Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гормональная регуляция содержания лектина пшеницы в стрессовых условиях

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Гормональная регуляция содержания лектина пшеницы в стрессовых условиях"

^ О4

ч

■а #

На правах рукописи

Безрукова Марина Валерьевна

Гормональная регуляция содержания лектина пшениаы в стрессовых условиях

Специальность ОЗ.ООЛ2 - Физиология растений

Автореферат на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа - 1997

Работа выполнена в Отделе биохимии и цитохимии Уфимского научного центра Российской Академии наук.

Научный руководитель - кандидат биологических наук Шакирова Ф.М.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Клячко Н.Л.; доктор биологических наук Кудоярова Г.Р.

Ведущее учреждение - Московская сельскохозяйственная академия имени К.А.Тимирязева.

Защита состоится 1997 г. в часов на заседании

диссертационного совета К 064.13.09 в Башкирском государственном университете имени 40-летия Октября.

Адрес: 450074, г. Уфа, ул. Фрунзе, 32.

Биологический факультет Башкирского государственного университета, ауд.332.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Башкирского государственного университета.

Автореферат разослаи'/^^.

г.

Ученый секретарь диссертационного сонета

к.б.н. Кузяхиетов Г.Г.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Проблема изучения механизмов устойчивости пшеницы к стрессам является одной из актуальных проблем растениеводства. Ее решение., может позволить направленно воздействовать на продуктивность растений. Стрессовые факторы окружающей среды вызывают значительные изменения в активности метаболизма клеток, тканей и целых растений. Как известно, решающая роль в регуляции обменных процессов в растениях принадлежит фитогормонам. Судя по многочисленным данным литературы, одной из первых неспецифических ответных реакция на стресс является накопление в растительных клетках АБК. Этому фитогормону отводится роль медиатора в становлении защитных реакций к стрессам, способствующих повышению устойчивости растений. К ним прежде всего можно отнести индукцию под влиянием АБК синтеза почти десятка стрессовых белков (Skriver & Mondy, 1990; Robertson et a!., 1994). В формирование защитных реакций растений вовлекаются также и некоторые присущие норме белки, синтез и количество которых увеличивается при стрессе (Shen et al.,1993). Можно полагать, что к таким белкам относится и пектин пшеницы - агглютинин зародыша пшеницы (АЗП), - обладающий специфическим сродством к N-ацстил-О-глюкозамину, являющемуся мономером хитина. Показано, что синтез и количественный уровень лектина пшеницы контролируется АБК (Raikhel et al.,1986). Несмотря на то, что физико-химические свойства этого белка очень хорошо исследованы, до сих пор дискутируется функциональная значимость этого белка для растений пшеницы (Peumans & Van Damme, 1995). В литературе имеются данные, свидетельствующие в пользу выполнения АЗП защитной функции к хитинсодержащим патогенам (Mirelman et al., 1975; Лахтин, Яковлева, 1987). К моменту начала пашей работы появились данные о существенном АБК-индуцируемом накоплении АЗП в ответ на засуху и осмотический стресс (Carmnue el al., 1989). В то же время, АЗП обнаруживается в растениях пшеницы на протяжении всего онтогенеза, причем количественный уровень этого белка не является постоянным (MishXind et al.,1980). I/o пому нельзя исключить, что в контроле его содержания принимают участие помимо АБК и другие фитогормоны, в том числе и

брассиностероиды. Брассиностероиды (БС) - новый класс фитогормонов, отличительным свойством которого является повышение устойчивости растений к стрессовым воздействиям разной природы (Хрипач и др.,1995; Прусакова, Чижова.1996). Правда механизмы их защитного действия пока недостаточно исследованы.

Цель и задачи исследований. Цель данной работы заключалась в выяснении принципиальной возможности регуляции содержания лектина пшеницы не только АБК, но и другими фитогормонами, а также исследовании изменений в его уровне при стрессовом воздействии для проверки возможности использования оценки этих изменений в качестве тест-системы развития зашитых реакций пшеницы. В связи с этим, перед нами были поставлены следующие задачи:

1) Провести анализ динамики содержания АЗП и АБК в растениях пшеницы при воздействии стрессов разной природы: грибном заражении, засолении, гипертермии.

2) Сравнительное исследование влияния АБК, ПУК, БАП, ГКз и эпибрассинолида на содержание лектина и АБК в проростках пшеницы.

3) Изучить влияние эпибрассинолида на баланс фитогормонов в растениях пшеницы.

4) Исследовать возможность вовлечения изменений в уровне АБК и лектина в формирование механизмов антистрессового действия эпибрассинолида при солевом стрессе.

