Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

МЕХАНИЗМЫ ЗАЩИТНОГО ДЕЙСТВИЯ АГГЛЮТИНИНА ЗАРОДЫША ПШЕНИЦЫ НА РОСТОВЫЕ ПРОЦЕССЫ РАСТЕНИЙ ПШЕНИЦЫ

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "МЕХАНИЗМЫ ЗАЩИТНОГО ДЕЙСТВИЯ АГГЛЮТИНИНА ЗАРОДЫША ПШЕНИЦЫ НА РОСТОВЫЕ ПРОЦЕССЫ РАСТЕНИЙ ПШЕНИЦЫ"



На правах рукописи

Кильлибекови Алсу Ринатовна

МЕХАНИЗМЫ ЗАЩИТНОГО ДЕЙСТВИЯ АГГЛЮТИНИНА ЗАРОДЫША ПШЕНИЦЫ НА РОСТОВЫЕ ПРОЦЕССЫ РАСТЕНИЙ

ПШЕНИЦЫ

03.00.12. • физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

УФА - 2005

Работа выполнена в Институте биохимик и генетики Уфимского научного центра Российской Академии наук.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

Фарида Миниихановна Шакирова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Лидия Валентиновна Ковалева; доктор биологических наук, профессор

Рам иль Магзинурович Хайруллин

Ведущая организация:

Казанский государственный университет

Защита состоится « 40 »

Д 212.013.11 п.

. ,.?005 года в « часов на заседании

диссертационного совета д 212,013.11 по защите диссертаций на соискание ученой степени кавдидата биологических наук при Башкирском государственном университете по адресу: 450074, г. Уфа, ул. Фрунзе, 32, биологический факультет БашГУ,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Башкирского государственного университета.

Автореферат разослан « ^ я ууу^Д, А1.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор Г .Г. Кузяхметов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Агглютинин зародыша пшеницы (АЗП) является типичным представителем лекгинов злаков, физико-химические и биологические свойства которого достаточно хорошо охарактеризованы [Chrispeels, Raikhel, 1991; Raikhet, et al., 1993; Rudiger, 1997; Rudiger, Gabius, 2001; Шакирова, 2001], однако его функциональная значимость до сих пор дискутируется в литературе [Rudiger, Gabius, 2001; Антонюк, Игнатов, 2001; Шакирова, 2001; Bezverkhova et al., 2002]. В связи с тем, что этот белок обладает специфичностью к N-ацетил-Д-глюкозамину (GlcNAc), к числу функций, которые он реально может выполнять в растениях пшеницы, относится защита от фитопатогениых грибок [Mirelman et al., 1975; Chrispeels, Raikhel, 1991; Ciopraga et al., 1999; Шакирова, 2001]. Вместе с тем, имеются данные об индукции АБК-опосредуемого накопления АЗП в растениях пшеницы в ответ на воздействие засухи, осмотического шока, засоления, гипертермии [Carnrnue et al., 1989; Шакирова и др., 1993; 1995; Shakirova et al„ 1996; Singh et al., 2000], что дает основание предполагать возможность участия лектнна пшеницы в защите растений от неблагоприятных факторов среды также и абиотической природы, однако, в данном случае не ясно, в чем проявляется его антистрессовый эффект. В связи с тем, что АЗП в растениях пшеницы преимущественно синтезируется и аккумулируется в меристематических тканях [Mishkind et al., 1 982; Raikhel et al., 1984; Stinissen et al., 1985; Cammue et al., 19S9], можно предполагать участие этого белка в регуляции деления клеток, Б пользу этого предположения свидетельствуют данные об активации экспрессии гена АЗП и накоплении этого белка в растениях пшеницы под влиянием индолилуксусной (ПУК) и гибберелловой кислот, 24-эпибрассинолида, цитокинина 6-бензиламинопурина [Шакирова и др., 2000; Авальбаев и др., 2001; Безрукова и др., 2001; Shakirova et al., 2001; Шакирова и Др., 2002], играющих, как известно, важную роль в стимуляции ростовых процессов растений.

Действительно, полученные к началу нашей работы данные о стимулирующем действии АЗП на рост клето! и

[Авальбаев, 2001], указывают на вовлечение АЗП в сигнальную регуляцию ростовых процессов клеток. Далее важно было исследовать, что лежит в основе ростстимулирующей активности лектина, ограничивается ли это свойство АЗП только растениями пшеницы или он может проявлять его и на других видах растений. Следует отметить, что АЗП обладает способностью экскретпроваться в окружающую среду [Mishkind et al, 1982; Cammue et al., 1989], но не ясно, какое значение это свойство лектина может иметь для роста клеток пшеницы. В связи с тем, что к числу характерных ответных реакций растений на повреждающие факторы среды относится торможение роста [Schuppler et al., 1998; Lin, Kao, 2001; Колес, Онсел, 2004], встает вопрос, способен ли пектин оказывать защитное действие на ростовые процессы клеток корней в стрессовых условиях.

