Многофазный характер концентрационной зависимости действия физиологически активных веществ на рост растений и устойчивость к фитопатогенам

Бабоша, Александр Валентинович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Многофазный характер концентрационной зависимости действия физиологически активных веществ на рост растений и устойчивость к фитопатогенам
ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Многофазный характер концентрационной зависимости действия физиологически активных веществ на рост растений и устойчивость к фитопатогенам"

На правах рукописи

БАБОША АЛЕКСАНДР ВАЛЕНТИНОВИЧ

МНОГОФАЗНЫЙ ХАРАКТЕР КОНЦЕНТРАЦИОННОЙ ЗАВИСИМОСТИ ДЕЙСТВИЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ НА РОСТ РАСТЕНИЙ И УСТОЙЧИВОСТЬ К ФИТОПАТОГЕНАМ

Специальность: 03. 01. 05 — Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

ПЗ АПР 2214

Москва - 2014

005546612

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина Российской академии наук (ГБС РАН)

Официальные оппоненты:

Аверьянов Андрей Александрович, доктор биологических наук, заведующий лаборатории биофизики, ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии Россельхозакадемии;

Балашова Ирина Тимофеевна, доктор биологических наук, заведующая лабораторией гаметных методов селекции, ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт селекции и семеноводства овощных культур Россельхозакадемии;

Дьяков Юрий Таричанович, доктор биологических наук, профессор Международного биотехнологического центра, ФГБОУ ВПО Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова,

Ведущая организация:

ФГБУН Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук

Защита состоится «24» июня 2014 г. в « 14 » часов « 30 » мин. на заседании диссертационного совета Д 220.043.08 при Российском государственном аграрном университете - МСХА имени К.А. Тимирязева по адресу: 127550, Москва, ул. Прянишникова, дом 15 (тел/факс 8(499)976-24-92)

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Н.И. Железнова Российского государственного аграрного университета — МСХА имени К.А. Тимирязева и на сайте университета vvwvv.timacad.ru

Автореферат разослан « 24» марта 2014 года

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор сельскохозяйственных наук профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследований. Особенностью многоклеточных живых организмов является наличие особой подсистемы, ответственной за адаптацию к изменяющимся условиям окружающей среды и предназначенной для поддержания структурной и функциональной целостности. Интенсивность иммунных ответов организма можно регулировать экзогенными физиологически активными веществами, которые получили название иммуномодуляторов (Л^апаЬоБ, 2000). Использование таких веществ - одно из перспективных направлений защиты растений от различных стрессовых воздействий (Озерецковская и др., 1994; Андреев, Талиева, 1996; Тютерев, 2002). Вместе с тем широкое применение иммуномодуляторов наталкивается на трудности, связанные с нестабильностью, а подчас и неоднозначностью их действия (Озерецковская, Васюкова, 2002). Обработка некоторыми препаратами способствует увеличению устойчивости растений к патогенам при использовании одних концентраций и увеличению восприимчивости при использовании других (Васюкова и др., 1996; Смолин и др., 2010), изменению направления иммуномодуляции на листьях разного яруса или в отношении разных патогенов (Смолин, Савельев, 2007). Более того, применение адаптогенов может приводить к снижению адаптивного потенциала у растений, уже обладающих определенным уровнем устойчивости (Гудковский и др., 2002). Такие физиологически активные вещества невозможно однозначно классифицировать как ингибиторы или активаторы устойчивости. На практике эффект может варьировать в зависимости от условий применения, а если эти условия плохо изучены или их невозможно контролировать, результат будет неопределенным. Актуальность изучения данного вопроса определяется и тем, что закономерности изменения величины активности и направления действия физиологически активных веществ могут играть фундаментальную роль в регуляции развития растений и их взаимодействия с окружающей средой.

Двойственность заложена в самом функционировании иммунной системы, например, в необходимости распознавать и находить способы защиты от патогенов с различной стратегией питания: биотрофов и некротрофов. Двойственный характер (в качестве компонентов защитных механизмов и нормального метаболизма с одной стороны, и как повреждающих агентов с другой) имеют активные формы кислорода. Наконец, активированное состояние иммунной системы в значительной степени несовместимо с нормальными процессами роста и развития. Вероятно, эволюция живых организмов протекает в условиях необходимости компромисса между ростом и развитием, ростом и защитой (Негшэ, Маиэоп, 1992). На метаболическом

уровне одним из инструментов согласования взаимоисключающих эффектов, по-видимому, служит сложная зависимость физиологического действия от концентрации у некоторых соединений, выполняющих регуляторные функции, прежде всего фитогормонов. Механизм перераспределения ресурсов может быть непосредственно связан с модификацией цитокининового сигналинга при запуске защитных эффектов, зависимых от R-генов (Igari et al., 2008).

Обычно многофазной называют такую зависимость от концентрации, которой соответствует концентрационная кривая, имеющая более или менее четко различаемые участки с разным наклоном. В своем крайнем выражении многофазность выражается в немонотонности, наличии одной или нескольких экстремальных точек (максимумов и минимумов). Если кривая имеет максимум, то превышение определенного уровня концентрации действующего вещества будет приводить к снижению активности. Очевидно, одинаковый эффект противоположно направленных воздействий также можно рассматривать как явление, основанное на закономерностях, которым соответствуют сложные концентрационные кривые. Многофазные концентрационные зависимости с U-образными участками достаточно часто встречаются в токсикологических (в т.ч. выполненных на модельных объектах растительного происхождения) и биомедицинских исследованиях (Александров, 1985; Calabrese, Blain, 2009). Для выяснения причин неоднозначности эффектов применения физиологически активных веществ особенный интерес представляют эксперименты, в которых были получены концентрационные кривые с несколькими экстремальными точками (Шакирова и др., 2002; Schistad, Nissen, 1984; Aver'yanov et al., 2007).

Некоторые исследователи отмечают существование у ряда веществ корреляции между антистрессорной и цитокининовой активностью (Жирмунская и др., 1989; Лукаткин и др., 2007). Вместе с тем данные о влиянии экзогенных цитокининов на инфекционный процесс противоречивы: в одних случаях их применение способствовало усилению устойчивости, в других -восприимчивости. Это позволяет предположить, что метаболизм цитокининов может играть важную роль в появлении разнонаправленное™ иммуномодулирующей активности и многофазных эффектов при использовании ряда физиологически активных веществ.

Цель исследования - выявить закономерности зависимости активности физиологически активных веществ от концентрации и их роль в регуляции ростовых процессов и устойчивости к фитопатогенам.

Задачи исследования:

1. Найти цитофизиологические параметры взаимодействия возбудителя мучнистой росы пшеницы Erysiphe graminis DC. f. sp. tritici March, и растений пшеницы Triíicum aestivum L., несущие информацию о состоянии патосистемы.

2. Установить характер концентрационной зависимости иммуномодулирующей активности цитокининов, закономерности ее варьирования в данной патосистеме и возможные механизмы возникновения.

3. Установить характер концентрационной зависимости активности цитокининов при их действии на рост корня и гипокотиля проростков томатов (Solanum lycopersicum L.) и рапса (Brassica napus L. ssp. oleífera Metzg.).

4. Выявить возможные проявления многофазности концентрационных зависимостей физиологически активных соединений (салициловая кислота, АБК, прооксиданты, олигоаденилаты растительного происхождения) и ее влияние на их применение в качестве регуляторов роста и устойчивости.

5. Определить закономерности индукции лектинов при действии физиологически активных веществ и инфицировании.

Положения, выносимые на защиту: Зависимость проявления иммуномодулирующих и рострегулирующих свойств от концентрации некоторых физиологически активных веществ, в частности, фитогормонов цитокининового типа, представлена многофазными кривыми с одной или несколькими экстремальными точками, форма зависимости варьирует при изменении физиологического состояния растений. Величина и направление активности иммуномодуляторов зависит от состояния цитокининового метаболизма. Многофазный механизм — один из возможных источников физиологической вариабельности на уровне клетки и особи.

Научная новизна работы. Проведено подробное исследование зависимости от концентрации иммуномодулирующей и рострегулирующей активности ряда физиологически активных веществ. Установлено, что концентрационная кривая активности фитогормонов цитокининового типа, АБК, прооксидантов и олигоаденилатов растительного происхождения может быть представлена многофазной немонотонной кривой с одной или несколькими экстремальными точками, зонами положительной и отрицательной модуляции, форма которой изменяется в присутствии веществ, влияющих на цитокининовый метаболизм, или изменении физиологических условий. Наоборот, величина и направление активности иммуномодуляторов, в частности салициловой кислоты, изменяется при воздействии на цитокининовый метаболизм. Построена математическая модель, отражающая основные особенности активности экзогенных

цитокининов в растении: многофазность концентрационной зависимости и неоднозначность иммуномодулирующего действия. Выдвинута гипотеза о роли многофазности концентрационных зависимостей в индукции физиологической вариабельности на уровне особей и отдельных клеток и регуляции ответных реакций на внешние воздействия.

Впервые установлено, что параметры гало (концентрическая зона измененной поверхности эпидермальной клетки вокруг места внедрения патогена) варьируют в зависимости от физиологического состояния патосистемы: степень проявления внутренней зональности и диаметр гало изменяются при обработке цитокининами, про- и антиоксидантами, а также блокатором кальциевых каналов. Закономерности действия цитокининов на размеры гало могут быть выражены многофазной немонотонной концентрационной кривой.

Впервые установлено, что выбор направления роста аппрессориев возбудителя мучнистой росы на листьях пшеницы не является случайным и изменяется при действии физиологически активных веществ. Рост аппрессориев нормальной морфологии происходит преимущественно вдоль главной жилки листа, напротив, большая часть аномальных аппрессориев растет в перпендикулярном направлении. Обработка зеатином изменяет соотношение направлений роста нормальных аппрессориев и гиф колоний.

Установлено неравномерное пространственное распределение лектинов в тканях растения, окружающих вирус-индуцированный некроз. Впервые показано увеличение количества лектинов при обработке перекисью водорода. На основе результатов собственных исследований и обобщения литературных данных выдвинута гипотеза, согласно которой взаимообусловленная регуляция концентрации лектинов и активных форм кислорода объясняет широкий круг экспериментальных фактов при патогенезе и действии абиотических стрессов.

Практическая значимость. Полученные данные расширяют представления о механизмах защитных реакций растений и возникновения вариабельности физиологических параметров, могут служить основой оптимизации технологий применения физиологически активных веществ. Размеры, структура гало и направление роста инфекционных структур патогена могут быть использованы для количественного описания патогенеза при характеристике сортов и исходного селекционного материала пшеницы по устойчивости к мучнистой росе. Впервые предложено использовать олигоаденилаты растительного происхождения для повышения эффективности технологии оздоровления от вирусов методом апикальных меристем.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на Международной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы фитовирусологии» (Ялта, 1994); международных конференциях «Modern Fungicides and Antifungal compounds» (Фридрихрода, Германия, 1996, 2007, 2010); Международной конференции «Актуальные вопросы экологической физиологии растений в XXI веке» (Сыктывкар, 2001); V Съезде общества физиологов растений России (Пенза, 2003); XIII и XIV симпозиумах по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твёрдых тел (Черноголовка Московской обл., 2003, 2005); XXI конференции по электронной микроскопии (Черноголовка Московской обл., 2006); Международной конференции «Современная физиология растений: от молекул до экосистем» (Сыктывкар, 2007); Второй международной конференции «Тнтродукщя, селекщя та захист рослин» (Донецк, 2009); Всероссийской научной конференции с международным участием, посвященной 80-летию со дня рождения академика Л.Н.Андреева (Москва, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 59 печатных работ, из них публикации в журналах, рекомендованных ВАК — 18, в зарубежных реферируемых журналах - 1.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4-х глав основных результатов, заключения, выводов и списка цитируемой литературы и публикаций по теме диссертации. Диссертация изложена на 515 страницах, иллюстрирована 55 таблицами и 75 рисунками. Список литературы содержит 747 библиографических названий, из них 536 на иностранных языках.

ВВЕДЕНИЕ

Представлен обзор литературных данных об основных известных механизмах иммунитета растений к патогенным микроорганизмам, роли фитогормональных веществ на примере цитокининов и абсцизовой кислоты, а также о форме кривых зависимости активности от концентрации для некоторых физиологически активных веществ.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Большая часть исследований выполнена с использованием патосистемы, включающей злаки (мягкая пшеница Triticum aestivum L. сорт Заря и линия Хакасская, ряд видов рода Aegilops (из коллекции ВИР) и пшенично-эгилопсные линии (из коллекции «Арсенал», Московский НИИСХ

«Немчиновка») и облигатный патоген - возбудитель мучнистой росы Erysiphe graminis DC. f. sp. tritici March. (Blumeria graminis f. sp. tritic'i). Растительными объектами исследования служили также листья табака Nicotiana tabacum L. (сорта Самсун NN и Самсун пп), N. glutinosa L. и Solanum chacoense L., клубни картофеля Solanum tuberosum L., инфицированные Х- и Y-вирусами картофеля (ХВК, YBK), вирусом табачной мозаики (ВТМ).