Научная новизна. Существенное АБК-индуцируемое накопление лектина пшеницы в ответ на неблагоприятные стрессовые воздействия биотической и абиотической природы говорит в пользу участия этого белка в становлении универсальной неспецифической реакции растений пшеницы в ответ на стресс и выполнении им защитной роли наряду со стрессовыми белками. Полученные нами данные свидетельствуют о возможности использования количественных изменений в уровне АЗП в качестве тест-системы для оценки развития защитных механизмов. Впервые показано, что гнбберелловая кислота (ГКО и 24-эпибрассинолид (ЭБ) могут контролировать накопление лектина пшеницы независимо от АБК, что указывает на существование альтернативных путей гормональной регуляции количественного уровня этого белка. Критерием оцеики защитного действия ЭБ на растения пшеницы в условиях засоления среды может служить заметное снижение стресс-индуцированного накопления в них АБК и лектина.

Практическая значимость работы. Используемый в работе метод последовательного экстрагирования фитогормона АБК и лектина из одной растительной навески позволяет проводить оперативную и эффективную оценку количественного содержания фитогормонов и АЗП методом иммуноферментного анализа. Накопление лектина пшепицы в ответ на стрессовые воздействия разной природы может служить тест-системой развития неспецифической защитной реакции растений пшеницы и использоваться в качестве показателя антистрессовой активности при отборе соединений, обладающих потенциальной способностью повышать продуктивность пшеницы.

Апробация работы. Результаты работы докладывались н обсуждались на III съезде Всероссийского общества физиологов растений (С.-Петербург, 1993), IX и X Конгрессе Федерации европейских обществ физиологов растений (Брно, Чехия, 1994; Флоренция, Италия, 1996), ежегодном симпозиуме "Физико-химические основы физиологии растений" (Пенза, 1996), И Международном симпозиуме по стрессу (Москва, 1996).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из . введения, обзора литературы, изложения методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения и выводов. Работа изложена на 167 стр. машинописного текста, содержит 23 рисунка и список литературы, включающий 321 работу.

2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служили проростки мягкой яровой пшеницы (Triticum aestivum L.) сортов Саратовская 29 и Московская 35, выращенных на свету дневных ламп ЛД-40 с интенсивностью освещения 12 клк и длительностью светового периода 16 ч/сут. Семена перед посевом стерилизовали 96% этанолом и проращивали в кюветах на фильтровальной бумаге на дистиллированной воде при температуре 21-23"С.

Инфицирование растений пшеницы спорами Septoria nodorum Berk, проводили путем опрыскивания 6-дневных проростков суспензией спор в стерильной дистиллированной воде, содержащей 0.1% твин-20 (James, 1971). Изолят гриба предоставлен Всероссийским НИИ

фитопатологии (Большие Вяземы, Моск. обл.)- Концентрация спор составляла 106 спор/мл, из расчета 100 мл суспензии на 1 м2 посевов пшеницы. Контрольные растения опрыскивали стерильной дистиллированной водой с добавлением твина-20. В полевых, условиях колосья растений пшеницы заражали на 6-й день после цветения суспензией спор той же концентрации.

Для постановки лабораторных физиологических опытов семена пшеницы проращивали на фильтровальной бумаге на воде в течение 3-х суток. После отделения эндосперма проростки выдерживали сутки на растворе 2% сахарозы для снятия эффекта поранения. Для моделирования засоления 4-суточные растения помещали на смесь 2% КаС1 и 2% сахарозы, контрольные растения оставляли на 2% растворе сахарозы.

Работу по исследованию механизмов действия БС на растения пшеницы проводили с использованием 0.4 мкМ 24-эгшбрассинолида, любезно предоставленного проф. Хрипачом В.А. (Институт биоорганической химии АН Беларуси, г.Минск). Концентрация была выбрана из специально проведенного опыта по отбору оптимальных концентраций действия ЭБ на рост растений пшеницы сорта Московская 35. Постановка физиологических опытов с ЭБ была аналогична вышеизложенной для моделирования засоления.

Для исследования экзогенного влияния других фитогормонов семена перед посевом стерилизовали 96% этанолом и проращивали на фильтровальной бумаге в чашках Петри при комнатной температуре на растворах АБК, ИУК или БАП в концентрации 1мг/л, ГКз - 0.1 мг/л в течение 4-6 дней. Контрольные растения проращивали на дистиллированной воде.

Содержание фитогормонов: АБК, ИУК, цитокининов и лектина пшеницы определяли в одной растительной навеске, последовательно экстрагируя фитогормоны и лсктин.

Растительный материал гомогенизировали в жидком азоте и экстрагировали фитогормоны в 80%-ном этаноле в течение 16 ч при 4"С. После центрифугирования сниргоиый сунернатант упаривали в токе воздуха да водною остатка, в аликвоте которого определяли содержание циюкининов методом непрямого твердофазного конкурентного иммугюферментного анализа (ИФА) (Кудоярова и др., 1989). Из оставшегося водного остатка извлекали АБК и ИУК диэтиловым эфиром

и метилировали их дназометаном. После упаривания эфирз сухой остаток растворяли в 80-%ном этаноле, в его алнквоте анализировали количественное содержание АБК и ИУК с использованием специфических анти-АБК и -ИУК сывороток методом ИФА (Ямалеев и др., 1989). Из оставшегося твердого растительного остатка лектин экстрагировали 50 мМ НС1 в течение I ч при комнатной температуре. Супернатант нейтрализовали 1 М фосфатным буфером, рН 7.2, и вновь центрифугировали. Количественную оценку лектина проводили в аликвоте надосадочной жидкости методом ИФА.