Цель и задачи исследований. Цель данной работы состояла в выяснении механизмов ростстимулирующего, а также защитного действия АЗП на ростовые процессы клеток корней проростков пшеницы при воздействии засоления и гипотермии. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1) изучить роль гормональной системы в реализации действия АЗП на рост клеток корней проростков пшеницы делением и растяжением в норме и при стрессе;

2) сопоставить характер количественных изменений в уровне лектина в корнях проростков пшеницы с динамикой экскреции этого белка в окружающую среду в стрессовых условиях;

3) провести анализ влияния АЗП на рост клеток корней ячменя (эволюционно близкий пшенице вид) и фасоли (эволюционно отдаленный вид) для оценки проявления ростстимулирующего действия АЗП на разных видах растений;

4) исследовать влияние АЗП на про- и антиоксиданткый статус растений пшеницы при засолении;

5) в системе in vitro оценить способность АЗП к связыванию с фитогормонами методом иммуноанализа с использованием тест-систем, специфичных для каждого из исследуемых компонентов.

Научная новизна. Выявлено, что в основе действия АЗП на рост клеток корней проростков пшеницы в нормальных и стрессовых условиях лежат вызванные обработкой пектином сдвиги в гормональном балансе. Показано, что ростстнмулирующее свойство АЗП не является универсальным для различных видов растений. Получены приоритетные данные о проявлении АЗП свойства антиоксиданта, которое основывается на снижении под влиянием предобработки АЗП уровня продукции активных форм кислорода, перекисного окисления липидов, экзоосмоса электролитов в условиях засоления среды. Впервые показана принципиальная способность АЗП к связыванию с фитогормонами, не затрагивая углевод-связывающие сайты лектина. Практическая значимость работы. Совокупность полученных результатов свидетельствуют о наличии у АЗП антиоксидантного и ростстимулирующего свойств, имеющих важное значение в проявлении защитного действия этого лектина на растения пшеницы & стрессовых условиях, что дополняет и расширяет наши знания о естественных механизмах устойчивости растений. Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на XIII и XIV конгрессе FESPB (Heraklion, 2002; Cracow, 2004); Европейской конференции «Устойчивость растений к стрессовым факторам» (Vama, 2002); II Международной конференции по анатомии и морфологии растений (Санкт-Петербург, 2002); международной научной конференции «Экологическая ботапика: наука, образование, прикладные аспекты» (Сыктывкар, 2002); V съезде Общества физиологов растений России (Пенза, 2003). Публикации, По материалам диссертации опубликовано 12 работ. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения и выводов. Работа изложена на 137 стр. и

б

иллюстрирована 31 рисунком. Список литературы включает 309 наименований, в том числе 225 - на иностранных языках.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объектом исследования служили растения пшеницы Triticum aestivum L. сорта Саратовская 29, ячменя Hordeum vulgare L. сорта Первенец и фасоли Phaseolus vulgaris L. сорта Горналь, Семена проращивали в кюветах на фильтровальной бумаге, смоченной водопроводной водой, при 21-23°С, 16-часовом фотопериоде и освещенности 12 клк в течение 3-х суток, после чего проростки после изоляции от эндосперма помещали на раствор 2% сахарозы в качестве питательного субстрата. Все опытные растворы готовили также на основе 2%-ной сахарозы. АЗП, ФГА, Кон А и глиадин использовали в концентрации 1 мг/л, NaCl - в концентрации 2%. С целью изучения защитного влияния АЗП (ja растения пшеницы при засолении использовали два варианта опытов: 1) 3-суточные проростки обрабатывали раствором АЗП в течение 24 ч, после чего переносили на 7 ч в раствор NaCI, а затем после отмывки от соли помещали в раствор 2%-ной сахарозы на сутки; 2) 4-суточные проростки подвергали воздействию NaCl в течение 7 ч, а затем переносили в раствор АЗП на 24 ч. Для анализа влияния АЗП на рост клеток корней ячменя при засолении 3-суточные проростки подвергали воздействию NaCl в течение 7 ч, затем проростки переносили на раствор АЗП на 24 ч. В опытах с растениями фасоли брали 6-суточные проростки, которые инкубировали в растворе АЗП в течение 24 ч. Контролем во всех опытах служили проростки, инкубированные на растворе 2%-ной сахарозы. С целью изучения защитного влияния АЗП на растения пшеницы при воздействии гипотермии также проводили два варианта опытов: 1) 3-суточные проростки обрабатывали раствором АЗП в течение 24 ч при температуре 21-23вС, после чего 4-суточные растения переносили на 24 ч в раствор 2%-ной сахарозы в холодную камеру с фотопериодом 16 ч при температуре 775°С. После 24 ч воздействия холодового стресса 5-суточные растения возвращали в нормальный температурный режим. Контрольные проростки все время находились при температуре 21-23"С. В ходе воздействия

холода часть корней проростков пшеницы фиксировали в жидком азоте для определения содержания АЗП и АБК. 2) 4-суточные проростки подвергали воздействию гипотермии в течение 24 ч, после чего 5-суточные растения 24 ч выдерживали в растворе АЗП, а затем б-суточные проростки переносили в раствор 2%-ной сахарозы на 21 -23 "С и выдерживали еще сутки.

Через определенные промежутки времени интактные проростки и отдельно их корни фиксировали для определения различных параметров, а также отбирали аликвоты среда инкубирования.