Отделенные первые или вторые настоящие листья 10-12-суточных проростков пшеницы после инокуляции возбудителя мучнистой росы инкубировали на растворах исследуемых веществ. В других опытах использовали интактные листья, при этом инфицированные проростки помещали корнями в раствор Кнопа, содержащий исследуемые концентрации фитогормона. Число видимых колоний мучнистой росы на абаксиальной и адаксиальной поверхностях использовали для оценки относительной устойчивости (восприимчивости) растения.

Гало выявляли при окраске фрагментов эпидермиса листа с абаксиальной стороны, 1 % амидочерным в 7 % уксусной кислоте. Для конфокальной микроскопии фрагменты эпидермиса обрабатывали флуоресцентными красителями (2',7'-дихлофлуоресцеин, бенгальский розовый). Для просмотра образцов использовали световой микроскоп Axioplan 2 (Carl Zeiss, Германия) и конфокальный микроскоп Olympus FV1000D. Размеры и расстояния на цифровых фотографиях определяли при помощи программы Image J.

Растительный материал для сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) фиксировали в 4 %-ном растворе глутарового альдегида и 2 %-ном растворе четырехокиси осмия и затем обезвоживали в серии спиртов и ацетоне, высушивали при критической точке (Balzers CPD 030 Critical Point Dryer, "Bal-Tec AG", Лихтенштейн), проводили напыление золотом (Bal-Tec SCD 005 Sputter Coater, "Bal-Tec AG", Balzers, Лихтенштейн). Свежесобранные листья исследовали при температуре —30°С с применением замораживающей приставки «Deben Cool stage» (Великобритания) без химической фиксации. В соответствии с разработанной нами методикой препараты наклеивали при помощи термопасты АлСил-3 либо КПТ-8 на медную пластинку (2x4 см), которую затем аналогичным образом фиксировали на столике замораживающей приставки (криоСЭМ). Образцы просматривали на сканирующем электронном микроскопе LEO-1430 VP (Carl Zeiss, Германия).

При изучении биологических свойств олигоаденилатов растительного происхождения (ОРП) использовали линии картофеля из коллекции ГНУ ВНИИКХ, культивируемые in vitro в стерильных условиях и содержащие моноинфекцию X-, S- или М-вирусов картофеля. Раствор ОРП, стерилизованный фильтрованием через бактериальные фильтры Millex-GS

0,22 мкм (Millipore, США), добавляли к автоклавированной агаризованной питательной среде, предварительно охлажденной до 40-50°С. Получение регенерантов из меристемных эксплантов проводили по общепринятой методике (Воловик и др., 1995). Перед вычленением меристем побеги картофеля обрабатывали ОРП, кратковременно погружая их в растворы соответствующей концентрации с последующим инкубированием во влажной камере 1-5 сут или замачивая в растворах ОРП 1 сут. Определение исходной зараженности основными вирусами картофеля (X, S, М, Y, L), отбор безвирусных меристемных линий, а также определение концентрации вирусного антигена в пробирочных растениях осуществляли с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) и диагностических наборов производства ВНИИ картофельного хозяйства (Воловик и др., 1995). Биологическую активность цитокининов определяли по индукции синтеза бета-амарантинов у Amaraníhus caudatus (Мазин и др., 1976).

Для оценки рострегулирующих свойств изучаемых веществ семена рапса (Brassica napus L. ssp. oleífera Metzg.J и томата (Solanum lycopersicum L., сорт Персей) проращивали в течение 2 и 5 сут соответственно в термостате при комнатной температуре (24° С) в темноте. От 15 до 20 или более проростков помещали в чашки Петри на фильтровальную бумагу, пропитанную исследуемым раствором, и инкубировали при комнатной температуре в темноте в течение 1 (рапс) и 2 (томаты) суток. По окончании срока инкубации измеряли длину корня и гипокотиля.

Оценку гемагглютинирующей активности лектинов проводили в 96-луночных планшетах в ячейках, имеющих дно округлой формы, с 1%-ой трипсинизированной суспензией эритроцитов кролика. Содержание антигена агглютинина зародышей пшеницы в 1-2-недельных проростках пшеницы определяли методом иммуноферментного анализа со специфическими иммуноглобулинами (Sigma, США) и пероксидазными конъюгатами белка G (Sigma, США) или антикроличьих антител (ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, Россия).

Достоверным считали визуально заметный экстремум (минимум или максимум), для которого на экспериментально полученной кривой имеются, по крайней мере, по одной точке справа и слева на оси концентрации (ось абсцисс), ординаты которых достоверно меньше ординаты экстремума для максимума и достоверно больше для минимума. Для сравнений использовали соответствующий вариант /-критерия и критерии множественных сравнений Ньюмена-Кейлса или Данна. При оценке существенности влияния изучаемого вещества в целом применяли дисперсионный анализ или его непараметрический аналог (критерий Крускала-Уоллиса). Основные статистические вычисления проводили в программе Excel 2003.

ГЛАВА 1. Морфологическая изменчивость возбудителя мучнистой росы пшеницы и цитофизиологических реакций растения как возможное фенотипическое проявление изменений в состоянии патосистемы

Особенности эктофитной стадии возбудителя мучнистой росы пшеницы.

Для нормального развития данного патогена характерно образование короткой аппрессориальной ростковой трубки, в отличие от конидий, прорастающих ростковой трубкой («израстание»), колоний не

сильно удлиненной образующих.

17 I 6

5 5

О)

¡4

§3 а>

) >

II 1 Г / \

9/ \2

й Л' 1г. I % _

Ы / ^--"1 I

^ I*/

1 1 1 1 1 1 1 I I

Рис. 1. Влияние зеатина на характер прорастания конидий возбудителя мучнистой росы через 48 ч после инфицирования (линия 56/99', отделенные листья, по данным СЭМ). 1 - нормальные и 2 — аномальные аппрессории. Здесь и на других рисунках крупным незаполненным маркером отмечены достоверные экстремальные точки согласно ¿-критерию. Заполненным маркером — экстремумы, достоверные также по критерию Ньюмена-Кейлса или Данна (непараметрический аналог критерия Ньюмена-Кейлса)

3 4 5 6 Зеатин, мкМ

Обработка зеатином оказывала влияние на рост патогена в эктофитной стадии. На рис. 1 представлены кривые зависимости числа нормальных и аномальных аппрессориев возбудителя мучнистой росы от концентрации зеатина через 48 ч после инфицирования на листьях пшенично-эгилопсной линии 56/99'. Согласно критерию Крускала-Уоллеса, влияние концентрации зеатина достоверно для вариантов обеих кривых со значениями р<0,0001. Концентрационная кривая дифференциации нормальных аппрессориев имела 2 пика при низких и высоких концентрациях с резким спадом стимулирующей активности при 1,5 мкМ. Наоборот, при этой концентрации зеатина наблюдали повышенное количество аномальных аппрессориев.

Число колоний коррелировало положительно с числом нормальных аппрессориев и отрицательно - с числом аномальных аппрессориев. Зависимость конечного результата патогенеза, т.е. числа нормально развитых спороносящих колоний (обычно через 6 сут после инфицирования), от концентрации зеатина для 2-х сортообразцов имела 2 области стимуляции роста колоний при 1 мкМ и 3-4.5 мкМ и минимум между ними (1.5 мкМ), т.е. форма этих кривых была аналогична форме кривой нормальных аппрессориев на рис. 1. По-видимому, при определенных условиях этапы прорастания конидий и дифференциации инфекционных структур патогена являются лимитирующими и оказывают решающее влияние на окончательное число сформировавшихся колоний.

Регуляция направления роста возбудителя мучнистой росы пшеницы вдоль и поперек главной жилки листа. В начале развития спора патогена находится в условиях неравноценности возможных направлений роста вдоль или поперек листа вследствие вытянутости эпидермальных клеток листьев злаков вдоль главной жилки листа. Цифровые фотографии, полученные методом СЭМ, использовали для подсчета нормальных и аномальных аппрессориев, которые относили к растущим вдоль главной жилки листа, если угол между длинной осью эпидермальной клетки и направлением аппрессория находился в пределах от 0° до 30°, и соответственно к категории роста поперек главной жилки в остальных случаях (рис. 2). Аналогично направление роста можно определить и для аппрессориев молодых колоний.

Признаки характера дифференциации и направления роста взаимосвязаны (табл. 1). В контроле большинство нормальных аппрессориев направлены вдоль главной жилки. Аналогичные результаты получены для аппрессориев в составе молодых колоний. Преобладание продольного роста наблюдали также на листьях Aegilops суИпс1пса и Ас. уауНоуН, Наоборот, рост аномальных аппрессориев был направлен преимущественно поперек главной жилки листа (пшеница, пшенично-эгилопсная линия) или численность обеих групп была одинаковой (Ае. су11п(1пса и Ае. \'а\'Ио\'И).

Обработка зеатином изменяла соотношение численности групп с разным направлением роста как у нормальных аппрессориев на стадии до начала роста гиф (табл. 1), так и у аппрессориев внутри колонии. Во всех случаях использования концентрации зеатина 3 мкМ было отмечено достоверное увеличение числа аппрессориев, направленных вдоль главной жилки листа, а при концентрации 1,5 мкМ преобладал поперечный рост, т.е. концентрационная кривая была многофазной и немонотонной.

Таким образом, нами обнаружена взаимосвязь между способностью конидии к нормальной дифференциации инфекционных структур и направлением роста аппрессориальной ростковой трубки. Цитокинины, как правило, способствовали увеличению доли поперечного роста. На более поздних этапах эти вещества оказывали влияние на направление роста гиф и, соответственно, форму колонии. Можно предположить, что результат взаимодействия с эпидермисом первичной ростковой трубки определяет направление аппрессориальной ростковой трубки в сторону наиболее вероятного расположения восприимчивой клетки.

Условия, благоприятствующие или препятствующие патогенезу, в удаленных частях одной клетки, очевидно, обладают большим сходством по сравнению с таковыми в разных клетках. При неблагоприятном первичном контакте в силу удлиненной формы клеток эпидермиса найти другую эпидермальную клетку, возможно, более восприимчивую к инфицированию, можно на более близком расстоянии именно при росте в поперечном направлении.

Таблица 1. Численность нормальных и аномальных аппрессориев, прорастающих в направлении вдоль и поперек главной жилки, на листьях пшенично-эгилопсной линии 56/991 в присутствии зеатина (48 ч после

Зеатин, мкМ Нормальные аппрессории Аномальные аппрессории Р/ Р2 Рз

Вдоль оси Поперек оси Вдоль оси Поперек оси

0 31 14 11 13 0,107 0,000 -

0,5 58 54 20 117 0,000 0,000 0,000

1 46 57 9 30 0,030 0,015 0,174

1,5 22 34 15 68 0,010 0,345 0,003

3 91 71 8 62 0,000 0,000 0,000

4,5 70 53 17 64 0,000 0,000 0,018

9 47 28 26 74 0,000 0,000 0,120

Примечания. рг-Рз - вероятности ошибки р(%2), соответствующие значениям у2. Значения р) - результат применения критерия независимости сопряженных признаков. При />;<0,05 характер дифференциации и направление роста аппрессория являются взаимозависимыми. Численности аппрессориев, растущих вдоль и поперек длинной оси эпидермальной клетки по отдельности для нормальных (р2) и аномальных (р3) аппрессориев, сравнивали с теоретическим соотношением 1:2, которое могло бы возникнуть при случайном направлении роста аппрессориальной ростковой трубки. При р<0,05 различия между долями соответствующих групп считали достоверными.

Рис. 2. Нормальные аппрессории, растущие вдоль (А) и поперек (Б) главной жилки листа; аномальные аппрессории, растущие вдоль (В) и поперек (Г) главной жилки и аппрессории молодых колоний, направленные вдоль (Д) и поперек (Е) главной жилки листа (СЭМ, фиксация и напыление): К - конидия, Ап - аппрессорий, ГМ - гифа мицелия.

Образование и вариабельность гало. Особенностью патогенеза мучнисторосяных грибов злаков является интенсивное образование гало -концентрических структур на поверхности эпидермальной клетки, выявляемых при цитохимической окраске некоторыми красителями (рис. 3 и 4). Малое гало (5-15 мкм) образуется в месте контакта первичной ростковой трубки, большое гало (15—50 мкм) — лопасти аппрессория (рис. 3). Непарные вторичные гало возникают в местах контакта с эпидермисом гиф мицелия.

В наших экспериментах область гало показала положительную реакцию на наличие перекиси водорода при окраске 2',7'-дихлофлуоресцеином (рис. 4). 3-амино-1,2,4-триазол и каталаза способствовали достоверному увеличению диаметра как большого, так и малого гало. В присутствии нитрата лантана происходило достоверное уменьшение этих показателей. Полученные данные свидетельствуют об участии в образовании гало кальциевой сигнальной системы и тесной связи данного явления с окислительным взрывом при инфицировании. Вероятно, благодаря модификации клеточных стенок

эпидермиса в присутствии перекиси водорода гало видны на некоторых

Рис. 3 Прорастание конидий Е. %гат1т8 на листьях пшеницы с образованием первичной (ПРТ) и аппрессориальной (Ап) ростковой трубок. А -СЭМ, препараты при -30°С; Б и В - световая микроскопия, окраска амидочерным. К - конидия, МГ - малое гало, БГ - большое гало. На врезках а и Ь - выделенные фрагменты более крупным планом

Рис. 4 Окрашивание зоны гало 2',7'-дихлофлуоресцеином (А-Г) и бенгальским розовым (Д, Е) (конфокальная микроскопия). На сагиттальной проекции (правые панели) в центре гало видны папиллы. Светло-зеленое или желтое окрашивание в зоне гало (А-Г) соответствует локализации перекиси водорода, синее (панель А) — автофлуоресценция фенольных веществ в зоне гало

Обработка зеатином приводила к существенному увеличению среднего диаметра большого гало через 24 ч после инфицирования (рис. 5). При этом сходным стимулирующим действием на размеры гало обладали 2 диапазона концентраций зеатина, разделенные зоной, в которой стимулирующая активность не проявлялась, а при концентрациях 1 и 1,5 мкМ зеатина наблюдали хорошо выраженные соответственно максимум и минимум.