Процедура ИФА лектина была аналогичной определению фигогормонов. Полистироловые планшеты ("Финбио") сенсибилизировали АЗП ("Serva", ФРГ) в концентрации 0.5 мкг/мл в 10 мМ фосфатном буфере, рН 7.2, при 37°С в течение 1.5 ч. Для удаления несвязавшихся с полистиролом молекул белка, как и на всех последующих этапах, лунки планшета трижды промывали фосфатно-солевым буфером, рН 6-7, содержащим 0.05% твин-20 (ФТ). В промытые лунки приливали ФТ, содержащий 0.5% желатины (ФТЖ) в качестве балластного белка, аликвоты растительных экстрактов или чистого препарата АЗП ((1 мг/мл) в виде десятичных стандартных разведений) и анти-АЗП сыворотку, разведенную в ФТЖ. Смесь инкубировали при 37"С в течение 1 ч. Планшеты промывали. Количественную оценку сорбированных на планшете анти-АЗП антител проводили путем добавления в лунки разведенных в ФТЖ меченых пероксидазой антикроличьих антител (ИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи, Москва). Планшеты выдерживали 1 ч при 37°С. Для оценки активности связавшейся с полистиролом пероксидазы в лунки после промывки добавляли субстрат, содержащий ортофенилендиамин (0.05%), перекись водорода (0.016%) в 0.06 М фосфатном буфере, рН 5.8. Развитие окраски останавливали добавлением 4 н серной кислоты. Интенсивность хромофорного ответа определяли на приборе "Titertek Uniskan" ("Flow laboratories", Англия) при 492 им. Содержание лектина в экстрактах рассчитывали по калибровочной кривой оптической плотности стандартных растворов АЗП с использованием оригинальной компьютерной программы.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Влияние стрессовых воздействий окружающей среды на изменение содержания АБК и лектина в растениях пшеницы.

В ряду предполагаемых функций лектина пшеницы защитная к биотическому стрессу является наиболее вероятной. В пользу этого свидетельствуют данные экспериментов по подавлению роста мицелия различных хитинсодержаших грибов, в присутствии АЗП (Mirelman et al.. 1975) и подавлению прорастания спор Helminthosporium sativum (Лахтин, Яковлева,1987). Одним из доказательств вовлечения АЗП в защитные реакции растений при патогенезе может быть увеличение содержания этого белка в ответ на инфицирование. Показано, что в регуляции синтеза и уровня этого белка участвует АБК (Raikhel et al.. 1986). В связи с этим, мы исследовали динамику содержания АБК и АЗП в проростках пшеницы при заражении фитолатогешшм грибом Septoria nodorum Berk. Из данных, представленных на рис. 1, можно видеть, что инфицирование вызывало повышение содержания АБК в сравнении с контролем (К), максимум которого приходился на вторые сутки после заражения. В последующие сроки значительных различий в уровне АБК в инфицированных и здоровых растениях не наблюдалось. В то же время, заражение проростков пшеницы S.nodorum вызывало увеличение уровня лектина лишь на б сутки после инокуляции. К моменту визуального проявления болезни (9-е сутки) содержание лектина в инфицированных растениях было в 3 раза выше, чем в здоровых.

Таким образом, представленные нами данные по увеличению уровня АЗП в растениях в ответ на инфицирование S. nodorum, наряду с полученными ранее результатами по заражению пшеницы пыльной головней (Ямалеев и др.,1988) и корневой гнилью (Шакирова и др.,1990), свидетельствуют о вовлечении этого белка в формирование реакций пшеницы в ответ на патогенез.

Валено отметить, что в период существенного увеличения уровня АЧП (6 сутки) в инфицированных проростках содержание АБК в них практически не отличалось от контрольных. Индуцированное заражением кратковременное накопление АБК по времени предшествовало увеличению уровня АЗП, и оно, вероятно, являлось рейдирующим сигналом к усилению образования лектина.

Рис.1. Влияние заражения септориозом на динамику содержания АБК и АЗП в проростках пшеницы

120 100

о 1

* я.

А л . в

ж 0

к —— *

гп, Г ,Пи, Т1.Ш

< О-

ЛАБК, К

АБК. З.гкх1

- а - Азп,

Э.гкхЗ.

з е э

Время поспе инокуляции, сут

Рис.2. Динамика содержания АБК и АЗП в корнях проростков пшеницы при воздействии МаС!

30

ш <

25-20-15 10 ■• 5 0

Л7

/

Г

• - 3500

• -зооо X га

•2500 с.

■ 2000 X

■ 1500 с:"

-1000 о <

-500

ЗАБК.К

=ЭАБК,

►—АЗП. К

АЗП.