Количественную оценку свободных АЬК, ИУК, нммунореактнвных к сыворотке против зеатинрибозида форм цитокининов (ЦК), а также АЗП проводили в одной и той же растительной навеске методом непрямого имму ноферментного анализа с использованием специфичных к каждому из перечисленных соединений кроличьих антител и меченных пероксидазой антикроличьих антител. Процедура этапов последовательного экстрагирования фитогормонов, лектина и их иммуноанализа описана ранее [Кудоярова и др., 1990; Шакирова и др., 1994].

Генерацию Ог* определяли акцепторным методом согласно [МинЪауеуа а! а!., 2001]. Активность СОД определяли по его способности конкурировать с нитросиним тетразолием за О1" [Чевари и др., 1985],

Концентрацию перекиси водорода оценивали по окислению ОФД [Хайруллин и др., 2001]. Тотальную активность пероксидазы определяли согласно [Малый практикум по физиологии растений, 1994; Юсупова, 2000].

Содержание малонового диальдешда (МДА) - конечного продукта лерекисного окисления липидов (ПОЛ) определяли согласно [Малый практикум по физиологии растений, 1994]. О проницаемости клеточных мембран проростков пшеницы судили по эюоосмосу электролитов, измеряя омическое сопротивление водных экстрактов в постоянном токе [Талиева и др. 2002].

Митотическую активность клеток апикальной меристемы (не менее 3000) и площадь клеток в зоне растяжения корней (не менее 500) оценивали

s

цитологическими методами с использованием окуляр-микрометра [Паушева, I98SJ.

С целью проведения биохимических и цитологических анализов использовали интактные проростки, изолированные корни или отрезки корней, соответствующие зонам деления и растяжения [Данилова и др., 1&90], Каждая растительная навеска содержала не менее 10 растений.

Опыты проводили не менее чем в трех биологических повторах и чегырех-пяти аналитических повторностях. В иллюстрациях представлены средние арифметические значения и ошибки средних.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Механизмы ростстиму л и ру ющего действия АЗП. Анализ влияния АЗП и других фитолектинов, для которых показана мнтогенная активность, ФГА и Кон А [Марков, Хавкнн, 1983; Л ахти н, 1986; Mirkov, Chnsp^clst 1993; Lens ct

at, 1998; Zhao et al„ 2001], показал, что максимальный стимулирующий эффект на рост клеток корней проростков пшеницы делением и растяжением наблюдался при использовании АЗП (рис. 1). Этот лектин за сутки воздействия привел к существенному увеличению митотнческого индекса клеток апикальной меристемы и площади клеток в зоне растяжения корней проростков. ФГА и Кон А не проявили такого аффекта на ростовые процессы клеток.

Рис. I. Влияние обработки 1 мг/л фитолектинов и глиадина на рост клеток корней 4-суточных проростков пшеницы.

а - митотичееккй индекс (МИ), б - площадь (Б) клеток

Птиалин, запаской белок зерновок пшеницы, который мы использовали в качестве альтернативного лектинам белка (не лектина) не оказал никакого влияния на деление и растяжение клеток корней проростков (рис. 1).

Известно, что важную роль в регуляции роста растений играют фитогормоны, поэтому в связи с выявленной ростстимулирующей активностью АЗП можно было ожидать его способность активно воздействовать на гормональный статус корней проростков пшеницы. Действительно, обработка проростков этим белком приводит к существенным сдвигам в содержании ИУК, ЦК и АБК в корнях в сторону их транзитного накопления (рис. 2). Несмотря на то, что АЗП вызывал накопление АБК, которая в целом рассматривается в качестве ингибитора ростовых процессов, важный вклад в про* явление рост-стимулирующего действия АЗП, по-видимому, вносит практически одновременное накопление под влиянием этого лектина гормонов - активаторов роста растений — ЦК и ИУК. Не вызывает удивления факт отсутствия влияния ФГА и Кон А на динамику содержания исследованных гормонов, с чем, вероятно, и связано отсутствие действия ФГА и Кон А на ростовые процессы клеток проростков Рис 2. Влияние АЗП на динамику

пшеницы. Это справедливо и в содержания гормонов ИУК (а), ЦК (б),

АБК (в) в корнях 4-суточных проростков пшеницы

отношении глиадина (рис. 2), Полученные данные указывают на ярко выраженный роететимулирующий эффект АЗП на клетки растений пшеницы, который является для него специфичным.

Обсуждая результаты наших опытов, необходимо подчеркнуть, что АЗП - белок, характерный для растений пшеницы, в то время как ФГА и Кон А, характеризующиеся митогенными свойствами в модельных системах, являются лектинами фасоли и канавалии, соответственно, и значительно отличаются от АЗП по углевод-связывающнм и другим характеристикам [Королев, 1984]. Поэтому не удивительно, что из всех тестированных в опытах пектинов именно АЗП, являющийся «своим» для растений пшеницы, оказывает ростстимулирующее действие на их клетки, обусловленное его влиянием на гормональный статус растений, что свидетельствует о совместном с фитогормонами участии АЗП в регуляции ростовых процессов растений пшеницы.

