Следовательно, в случае с отрезками корней мы имеем сходную с колеопти-лями гормональную реакцию, но выраженную более сильно, судя по нарушению гормонального статуса.

В то же время отрезки корней слабо реагируют на низкотемпературный стресс (4°С). Уровень свободных фитогогмонов, как правило, за все время опыта не отличается от контроля (табл. 5). К 90 мин после 4°С в отрезках корней возрастает только уровень свободной АБК. Однако содержани« связанных форм всех исследованных фитогормонов через I мин после импульса низкотемпературного стресса имеет тенденцию к уменьшению, также кек и в вариантах с высокотемпературным стрессом.

Таким образом, в реакциях отрезков колеоптилеи и корней на высоко- и низкотемпературный стресс имеются элементы как сходства, так и различия. Во всех случаях изменения в содержании фитогормонов носят колебательный характер и обусловлены распгчом, синтезом и взаимопревращениями свободных и связанных форм. В нашей работе впервые показано, что сдвиги в содержании всех исследованных фитогормонов в растительных тканях происходят у^е в первую минуту после кратковременного (4 с) высоко- и низкотемпературного стресса. Понижение уровня ИУК, цитокининов, ГА и АБК в пределах 30 мин - общая реакция для отрезков колеоптилей и ко) ней. К 90 мин после стресса возрастает уровень свободной АБК (а; исключением корней после 50°С). Принципиально сходные данные по отдельным фитогормонам имеются и и-литературе, однако за более длительный период (Пустовойтова, 197? ; Волкова и др.,-Г)8Т,1991

Акимова, 1988; Creelman et nl. , 1987; Pillay, Beyl , 1990; Norman et al. , 1990 И др.).

Какую же роль, исходя из полученных нами данных, играет эндогенные фитогормоны при прямом кратковременном действии высоко-и низкотемпературного стресса на отрезки колеоптилей и корней проростков кукурузы? Как видно из табл. 4,5, к 5 мин уровень свободных цитокининов восстанавливается (достигает уровня контроля), а к 30 мин отношение АБК/ИУК (50°С) снижается, что и может быть причиной восстановления интенсивности роста. Возрастание уровня . ИУК к 90 мин в стрессовых вариантах должно способствовать дальнейшему росту отрезков колеоптилей. Увеличение содержания АБК, возможно, происходит в верхушке колеоптиля и корневом чехлике. Эти явления можно рассматривать как гормональные звенья фазы адаптации.

Быстрые гормональные сдвиги в корнях проростков кукурузы

после кратковременного действия низко., •"емпературы на побег.

Опыты с изолированными частями растений позволяют изучить непосредственный ответ этих частей на прямое действие стрессора. Однако в целом растении все его ткани и органы взаимодействуют между собой, и на локальное стрессовое воздействие растение отвечает как единое целое. Тем не менее, механизм этих взаимодействий в стрессовых условиях почти не изучен. Этой теме посвящены лишь единичные работы (Кудоярова и др., 1990; Акимова и др.,1991)..

В нашей работе с целыми 4-суточными этиолированными пророст- ; ками кукурузы локальному низкотемпературному воздействию (вода !• '<°С, 10 с) подвергали побеги, а комплексный анализ фитогормонов через 10 и 90 мин проводили в дистальной части корней (10 мм), удаленных от места воздействия стрессоря на 10 см. Было показа-но(табл. б), что через 10 мин в дистальной части корней возрастает содержание свободных цитокининов на 110$, АБК на 101%, ГА на 60% и ИУК на 48$ относительно контроля. Увеличивается также содержание связанных ИУК и цитокининов. К 90 мин количество свободных ИУК и ГА снижается; а содержание З+ЗР и АБК резко превышает контроль, оербенно АБК (на 216$). Значительно возраста'ет отношение АБК/ИУК (5,2). Полученные данные свидетельствуют о том, что растительные организмы действительно способны быстро передавать сигнал о стрессовых воздействиях из одних частей в другие, и что этот сигнал индуцирует резкие изменения в гормональной

Таблица б Изменение содержания свободных и связанных фитогормонов в дис-тальной части корней (10 мм) проростков кукурузы после низкотемпературного кратковременного (10 с) стрессового воздействия на побеги этих проростков (пг/отрезок)

Варианты Время ИУК З+ЗР

стресс (мин) а . своб. связ. своб. связ.