та

В 14

Время, ч

Рис.3. Изменение уровня АБК и АЗП при воздействии теплового шока в культуре клеток пшеницы

1600

1400

1200

ё 1000 X

800 +

600 400 200- ■ О

- -

£

1в

Время, ч

$

Поскольку увеличение содержания АБК в растениях относится к неспецифическим реакциям, в ответ на стресс, можно думать, что изменение в уровне АБК может приводить к увеличению АЗП и при стрессах абиотической природы. Мы предположили, что накопление АЗП может представлять собой некий универсальный ответ растений на различные стрессовые воздействия. Основанием для такого предположения послужили опыты по выявлению существенного увеличения как АБК, так и АЗП в корешках проростков пшеницы, подвергнутых воздействию осмотического шока и засухи (Сатлше е1 а!.. 1989).

Мы в своей работе исследовали влияние теплового шока и засоления на количественные изменения АБК и АЗП в клетках пшеницы.

В опытах по воздействию гипертермии на динамику содержания АБК и лектина мы использовали каллусную культуру клеток пшеницы сорта Безснчукская 139, любезно предоставленную И.Ф.Шаяхметовым. Эти результаты приведены на рис. 3, из которого можно видеть, что через 4 ч культивирования каллусов при 40°С содержание в них АБК повышалось в два, а через 9 ч - в семь раз в сравнении с контрольным вариантом (24 °С). В последующие часы ее концентрация постепенно снижалась до уровня контроля. Такое повышение содержания АБК указывает на то, что клетки, культивируемые при 40 "С, испытывали сильный температурный стресс.

Гипертермия вызывала также сильное повышение содержания лектина в каллусах, который к 18 ч экспозиции почти на порядок превышал контрольное значение. Этому пику предшествовал 9-часовой ла!-период. Можно видеть, что именно в данном временном промежутке наблюдалось интенсивное увеличение концентрации АБК в клетках. Такой опережающий накопление лектина всплеск АБК иллюстрирует факт регуляции количественного уровня дентина этим фитогормоном.

Следует отметить, что благодаря использованию в опытах стабилизированной каллусной ткани нам удалось выявить столь значительное повышение содержания лектина при температурном шоке, четко свидетельствующем об участии этого белка в ответе клеток пшеницы на тепловой стресс и, таким образом, отнести АЗП к белкам, сопутствующим белкам теплового шока.

На рис. I приведена динамика уровня АБК и лектина в корнях 4-суточных проростков пшеницы цусловиях засоления среды. 2% раствор

NaCl вызывал уже спустя 1 ч от начала воздействия резкое накопление АПК, максимум которого приходился на 2 ч. Затем происходило постепенное снижение содержания этого фитогориона. Засоление приводило к многократному увеличению уровня лектина в корнях пшеницы, максимум которого приходился на 7 ч от момента перенесения проростков на 2% NaCl. В последующие часы содержание АЗП постепенно снижалось.

Па основании представленных данных можно сделать вывод о вовлечении лектина в формирование ответных реакций проростков пшеницы на воздействие 2% NaCl. Значительное накопление этого белка в условиях засоления, очевидно, является АБК-индуцируемым, так как двукратное увеличение содержания АБК предшествовало пятикратному накоплению лектина в корнях. Действительно, засоление среды вызывает довольно быстрые изменения в концентрации АБК (Montero et al.,1994), которые могут существенно изменить белковый спектр клеток растений, в частности баланс стрессовых и отдельных "нормальных" белков, их сопровождающих и участвующих в формировании защитных реакций растений в ответ на данное стрессовое воздействие (Ramagopal,1987).

Таким образом, максимуму накопления лектина в корнях растений пшеницы предшествует увеличение уровня АБК, что, очевидно, подтверждает известный из литературы факт участия АБК в контроле синтеза и содержания этого белка (Raikhel et al., 1986; Cammue et al.. 1989).

Значительное увеличение уровня лектина (в 3-4 раза при воздействии засухи и осмотического шока (Cammue et al., 1989) и, согласно нашим данным, в несколько раз при биотическом стрессе, засолении и тепловом шоке) свидетельствует об участии этого белка в формировании ответа клеток к стрессовым воздействиям различной природы.

Приведенные в данном разделе результаты позволяют сделать вывод о том, что увеличение количества лектина пшеницы является компонентом неспецифической универсальной защитной реакции растений и регулируется АБК, поскольку увеличение уровня АБК предшествует накоплению лектина.

3.1.1 Исследование механизмов регуляции накопления лектина с использованием ингибигорного анализа

Исследования по синтезу и накоплению АЗП в ходе формирования, созревания и прорастания зародышей пшеницы показали наличие пула запасных пектиновых шРНК в клетках (Peumans et al.,1982). Кроме того известно, что АЗП является продуктом посттрансляционного процессинга из высокомолекулярного шикозилированного предшественника, т.н. пробелка, который может депонироваться в вакуолях (Chvispeels & RaikJiel, 1991) и, вероятно, не узнается антителами к АЗП.

Полученные нами данные о сравнительно быстром накоплении АЗП. индуцированном засолением, позволили нам сделать предположение о возможности, по крайней мере в первые часы, увеличения содержания этого белка за счет синтеза на ранее синтезированных тРНК или мобилизации из пробелка.