45 -

Рис. 5 Влияние зеатина на диаметр большого гало при инфицировании возбудителем мучнистой росы пшеницы отделенных листьев линии 56/99' 24 ч после инфицирования

20 -1-1-.-.-

0 1 2 3 4 5

Зеатин, мкМ

Таким образом, нами впервые показано, что размеры гало могут изменяться под действием физиологически активных веществ, в частности, фитогормонов цитокининового типа и соединений, которые влияют на содержание активных форм кислорода. При этом зависимость величины диаметра гало от концентрации этих веществ представлена многофазной немонотонной кривой.

ГЛАВА 2. Многофазность иммуномодулирующего действия физиологически активных веществ.

Иммуномодулирующие свойства цитокининов в патосистеме пшеница-возбудитель мучнистой росы. Зависимость числа колоний возбудителя мучнистой росы на листьях проростков пшеницы от концентрации зеатина и зеатин-рибозида была нелинейной и немонотонной, имела максимумы и минимумы (рис. 6). В опытах с отделенными листьями получен один широкий минимум восприимчивости (0,5-3 мкМ). Большинство экспериментальных точек минимума имели достоверные отличия при сравнении с вариантами с меньшей концентрацией цитокинина (включая и необработанный контроль) и

вариантами, полученными при более высоких концентрациях цитокинина. Кривая для интактных листьев проростков, получавших цитокинин через корни, имела 3 четко выделяющиеся области: зона индуцированной устойчивости (представленная концентрацией 3 мкМ) с обеих сторон окружена зонами стимуляции восприимчивости (0,5-1 и 4,5-9 мкМ). Левый максимум и минимум имели обе ветви, а предполагаемый правый максимум (или, точнее, область повышенной восприимчивости при высоких концентрациях) выделен достоверными отличиями только с одной стороны. Таким образом, обработка зеатином и зеатин-рибозидом может приводить к существенному увеличению восприимчивости или устойчивости в зависимости от концентрации и условий применения цитокинина.

Рис. 6 Зависимость плотности колоний возбудителя мучнистой росы от концентрации экзогенного зеатина (1) и зеатин-рибозида (2) на интактных (А) и отделенных (Б) листьях пшеницы сорта Заря (6 сут после инфицирования).

£ и

100

4 6

Цитокинин, мкМ

Некоторые примеры кривых зависимости иммуномодулирующих свойств зеатина от его концентрации в патосистеме пшеница-возбудитель мучнистой росы представлены на рис. 7. Опыты проведены в весенне-летний период (с апреля по июнь). Несмотря на одинаковый возраст растений и сходные условия выращивания, реальное состояние проростков разных серий варьировало (временной дрейф). Две из полученных кривых расположены целиком в положительной или отрицательной области. В соответствии с данными кривой

1, зеатин стимулирует развитие колоний при одних концентрациях и не оказывает влияния на данный процесс при других. На кривой под номером 3 одни концентрации зеатина дают достоверный стимулирующий эффект, а другие достоверно ингибируют развитие колоний патогена. При этом все кривые являются немонотонными и имеют от 1 до 3 экстремальных точек. Кривые 1, 3 и 4 имели зону с достоверным патоген ингибирующим эффектом, кривые 1-3 — по 2 диапазона с достоверной патоген-стимулирующей активностью. На кривых 1 и 3 точки минимума отделены достоверными отличиями от окружающих максимумов. Диапазоны концентраций примерно одинаковы на разных кривых для каждой из областей разного направления иммуномодуляции. Форма кривых сходна с той, которую наблюдали в некоторых экспериментах главы 1. Таким образом, можно предположить, что все 4 кривые являются проявлением общей закономерности, а различия связаны с изменением степени проявления стимулирующей число колоний активности в зонах максимумов и ингибирующей активности в зоне минимума.

юоо

100

о с

Рис. 7 Зависимости числа колоний возбудителя мучнистой росы от концентрации экзогенного зеатина. На кривых 1—4 приведены результаты независимых экспериментов, проведенных в период с апреля по июль. Заполненным маркером отмечены средние, достоверно отличающиеся от контроля без цитокининов согласно критериям Ньюмена-Кейлса или Данна

2 з

Зеатин, мкМ

Варьирование формы концентрационных кривых на рис. 7, получаемых в независимых опытах, является результатом невозможности точного воспроизведения некоторых, вероятно, существенных условий эксперимента. Однако в опыте, представленном на рис. 6, все 4 кривые получены с

использованием одной серии проростков и инфицированы одновременно одним и тем же инокулюмом. Сравнение кривых для зеатина и зеатин-рибозида позволяет оценить вариабельность между результатами независимых экспериментов в гипотетических условиях идентичного физиологического состояния растения-хозяийа и идентичного качества конидиального инокулюма. Как и следовало ожидать, использование химически различных, но сходных по своим свойствам, цитокининов дает практически одинаковые (с учетом небольшого различия величины собственно цитокининовой активности) концентрационные кривые. И, наоборот, изменения физиологического состояния у отделенных листьев вызывает резкие изменения формы концентрационной кривой независимо от типа применяемого цитокинина.

70 60

3 50

4 о>

I 40

х о

с 30

¡г

20 10

70 60

ц50 а>

¡40

° 30 о * 20

И \ т

5 .••4-. I _ ___—^ 3

V л'5

т ■ [А . - ' * , 4

А/ Л--"

•

± _________$ 2

Рис. 8 Влияние условий минерального питания на концентрационные кривые зависимости числа колоний возбудителя мучнистой росы (число колоний на см2) от концентрации экзогенного зеатина. 1 — раствор Кноппа, 2 -раствор Кноппа без азота, 3 - дистиллированная вода, 4 - раствор Кноппа с заменой нитратного азота на эквимолярное количество азота в аммонийной форме.

Зеа-шн, мкМ

Проростки пшеницы в эксперименте, представленном на рис. 8, выращивали в течение 2 нед на растворе Кнопа. За 1 сут до инфицирования проростки помещали в питательные растворы без зеатина с различным минеральным составом. Непосредственно после инфицирования в раствор добавляли зеатин в различных концентрациях. При этом наблюдали 2 типа концентрационных кривых: растения на дистиллированной воде дали

зависимость с минимумом восприимчивости (кривая 3), а концентрационные кривые зеатина на полном растворе Кнопа (кривая 1) или в отсутствие азота (кривая 2) имели 2 максимума и минимум. Последние две кривые имели хорошо выраженный максимум при низких концентрациях с достоверным по сравнению с контролем увеличением восприимчивости и отделенный от остальной части кривой достоверным отличием в точке минимума. Второй максимум при высоких концентрациях зеатина был выражен в меньшей степени, однако также присутствовал на обеих кривых. При замене нитратного азота аммиачным добавление зеатина не приводило к существенному изменению числа колоний по сравнению с контролем без зеатина (кривая 4). Однако флуктуации ординат точек данной кривой имели определенные черты сходства с обоими вышеописанными типами, т.е. зависимость доза-эффект в данном варианте была промежуточной между кривой с минимумом и многофазной кривой с 2-мя максимумами по форме и по величине восприимчивости.

Как видно из рис. 6-8, форма получаемых кривых имеет несомненные черты сходства, которые могут быть выявлены в виде общих трендов при анализе нескольких независимых экспериментов. Для этого были отобраны данные 24 концентрационных кривых - результаты всех экспериментов, в которых использованы только интактные листья растений пшеницы одного сорта, а экспериментальные варианты отличались только концентрацией зеатина и не содержали каких-либо других добавок. В качестве повторности взяты средние значения числа колоний при различных концентрациях зеатина отдельно для адаксиальной и абаксиальной сторон листа, выраженные в процентах от среднего числа колоний для каждого эксперимента (рис. 9). Полученная для абаксиальной стороны листа кривая имела две зоны некоторого повышения восприимчивости и минимум между ними. Ордината минимума на этой кривой имела четкие отличия от ординат визуальных максимумов, подтвержденные при использовании критерия Ньюмена-Кейлса, учитывающего эффекты множественных сравнений. Следует отметить, что статистическое подтверждение на обобщенной кривой имел только минимум, а повышение восприимчивости при 0,5 и 4,5 мкМ зеатина не выделялось на фоне ошибки, определяемой вариабельностью формы кривой в независимых экспериментах. Очевидно, достоверные отличия для минимума являются результатом повторения данного элемента на кривых разной формы. Концентрационная зависимость числа колоний на адаксиальной стороне в точности повторяла все элементы кривой абаксиальной стороны листа, однако различия не превышали величину случайных ошибок. Подсчет числа экстремальных точек в отдельных экспериментах показал примерно

одинаковые величины для обеих сторон листа. Причиной, которая обусловила меньшую амплитуду кривой для адаксиальной стороны, было более равномерное распределение минимумов и максимумов между диапазонами концентраций 0,25-0,5 и 1-1,5 мкМ.

130 ^

Рис. 9 Обобщенная концентрационная кривая плотности колоний мучнистой росы на листьях пшеницы (1 — адаксиальная и 2 — абаксиальная стороны листа), построенная по результатам 24 экспериментов.

3 4 5 6 Зеатин, мкМ

Достаточно очевидно, что эндогенные вещества, синтезированные в ответ на предшествующие биотические и абиотические стрессы, способны оказывать влияние не только на восприимчивость растений, но и на метаболизм цитокининов и, соответственно, на форму концентрационной кривой цитокининов. Одним из подобных веществ является салициловая кислота. На рис. 10 представлены концентрационные кривые иммуномодулирующих свойств салициловой кислоты в 3-х независимых экспериментах. Во всех 3-х экспериментах при концентрации 20 мкМ наблюдали минимум (достоверный или визуально заметный), соответствующий относительному увеличению устойчивости растения. Дополнительно все кривые имели по 2 в разной степени выраженных максимума. На кривой №1 этим точкам соответствовало почти 2-кратное увеличение плотности колоний патогена, достоверное при сравнении с необработанным контролем. В независимых экспериментах варьировали общая направленность иммуномодуляции, что выражалось в расположении концентрационной кривой целиком или почти целиком выше или ниже уровня контроля. Таким образом, концентрационная зависимость для салициловой кислоты в исследуемой модельной патосистеме может иметь вид немонотонной и многофазной кривой с 3-мя экстремальными точками, по форме и характеру вариабельности сходной с кривыми зеатина.

Рис. 10 Зависимости числа колоний возбудителя мучнистой росы от концентрации салициловой кислоты. 13 - результаты независимых экспериментов. Отдельные точки с ординатой 100% показывают уровень ошибки в контроле.

ю 100

Салициловая кислота, мкМ

1000

Рис. 11 Зависимость числа колоний возбудителя мучнистой росы от концентрации зеатина в присутствии салициловой кислоты. 1 -только зеатин; 2-20 мкМ и 3 - 100 мкМ салициловой кислоты.

2 з

Зеатин, мкМ

Изменение концентрационных зависимостей иммуномодулирующих свойств зеатина исследовали в присутствии 2-х концентраций салициловой

кислоты (рис. 11). Концентрация 20 мкМ соответствовала минимуму восприимчивости на кривых рис.11. Зеатин практически полностью нивелировал защитные свойства салициловой кислоты, при этом данная концентрация не изменяла форму концентрационной зависимости зеатина. Концентрации 100 мкМ соответствовало некоторое увеличение восприимчивости (рис. 10). При совместном применении она достаточно существенно изменяла форму концентрационной кривой зеатина, приводила к появлению максимума при высоких концентрациях и смещению вправо левого пика.

Суммируя вышесказанное, необходимо отметить, что изменение условий минерального питания, освещения и добавление различных концентраций иммуномодуляторов иной химической природы вызывает изменение формы концентрационной кривой действия зеатина на число колоний возбудителя мучнистой росы и, возможно, другие параметры, связанные с патогенезом. Диапазон изменений формы кривых сопоставим с тем, который можно наблюдать в независимых опытах и, возможно, в опытах разных авторов и в разных патосистемах. С другой стороны, присутствие зеатина также влияло на величину и направление активности этих иммуномодуляторов. Полученные данные позволяют предположить, что в основе иммуномодулирующей активности некоторых соединений лежит общий механизм, тесно связанный с цитокининовым обменом, а разнонаправленность иммуномодуляции в значительной степени может быть обусловлена его подвижностью при изменении условий среды или действии стрессовых факторов.