Контроль 10 90 303*39 451*60 604*93 657*80 688*72 802*101 820*144 1540*240

Опыт 10 90 тт 379*50 931*136 1477*176 1449*151 1176*156- 1733*187 1224*177

АБК ГА

своб. связ. своб. связ.

Контроль 10 90 465*77 627*83 1221*144 1684*174 10,8*2,0 37,2*10,0 11,2*1,0 10,14*1,2

Опыт 10 90 965*103 1982*143 1207*131 1604*174 19,4*6,0 18,0*2,3 8,5*0,7 ' 10,9*1,4

системе. Эти изменения принципиально иные, чем при прямом воздействии стрессора на дистальную часть корня: наблюдается не снижение содержания фитогормонов, а их повышение. Очевидно, таким образом части растении, испытывающие влияние стрессора, побуждают другие органы "придти к ним на помоги".

Какова же природа сигнала, передающего по всему растению информацию о локальном стрессовом воздействии? Судя по скорости передачи,таким сигналом может быть электрический импульс. Электрические импульсы типа потенциала действия индуципуются у растений под влиянием различных стрессовых факторов (Опритов и др., 1991; Oavi.ee et а1. , 1991; сгЬаХЪегз, Со^гоуе , 1992). 'о работе Кудояровой с соавт. (1990), в которой регистрировались быстрые изменения свободной и связанной ИУК, были записаны и распространяющиеся электрические потенциалы действия. Таким образок, целостная,реакция растительного организма на локальное действие стрессора включает в себя быстрые изменения гормонального статуса в других частях растения, причем в качестве индуктора этих изменений, возможно, выступает потенциал действия.

ВЫВОДЫ

1. Модифицирована методика, позволяющая определять с использованием иммуноферментного анализа и чувствительной Йиопробы содержание ИУК, цитокининов (З+ЗР), гиббереллинов (ГА) и АБК в свободной и связанной формах в одной навеске (0,2-1 г сирой массы).

2. Проведен анализ эндогенных фитогормонов в 13 органах и зонах 4-суточных этиолированных проростков кукурузы, показавший, что вдоль осевых органов существуют четкие градиенты содержания и баланса ИУК, З+ЗР, ГА и АБК, которые в ряде случаев сопоставимы с поведением клеток вдоль этих органов, что указывает на при-' мгнимость теории позиционной информации для растительных организмов.

3. Установлено, что у колеоптйля наблюдается нисходящий градиент всех свободных и связанных фитогормонов от верхушки, где осуществляется синтез ИУК, к основанию, причем содержание свободных фитогормонов в верхушке (4 мм) составляет для ИУК 152,6, З+ЗР - 38,0, ГА - 1,03 и АБК - 208,5 нг нй г сырой массы. Высокая концентрация АБК в верхушке," по-видимому, необходима для торможения роста клеток в этом органе.

для формирующихся настоящих листьев характерны высокая концентрация свободных ГА (1,76 нг на г сырой массы) и очень низкое содержание свободной ИУК (15,8 нг на г сырой массы ), что согласуется с активирующим действием ГА и тормозящим влиянием ауксина на рост основания листа проростков кукурузы. Отношение З+ЗР/ИУК в листьях высоко, что необходимо для пролиферативной активности клеток в интеркалярной меристеме.

5. Б колеоптильном у'зле, где активно идет деление клеток, также высоко отношение свободных З+ЗР/ИУК,. но концентрации всех фитогормонов относительно невелики, что позволяет фитогормонам, притекавшим из других органов, оказывать влияние на функциональную активность апикальной и субапикальной меристем.

6. для апикальное части мезокотиля, где в условиях темноты идет интенсивный рост клеток, характерно относительно высокое содержание свободной ИУК и самое низкое в проростке отношение АБК/ИУК.