В связи с этим, мы провели опьггы на интактных проростках с использованием кордицепина и циклогексимида, эффективных ингибиторов синтеза РНК и белка (рис.4). Присутствие в среде кордицепина в концентрации 50 мг/л, подавляющего синтез РНК более чем на 70%, не препятствовало индуцированному засолением накоплению АЗП в течеиие 8.5 ч, после чего происходило резкое падение уровня лектина (рис. 4а). На рис. 46 приведены результаты по влиянию засоления на изменение содержания АЗП в присутствии циклогексимида. В течение первых 4 ч накопление лекгина, вызванное засолением, может происходить за счет ранее синтезированных молекул-предшественников A311, т.к. одновременное с 2% NaCl внесение в среду циклогексимида (10 мг/л), не снижало этот процесс, несмотря на то, что в этой концентрации циклогсксимид подавляет синтез белка почти на 90% (Cleland, 1971). Однако в последующем наблюдалось резкое падение в количестве лектина относительно контроля под дейст вием ингибитора.

Таким образом, стресс может индуцировать накопление лектина пшеницы не только за счет его синтеза de novo, как показано в работе Caimnuc et ai. (1989), но и за счет его образования на ранее сингезирооаииых лектиновых тпРИК и/или мобилизации из пробелка. Такая ситуация вполне может иметь место, поскольку агглютинин

Рис.4. Влияние кордицепина (а) и циклогексимида (б) на динамику содержания АЗП в проростках пшеницы в условиях засоления

11

Время, ч

140

ОС С

о о.

Г 120

о

100

с

07 <

Я N301

□ Циклогексимид ♦ МаС1

б

5

зародыша пшеницы является "нормальным" белком, характерным для растений пшеницы, и, скорее всего, определенный резерв лектиновых шРНК и предшественников АЗП всегда присутствует в клетках.

3.2. Влияние экзогенных фитогормонов на динамику содержания лек-тина и АБК в молодых проростках пшеницы.

Поскольку массированный синтез лектина происходит в период формирования и созревания семян и контролируется АБК, предполагалось, что этот белок играет важную роль в становлении состояния покоя (ЗшшБеп & Решпаш,1984). Однако АЗП присутствует в растениях пшеницы на протяжении всего онтогенеза (М^Ькшс! ег а1., 1983). Хорошо известно, что онтогенез находится под четким контролем всех классов фитогормонов. В связи с этим, было интересно выяснить, участвуют ли другие фитогормоны, помимо АБК, в контроле уровня этого белка и изменяют ли они в то же время содержание эндогенной АБК. Мы исследовали влияние экзогенных ИУК, БАП, ГКэ и АБК на динамику содержания лектина в сочетании с их действием на количество АБК в молодых проростках пшеницы.

Специальные опыты по исследованию динамики содержания АЗП показали существенные изменения в содержании этого белка в ходе прорастания семян (в течение 7 суток). Поэтому важно было использовать фитогормоны в таких концентрациях, чтобы они не оказывали заметного влияния на ростовые показатели проростков. АБК в концентрации 1 мг/л не полностью ингибировала, а лишь тормозила рост проростков, тогда как использование ИУК (1 мг/л), БАП (1 мг/л) и ГК} (0.1 мг/л) не вызывало увеличения сырой массы растений в сравнении с контролем.

Экзогенная обработка АБК приводила к увеличению эндогенного содержания этого фитогормона, что неизбежно сказывалось на накоплении лектина пшеницы (рис. 5). Эти данные подтверждают известный факт участия АБК в контроле накопления этого белка ^¡[ШБеп е1а1.,1984; Саттиее! а1.,1989).

Результаты, приведенные на ряс. 6, показывают, что как ИУК, так и БАП вызывали повышение содержания лектина в сравнении с контрольными растениями. В то же время мы видим, что под влиянием этих фитогормонов увеличивалось содержание эндогенной АБК, максимум которого предшествовал накоплению лектина. Важно

Рис.5. Динамика содержания АБК (а) и АЗП (б) в проростках пшеницы при проращивании на растворе экзогенной АБК (1 мг/л)

Время, сут

—♦—к

- АБК

Рис.6. Динамика содержания АЗП (а) и АБК (б) в проростках при проращивании пшеницы на растворах БАП (1мг/л) и ИУК (1 мг/л)

550 500

К «0 +

с;

8. «я

л

о 350 +

° 300 о*

250

СО

< 200

150 100

л.

Рз

Й р

а

1

И АЗП нэ БАП □ АЗП на ИУК

Время, сут

500

450 - ■

400

С

0 350 о.

1 300 §

1- 250- ■

200- ■ Ш 150

ф

ш

I

ш

|г И

а АБК на БАП □ АБКиаИУК

б

отметить, что значительное накопление АБК под действием ИУК и БАП не оказывало влияния на прирост сырой массы. Таким образом, мы обнаружили факт участия как ауксина, так и цитокинина в регуляции уровня лектина, однако это, вероятно, может происходить опосредованно через воздействие этих фитогормонов на содержание АБК.