Математическая модель концентрационной зависимости влияния цитокининов на восприимчивость листьев пшеницы к возбудителю мучнистой росы. Очевидно, что появление на концентрационной кривой 2-х пиков должно быть связано с действием каких-либо 2-х процессов, имеющих концентрационную зависимость в виде кривой оптимума. Для построения математической модели был выбран механизм с последовательным соединением подобных реакций, в которых продукт первой реакции или процесса является субстратом следующего этапа (Гуревич, 2001). В этом случае второй процесс дает один пик на восходящей ветви первой кривой, а другой пик - на его же нисходящей ветви (рис. 12). На рис. 13 представлена гипотетическая схема размещения этих процессов в клеточных компартментах: экзогенный цитокинин, попадающий, в конечном счете, в межклетник листа, переносится в эпидермальную клетку при участии процесса с субстратным ингибированием. Будем считать, что кинетика данного процесса описывается моделью открытой реакции с субстратным угнетением (Каймачников, Сельков,

1976). Затем при участии второго процесса с субстратным ингибированием способствует образованию веществ, наличие которых является критическим для образования колонии. _

Рис. 12 Схема возникновения концентрационной кривой с 2-мя максимумами (1+Н) в результате соединения 2-х последовательных процессов (I и И) с кривой оптимума, при котором продукт первого процесса является субстратом для второго. При увеличении концентрации в соответствии с процессом I происходит увеличение концентрации промежуточного субстрата Б2 до максимального уровня (восходящая ветвь — пунктирная линия), что дает первый диапазон концентраций Б2. Дальнейшее увеличение 81 приводит к уменьшению концентрации Б2 (нисходящая ветвь - сплошная линия) — второй диапазон концентраций Б2, близкий по величине к первому, но возникающий при более высоких концентрациях Б1. Реализация процесса II в диапазоне концентраций субстрата Б2, задаваемых пунктирной линией на графике I, дает левый пик концентрации продукта Р на графике суммарной кривой, также обозначенный пунктиром. Соответственно, второй диапазон 82, задаваемый нисходящей (сплошной) ветвью, дает правый пик концентрации продукта Р

Поскольку в патосистеме скорость биохимических этапов существенно превышает скорость морфологических процессов, концентрации действующих веществ должны успеть достигнуть стационарных значений, что дает право описывать влияние цитокининов на устойчивость растения-хозяина системой алгебраических уравнений.

—Р*Б , -к*г = 0 С-Ь*с-у = 0 ¿■-¿*5 + у = 0 у =-, С~Г/-п.

М + , + ^ / + (с + *)*(/ + с')'

где chs- концентрация цитокинина в межклеточном пространстве и внутри клетки, b, d, a, f не- параметры; v, S и d*s - скорость поступления, синтеза и расходования цитокинина в эпидермальной клетке соответственно; С и Ь*с - скорость поступления и расходования цитокинина в межклеточном пространстве. Численные решения уравнений математической модели осуществляли с использованием программы Content.

Межклеточное пространство

Ъ*с

Рис. 13 Гипотетическая схема возникновения многофазной концентрационной зависимости при действии экзогенного цитокинина на число колоний возбудителя мучнистой росы пшеницы

На рис. 14 представлены зависимости г(С) при различных значениях параметров. При этом происходило изменение положения отдельных максимумов, а также и формы кривой в целом, что и наблюдали в реальных экспериментах. Так, зависимость от концентрации зеатина для проростков, выращенных на дистиллированной воде (рис. 8), была представлена хорошо выраженным минимумом, а кривые, полученные на проростках в вариантах с использованием раствора Кнопа и без азота, имели, по крайней мере, один хорошо выраженный максимум. Флуктуации кривой в варианте с азотом в аммонийной форме имели уменьшенную амплитуду, что можно сопоставить с аналогичным уменьшением амплитуды на кривой №2 рис. 14ё. Построенная математическая модель отражает основные особенности влияния экзогенных цитокининов на восприимчивость проростков пшеницы: многофазность,

вариабельность при изменении условий эксперимента и разнонаправленность иммуномодулирующего действия.

Рис. 14 Симуляция зависимости плотности колоний патогена (г) от концентрации экзогенного цитокинина (С) согласно модели (1-3) при изменении некоторых параметров, а-г: а=0,5; £=0,1; £=0,01; к=0,02; р=0,3; М=0,7, а : (1=0,9; 8=0,1; К=0,1; 1 -Ь=0,1; 2-Ь=0,25; 3 - Ь=0,5; б: Ь=0,25; 8=0,1; К=0,1; 1 - (1=0,5; 2 - с1=0,9; 3 - (1= 1,4; в: Ь=0,25; (1=0,9; К=0,1; 1 - 8=0,05; 2 -8=0,1; 3 - 8=0,2; г: Ь=0,25; (1=0,9; 8=0,1; 1 - К=0,05; 2 - К=0,1; 3 - К=0,3 ; 4 -К=0,5.

В соответствии с данной моделью форма кривой изменяется при изменении параметров, соответствующих притоку и расходованию цитокининов. На основе предложенной модели высказаны гипотезы, объясняющие роль цитокининов в регуляции патогенеза, неоднозначное

действие некоторых иммуномодуляторов, а также ранее известные экспериментальные данные о корреляции между устойчивостью и содержанием цитокининов. Использование данной модели может оказаться полезным в понимании физиологического смысла таких характерных для состояния стресса явлений как изменение уровня фитогормонов при инфицировании, увеличение активности цитокининоксидазы, изменении устойчивости при взаимодействии стрессов различной природы и др.

Действие олигоаденилатов растительного происхождения (ОРП) на вирусную инфекцию и рост черенков картофеля в культуре ткани in vitro.

ОРП получали при инкубации реакционной смеси, содержащей АТФ в присутствии растительного фермента, иммобилизованного на дсРНК-сорбенте (Бабоша и др., 1990). Было установлено, что они способны воздействовать на репродукцию вируса при микрочеренковании и рост микрочеренков картофеля в культуре in vitro. Направленность действия на концентрацию вирусов варьировала: в разных экспериментальных условиях было получено как достоверное ингибирование вирусной репродукции, так и ее достоверное стимулирование. Активность ОРП сложным образом зависела от длительности культивирования (пассажа), концентрации и типа вируса, а также от их сочетания. Концентрационные кривые имели экстремальные точки, а их форма варьировала. Ростстимулирующая активность ОРП была более стабильной. Однако превышение концентрации ОРП выше оптимальной также приводило к снижению или полному исчезновению эффекта (кривая оптимума). ОРП проявляли цитокининподобную активность: достоверное повышение содержания бета-амарантинов в проростках Amaranthus candatus происходило также при использовании достаточно низких концентраций ОРП (4 рМ). Величина максимальной цитокининподобной активности примерно соответствовала активности 0,1 мкМ кинетина.

Использование ОРП при оздоровлении картофеля от вирусной инфекции методом меристем показало повышение выхода регенерантов, свободных от вирусной инфекции. Наибольший эффект был связан с увеличением количества регенерантов, которые прижились и оказались способны к морфогенезу (78— 100% по сравнению с 22^6% в контроле). Однако необходимо отметить, что применение ОРП требует тщательного подбора условий применения (концентраций и сроков обработки). Увеличение концентрации или времени обработки черенков картофеля, как правило, не приводило к усилению антистрессорной или антивирусной активности. При совместном применении с зеатином на листьях пшеницы ОРП способствовали изменению формы концентрационной зависимости действия цитокинина на число колоний

мучнистой росы. Принимая во внимание возможное участие этих веществ в метаболизме цитокининов (цитокининподобная активность в биотесте) и высокую вариабельность концентрационных кривых как цитокининов, так и некоторых других иммуномодуляторов, можно предположить, что и для данных соединений стабильные или нестабильные результаты могут быть связаны со стабильностью формы зависимости от концентрации. По-видимому, сходное взаимодействие с цитокининовым метаболизмом лежит в основе биологической активности также некоторых других адаптогенов и стресспротекторов. Это делает очевидным необходимость поиска таких условий практического применения физиологически активных веществ, при которых действие случайных факторов не приводило бы к существенным изменениям формы концентрационной зависимости.

Изменение восприимчивости пшеницы к возбудителю мучнистой росы при обработке экзогенной АБК. Обработку АБК проводили в разные сроки относительно момента инфицирования, предполагая разную чувствительность мучнисторосяного патогена на разных этапах развития. Форма концентрационной кривой при изменении условий эксперимента или в разных экспериментах изменялась в пределах от широкой области ингибирования или узкого минимума до кривой с достоверным увеличением числа колоний патогена. Иногда наблюдали более сложные концентрационные кривые с 2-мя экстремальными точками: максимумом и минимумом. В наибольшей степени форма концентрационной кривой зависела от времени применения АБК относительно момента инфицирования. Небольшие изменения времени обработки приводили к постепенным изменениям формы концентрационной кривой. При более позднем применении АБК вначале исчезало ингибирование при низких концентрациях (1,5—3 мкМ), затем в этом месте кривой появлялся максимум числа колоний, и далее, при обработке через 2 сут после инфицирования, зона, относительно благоприятная для патогена, смещалась в сторону более высоких концентраций АБК, а в диапазоне 1,5-3 мкМ вновь наблюдали минимум. Это позволяет предположить, что 2 временных интервала ингибирующего действия АБК могут соответствовать некоторым разделенным во времени сходным процессам, которые происходят при внедрении патогена в эпидермальные клетки, например, проникновению первичных и вторичных инфекционных структур в растительную клетку или образованию первичных и вторичных гаусторий. Аналогичные периоды повышенной чувствительности патогена примерно в те же сроки наблюдали при обработке перекисью водорода и 3-АТА (Аветисян, Бабоша, 2013).

ГЛАВА 3. Многофазное действие экзогенных цитокининов в регуляции ростовых процессов

Многофазные концентрационные кривые, описанные в главах 1 и 2, касались процессов, происходящих в патосистеме. Представляет интерес выяснить, свойственна ли такая многофазность более широкому кругу явлений. Концентрационные кривые ингибирования зеатином роста корня проростков рапса представлены на рис. 15. Эти кривые не являются монотонными и, наряду с хорошо выраженным ингибирующим трендом, имеют несколько достоверных экстремальных точек. В независимых экспериментах величина и положение пиков по оси абсцисс варьировали аналогично тому, как это происходило с кривыми иммуномодулирующей активности.

Как уже отмечалось, при наличии общих закономерностей концентрационной зависимости немонотонного компонента возможно построение суммарной кривой. Для иммуномодулирующих свойств такие суммарные кривые представлены на рис. 9.

На рис. 16 приведены суммарные кривые, обобщающие результаты 15 независимых экспериментов с проростками рапса и 19 экспериментов с проростками томатов. Для каждого варианта каждой из экспериментальных кривых этих опытов получены величины отклонения среднего от линии регрессии. Если какие-либо концентрации зеатина способствовали более сильному ингибированию роста (минимум), остаток имел отрицательный знак, наоборот, при ослаблении ингибирующих свойств в максимумах он становился положительной величиной. Все использованные в данных экспериментах градации концентрации зеатина были разбиты на 10 диапазонов. Для каждого из экспериментов отклонения, полученные при близких концентрациях одного диапазона, усредняли. Средневзвешенная концентрация для каждого диапазона концентраций зеатина использована в качестве абсциссы. Таким образом, полученные кривые представляли только немонотонный компонент общей зависимости, поэтому не имели наклона, а сами средние остатки колебались вокруг нулевого значения.

Как указано выше, на кривых, полученных в разных экспериментах, экстремальные точки могут возникать при несколько различных концентрациях. Поэтому обнаружить экстремум на обобщенной кривой можно только в случае, если его положение по оси концентрации стабильно и мало изменяется в независимых экспериментах. Достоверные экстремальные точки при концентрациях 0,35 и 0,9 мкМ зеатина на кривой корня рапса (рис. 16А), а также 2 максимума 0,04 и 0,3 мкМ и минимум между ними на кривой томатов

(рис. 16Б), по-видимому, представляют именно такие зоны с относительно стабильными отклонениями от монотонности.

Зеатин, мкМ Зеатик, мхМ

Рис. 15 Зависимость роста корня от концентрации экзогенного зеатина в 2-х независимых экспериментах (А и Б). Пунктирной линией представлены линии регрессии, соответствующие монотонной части концентрационной зависимости.

Рис. 16 Немонотонная часть концентрационной зависимости роста корня проростков (по данным 15-ти (А — рапс) и 19-ти (Б - томаты) независимых экспериментов). Повторностью при вычислении среднего и ошибки на графиках служили остатки, полученные вычитанием из средних для каждой концентрации отдельного опыта соответствующей ординаты точки на линии регрессии, построенной по результатам данного эксперимента. Линии

регрессии при расчете средних остатков кривой 1 построены с использованием всех градаций концентрации (линия 1), или при исключении максимумов 0,04 и 0,3 мкМ зеатина (линия 2).

Сравнивая обобщенные кривые остатков для рапса и томатов, следует отметить их несомненное сходство. У обоих видов хорошо проявились положительные отклонения от линии регрессии. В обоих случаях имеется минимум, однако у томатов к нему прилегают максимумы с обеих сторон, а у рапса - только со стороны больших концентраций. Эти различия могут быть объяснены различной степенью детализации концентрационных кривых в области максимумов и левее при более низких концентрациях. Сходные результаты для обоих видов получены и при изучении концентрационных кривых длины гипокотилей.