Взаимодействие АЗП с фитогормонами. Поскольку местом преимущественного синтеза и аккумуляции АЗП в растениях являются меристематические ткани корней и основания стебля, в числе предполагаемых функций лектина пшеницы обсуждается его участие в регуляции деления клеток [Королев, 1984]. В связи с полученными нами данными о вовлечении АЗП в сигнальную регуляцию ростовых процессов клеток, можно было предположить возможность взаимодействия этого лектина с фитогормонами. В пользу этого предположения свидетельствуют данные о способности Кон А связываться с ауксином [Edelman, Wang, 1978; Rudiger, 1997] и лектинов бобовых - с гормонами цитокинининовой природы [Roberts, Goldstein, 1983; Maliarik et al„ 1987; Bouckaert et al., 1999; Hameliyck et at., 1999]. Причем во взаимодействие лектинов бобовых с ЦК вовлекаются центры гидрофобного связывания, не затрагивая углевод-связываюшие домены белков [Roberts, Goldstein, 1983; Rudiger, 1997; Bouckaert et al., 1999], посредством чего эти лектины могут оказывать воздействие на состояние гормональной системы в целом и, таким образом, регулировать рост и развитие растений [Hameliyck et

а)., 1999). Возможно, что и АЗП может обладать центрами гидрофобного связывания, с помощью которых он мог бы также связывать фитогормоны. Поэтому далее важно было провести работу по принципиальной оценке способности АЗП к взаимодействию с гормонами, например, ИУК и цитокинином зеатином {7.).

С этой целью мы использовали иммунологические тест-системы для количественной оценки АЗП, ИУК и ЦК с использованием полученных к этим соединениям кроличьих антител и антнкроличьих антител, меченных пероксидазой (ПК), процедура иммуноферментного анализа (ИФА) которых детально описана ранее в следующих работах: для АЗП [Хайруллин и др., 1992}, для ИУК [Ямалеев и др., 1989], для ЦК [Кудоярова и др., 19901.

Рис. 3. Иммуноанзлиз к росс-реактивности АЗП и фитогормонов. а и в - иммунологические тест - системы на АЗП; б - иммунологическая тест - система на 2; г - иммунологическая тест - система на ИУК.

Контролем (100%) служили чистые образны АЗП, Ъ и ИУК в исходно взятых количествах из расчета 100 иг на лунку планшета

Использование иммуноанализа позволяет регистрировать изменения исходно взятых количеств этих соединений в систему in vitro. Для оценки изменения в результате связывания с гормонами количества АЗП в пробирки приливали по 1 мл фосфатно-солевого буфера, рН 7.4, содержащего 0.05% твин-20 (ФТ) и 0,5% овальбумин, в котором растворяли по 1 мкг АЗП и по 0, или I, или 2, или 4 мкг ИУК или Z. Смесь инкубировали 1 ч при 37°С. После этого в лунки пол «стиролового планшета, предварительно сенсибилизированного АЗП, приливали по 100 мкл смеси, так что на каждую лунку приходилось по 100 иг АЗП, и по 100 мкл антн-АЗП сыворотки. Затем планшеты выдерживали в течение 1 ч при 37°С, после чего планшет тщательно промывали трижды ФТ и в лунки приливали ПК. Далее процедуру ИФА АЗП проводили согласно [Хайруллнн и др., 1992], Из рис. За видно, что при возрастании доз Z, взятых в смесь с АЗП, количество промеряемого в ИФА лектина в проценте от контроля последовательно снижалось. Тест-система на Z позволяет регистрировать изменение исходно взятого количества Z из расчета 100 иг на лунку в результате его взаимодействия с АЗП а возрастающих количествах, так что в расчете на лунку приходилось по 0, 100, 200 или 400 иг. Процедура инкубации смеси АЗП с гормоном и последующие операции проводили так же, как описано абзацем выше. ИФА ЦК проводили согласно [Кудоярова и др., 1990]. Из рис. 36 видно, что при увеличении количества АЗП в смеси с одним и тем же исходно взятым количеством Z наблюдается постепенное уменьшение его регистрируемого количества.

Аналогичные результаты получены и при анализе взаимодействия АЗП с ИУК (рис. З в и г), что указывает на принципиальную способность АЗП связывать фнтогормоны.

С целью проверки специфичности взаимодействия фитогормонов именно с лектином, нами были проведены опыты, в которых фнтогормоны вместо АЗП инкубировали с глиадином в разных разведениях. Глиадин, использованный в тех же дозах, что и АЗП, не изменял регистрируемые ИФА количества Z и

ИУК, что указывает на специфичность взаимодействия АЗП с фитогормонами (данные приведены в диссертации).

Специфичный к АЗП углевод GlcNAc, использованный в разных разведениях, не влиял на характер взаимодействия АЗП с Z и ИУК, поскольку его присутствие в среде инкубации АЗП с фитогормонами не предотвращало уменьшение промеряемого в ИФА количества каждого из гормонов после инкубирования с лектияом, Эти данные свидетельствуют о том, что взаимодействие АЗП с гормонами может осуществляться по аналогии с лектиком бобовых посредством сайтов гидрофобного связывания.

Таким образом, данные о сродстве АЗП с ЦК и ИУК позволяют предполагать важную роль этого лектина в регуляции количественного уровня фитогормонов в растениях и, следовательно, в регуляции процессов роста пшеницы.