7. В кончике корня (2 мм), где осуществляется деление клеток и синтез цитокининов, ГА и АБК, концентрации всех свободных и связанных фитогермонов высоки: ИУК - 176,6, З+ЗР - 275,2, ГА - 4,26

и АБК - 360,6 нг на г сырой массы (свободные формы), а отношения

свободных З+ЗР/ИУК и АБК/И/К самые высокие из всех органов проростка. Высокий уровень АБК, возможно, тормозит деление клеток в покоящемся центре.

8. Концентрации свободных З+ЗР, ГА и особенно АБК в зоне растяжения корня в пересчете на I г сырой массы снижаются (из-за образования в клетках центральной вакуоли), а уровень свободной ИУК имеет тенденцию к повышению.

9. для зоны "дифференцировки" характерны самый высокий уровень свободной ИУК (290,3 нг на г сырой массы), что необходимо для закладки боковых корчей, и повышение концентраций З+ЗР и АБК,

10. При действии кратковременного (4 с) высоко-' (50°С) и низкотемпературного (4°С) стресса на дистальные отрезки колеопти-лей и корней (20 мм) 4-суточных этиолированных проростков кукурузы сдвиги в содержании ИУК, З+ЗР, ГА .и АБК в растительных тканях происходят уже в первую минуту. Изменения в содержании фитогормо-нов носят колебательный характер.

11. У отрезков колеоптилеи при том и другом видах стресса 3i период 1-30 мин происходит снижение всех свободных Форм ?итогорм( нов, а к 90 мин уровни свободных и связаннпх ИУК и АБК возрастаю' У отрезков корней после 50°С наблюдается сходная с колеоптилями гормональная рекция, но выраженная более сильно. Однико после низкотемпературного стресса содержание свободных фитогормонов у корней, как правило, нз отличается от контроля, за исключением свободной АБК, уровень которой к 90 мин возрастает.

12. При действии импульсного (10 о) низкотемпературного стресса С»°С) на побеги 4-суточных этиолированных проростков кукурузы в дистальной части корней в пределах 10 мин возрастает содержание свободных и связанных ИУК, З+ЗР и свободных ГА и АБК. Предполагается электрическая передача сигнала. Таким образом, стрессовое воздействие на одну часть интактного растения ичдуци-рует быстрые гормональные сдвиги в другой ее части, причем иного характера, чем при прямом действии стрессора. Полученные данные указывают, что растительный организм отвечает на стрессовое воздействие как единое целое.

Список работ, опубликованных по теме диссертации,

1. Полевой А.З. Активность гиббереллинов в органах проростка кукурузы//Вестник С.-ПбГУ. Биология. Сер.3.-1992.-Вып.

24.-С .70-73.

2. Полевой В.В., Полевой A.B. Эндогенные фитогормоны этиолированных проростков кукурузи//Физиология растений.-1992.-Т.39. -Зып. б. -С .1165-1174.

3. Полевой A.B. Биоэлектрическая реакция отрезков колеопти-лей и корней кукурузы но кратковременный температурный стресс //Вестник С.-ПбГУ. Биология. Сер.3.-1993.-Вып.1.7*4

4. Ермаков E.Ii., Полевой A.B. Изменение баланса эндогенных ИУК и АБН в корнях проростков кукурузы при прямом и опосредован-, ном низкотемпературном стрессе//Докл. Россельхозакадемии,-1993.-» 3.

5. Полевой А.Б. Изменения эндогенных $итогормонов в колеоп-тилях и корнях проростков кукурузы после кратковременного температурного стресса//$изиология растений.-1993.-Т.40 (в печати).

6. Полевой A3. Быстрые гормональные сдвиги в корне проростка кукурузы после кратковременного действия низкой температуры

на побег//Тезисы Ш Всероссийского съезда физиологов растений. Санкт-Петербург, 1993 (в печати). -

Подписано к печати 25.03.93. Заказ 356. Формат 60x84/15. Объем 1 п. л. Тираж 150.

Ломоносовская типография. 169510, г. Ломоносов,-пр. Юного ленинца, 9.