Зеатин, мкМ

Дополнительные вещества, в частности, тидиазурон, способны изменять форму концентрационной кривой ингибирования роста корня в присутствии зеатина (рис. 17). Как известно, тидиазурон обладает активностью настоящего цитокинина и способен взаимодействовать с некоторыми цитокининовыми рецепторами (1поие е/ а1, 2001; Уатас1а е! а!., 2001). С другой стороны это вещество - конкурентный ингибитор цитокининоксидазы (ВПуеи е1 а!., 2001). В обоих случаях тидиазурон можно рассматривать как дополнительный цитокинин или фактор, увеличивающий активность цитокининов. В этом случае его добавление должно сдвигать всю концентрационную кривую зеатина влево. Данные рис. 17 очень трудно интерпретировать с позиций такого суммирования цитокининов. Соотношения между формой кривой зеатина в

присутствии разных концентраций тидиазурона аналогичны таковым на рис. 9 для иммуномодулирующих свойств зеатина при изменении минерального состава среды или данным вычислительного эксперимента на рис. 14с1, что предполагает действие закономерностей, близких к описанным математической моделью для иммуномодулирующих свойств. Сходные изменения формы кривой ингибирования роста корня и гипокотиля зеатином наблюдали при добавлении перекиси водорода (рис. 18).

Таким образом, исследование в разных экспериментальных моделях показало немонотонность концентрационной зависимости действия цитокининов, а также некоторых других физиологически активных веществ. Немонотонность в наших опытах проявлялась в наличии на концентрационной кривой ряда экстремальных точек: минимумов и максимумов. Существенность данных флуктуаций показана с использованием методов математической статистики.

Зеатин, мкМ

Рис. 18

Концентрационная зависимость действия зеатина на длину корня(А) и гипокотиля (Б) проростков рапса в присутствии различных концентраций перекиси водорода (в %% от контроля без зеатина, по данным рис. 3.14): 1 -0; 20,3; 3 — 1;4 — 3;5 — 10 мМ. Сравнения между средними осуществляли с использованием исходных данных.

ГЛАВА 4. Индуцибельные лектины и устойчивость растений к патогенным организмам и абиотическим стрессам.

Лектины представляют собой сборную группу белков, способных обратимо и специфически связывать («узнавать») углеводные остатки различной химической природы. В силу того, что лектины являются белками с вполне определенной внутриклеточной локализацией, экзогенные обработки лектинами, а также изменение их эндогенного синтеза в трансгенных растениях не могут достаточно точно моделировать изменения их внутриклеточной концентрации. Тем не менее, имеются данные о том, что как увеличение, так и уменьшение уровня эндогенного лектина в трансгенных растениях приводило к сходным аномалиям взаимодействия растений с азотфиксирующими бактериями (Brill et al., 2004). Это свидетельствует о сложном характере взаимосвязи между концентрацией лектинов и вызываемыми ими физиологическими эффектами.

В главе 4 рассмотрены полученные нами и литературные экспериментальные данные относительно возможных защитных и регуляторных функций лектинов, в первую очередь тех, которые способны к индукции под действием физиологически активных веществ. Объектами исследования служили отделенные листья Nicotiana glutinosa и Solanum chacoense, экспланты, вырезанные из клубней картофеля и листьев табака. Показано, что ряд соединений различной природы, включая, альфа-интерферон человека, хитозан, глюкоманнан, декстран-сульфат и целлюлазу, а также инфицирование вирусами (BTM, ХВК, YBK) могут индуцировать активность гемагглютининов. Эта индукция имеет сложный характер распределения между белковыми фракциями, а также зависимости от времени после обработки и концентрации вещества-индуктора.

Развитие сверхчувствительной реакции сопровождалось также достаточно сложным распределением активности лектинов в пространстве и во времени. Можно выделить, по крайней мере, 4 зоны. Непосредственно вокруг некроза (2 мм) отмечали повышение активности лектинов в ранние сроки во всех фракциях. Зона 5-9 мм характеризовалась максимумом активности лектинов фракции слабо связанных и снижением активности прочно связанных мембранных лектинов в ранние сроки после инфицирования. Соотношение активности в различных фракциях в межнекротической области было противоположным с уменьшением количества лектинов в легкорастворимой фракции. Очевидно, влияние расстояния до центра некроза на активность лектинов и концентрацию некоторых других соединений опосредовано градиентом определенных веществ, возникающих в сайтах взаимодействии

вируса и растения и распространяющихся в соседние клетки. Независимо от того, связаны ли они с индукцией восприимчивости патогеном или с сигналами, продуцируемыми защитной системой растения, этот градиент, по крайней мере, изначально должен быть монотонным. Из этого следует, что разнонаправленные изменения активности лектинов, которые наблюдали на разном расстоянии от центра некроза, можно интерпретировать как проявления немонотонной концентрационной зависимости, а изменения направленности изменений в динамике патологического процесса - как изменения формы подобной концентрационной зависимости с вариабельностью, сходной с вариабельностью кривых цитокининов или АБК.

Об изменении количества лектинов в проростках пшеницы судили по изменению количества антигена фитогемагглютинина пшеницы при проведении иммуноферментного анализа. При обработке 1 и 10 мМ перекиси водорода наблюдали транзитное более чем двукратное увеличение количества лектинов с максимумом через 2 ч.

Известно, что увеличением активности лектинов сопровождаются как ответы на стрессовые воздействия, так и процессы роста и морфогенеза. Все это позволяет предположить, что индуцируемые изменения опосредованы общим процессом. Увеличение активности лектинов при обработке перекисью водорода свидетельствует о том, что одним из таких интегральных процессов может быть транзитное повышение концентрации активных форм кислорода -окислительный стресс. Большой массив литературных данных позволяет также сделать вывод о возможной роли лектинов в прохождении цикла дестабилизации и стабилизации цитоскелета. Связывание и диссоциация лектинов с компонентами цитоскелета наряду с синтезом de novo, вероятно, вносит вклад в стресс индуцируемые изменения активности лектинов различных фракций при стрессовых воздействиях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучение концентрационных зависимостей является неотъемлемой частью оптимизации технологии применения физиологически активных веществ. В данной работе исследовали концентрационный аспект активности фитогормональных веществ (преимущественно с цитокининовой активностью) и соединений, связанных с протеканием окислительного стресса. Основным модельным объектом была патосистема, включающая возбудитель мучнистой росы Erysiphe graminis f. sp. tritici и растения пшеницы. Возбудитель мучнистой росы злаков является достаточно удобным объектом для изучения взаимодействия растения и паразита в эктофитной стадии.

Как было установлено нами, такие параметры развития возбудителя мучнистой росы, как направление роста аппрессориальной ростковой трубки и диаметр патоген-индуцированного гало, способны изменяться под действием цитокининов, про- и антиоксидантов и могут быть использованы для количественного описания патогенеза. При этом зависимости этих параметров от концентрации экзогенного цитокинина были многофазными и немонотонными, имели экстремальные точки в виде одного или большего числа максимумов и минимумов.

Для более подробного исследования зависимости доза-эффект в качестве оценки изменения восприимчивости растений пшеницы и иммуномодулирующих свойств физиологически-активных веществ использовали изменение поверхностной плотности колоний патогена. Полученные концентрационные кривые для зеатина и некоторых других цитокининов также немонотонны: имели области положительной и отрицательной модуляции. Наблюдали варьирование формы и положения отдельных элементов концентрационной зависимости как в независимых экспериментах, так и при изменении условий освещенности, минерального состава среды или дополнительной обработке другими физиологически активными веществами. Подбором контрастных условий получали резко отличающиеся концентрационные зависимости в пределах одного и того же эксперимента, а постепенные изменения вызывали постепенные изменения формы кривой. В целом, концентрационная зависимость иммуномодулирующих свойств цитокининов в использованной патосистеме была представлена вариабельной многофазной кривой, форма которой изменялась в пределах от единственного минимума (индукция устойчивости) до единственного максимума (индукция восприимчивости к патогену). Из более 70-ти полученных кривых примерно половина имела по 2 выраженных максимума и минимум между ними.

При широком распространении процессов с субстратным ингибированием достаточно высокой должна быть и вероятность их сочетания. Нами построена математическая модель, соответствующая последовательному соединению таких процессов. При проведении численного эксперимента форма виртуальной концентрационной кривой менялась при изменении параметров притока и расходования цитокининов. Оказалось возможным подобрать значения параметров, которым соответствовали кривые сложной формы с 2-мя максимумами, сходные с получаемыми в реальном эксперименте.

Сложная концентрационная кривая, изменяющаяся в зависимости от физиологического состояния растения, затрудняет поиск оптимальных условий при практическом использовании физиологически активных веществ.

Оказалось, что результат применения такого классического индуктора устойчивости, как салициловая кислота, может изменяться в достаточно широких пределах в присутствии цитокининов. В той мере, в какой обработка разными концентрациями экзогенных цитокининов способна моделировать изменения их эндогенного содержания в естественных условиях, наши эксперименты демонстрируют, по крайней мере, для некоторых индукторов устойчивости зависимость величины и направления иммуномодуляции от физиологического состояния ткани и особенностей цитокининового обмена. В этом случае стабильность результатов при практическом использовании может быть достигнута при стабилизации нужной формы концентрационной кривой.

Многофазные концентрационные зависимости получены также при исследовании действия цитокининов на рост корня и гипокотиля проростков рапса и томатов, синтез бета-амарантина в Амарантус-тесте. Немонотонность проявлялась на фоне характерного ингибирующего (ростовые процессы) или стимулирующего (синтез бета-амарантина) тренда. Для немонотонного компонента были характерны те же свойства, что и для иммуномодулирующей активности: высокая вариабельность при изменении условий эксперимента, влияние на форму кривой иммуномодуляторов иной химической природы (салициловая кислота) или модификаторов метаболизма цитокининов (тидиазурон).

Полученные данные свидетельствуют в пользу общего механизма, который лежит в основе многофазности концентрационной зависимости как иммуномодулирующей, так и рострегулирующей и, вероятно, иных активностей цитокининов. Определенную общность можно последить в характере изменений активности лектинов и, по-видимому, многих других белковых и небелковых веществ при биотических и абиотических стрессах с одной стороны, и процессах роста и морфогенеза с другой. При этом в условиях, когда классификация вещества как индуктора или ингибитора носит ситуационный характер, расшифровка физиологического значения динамики при инфицировании может быть другой, чем, если считать регулятор только индуктором или только ингибитором. Широкий круг разнообразных явлений, объединяемых сходством концентрационных зависимостей или сопровождающихся индукцией лектинов, свидетельствует о том, что механизм их регуляции зависит от некоторых интегральных процессов в растительной клетке. Этой роли, вероятно, хорошо соответствуют окислительный стресс и перестройки цитоскелета, которые можно наблюдать как при действии стрессоров, так и при росте или морфогенезе.

При построении суммарных концентрационных кривых с использованием отдельных кривых независимых экспериментов в качестве повторностей

происходило уменьшение амплитуды колебаний восприимчивости и потеря наиболее вариабельных элементов кривой. Соответствующие закономерности можно легко экстраполировать, предположив, что в полевом эксперименте следует ожидать упрощения формы кривой, и, наоборот, распространить на уровень отдельных растений или клеток. Несмотря на невозможность построения концентрационной зависимости для отдельного растения, совершенно очевидно, что совокупности параметров его цитокининового метаболизма соответствует кривая определенной формы. При этом наблюдаемые в одном поле зрения разные типы дифференциации инфекционных структур возбудителя мучнистой росы, гало различных размеров и структуры и наличие инфекционных единиц на разной стадии развития, возможно, являются результатом вариабельности, генерируемой с участием многофазного механизма.

Известно, что присутствие в естественных популяциях (в отличие от агросистем) растений с различными генами устойчивости и рас патогена, обладающих разными возможностями по их преодолению, придает данной системе устойчивость и возможность длительного сосуществования растения и паразита. Очевидно, что многофазность концентрационных зависимостей для регуляторных соединений должна приводить к увеличению многообразия вариантов физиологического состояния организма даже в совокупности особей, имеющих идентичный геном. Колебания средней восприимчивости растений пшеницы в разных вариантах обработки цитокининами, а также разная судьба отдельных конидий, пытающихся проникнуть в соседние клетки эпидермиса, дают амплитуду результатов инфицирования, вполне сопоставимую с действием вертикальной устойчивости. Случайная вариабельность физиологического характера, по-видимому, имеет важное адаптивное значение, частично выравнивая шансы на выживание разных генотипов. Вариабельность восприимчивости растения и агрессивности фитопатогена на уровне популяции или отдельных клеток одного организма может оказывать воздействие на устойчивость биосистемы, аналогичное генетическому разнообразию, и играет роль в выживании как растения-хозяина, так и патогена.