Влияние АЗП на интенсивность ростовых процессов клеток корней других растений. Участие АЗП в регуляции ростовых процессов растений пшеницы вполне понятно, поскольку он является для этих растений эндогенным белком. Вероятно, именно этим обусловлено отсутствие заметного эффекта на рост клеток корней пшеницы чужеродных для пшеницы лектинов, ФГА и Кон А (рис. 1). В связи с этим встает вопрос, а способен ли АЗП проявлять ростстимулирующее свойство в растениях других видов, ддя которых он не является собственным лектияом. Результаты опытов показали, что обработка 3-е уточных проростков ячменя в течение 24 ч АЗП привела к стимуляции

в 1 а

г ЗЙр:

Контроль АЗЛ

Рис. 4. Влияние обработки АЗП на МИ меристе магически к клеток корней 4-суточных проростков ячменя (а) и 7-суточных проростков фасоли (б)

ростовых процессов клеток корней растений ячменя в той же мере, как и растений пшеницы (рис. 4а), что, вероятно, обусловлено высокой степенью гомологии лектинов ячменя и пшеницы, а также ряда лектинов других злаков [Peuroans, 1984].

Обработка 6-суточных проростков фасоли АЗП в течение 24 ч не выявила стимуляции деления клеток апикальной меристемы корней (рис. 46), что, вероятно, связано с тем, что использованная система является строго гетерогенной для этого белка (также как и ФГА, и Кон А для растений пшеницы). Следовательно, АЗП проявляет свое ростстимулирующее действие на клетки пшеницы, для которых он является эндогенным белком, или на клетки эволюционно близких растений (ячмень). Справедливость этого заключения подтверждают полученные нами данные о проявлении ростстимулирующего свойства ФГА в эндогенной для него системе -проростках фасоли. Так, обработка проростков фасоли ФГА приводила к увеличению митотической активности клеток апикальной меристемы корней почти на 50%,

Механизмы защитного действия АЗП на растения пшеницы. В связи с тем, что многократному увеличению уровня лектина в растениях пшеницы в стрессовых условиях предшествует накопление АБК, было сделано заключение О том, что АЗП является участником АБК-контролируемых антистрессовых реакций [Шакирова, 2001]. Вместе с тем, механизмы защитного действия АЗП на растения еще далеки от ясности. Полученные нами результаты позволили обосновать ростстимулирующее свойство АЗП на клетки корней проростков пшеницы. Далее важно было исследовать, проявляет ли он это свойство на клетки корней проростков при неблагоприятных воздействиях среды.

В связи с тем, что интенсивный синтез и аккумуляция АЗП наблюдается в меристематических тканях пшеницы, кроме того, он является экскретируемым белком [Сазшпие et а!., 1989], можно было предположить, что это может играть определенную роль в защите клеток апикальной меристемы корней от

повреждающего действия стрессовых факторов. Проверке этого предположения посвящен данный раздел работы.

Гипотермия. Изменение температурного режима растений относится к числу наиболее распространенных неблагоприятных воздействий среды. Имеются данные об активации геммагдютинирующей активности лектинов растений пшеницы в ответ на низкую температуру [Тимофеева и др., 1999], однако нам представлялось важным провести оценку количественных изменений АЗП в корнях в условиях гипотермии. Как видно (рис. 5), низкая положительная температура вызывает АБК-опо-

>5 О

О. *

X <

0.5

0,1

ЗЛбк -лап

■ 120.1

/

Л

№

■ 40

1 § I §

С

(О <

2 3.5 5 Г 9 Время, ч

I

§

300

200 -

« ^ 5 < ^ ^ 100

я

средуемое существенное транзитное накопление АЗП. Снижение содержания лектина в корнях сопровождается многократным возрастанием его уровня в среде инкубирования проростков. Можно думать, что этот факт имеет значение для защиты роста клеток корней в условиях гипотермии. Предобработка проростков АЗП не предотвращает ингибирующий эффект низкой температуры на рост клеток делением и растяжением, но поддерживает его на уровне близком к контролю (рис. б), что, вероятно, обусловлено значительно более высокими показателями роста клеток корней

в этом варианте опыта до стрессового воздействия. После удаления стрессора активность ростовых процессов постепенно восстанавливается, однако интенсивность этих процессов в клетках корней предобработанных АЗП

4 СУТ 0-7ч(

5сут 7.24ч (

6 еут 0-Й4ч

Рис, 5. Влияние гипотермии на динамику содержания АБК и АЗП в корнях 4-суточных проростков пшеницы (а) и выход АЗП в среду инкубирования проростков (б)

проростков заметно выше в сравнении с необработанными лектнном проростками (рис. 6).

5-

3

2 3-і

□ Контроль О

ж

24

шт

Время, су?

Рис, 6, Влияние предобработки АЗП и гипотермии на рост клеток корней проростков пшеницы. 3-суточные проростки инкубировали в растворе АЗП в течение 24 ч, после чего переносили на среду без АЗП и подвергали холодовому стрессу в течение 24 ч. а - м«готический индекс; б - площадь клеток

4.5

^э.5 з:

1,3

с Контроль-МП

вт*мп

6 7

Время, суг

6 7

время, суг

Рис. 7, Влияние обработки АЗП на рост клеток корней проростков пшеницы после воздействия гипотермии. 4-суточные проростки переносили на 7°С на 24 ч, после чего возвращали на нормальный температурный режим и обрабатывали АЗП в течение 24 ч. а - митогическнй индекс; б - площадь клеток

В другом варианте опытов мы обрабатывали проростки АЗП сразу после гипотермии (рис. 7). Как видно, обработка подвергнутых воздействию низкой температуры проростков пшеницы АЗП ускоряет репарацию ростовых процессов клеток корней.