Совершенно иная картина наблюдалась при действии ГК< (рис.7а). Несмотря на то, что содержание лектина в проростках пшеницы в ходе прорастания под влиянием ГКз менялось, опытный и контрольный варианты по уровню АБК практически не различались. Полученные результаты свидетельствуют о возможности непосредственного участия гиббереллина в контроле изменения содержания АЗП.

Следовательно, количественные изменения лектина пшеницы регулируются не только АБК. Наряду с ней в контроле этого процесса могут быть задействованы и другие фитогормоны.

3.3, 24-энибрассинолид - представитель нового класса фитогормонов.

Брассиностероиды представляют собой новый класс фитогормонов стероидной природы, характеризующийся широким спектром биологической активности (Adam & Petzo1d,I994). Способность брассиностероидов и их структурных аналогов в ничтожно малых концентрациях стимулировать рост и развитие растений вызвала появление работ по практическому использованию этих фитогормонов и выявлению их антистрессовой активности уже на начальном этапе исследований (Хрипач и др.,1995). Брассиностероиды оказались способны усиливать устойчивость растений к ряду стрессовых воздействий как биотической, так и абиотической природы, что предполагает их участие в формировании неспецифических адаптивных механизмов (Кораблева, Платонова, 1995). Однако механизмы защитного действия этого фитогормонаеше недостаточно изучены.

3.3.!. Влияние ЭВ на изменение содержания АЗП и АБК в корнях приростков пшеницы.

Мы провели сравнительный анализ динамики изменения содержания АЗП и АБК также и под влиянием ЭБ, результаты которого приведены на рис. 76. Как видно, перенесение 4-суточных растений на

Рис.7. Динамика содержания АЗП и АБК в проростках при проращивании пшеницы на растворах 0.1 мг/л ГКз (а) и 0.4 мкМ ЭБ (б)

о

о а. о а.

С <

/

Л

450

400

1 1АЗП. К

350 § Г|'..|.1'г'11АЭП на ГКЗ

ь < АБК, К

зоо о - в - АБК на ГКЗ

о. 250 С

200^-ш 150 <

100

50

0

Время, сут

1800 1600

К

I 1400

Ш

ГО <200

а ^ 1000 I

§• 800

| 600

С 400 <

■- А

-I!

1}1

40 К г:

1

35 ф К

га

30 о.

ч-

25

т

о.

20 о ^

15

10 Ш

<

•■5 0

6 14

Время, ч

I 1АЯПК

I. . --1ДЧП на ЭБ

« АБК, К - О - АБК на ЭБ

раствор ЭБ (0.4 мкМ, см. рис. 8) приводило к постепенному накоплению лектина в корнях, так что к концу опыта (14 часов) содержание АЗП в них было почти вдвое выше по сравнению с контролем. Таким образом, наши данные свидетельствуют о стимуляции под влиянием ЭБ накопления АЗП в корнях пшеницы. В то же время. ЭБ на протяжении всего опыта не вызывал каких-либо значительных изменений в уровне Л Б К в корнях исследованных проростков. В опытах с ЭБ мы столкнулись с ситуацией сходной с действием ГКд на изменение количественного уровня АЗП.

Таким образом, ЭБ, так же как и ПС3, способен индуцировать увеличение уровня лектина независимо от АБК. Эти результаты иллюстрируют наличие альтернативных путей регуляции фитогормонами содержания этого белка.

3.3.2. Влияние ЭБ на гормональный баланс проростков пшеницы.

Проведенные нами опыты по выбору оптимальной концентрации действия ЭБ (в диапазоне 40 пМ - 40 мкМ) на рост 4-суточных растений пшеницы выявили наличие двух максимумов концентраций ЭБ (рис.8). Мы в своей работе использовали 0.4мкМ ЭБ, поскольку в этой концентрации фитогормон вызывал наибольшее удлинение корней проростков. Рост растений - интегральный физиологический процесс, который находится под четким гормональным контролем. В связи с этим, было интересно исследовать влияние ЭБ на содержание других фитогормонов, с тем чтобы попытаться выяснить природу рост-стимулируюшей активности ЭБ в растениях пшеницы.

В литературе имеется немало данных о влиянии брассиностероидов на баланс фитогормонов, однако они достаточно противоречивы (Eun et а!.. 1989; Курапов,1996; Прусакова, Чижова,1996). В связи с этим, задача нашей работы состояла в исследовании динамики содержания свободных цигокининов, ИУК и АБК в растениях мягкой пшеницы при действии ЭБ. Данные рис. 9 показывают, что уже через час от момента воздействия ЭБ в корнях проростков наблюдалось почти двукратное накопление цитокининов, которое поддерживалось на протяжении 14 ч опыта. В то же время, выдерживание растений на ЭБ практически не оказывало влияние на изменение уровня ИУК и АБК в корнях проростков (рис. 10).