ВЫВОДЫ

1. Цитокинины оказывают влияние на морфологию первичных инфекционных структур возбудителя мучнистой росы пшеницы. Рост аппрессориальной ростковой трубки возбудителя мучнистой росы нормальной морфологии на листьях пшеницы происходит преимущественно вдоль главной

жилки листа, напротив, большая часть аномальных аппрессориев растет в перпендикулярном направлении. Обработка цитокининами изменяет долю нормальных аппрессориев, растущих в продольном направлении. Выдвинута гипотеза, что направление роста аппрессориальной ростковой трубки имеет адаптивное значение. При благоприятном контакте с эпидермисом первичной инфекционной трубки рост происходит вдоль главной жилки листа в ту же восприимчивую клетку, при неблагоприятном первичном контакте - поперек жилки с попыткой проникновения в ближайшую другую клетку.

2. Размеры и структура гало (концентрические образования вокруг мест контакта растения и возбудителя мучнистой росы) способны изменяться при действии фитогормонов цитокининового типа, про- и антиоксидантов.

3. Концентрационная зависимость действия цитокининов на восприимчивость растений пшеницы к мучнистой росе, характер и направление роста первичных инфекционных структур фитопатогена, а также на размеры гало имеет многофазный характер и может включать области положительной и отрицательной модуляции. Изменение формы концентрационной кривой действия зеатина на число колоний возбудителя мучнистой росы происходит при изменении физиологических условий (минерального питания, освещения) или в присутствии дополнительных иммуномодуляторов. Спектр концентрационных зависимостей при варьировании условий, включает кривые доза-эффект в диапазоне от единственного максимума до единственного минимума, а также кривые промежуточной формы с 2-мя максимумами и минимумом между ними.

4. Концентрационная зависимость действия цитокининов на рост корня и гипокотиля проростков рапса и томатов, а также на синтез бета-амарантинов в амарантус-тесте является немонотонной. Это проявляется в наличии одной или нескольких экстремальных точек на фоне характерного ингибирующего (регуляция роста) или стимулирующего (синтез бета-амарантина) тренда. Форма немонотонного компонента общей зависимости варьирует аналогично кривым, полученным для иммуномодулирующих свойств цитокининов.

5. Разработана математическая модель, отражающая многофазность, высокую вариабельность при изменении условий эксперимента и разнонаправленность физиологической активности экзогенных цитокининов на восприимчивость к возбудителю мучнистой росы и ростовые процессы. При проведении численной имитации изменение величины параметров, соответствующих притоку и расходованию цитокининов, воспроизводит основные типы экспериментальных кривых.

6. Уровень активности ряда физиологически активных веществ изменяется при применении совместно с цитокининами. Выдвинута гипотеза о том, что в

основе их иммуномодулирующей активности лежит общий механизм, тесно связанный с цитокининовым обменом. Неоднозначные результаты при практическом использовании иммуномодуляторов могут быть связаны с подвижностью метаболизма цитокининов при изменении условий среды или действии стрессовых факторов.

7. Обработка олигоаденилатами растительного происхождения усиливает рост микрочеренков в культуре in vitro и жизнеспособность эксплантов картофеля при культивировании апикальных меристем. Влияние этих веществ на концентрацию вирусного антигена неоднозначно: в разных условиях может быть получено как ингибирование, так и стимулирование.

8. Обработка иммуномодуляторами и инфицирование вирусами растений табака и картофеля индуцируют разнонаправленные изменения активности лектинов со сложным пространственным распределением в околонекротических тканях. Перекись водорода вызывает транзитное повышение антигена агглютинина зародышей в корнях проростков пшеницы на раннем этапе и его снижение в более поздний период. Выдвинута гипотеза о роли оксидативного стресса в регуляции количества лектинов и его взаимосвязи с прохождением циклов дестабилизации и стабилизации цитоскелета в ходе реакции растения на биотические и абиотические стрессоры.

9. Многофазность концентрационных зависимостей воздействия регуляторных соединений на устойчивость и ростовые процессы приводит к увеличению многообразия вариантов физиологического состояния организма. Увеличение физиологической вариабельности имеет адаптивное значение, повышая устойчивость биосистемы: играет роль в выживании растения-хозяина и патогена.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ В РЕЦЕНЗИРУЕМЫХ ЖУРНАЛАХ И ПАТЕНТЫ

1. Бабоша A.B. Действие альфа-интерферона человека и вирусной инфекции на активность фитогемагглютининов и другие показатели в листьях растений табака и картофеля // Физиология растений. 1995. Т.42. N 6. С. 891898.

2. Ладыгина М.Е., Бабоша A.B. Физиолого-биохимическая природа вирусного патогенеза, устойчивости и регуляции антиинфекционной активности // Физиология растений. 1996. Т. 43. N 5. С. 729-742.

3. Бабоша A.B., Бойко В.В., Морозова З.Р. Действие олигоаденилатов растительного происхождения на вирусную инфекцию, антистрессорные и рострегулирующие свойства в культуре ткани картофеля // Физиология растений. 2002. Т. 49. № 3. С. 444^)50.

4. Бойко В.В., Бабоша A.B. Использование веществ с антистрессовой активностью при оздоровлении картофеля от вирусов методом апикальной меристемы // Биотехнология. 2002. № 3. С. 42.

5. Бабоша A.B. Изменение активности лектинов в растениях, обработанных индукторами устойчивости // Известия АН. Сер. биол. 2004. № 1. С. 59-64.

6. Бабоща A.B. Пространственное распределение активности лектинов в околонекротической зоне листьев табака, инокулированного вирусом табачной мозаики // Известия АН. Сер. биол. 2004. № 3. С. 319-325.

7. Сережкина Г.В., Мишина Г.Н., Кондратьева В.В., Рябченко A.C., Бабоша A.B., Тапиева М.Н., Аветисян Т.В., Андреев Л.Н., Лапочкина И.Ф. Динамика абсцизовой кислоты и цитокининов в листьях пшенично-эгилопсных линий и их родительских форм при поражении мучнистой росой // Известия АН. Сер. биол. 2004. № 5. С. 532-538.

8. Бабоша A.B. Иммуномодулиругощие свойства различных природных цитокининов в патосистеме пшеница-возбудитель мучнистой росы // Микология и фитопатология. 2004. Т. 38. № 6. С.84-89.

9. Бабоша A.B. Изменение содержания агглютинина зародышей пшеницы в растениях, обработанных перекисью водорода // Прикл. биохим. микробиол. 2006. Т. 42. № 2. С. 247-251.

10. Бабоша A.B. Индуцибельные лектины и устойчивость растений к патогенным организмам и абиотическим стрессам // Биохимия. 2008. Т. 73. № 7. С. 1007-1022.

11. Бабоша A.B. Лектины и проблема распознавания фитопатогенов растением-хозяином // Журнал общей биологии. 2008. Т. 69. № 4. С. 318-335.

12. Бабоша A.B., Рябченко A.C., Аветисян Т.В. Влияние экзогенных цитокининов на динамику развития и дифференциацию инфекционных структур возбудителя мучнистой росы пшеницы // Цитология. 2009. Т. 51. № 7. С. 602-611.

13. Рябченко A.C., Аветисян Т.В., Бабоша A.B. Особенности роста возбудителя мучнистой росы пшеницы вдоль и поперек длинной оси листа под действием экзогенного зеатина // Известия АН. Сер. биол. 2009. № 5. С. 1-13.

14. Babosha A.V. Regulation of resistance and susceptibility in wheat powdery mildew pathosystem with exogenous cytokinins // J. Plant Physiol. 2009. V. 166. P. 1892-1903.

15. Комарова Г.И., Бабоша A.B. Многофазный характер зависимости роста корня и гипокотиля проростков рапса от концентрации зеатина и тидиазурона применительно к условиям биологических систем жизнеобеспечения // Авиакосмическая и экологическая медицина. 2010. Т. 44. №2. С. 61-65.

16. Бабоша A.B., Комарова Г.И. Совместное действие зеатина и перекиси водорода на рост проростков рапса и томатов применительно к условиям биологических систем жизнеобеспечения // Авиакосмическая и экологическая медицина. 2010. Т. 44. № 3. С. 46-50.

17. Бабоша A.B. Зависимость иммуномодулирующих свойств природных и синтетических цитокининов от их концентрации в патосистеме пшеница-

возбудитель мучнистой росы // Микология и фитопатология. 2011. Т. 45. № 6. С. 92-97.

18. Бабоша А.В. Особенности концентрационной зависимости действия зеатина на восприимчивость растений пшеницы к возбудителю мучнистой росы // Известия РАН. Сер. биол. 2012. № 6. С. 1-9.

19. Бабоша А.В., Комарова Г.И. Концентрационные эффекты действия салициловой кислоты и зеатина на рост корня и гипокотиля проростков томатов и рапса // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. 2013. №4(1). С. 145-152.

ПУБЛИКАЦИИ В МАТЕРИАЛАХ КОНФЕРЕНЦИЙ И СБОРНИКАХ

20. Бабоша А.В. Исследование биологических свойств растительных олигоаденилатов// Биотехнология в картофелеводстве (Под ред. Л.Н. Трофимца и С.М. Мусина). М.: НИИКХ, Россельхозакадемия, 1991. С. 104-110.

21. Бабоша А.В., Ладыгина М.Е. Определение фитогемагглютининов в связи с вирусоустойчивостью картофеля // Физиолого-биохимические и биофизические методы диагностики степени устойчивости растений к патогенам и другим факторам (Под ред. М.Е. Ладыгиной). М.: МГУ, 1992. С. 43-52.

22. Babosha A.V. The increase of the phytohemagglutinins activity in tobacco and potato leaves after virus infection and the treatment with dsRNA, human alpha-interferon// Fundamental and applied problems in phytovirology: Abstr. Intern. Conf. (Ukrain, Crimea, Yalta 22-26 May, 1994). P. 18.

23. Ladygina M.E., Babosha A.V. The action of human interferon in potato and tobacco leaves, possible ways of regulation of the antiinfection activity II Modern Fungicides and Antifungal compounds (H. Lyr, P.E. Russell and H.D. Sisler eds.), Reinhardsbrunn Symposium 1995. Andover, Hampshire (UK): Intercept Ltd, 1996. P. 527-534.

24. Babosha A.V. Spatial distribution of lectins in local lesion surrounding during virus-induced hypersensitive response in tobacco leaves / Modern Fungicides and Antifungal compounds. Abstr. 12th. Intern. Symp. (Thuringia, Germany, May 24-29, 1998). P. 56.

25. Бабоша А.В. Влияние кинетина на устойчивость пшеницы к мучнистой росе / Регуляторы роста и развития растений в биотехнологиях. Тезизы 6-й Международной конференции (Москва, 26-28 июня 2001 г.). М.: Изд-во МСХА, 2001. С. 81.

26. Бабоша А.В. Лектин-лигандные взаимодействия в регуляции фотосинтетического транспорта электронов в инфицированных растениях / Актуальные вопросы экологической физиологии растений в XXI веке: Тезисы докладов Международной конференции (Сыктывкар, 1-6 октября 2001 г.). С. 158-159.

27. Бабоша А.В., Мансуров В.В., Петухов С.Н., Мусин С.М. Электрическое сопротивление околонекротической зоны листовой ткани при инфицировании

вирусом табачной мозаики / Актуальные вопросы экологической физиологии растений в XXI веке: Тезисы докл. междунар. конференции (Сыктывкар, 1-6 октября 2001 г.). С. 159-160.

28. Бабоша A.B. Регуляция фотосинтетического транспорта электронов в инфицированных растениях под действием лектинов и углеводных лигандов / Современная микология в России. Тезисы докладов 1 съезда микологов России / Под ред. Т.А.Белозерской и др. М.: Изд-во «Национальная академия микологии», 2002. С. 172.

29. Бабоша A.B. Влияние экзогенной АБК на устойчивость пшеницы к мучнистой росе/ Современная микология в России. Тезисы докладов 1 съезда микологов России / Под ред. Т.А. Белозерской и др. М.: Изд-во «Национальная академия микологии», 2002. С. 173.

30. Рябченко A.C., Сережкина Г.В., Мишина Г.Н., Аветисян Т.В., Бабоша A.B. Ультраструктурное исследование морфологической изменчивости возбудителя мучнистой росы пшеницы в связи с его паразитической адаптацией к различным по устойчивости пшенично-эгилопсным линиям // XIII Российский симпозиум по растровой микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел (Черноголовка, 2—4 июня 2003 г.). С. 189.

31. Бабоша A.B. Иммуномодулирующие свойства различных природных цитокининов в патосистеме пшеница-возбудитель мучнистой росы / V Съезд общества физиологов растений России. Тезисы докладов (Пенза, 15-21 сентября 2003 г.). С. 172-173.

32. Babosha A.V. Immunomodulation by various natural cytokinins in a pathogenic system the wheat — powdery mildew/ Abstracts of 14th International Reinhardsbrunn Symposium "Modern Fungicides and Antifungal Compounds" (Thuringia, Germany, 2004). P. 74.

33. Бабоша A.B. Иммуномодулирующие свойства АБК в патосистеме пшеница-возбудитель мучнистой росы / Ботанические сады как центры сохранения биоразнообразия и рационального использования растительных ресурсов. Материалы международной конференции, посвященной 60-летию Главного ботанического сада им. Н.В. Цицина РАЩМосква, 5-7 июля 2005 г.). С. 38-40.