Полученные результаты указывают на возможность вовлечения АЗП в защиту растений пшеницы от низкотемпературного стресса, что проявляется в снижении степени повреждающего действия стрессового фактора на рост

т™- ж 4,5- |е 11 - С а 1.5 3 в о Контроль

«V к

0 4 в 12 16 Время, ч

клеток корней и ускорении относительно необработанных лектином растений восстановления интенсивности ростовых процессов в пост-стрессовый период. Засоление. Засоление среды также индуцирует обратимое накопление АЗП в корнях проростков и последующий выход этого белка в окружающую среду (рис.8), что может играть важную роль в защите ростовых процессов клеток корней и от действия ЫаС1. Засоление вызывает сильное торможение деления клеток апикальной меристемы корней. Несмотря на то, что предобработка АЗП в течение суток не предотвращала стресс-индуциро-ванного ингибирования роста клеток, МИ клеток корней предобработанных АЗП растений был не ниже контрольного значения (рис. 9а). Вместе с тем, в отличие от растений, подвергнутых гипотермии, которые через сутки после стресса практически восстанавливали интенсивность

1100 I 650

в> те X

£ И»

3 100

4«ут

0-7 ч №С!

П

5еут

24 ч после

веут

43 ч после

Рнс. 8. Динамика содержания АЗП в корнях 4-суточных проростков пшеницы в условиях засоления среды (а) и в окружающей среде после действия на проростки 2%-ного №С1 в течение 7 ч (б)

Рис. 9. Влияние АЗП и засоления на митотическую активность клеток апикальной меристемы корней проростков пшеницы, а - предобработка АЗП в течение суток и последующее воздействие 2%-ного ЫаС! в течение 7 ч; б - обработка АЗП после 7-часового воздействия 2%-ного ЫаС1

ростовых процессов, в случае засоления показатель роста клеток через сутки после удаления 2%-ного КаС1 из среды возрастал не намного в обоих вариантах с предобработкой и без обработки АЗП, Это скорее всего связано с тем, что засоление является не только фактором, нарушающим водный статус растений, но и, по-видимому, даже в большей мере, вызывающим токсический эффект на растения [Строганов, Лапина, 1964],

Предобработка АЗП также не предотвращала торможение роста клеток корней растяжением, однако, этот показатель, как и в случае анализа МИ, соответствовал контрольному значению. Вместе с тем, поддержание при засолении интенсивности ростовых процессов клеток корней пшеницы вследствие предобработки АЗП на уровне контроля указывает на защитный эффект лектина на растения.

Обработка проростков АЗП в течение суток в пост-стрессовый период, способствует ускорению репарации ростовых процессов клеток корней, о чем свидетельствуют данные по увеличению митотической активности клеток апикальной меристемы (рис. 96), Это справедливо также и в отношении роста клеток корней растяжением.

Рис. 10. Влияние предобработки Таким образом, выявленный нами

АЗП на динамику содержания , ______________лг>гт

АБК (а), ИУК (б) и ЦК (в) в ^ тРанзитного накош1ения АЗП в

корнях 4-суточных проростков корнях в условиях гипотермии и засоле-пшеницы в ходе воздействия

2%-ного ЫаС1 ния и последующей экскреции этого

белка в окружающую среду может иметь важное значение для восстановления митотического потенциала и интенсивности роста клеток корней проростков пшеницы растяжением.

В основе защитного действия обработки АЗП на рост клеток при стрессе и в пост-стрессовый период лежит его способность активно влиять на состояние гормональной системы растений. Это положение иллюстрируется данными анализа количественных изменений АБК, ПУК и ЦК в корнях проростков, подвергнутых обработке АЗП и воздействию засоления, приведенными на рис. 10 и 11.

Предобработка АЗП предотвращала стресс-индуцированное накопление АБК и снижение уровня ИУК и ЦК (рис. 10), тем самым способствовала поддержанию гормонального баланса на уровне близком контролю. Такие изменения в состоянии гормональной системы отражаются в нормализации под влиянием предобработки АЗП показателей роста клеток корней. Обработка проростков АЗП в пост-стрессовый

период способствует ускорению увеличению содержания гормонов -активаторов роста, ИУК и ЦК по сравнению с необработанными (рис. 11),что лежит в основе выявленного нами эффекта АЗП на ускорение репарации

Рис. 11. Влияние предобработки 2% ЫаС1 (7 ч) на динамику содержания АБК (а), ПУК (б) и ЦК (в) в корнях 4-суточных проростков пшеницы при последующем воздействии АЗП