Рис.10. Динамика содержания ИУК (а) и АБК (б) в корнях проростков пшеницы, обработанных 0.4 мкМ ЭБ

>5 Ф

1 О.

О ^

о о га

2 >3

о а. 2 о

>

■Й

л

□к

□ ЭБ

8 14

Время, ч

600

>2

О X 500-

о.

о

^

л 400-

о

о

га

5

зоо-

О

О.

л

О

200-

X

100-

Ш

<

1Д

л*.

X

л

лХ

Й

д

ок

□ ЭБ

б 14

Время, ч

а

б

|}Г|

О

Таким образом, ЭБ в корнях 4-суточных проростков пшеницы, не вызывая каких-либо существенных изменений в балансе ИУК и АБК, практически сразу индуцировал увеличение содержания цитокининов. Можно думать, что ростстимулирующая активность ЭБ в растениях пшеницы в первую очередь связана с изменением уровня цитокининов.

Сопоставляя собственные результаты по влиянию ЭБ на количественные изменения содержания различных фитогормонов с данными, имеющимися в литературе, нельзя выявить единства в гормональном ответе растений на экзогенную обработку брассиностероидами. Однако важно подчеркнуть, что брассиностероиды могут оказывать быстрое воздействие в целом на гормональный статус растений, вступая во взаимоотношения с отдельными классами фигогормонов, в комплексе с которыми они участвуют в регуляции физиологических процессов в растительных организмах.

3.3.3. Сравнительный анализ содержания лектина и АБК в корнях проростков пшеницы при воздействии ЭБ и засоления.

Ранее уже были получены данные, свидетельствующие о повышении под влиянием ЭБ устойчивости ячменя к солевому стрессу (Бокебаева,1991), При этом было показано, что одним из показателей антистрессового действия при засолении является снижение под его влиянием \'аС1-индуцируемого накопления пролина. Нам было интересно исследовать, происходит ли снижение также вызванного засолением накопления АБК и лектина пшеницы в присутствии ЭБ.

К простому способу визуальной оценки защитного действия различных соединений на растения в условиях стресса можно отнести анализ ростовых характеристик. На рис. 11а показано изменение длины корней 4-суточных проростков пшеницы при одновременном во ¡действии на растения ЭБ и 2% №С1. Засоление приводило к торможению роста корней в сравнении с контролем. В то же время, присутствие ЭБ снижало стресс-индуцированное ингибирование роста. Этот опыт свидетельствует о явном антистрессовом действии ЭБ на растения пшеницы в условиях засоления.

Результаты сравнительного анализа влияния ЭБ на динамику содержания лектина и АБК в корнях пшеницы в присутствии 2% ШС1 приведены на рис. 116. Можно видеть, что присутствие в среде ЭБ

Рис.11. Влияние ЭБ на рост корней пшеницы (а) и изменение в них содержания АЗП (б) и АБК (в) в условиях засоления

- О- к

—»—N301 —А—ЭБ + ЫаС1

2 3

Время, сут

£ X О. О * 1.5

2 1 ■■

с: о.5 • • СО < 0

м

—

___

- а - ЫаС1 —X—ЭБ+№С|

10 12 14

Время,ч

ш <

28 26 24 22 20-18- ■ 16

14 • • 12 10

5 1 г

Л*.

/ \ X

--х.

— - н:

-а - N301 —Х- ЭБ+ЫаС!

12 14

Время, ч

е

8

значительно (почти на 50%) снижало вызванное засолением резкое увеличение содержания лектина. ЭБ, как видно, снижал также почти на 50% и индуцированное засолением накопление АБК.

Приведенные результаты свидетельствуют о явном защитном действии ЭБ на растения пшеницы в условиях засоления среды, которое выражается в предотвращении резкого накопления в них уровня АБК и лектина.

* * *

Суммируя результаты, приведенные в данной работе, следует подчеркнуть, что воздействие на растения пшеницы стрессовых факторов как биотической (септориоз), так и абиотической (тепловой шок и засоление) природы индуцирует существенное накопление АЗП, которому предшествует увеличение уровня АБК, что позволяет такое изменение уровня лектина использовать 8 качестве тест-системы для оценки развития неспецифических защитных реакций растений пшеницы к стрессовым воздействиям. Полученные результаты подтверждают данные об индукции абсцизовой кислотой синтеза и накопления этого белка. Однако регуляция количественного уровня лектина пшеницы не ограничивается только АБК. В контроле содержания АЗП участвуют и другие фитогормоны: ИУК, БАП, 1К) и ЭБ. Однако если регуляция ИУК и БАП уровня лектина может быть опосредована вызванным этими фитогормонами накоплением АБК, то ГКз и ЭБ способны индуцировать повышение содержания АЗП независимо от АБК. Эти данные расширяют представления о гормональной регуляции уровня отдельных белков и свидетельствуют о существовании альтернативных путей регуляции различными фитогормонами накопления лектина пшеницы.

ВЫВОДЫ

1. Стрессовые воздействия разной природы (септориоз, засоление и тепловой шок) вызывают накопление лектина пшеницы, которому предшествует накопление АБК, что соответствует представлениям об АБК-зависимости этого процесса,

2. Впервые показано, чго, наряду с АБК, в регуляции содержания лектина пшеницы участвуют другие фитогормоны: ауксины, гиббереллины, цитокинины, брассшюстероиды.

3. Обнаружено, что экзогенные ИУК и БАП могут контролировать уровень АЗП опосредованно через их влияние на накопление АБК, тогда как ГК] и эпибрассинолид, вероятно, могут использовать альтернативные пути регуляции.

4. Эпибрассинолид индуцирует накопление цитокининов в растениях пшеницы, но не влияет на содержание ИУК и АБК.

5. Впервые показано, что антистрессовое защитное действие эпибрассинолида в условиях засоления проявляется в снижении индуцированного солевым стрессом накопления АБК и АЗП в корнях проростков пшеницы. Это' может свидетельствовать о снижении под влиянием ЭБ степени неблагоприятного воздействия NaCl, что согласуется с нормализацией ростовых процессов растений.

6. Представляется возможным использование количественных изменений уровня АЗП в качестве критерия оценки развития неспецифических защитных механизмов пшеницы к различным стрессовым воздействиям.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации,

1. Хайруллин P.M., Шакирова Ф.М., Безрукова М.В., Ямалеев A.M. Использование твердофазного конкурентного иммуноферментного анализа для определения содержания лектина в семенах и проростках пшеницы // Прикл. биохимия и микробиол.- 1992.- Т.28, вьпт.З,- С.468-474.

2. Хайруллин P.M., Шакирова Ф.М., Безрукова М.В., Ямалеев A.M. Изменение содержания лектина, абсцизовой и индолилуксусной кислот в растениях пшеницы, инфицированных Septoria nodomrn Berk. // Физиол. и биохимия культ, раст,- 1993,- Т.25, N2,- С. 138-144.

3. Шакирова Ф.М., Безрукова М.В., Хайруллин P.M. Влияние солевого стресса на содержание лектина в проростках пшеницы // III съезд Всероссийского общества физиологов растений, Санкт-Петербург, 24-29 июня, 1993: Тезисы докл. Часть 1.-С.-Г16, 1993 -С.43.

4. Шакирова Ф.М., Безрукова М.В., Хайруллин P.M. Увеличение уровня лектина в проростках пшеницы под влиянием солевого стресса // Известия РАН. Серия биол,- 1993.- N1,- С.142-145.

5. Шакирова Ф.М., Максимов И.В., Хайруллин P.M., Безрукова М.В., Ямалеев A.M. Влияние септориоза колоса на динамику накопления

лектина и содержание фигогормонов в развивающихся зерновках пшеницы // Физиол. и биохимия культ, раст.- 1994,- Т.26, N1,- С.40-45.

6. Shakirova F.M., Bezrukova M.V. Cytokinin effect on lectin and ABA content in wheat seedlings // Abstracts 9-th Congress of the Federation of European Societies of Plant Physiology. Bmo, Czech Republic, July 3-8, 1994 II Biologia Piantarum, 1994,- V.36 (suppl).- S.38.

7. Шакирова Ф.М., Безрукова M.B., Шаяхметов И.Ф. Влияние теплового стресса на динамику накопления АБК и лектина в клетках каллуса пшеницы П Физиол. раст.- 1995.- Т.42, N5.- С.700-702.

8. Shakirova F.M., Bezrukova M.V., Bokebaeva G.A. The influence of brassinolide on WGA and ABA level in wheat roots // Abstract of Annual symposium of physical-chemical basis of plant physiology. 5-8 February, 1996, Penza.- Pushchino, 1996.- P.56.

9. Shakirova F., Maximov 1., Bezrukova M., Khairullin R., Vakhitov V. Dynamics of ABA and WGA level in developing wheat kernels under infection by Septoria nodorum Berk. // Abstracts 10-th of the Federation of European Societies of Plant Physiology, Florence, Italy, September 9-13, 1996. From molecular mechanisms to the plant: an integrated approach// Plant Physiology and Biochemistry, Special issue, 1996,- P.287.

10. Shakirova F.M., Bezrukova M.V., Bokebaeva G.A., Khripach V.A. The comparative analysis of lectin and ABA content in roots of wheat seedlings under the action of epibrassinolide and salinity // International symposium on stress and inorganic nitrogen accumulation & the 2-nd FOHS biostress symposium. 17-21-st September, 1996, Moscow.- K.A.Timirjazev Institute of Plant Physiology, Moscow, 1996,- P.96.

11. Shakirova F.M., Bezrukova M.V., Shajakhmetov I.F. Effect of temperature shock on the dynamics wheat germ agglutinin accumulation in wheat cell culture // Plant Growth Regulation.- 1996,- V.19, N1- P.85-87.

12. Безрукова M.B., Шакирова Ф.М. Влияние экзогенной обработки фитогормонами на динамику содержания лектина и абсцизовой кислоты в ходе прорастания семян пшеницы // Известия РАН. Серия биологическая.- В печати.