34. Бабоша A.B., Кондратьева В.В., Рябченко A.C., Мишина Г.Н., Аветисян Т.В., Сережкина Г.В., Чикида H.H., Лапочкина И.Ф., Андреев Л.Н. Динамика цитокининов и абсцизовой кислоты при инфицировании мучнистой росой пшеницы в патосистемах с различным уровнем совместимости / Ботанические сады как центры сохранения биоразнообразия и рационального использования растительных ресурсов. Материалы международной конференции, посвященной 60-летию Главного ботанического сада им. Н.В.Цицина РАН (Москва, 5-7 июля 2005 г.). С. 35-38.

35. Рябченко A.C., Мишина Г.Н., Сережкина Г.В., Аветисян Т.В., Чикида H.H., Лапочкина И.Ф., Бабоша A.B., Андреев Л.Н. Морфологическая изменчивость возбудителя мучнистой росы пшеницы как следствие проявления иммунологического потенциала различных по устойчивости видов рода

Эгилопс и пшенично-эгилопсных линий / Ботанические сады как центры сохранения биоразнообразия и рационального использования растительных ресурсов. Материалы международной конференции, посвященной 60-летию Главного ботанического сада им. Н.В.Цицина РАН (Москва, 5-7 июля 2005 г.). С. 437-440.

36. Рябченко А.С., Бабоша А.В., Аветисян Т.В. Применение сканирующей электронной микроскопии при оценке влияния зеатина на развитие мучнистой росы пшеницы // Тезисы докладов XIV Российского симпозиума по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел (Черноголовка, 30 мая-2 июня 2005 г.). С. 264.

37. Бабоша А.В., Рябченко А.С., Аветисян Т.В. Применение сканирующей электронной микроскопии при оценке влияния 3-амино-1,2,4-триазола на развитие мучнистой росы пшеницы // Тезисы докладов XXI Российской конференции по электронной микроскопии (Черноголовка, 5-10 июня 2006 г.). С. 201.

38. Бабоша А.В. Нелинейная зависимость иммуномодулирующего действия цитокининов от их концентрации в патосистеме пшеница-возбудитель мучнистой росы / Современная физиология растений: от молекул до экосистем: Материалы докладов международной конференции. Ч. 1. (Сыктывкар, 18-24 июня 2007 г.). С. 247-249.

39. Бабоша А.В., Рябченко А.С., Аветисян Т.В. Морфологическая изменчивость возбудителя мучнистой росы пшеницы при использовании цитокининов // Тез. докл. XV Российского симпозиума по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел (Черноголовка, 4-7 июня 2007). С. 275-276.

40. Бабоша А.В. Влияние экзогенных моносахаридов и лектинов на активность реакции Хилла в изолированных хлоропластах здоровых и инфицированных растений//Бюллетель ГБС. 2007. Т. 194. С. 158-169.

41. Babosha A.V., Ryabchenko A.S., Avetisyan T.V. Action of exogenous cytokinins on morphological variability of the causal organism of wheat powdery mildew / Modern Fungicides and Antifungal Compounds V. Proceedings of the 15th International Reinhardsbrunn Symposium May 06 - 10, 2007, Friedrichroda, Germany/ H.W. Dehne, H.B. Deising, U. Gisi, K.H. Kuck, P.E. Lyr (Eds.)/ Braunschweig: DPG Selbstverlag, 2008. P. 195-196.

42. Babosha A.V. Immunomodulation with zeatin in wheat-powdeiy mildew pathosystem in the presence of plant oligoadenylates / Modern Fungicides and Antifungal Compounds V. Proceedings of the 15th International Reinhardsbrunn Symposium May 06 - 10, 2007, Friedrichroda, Germany/ H.W. Dehne, H.B. Deising, U. Gisi, K.H. Kuck, P.E. Lyr (Eds.)/ Braunschweig: DPG Selbstverlag, 2008. P. 193-194.

43. Аветисян Г.А., Бабоша А.В. Влияние перекиси водорода на развитие мучнистой росы пшеницы // Фундаментальные и прикладные проблемы ботаники в начале XXI века: Материалы всероссийской конференции

(Петрозаводск, 22-27 сентября 2008 г.). Часть 2. Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 2008. 349 с. С. 103-105.

44. Рябченко A.C., Аветисян Т.В., Аветисян Г.А., Бабоша A.B. Влияние экзогенного зеатина на ранние этапы развития возбудителя мучнистой росы пшеницы // Фундаментальные и прикладные проблемы ботаники в начале XXI века: Материалы всероссийской конференции (Петрозаводск, 22-27 сентября

2008 г.). Часть 2. Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 2008. 349 с. С. 153-156.

45. Аветисян Г.А., Бабоша A.B. Влияние перекиси водорода и З-амино-1, 2, 4-триазола на развитие мучнистой росы пшеницы // Современная микология в России. Материалы 2-го Съезда микологов России. М.: Национальная академия микологии, 2008. Т. 2. С. 157.

46. Бабоша A.B., Рябченко A.C., Аветисян Т.В. Немонотонность зависимости доза-эффект как причина неоднозначности иммуномодулирующих свойств цитокининов // Современная микология в России. Материалы 2-го Съезда микологов России. М.: Национальная академия микологии, 2008. Т. 2. С. 163.

47. Рябченко A.C., Аветисян Т.В., Аветисян Г.А., Бабоша A.B. Влияние экзогеного зеатина на морфологические показатели развития колоний возбудителя мучнистой росы пшеницы// Современная микология в России. Материалы 2-го Съезда микологов России. М.: Национальная академия микологии, 2008. Т. 2. С. 202-203.

48. Аветисян Г.А., Бабоша A.B. Роль окислительного стресса в патогенезе возбудителя мучнистой росы пшеницы // Бюллетель ГБС. 2009. Т. 196. С. 158165.

49. Бабоша A.B., Комарова Г.И., Аветисян Т.В. Влияние дипиридамола на иммуномодулирующие свойства зеатина в патосистеме растения пшеницы-возбудитель мучнистой росы // Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2009. №1.

50. Бабоша A.B., Рябченко A.C., Аветисян Т.В., Комарова Г.И. Многофазный характер зависимости иммуномодулирующей и рострегулирующей активности цитокининов от их концентрации / 1нтродукц1я, селекщя та захист рослин: Матер1али ДругоУ м1жнародно1 науковоТ конференцп (м. Донецьк, 6-8 жовтня

2009 р.). Донецьк, 2009. Том 1. 434 с. С. 55-60.

51. Рябченко A.C., Бабоша A.B., Аветисян Т.В. Использование сканирующей электронной микроскопии при исследовании особенностей роста возбудителя мучнистой росы пшеницы вдоль и поперек длинной оси листа / Тезисы докладов XXI Российского симпозиума по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твёрдых тел (РЭМ-2009) (Черноголовка, 31 мая-3 июня 2009 г). С. 244.

52. Аветисян Г.А., Бабоша A.B. Особенности развития возбудителя мучнистой росы пшеницы при действии окислительного стресса / Тезисы докладов XXI Российского симпозиума по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твёрдых тел (РЭМ-2009) (Черноголовка, 31 мая-3 июня 2009 г). С. 215.

53. Бабоша А.В., Рябченко А.С., Комарова Г.И., Аветисян Т.В. Многофазные концентрационные зависимости иммуномодулирующих и рострегулирующих свойств фитогормонов// Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2010. № 1.С. 84.

54. Бабоша А.В., Рябченко А.С., Аветисян Т.В. Действие абсцизовой кислоты на восприимчивость растений и морфологию возбудителя мучнистой росы пшеницы // Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2010. № 1. С. 84-85.

55. Рябченко А.С., Бабоша А.В., Аветисян Т.В., Комарова Г.И. Закономерности направления роста возбудителя мучнистой росы пшеницы относительно длинной оси листа на видах рода Aegilops L. // Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2010. № 1. С.125-126.

56. Бабоша А.В., Комарова Г.И., Рябченко А.С., Аветисян Т.В. Особенности концентрационной кривой рострегулирующих и иммуномодулирующих свойств цитокининов в норме и при моделировании состояния стресса / Тезисы докладов Всероссийского симпозиума «Растение и стресс» (Москва, 9-12 ноября 2010 г). С. 43^14.

57. Babosha A.V., Avetisyan G.A., Ryabchenko A.S., Avetisyan T.V. The action of 3-amino-l,2,4-triazole on early developmental stages of the wheat powdery mildew pathogen. // Proceedings of the 16th International Reinhardsbrunn Symposium «Modern Fungicides and Antifungal Compounds» (Germany, Fredrichroda, 2011). P. 381-384.

58. Ryabchenko A.S., Babosha A.V., Avetisyan T.V. Regularities of direction relative to the axis of wheat leaf for growth of wheat powdery mildew infection structures. Proceedings of the 16th International Reinhardsbrunn Symposium «Modern Fungicides and Antifungal Compounds», (Germany, Fredrichroda, 2011). P. 385-388.

59. Бабоша A.B., Рябченко A.C., Комарова Г.И., Аветисян Г.А., Аветисян Т.В. Многофазные концентрационные зависимости в регуляции ростовых процессов и восприимчивости к фитопатогенам / Ботанические сады в современном мире: теоретические и прикладные исследования. Материалы Всероссийской научной конференции с международным участием, посвященной 80-летию со дня рождения академика Л.Н.Андреева (5-7 июля 2011 г., г, Москва). М.: Товарищество научных изданий КМК, 2011. 765 с. С. 35-39.

Отпечатано с готового оригинал—макета в Типографии «Фабрика Переплета Триумф» Подписано в печать 20.03.2014 г. Формат 60x84 Объем 3 п.л. Тираж 100 экз. Тел.8 (916) 351-39-43

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Бабоша, Александр Валентинович, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ГЛАВНЫЙ БОТАНИЧЕСКИЙ САД ИМ. Н.В.ЦИЦИНА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

051:0145'1084

На правах рукописи Бабоша Александр Валентинович

Специальность 03. 01. 05 - Физиология и биохимия растений

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва-2014

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 6

Основные представления о природе иммунитета растений 11

Фитогормоны и патогенез 28

Синтез, рецепция и транспорт цитокининов и АБК 29

Изменение уровня цитокининов и абсцизовой кислоты при инфицировании 40

Синтез растительных гормонов патогенами 45

Иммуномодулирующие свойства экзогенных цитокининов и АБК 50 Механизмы влияния цитокининов и АБК на устойчивость растений 55 Многофазность концентрационных зависимостей физиологически активных веществ 58

Цели и задачи исследования 70

ГЛАВА I. МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ ВОЗБУДИТЕЛЯ МУЧНИСТОЙ РОСЫ ПШЕНИЦЫ И ЦИТОФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ РАСТЕНИЯ КАК ВОЗМОЖНОЕ ФЕНОТИПИЧЕСКОЕ ПРОЯВЛЕНИЕ ИЗМЕНЕНИЙ В СОСТОЯНИИ ПАТОСИСТЕМЫ

1.1 Особенности развития возбудителя мучнистой росы пшеницы 77

1.1.1 Действие экзогенных цитокининов на параметры ранних этапов развития возбудителя мучнистой росы пшеницы 82

1.1.2 Развитие возбудителя мучнистой росы пшеницы при моделировании окислительного стресса 89

1.2 Регуляция направления роста возбудителя мучнистой росы пшеницы вдоль и поперек главной жилки листа 93

1.3 Образование и вариабельность гало - ответная реакция эпидермальных клеток злаков на проникновение возбудителя мучнистой росы 114

1.3.1 Изменение размеров гало под действием экзогенных цитокининов

121

1.3.2 Изменчивость гало под действием оксидативного стресса и метаболических ингибиторов 125

1.3.3 Изучение гало методом сканирующей электронной микроскопии

137

ГЛАВА II. МНОГОФАЗНОСТЬ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ 143

2.1 Иммуномодулирующие свойства цитокининов в патосистеме пшеница-возбудитель мучнистой росы 145

2.2 Форма концентрационной кривой иммуномодулирующих свойств цитокининов и ее варьирование 152

2.3 Влияние иммуномодуляторов на форму концентрационной кривой иммуномодулирующей активности зеатина при совместном применении

172

2.4 Математическая модель концентрационной зависимости влияния цитокининов на восприимчивость листьев пшеницы к возбудителю мучнистой росы 181

2.5 Динамика цитокининов и абсцизовой кислоты при инфицировании мучнистой росой пшеницы в патосистемах с различным уровнем совместимости 202

2.6 Биологические свойства олигоаденилатов растительного происхождения 207

2.6.1 Действие олигоаденилатов растительного происхождения на вирусную инфекцию и рост черенков картофеля в культуре ткани in vitro 214

2.6.2 Олигоаденилаты растительного происхождения при оздоровлении картофеля от вирусов методом апикальной меристемы 220

2.6.3 Цитокининподобная активность интерферона и олигоаденилатов растительного происхождения 227

2.6.4 Иммуномодулирующие свойства олигоаденилатов растительного происхождения в патосистеме пшеница-возбудитель мучнистой росы и их влияние на форму концентрационной кривой зеатина при совместном применении 231

2.7 Изменение восприимчивости пшеницы к возбудителю мучнистой росы при обработке экзогенной АБК 238