ростовых процессов. Совокупность полученных данных указывает на важную роль АЗП в сигнальной регуляции ростовых процессов клеток проростков пшеницы, имеющее большое значение для растений в нормальных условиях произрастания и, особенно, при воздействии стрессовых факторов среды. Влияние АЗП на про-/антноксидантну ю систему растений пшеницы при засолении. Известно, что стрессовые факторы смещают прооксидантно-антиоксидантное равновесие в клетках растений, что связано с усилением под их влиянием продукции активных форм кислорода (АФК) и активности антиоксидантных ферментов [Рагтат е1 а!., 2004]. Поэтому не удивительно, что инкубирование 4-суточных проростков в среде, содержащей 2%-ный №С1, приводило к значительному возрастанию концентрации Ог' и Н^Ог в корнях проростков пшеницы, а также активации суперокснддисмутазы (СОД) и пероксидазы (рис, 12). Полученные данные указывают на то, что засоление в растениях индуцирует окислительный стресс, резко повышающий уровень перекисного окисления липидов (ПОЛ), о котором можно судить по концентрации малонового диальдегида (МДА) - конечного продукта ПОЛ (рис. 12). Усиление ПОЛ при стрессе приводит к нарушению целостности мембранных структур клеток и, следовательно, к изменению их проницаемости [Ьерппсе е1 а5., 2000]. Действительно, о силе повреждающего эффекта засоления на целостность мембран клеток свидетельствуют данные о резком увеличении выхода электролитов из тканей (рис. 12) по сравнению с контролем.

Полученные результаты указывают на дисбаланс прооксидантной и антиоксидантной системы в проростках пшеницы при воздействии засоления среды, свидетельствующий о том, что КаС1 в использованной концентрации является сильным стрессором, приводящим к повреждению целостности клеточных структур, что приводит к торможению ростовых процессов.

Предобработанные АЗП проростки в условиях засоления характеризовались заметно меньшим уровнем Ог* и НгОг и, соответственно, меньшей активностью супероксидансмутазы и пероксидазы в сравнении с

необработанными (рис. 12). В предобработанных АЗП проростках уровень ПОЛ также снижен, что отражается в значительном уменьшении экзоосмоса электролитов (рис, 12).

в

время обработки 3 ч

190

160

<30

100

(АЗП)» ¿%№С1 (МП)*МаС1

Время обработки 24 ч

220

160

140 -

I* £

(АЗП)

г* то (*эп|-ч*а

Время обработки 3 ч

Рис. 12. Влияние предобработки АЗП и засоления на генерацию супероксид-аниона (а), активность СОД (б), продукцию перекиси водорода (в), активность перокскдазы (г), уровень ПОЛ (д) к экзоосмос электролитов (е) в 4-суточных проростках пшеницы

Следовательно, о защитном действии предобработки АЗП

свидетельствуют полученные данные о снижении уровня вызванного

засолением нарушения состояния антиоксидантной системы, что, вероятно, вносит важный вклад в нормализацию ростовых процессов в стрессовых условиях.

На рис. 12 приведены данные о влиянии суточной предобработки АЗП, которая, как видно, не остается безразличной для растений пшеницы. Об этом свидетельствуют данные о некотором увеличении в нормальных условиях продукции супероксид аниона, активности СОД и экзоосмоса электролитов. Однако, очевидно, что такие изменения вследствие предобработки АЗП не являются повреждающими, судя по его влиянию на ярко выраженную активацию ростовых процессов клеток. Вместе с тем, они могут служить показателями предадаптирующего к возможным стрессовым ситуациям действия АЗП, важную роль в котором, вероятно, играет транзитное накопление АБК (рис. 2 в), участвующей в запуске в растениях широкого спектра защитных реакций. К ним, в частности, можно отнести СОД, синтез которой контролируется АБК [Sakamoto et al., 1995].

Следовательно, АЗП может участвовать в регуляции активности антиоксидантных ферментов, действие которых направлено на снижение генерации АФК при стрессе. В то же время, незначительная генерация О/ может иметь важное значение в запуске каскада защитных реакций в растениях [Desikan et al., 2001; Тарчевский, 2002; Чиркова, 2002], что, таким образом, также является показателем предадаптирующего действия АЗП.

Совокупность полученных результатов позволяет заключить, что четко выраженный стимулирующий и защитный эффект АЗП по отношению к гипотермии и засолению на ростовые процессы клеток корней проростков пшеницы тесно связан с его влиянием на состояние гормональной системы. Можно предполагать, что определенное значение в этом может играть выявленная нами способность АЗП в системе in vitro взаимодействовать с ИУК и цитокинином. Выявлено, что важный вклад в проявление предадаптирующего действия АЗП на растения пшеницы к последующим стрессовым воздействиям

может вносить его антиоксидантный эффект. Таким образом, в работе получены экспериментальные доказательства наличия у АЗП свойств ростстимулятора и антиоксиданта, имеющих важное значение в проявлении этим лектином защитного действия на ростовые процессы растений пшеницы.

ВЫВОДЫ

1) Впервые показано, что АЗП вызывает перестройки в гормональной системе растений пшеницы, связанные с транзитным накоплением АБК, ИУК и цитокиников, что лежит в основе его ростстимулирующего действия на клетки корней.

2) Обнаружено, что АЗП проявляет ростстимулирующий эффект на клетки растений ячменя, сопоставимый с растениями пшеницы (эволюционно близкие виды), и не проявляет его в растениях фасоли (эволюционно отдаленный вид).

3) Впервые выявлено, что гипотермия вызывает в корнях проростков пшеницы резкое, АБК-опосредуемое накопление АЗП, сопровождающееся экскрецией этого белка в окружающую среду. Обработка АЗП снижает степень стресс-индуцированного торможения роста клеток корней делением и растяжением и ускоряет репарацию ростовых процессов после воздействия гипотермии,

4) Получены приоритетные данные о роли гормональной системы в регуляции под влиянием АЗП роста клеток корней проростков пшеницы в условиях засоления и в пост-стрессовый период.

5) Выявлено, что к механизмам защитного действия АЗП на растения пшеницы при засолении относится значительное снижение продукции АФК, перекисного окисления липидов, экзоосмоса электролитов, что отражается в нормализации интенсивности ростовых процессов проростков.

6) Методом иммуноанализа с использованием специфичных к АЗП, ИУК и зеатину тест-систем выявлена принципиальная способность АЗП связывать in vitro эти фитогормоны по независимым от углевод-связывающих центров сайтам.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Avalbaev A., Bezmkova М,, Kildibckova A., Fatkhutdinova R,, Shakirova F. WGA restores cell division and growth of wheat seedlings under salinity // European workshop on environmental stress and sustainable agriculture: Abstracts. Acad. M. Popov Institute of Plant Physiology. Varna, Bulgaria, 2002. P. 32.

2. Bezrukova M.V., Avalbaev A.M., Kildibckova A.R., Fatkhutdinova R.A., Shakirova F.M. Participation of WGA in 24-epibrassinolide-induced cell division in root meristem of wheat seedlings // ХП1 Congress of the FESPP: Abstracts, Heraklion, Greece, 2002, P. 249.

3. Безрукова M.B., Авальбаев A.M., Кильдибекова A.P., Фатхутдинова P.A., Шакнрова Ф.М. Взаимодействие пектина пшеницы и 24-эпибрассинолида в регуляции деления клеток корней пшеницы // Доклады АН. 2002. Т. 387, № 2. С. 276-278.

4. Безрукова М.В., Авальбаев А.М., Фатхутдинова Р.А., Кильдибекова А.Р„ Шакнрова Ф.М. Участие АЗП в активации деления корней проростков пшеницы под влиянием 24-эпибрассинолида // Труды II Международной конференции по анатомии и морфологии растений. Санкт-Петербург, 2002. С.217-218.

5. Безрукова MB., Авальбаев A.M., Фатхутдинова Р.А., Кильдибекова А.Р., Шакирова Ф.М. Защитный эффект лектина на рост проростков пшеницы при засолении среды II Межд, научная конф. «Экологическая ботаника: наука, образование, прикладные аспекты». Сыктывкар, Россия, 2002. С. 34-35.

6. Avalbaev А.М., Bezrukova M.V., Kildibekova A.R,, Fatkhutdinova R.A4 ShakirovaF.M. Wheatgermagglutminrestorescelldivision andgrowth ofwheat seedlings under salinity//Bulgarian Journal of Plant Physiology. Special issue. 2003. (Proceedings of the European workshop on environmental stress and sustainable agriculture, Varna, Bulgaria, 2002. Acad. M. Popov Institute of Plant Physiology). P. 257-263.

7. Безрукова M.B., Кильдибекова A .P., Авальбаев A.M., Шакирова Ф.М. Механизмы защитного действия АЗП на рост клеток корней проростков

пшеницы при засолении // Материалы V съезда Общества физиологов растений России. Пенза, 2003. С. 247.

8. Shakirova FJM., Kildibekova A.R., Bezrukova M.V., Avalbaev A.M. Wheat germ agglutinin regulates cell division in wheat seedling roots II Plant Growth Regulation. 2004. V. 42, N 2. P. 175-180.

9. Безрукова МЛ., Кильдибекова A.P., Авальбаев A.M., Шакирова Ф.М. Участие агглютинина зародыша пшеницы в регуляции деления клеток апикальной меристемы корней проростков II Цитология. 2004. Т. 46, № 1. С. 35-38.

10. Кильдибекова А.Р., Безрукова М.В., Авальбаев A.M., Фатхутдинова Р.А., Шакирова Ф.М. Механизмы защитного действия агглютинина зародыша пшеницы на рост клеток корней проростков пшеницы при засолении // Цитология. 2004. Т. 46, № 4. С. 312-316.

11. Кильдибекова А.Р., Авальбаев A.M., Безрукова М.В., Шакирова Ф.М. Оценка сродства АЗП с фитогормонами методом иммуноанализа / Итоги биологических исследований. Сборник научных трудов. Уфа; БашГУ, 2004. Вып. 8. С. 33-38.

12. Bezrukova M.V., Kildibekova A,R.,GimalovF.R., Shakirova F.M. WGA participates in protection of cells in wheat seedling roots in response to cold stress// XIV Congress of the FESPB: Abstracts. Cracow, Poland, 2004. P. 229.

Кильдибекова Алсу Ринатовна

МЕХАНИЗМЫ ЗАЩИТНОГО ДЕЙСТВИЯ АГГЛЮТИНИНА ЗАРОДЫША ПШЕНИЦЫ НА РОСТОВЫЕ ПРОЦЕССЫ РАСТЕНИЙ

ПШЕНИЦЫ

03.00.12 - физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Лицензия № 0177 от 10.06,96 г. Подписано к печати 27,12.2004 Бумага офсетная. Отпечатано на ризографа. Формат 60x84 Усл.-печ. л. 1,5, Уч.-иэд. 1,7. Тираж 100 экз. Заказ № 328,

450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3, Башкирский государственный медицинский университет