2.8 Влияние медиаторов кальциевой сигнальной системы на восприимчивость пшеницы к мучнистой росе 248 ГЛАВА III. МНОГОФАЗНОЕ ДЕЙСТВИЕ ЭКЗОГЕННЫХ ЦИТОКИНИНОВ В РЕГУЛЯЦИИ РОСТОВЫХ ПРОЦЕССОВ 252

3.1 Концентрационная зависимость действия цитокининов на рост корня

и гипокотиля проростков рапса 255

3.2 Многофазность концентрационной зависимости действия цитокининов на рост корня и гипокотиля проростков томатов 274

3.3 Влияние цитокининов разного химического строения на длину проростков рапса и томатов 277

3.4 Суммарные концентрационные кривые томатов и рапса 288

3.5 Вариабельность концентрационной зависимости рострегулирующего действия цитокининов в присутствии иммуномодуляторов и цитокининов иной природы 297

3.5.1 Взаимное влияние тидиазурона и зеатина 297

3.5.2 Концентрационная кривая зеатина при моделировании окислительного стресса 306

3.5.3 Изменение концентрационной кривой зеатина в присутствии салициловой кислоты 314

3.6 Многофазность концентрационной зависимости активности цитокининов в амарантус-тесте 328

ГЛАВА IV. ИНДУЦИБЕЛЬНЫЕ ЛЕКТИНЫ И УСТОЙЧИВОСТЬ РАСТЕНИЙ К ПАТОГЕННЫМ ОРГАНИЗМАМ И АБИОТИЧЕСКИМ СТРЕССАМ 335

4.1 Изменение активности лектинов при инфицировании и в растениях, обработанных индукторами устойчивости 339

4.2 Пространственное распределение активности лектинов в околонекротической зоне листьев табака, инокулированного вирусом табачной мозаики 351

4.3 Влияние экзогенных моносахаридов и лектинов на активность реакции Хилла в изолированных хлоропластах здоровых и инфицированных растений 361

4.4 Изменение содержания агглютинина зародышей пшеницы (АЗП) в растениях, обработанных перекисью водорода 373

4.5 Роль лектинов в регуляции защитных реакций и ростовых процессов растений 382

4.5.1 Индукция лектинов при биотических и абиотических стрессах 383

4.5.2 Лектины и фитогормоны 390

4.5.3 Лектины в ростовых процессах 393

4.5.4 Лектины и окислительный стресс 396

4.5.5 Лектины и цитоскелет 398 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 406 ВЫВОДЫ 420 ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ 422 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 423 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 505 ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ В РЕЦЕНЗИРУЕМЫХ ЖУРНАЛАХ И ПАТЕНТЫ 505 ПУБЛИКАЦИИ В МАТЕРИАЛАХ КОНФЕРЕНЦИЙ И СБОРНИКАХ 507 СВЕДЕНИЯ О ЛИЧНОМ УЧАСТИИ И СОАВТОРАХ 515

ВВЕДЕНИЕ

Особенностью многоклеточных живых организмов является наличие особой подсистемы, ответственной за адаптацию к изменяющимся условиям окружающей среды и предназначенной для поддержания структурной и функциональной целостности. Кроме того, иммунная система распознает и уничтожает чужеродные, измененные или потерявшие функциональность вещества и клетки, сохраняя наиболее важные признаки организма, приобретенные в процессе эволюции. Эти функции иммунной системы активируются при внедрении патогена или действии абиотических стрессоров. Основные представления о закономерностях взаимодействия растения и патогена возникли в результате бурного развития биологии в начале 20-го века и были обобщены Н.И. Вавиловым в разработанной им теории генотипического иммунитета. Им же был предложен термин для обозначения этого нового раздела биологии растений - фитоиммунологии. В связи с иммунитетом растений Н.И. Вавилов выделял две стадии развития паразитов: «проникновение паразита в растение и распространение паразита внутри тканей растения-хозяина» (Вавилов, 1935: цит. по Вавилов, 1986, с.324). Разные исследователи представляли данный процесс с разной степенью детализации. Так, по мнению К.Т. Сухорукова (1952) среди основных этапов следует выделять: развитие патогена на поверхности растения, проникновение в растительную клетку, фазу реакции растения на заражение и итоговый период, внешне проявляющийся симптомами заболевания. Более поздние этапы защитных реакций при патогенезе несут черты сходства и, по-видимому, в определенной степени имеют общую природу с адаптивными реакциями, индуцируемыми в ответ на абиотические стрессовые воздействия.

Интенсивность иммунных ответов организма можно регулировать экзогенными физиологически активными веществами, которые получили

название иммуномодуляторов (ТиапаЬоБ, 2000). Использование таких веществ - одно из перспективных направлений регуляции патогенеза и защиты растений от стрессовых воздействий различной природы (Озерецковская и др., 1994; Андреев, Талиева, 1996; Тютерев, 2002). Вместе с тем их широкое применение наталкивается на трудности, связанные с нестабильностью, а подчас и неоднозначностью их действия (Озерецковская, Васюкова, 2002). Так опрыскивание растений, обладающих определенным уровнем естественной устойчивости, растворами адаптогенов снижало их адаптивный потенциал (Гудковский и др., 2002). Использование препарата гуми 20 с антистрессорным и ростстимулирующим действием способствовало повышению степени распространения твердой головни (Хайруллин и др., 2009). Достаточно стабильная устойчивость ржи к возбудителям ржавчины и мучнистой росы была получена при опрыскивании посевов эпином-экстра, иммуноциофитом и ЦеЦеЦе 460. В то же время использование циркона, тидиазурона, гуми 30, иммуноцитофита и цитодефа дало разнонаправленные результаты иммуномодуляции на листьях разного яруса или в отношении разных патогенов (Смолин, Савельев, 2007).

Имеются примеры, когда разнонаправленность иммуномодулирующего действия проявлялась непосредственно в экспериментах с использованием различных концентраций физиологически активных веществ.

7 6

Эпибрассинолид в концентрации 1(Г- 10_о г/л оказывал ингибирующее действие на развитие В1ро1ап8 Богокшапа на проростках ячменя, однако

меньшая концентрация 10" оказывала стимулирующее действие (Смолин и др., 2010). Наоборот, превышение концентрации классического индуктора устойчивости, салициловой кислоты, выше определенного предела стимулировало восприимчивость к фитофторозу, более того индукция устойчивости у обработанных растительных тканей через определенное время сменялась индукцией восприимчивости (Васюкова и др., 1996). Изменение физиологического состояния клубней картофеля при хранении

вызывало изменения иммунизирующего диапазона концентраций данного вещества на несколько порядков (Васюкова и др., 1996). В связи с этим интересно отметить, что направление действия салициловой кислоты на флоэмную разгрузку в корнях кукурузы также изменялось в зависимости от концентрации или продолжительности экспозиции (Бурмистрова и др., 2009). Возможно, что подобная неоднозначность имеет более общий характер и не ограничивается только защитными реакциями при патогенезе или даже только регуляцией устойчивости к неблагоприятным факторам в целом. В случае такого разнонаправленного действия физиологически активных веществ их невозможно однозначно классифицировать как ингибиторы или активаторы. При практическом применении таких соединений эффект будет варьировать в зависимости от условий применения, а если эти условия плохо изучены или их невозможно контролировать с достаточной степенью точности, результат будет неопределенным. Можно ожидать возникновения сходных проблем и в совершенно неожиданных областях применения экзогенных соединений. Например, инсектициды из класса неоникотиноидов, как оказалось, способны в качестве побочного действия индуцировать салицилат-зависимые защитные реакции, устойчивость к стрессам и увеличение продуктивности в отсутствии насекомых-вредителей (Ford et al, 2010). Однако в других экспериментах увеличение продуктивности не наблюдали (Wilde et al, 2007). Актуальность изучения данного вопроса определяется и тем, что закономерности изменения направления действия подобных физиологически активных веществ могут играть фундаментальную роль в регуляции развития растений и их взаимодействия с окружающей средой.

Приведенные выше примеры свидетельствуют о сложности механизмов устойчивости. Одним из источников неоднозначности при индукции защитных реакций на инфицирование, по-видимому, является необходимость распознавать и находить способы защиты от патогенов с противоположной

стратегией питания: биотрофов и некротрофов (Thomma et al., 1998), а также фитопатогенов и фитофагов (Буров, Долженко, 2008). Другим источником, вероятно, может быть двойственный характер активных форм кислорода (АФК), как компонентов нормального метаболизма и как повреждающих агентов.

Двойственность заложена и в самом функционировании иммунной системы, активированное состояние которой в значительной степени несовместимо с нормальными процессами роста и развития. Эволюционные процессы, по-видимому, протекают в условиях необходимости компромисса между ростом и развитием, ростом и защитой (Herms, Mattson, 1992). Необходимость метаболических изменений, увеличивающих устойчивость к внешним воздействиям, но не всегда оптимальных для роста или развития, ведет к представлениям о цене устойчивости и цене восприимчивости -обстоятельствам, не позволяющим считать наличие гена устойчивости всегда безусловным преимуществом и способствующим тем самым поддержанию полиморфизма в популяции (Brown, 2002; Tian et al2003; Bostock, 2005). В качестве примера можно привести обнаруженную у устойчивого к Y-вирусу картофеля сорта табака повышенную по сравнению с восприимчивым сортом чувствительность к высоким концентрациям озона (Ye et al., 2012). На практике неоднозначность устойчивости может проявляться, например, в снижении числа семян и урожая в целом у устойчивых к мучнистой росе трансгенных линий пшеницы с повышенной экспрессией хитиназ и глюканаз (Kalinina et al., 2011). Снижение урожайности происходит и при использовании индукторов устойчивости (Heil et al., 2000).

Механизм перераспределения ресурсов между различными физиологическими программами может быть непосредственно связан с модификацией цитокининового сигналинга при запуске защитных эффектов, зависимых от R-генов (Igari et al., 2008). При этом происходит изменение содержания и активности фитогормонов. Верно и обратное: приведенные

ниже данные о влиянии фитогормонов на устойчивость свидетельствуют о том, что изменения фитогормональной системы способно модифицировать протекание защитных реакций.

На метаболическом уровне одним из инструментов регуляции процессов, требующих согласования взаимоисключающих эффектов, может быть многофазная концентрационная зависимость физиологического действия у регуляторных соединений. При этом наличие иммуностимулирующей и иммуносупрессорной функции у одного и того же соединения не только более экономно с точки зрения расхода материальных ресурсов, но и должно создать более сложную конфигурацию регуляторных механизмов: при накоплении иммуномодулятора с переходом на ингибиторную ветвь концентрационной кривой химические реакции, которые приводят к его инактивации, будут способствовать усилению иммунного ответа и наоборот. Если жизненный цикл паразита требует более длительного совместного существования, для сохранения иммуносупрессии соответствующие сопряженные и синхронизированные механизмы переключения должны существовать и у патогенного организма.

Среди физиологически активных веществ, которые, по-видимому, способны давать разнонаправленные иммуномодулирующие и

рострегулирующие эффекты, в первую очередь необходимо назвать соединения с фитогормональной активностью.

Основные представления о природе иммунитета растений

Распознавание микроорганизма в качестве патогена на самых ранних этапах взаимодействия является одним из основных условий включения защитных реакций и возникновения состояния устойчивости. Согласно гипотезе Флора (H.H. Flor) «ген-на-ген» для такого хода патологического процесса - несовместимости растения и патогена - необходимо наличие 2-х

доминантных генов: гена авирулентности у патогена и гена устойчивости у растения (Дьяков, 1996). Продуктом гена устойчивости является специфический рецептор, способный узнавать либо собственно продукт гена авирулентности (например, специфическую глюкозил-трансферазу), либо результат его активности (уникальную гликопротеидную структуру клеточной стенки фитопатогена). Потеря фитопатогеном продукта гена авирулентности или его модификация в результате мутации делает его невидимым для рецепторов растения-хозяина. Однако совместимость и возможность развиваться в клетках растения «оплачивается» снижением жизнеспособности патогена вследствие потери или ослабления функций, которые выполнял продукт гена авирулентности (Albersheim, Anderson-Prouty, 1975).

Развитием этих представлений явилась разработка «сторожевой модели»: продукты генов устойчивости (R-генов) могут связываться не напрямую с продуктами гена авирулентности, но скорее отслеживать изменения белков хозяина в результате их взаимодействия с эффекторами фитопатогена (Dangl, Jones, 2001). Таким образом, молекулы, воспринимаемые растением в качестве индикаторов чужеродного вторжения, можно разделить на две группы, а системы, обеспечивающие их рецепцию, составляют основу двух ветвей распознающей части иммунной системы растений.

Взаимодействие этих ветвей исследователи представляют в виде «зигзаг»-модели (Jones, Dangl, 2006). В этой схеме распознавание низкоспецифичных эволюционно консервативных полимеров патогена, свойственных большим группам микроорганизмов (pathogen-associated molecular patterns - PAMPs), осуществляют трансмембранные рецепторы растения (pattern recognition - receptors (PRRs) (Alte

Информация о работе

Бабоша, Александр Валентинович
доктора биологических наук
Москва, 2014
ВАК 03.01.05

Диссертация

Многофазный характер концентрационной зависимости действия физиологически активных веществ на рост растений и устойчивость к фитопатогенам - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы