Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Замедленная флуоресценция водоросли хлорелла в оценке иммунитета клубней картофеля

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Прокушкин, Анатолий Станиславович, Красноярск



*/ ч/ 1/ / 7 0 >

МИНИСТЕРСТВО ОБЩЕГО И ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

КРАСНОЯРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ПРОКУШКИН АНАТОЛИИ СТАНИСЛАВОВИЧ

ЗАМЕДЛЕННАЯ ФЛУОРЕСЦЕНЦИЯ ВОДОРОСЛИ ХЛОРЕЛЛА В ОЦЕНКЕ ИММУНИТЕТА КЛУБНЕЙ КАРТОФЕЛЯ

03.00.12 - физиология растений

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук профессор КрасГУ Ю.С. Григорьев

Красноярск 1999 г.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 4 ГЛАВА 1. Физиолого-биохимические механизмы устойчивости

растений к фитопатогенам 8

1.1. Особенности физиолого-биохимических механизмов покоя клубней картофеля 8

1.2. Механизмы иммунитета картофеля Solanum tuberosum L. 13

1.3. Механизмы действия защитных веществ растений 17

1.4. Методы оценки сортов картофеля на устойчивость к болезням 25

ГЛАВА 2. Замедленная флуоресценция хлорофлла в оценке физиологического состояния и действия различных веществ на

растения 30

2.1. Современные представления о механизме ЗФ 30

2.2. Использование ЗФ в целях биологического тестирования 33 ГЛАВА 3. Объект и методы исследования 38

3.1. Объект исследований: картофель Solanum tuberosum L. 38

3.2. Тест-организм: микроводоросль Chlorella vulgaris Beijer. 38

3.3. Методы исследований 40 ГЛАВА 4. Зависимость интенсивности замедленной флуоресценции от 47

условий ее измерения и параметров тест-культуры водоросли

4.1. Зависимость показателей ЗФ в от плотности суспензии водоросли 47

4.2. Влияние времени экспозиции и условий освещения на выход ЗФ 51

4.3. Роль интенсивности возбуждающего света 53

4.4. Нормирование чувствительности тест-организма при помощи контрольного токсиканта 54

4.5. Влияние физико-химических параметров тестируемых сред 55

?

ГЛАВА 5. Сортовые особенности действия клеточного сока клубней

картофеля на тест-организм 58

5.1. Сортовая специфичность действия гомогенатов клубней картофеля на замедленную флуоресценцию хлорофилла водоросли хлорелла 58

5.2. Особенности фитотоксичекого действия клеточного сока клубней 60

ГЛАВА 6. Роль "вторичных метаболитов" тканей клубней картофеля в

формировании фитотоксического эффекта 70

6.1. Характеристика фитотоксических веществ тканей клубней картофеля и их роль в устойчивости к патогенам 70

6.1.1. Фенольные соединения и их роль в устойчивости и фитотоксических эффектах 71

6.1.2. Роль продуктов окисления ФС в защитных реакциях картофеля 82

6.2. Роль гликоалкалоидов в фитотоксической реакции 90

6.3. Оценка влияния постинфекционных факторов устойчивости 92 ГЛАВА 7. Устойчивость сортов картофеля по отношению к фитофторе 100 ВЫВОДЫ 106 ЛИТЕРАТУРА 108 Приложения 126

з

ВВЕДЕНИЕ

Одной из важнейших составляющих решения проблемы борьбы с поражением культурных растений микроорганизмами и другими паразитами является постижение механизмов химической устойчивости растений к болезням (Харборн, 1985; Остроумов, 1986). Главную роль среди веществ ответственных за формирование фитоиммунитета играют соединения "вторичного метаболизма", несущие помимо этого и иные функции, которые до сих пор интенсивно изучаются. Важно отметить, что набор защитных механизмов разных видов растений строго специфичен. Среди веществ фитоиммунитета существенный интерес проявляется к таким соединениям, как фенольные вещества, алкалоиды, терпеноиды и т.д (Запрометов, 1993; Lyon, 1998; Partridge, 1998). Подавляющее большинство исследований показывает, что в связи с широким использованием защитных веществ в других физиологических реакциях их действие неспецифично и оказывает воздействие на фитопатогены и прочие микроорганизмы, обеспечивая барьер на пути инвазии (Горленко, 1973; Гусев, Метлицкий, 1982; Сердюков и др., 1984). В то же время обнаружено, что посредством этих веществ растения влияют и друг на друга в аллелопатических взаимодействиях и сдерживают атаки фитофагов (Райе, 1978; Гродзинский и др., 1987 и т.д.).

Отдельной проблемой выносится потеря устойчивости селекционными сортами, которая заключается, как правило, в изменении физиологических и биохимических свойств патогенов и возникновении рас паразитов, преодолевших устойчивость растения (Сердюков, 1984). В селекционной практике известно, что вновь создаваемые устойчивые сорта растений требуют постоянного контроля и регулярной смены (Писарев, Трофимец, 1982; Росс, 1989). Здесь же можно выделить, что сорт как генетически обусловленная совокупность потенциальных

свойств растения реализует их в зависимости от конкретных экологических условий, в которых оно развивается. Т.е. компоненты генотипа проявляются лишь в определенных условиях среды и могут значительно варьировать из года в год (Котова, 1990).

В связи с этим представляется важным поиск методов, позволяющих качественно отбирать сорта и отдельные растения, обладающие высокой устойчивостью к фитопатогенам и хорошей лёжкостью клубней характерных для каждого отдельного года. В то же время неспецифические механизмы действия защитных соединений, которые характеризуют фитоиммунные реакции, позволяют предположить, что в систему оценки устойчивости сортов можно вводить не только специфические фитопатогенные микроорганизмы, но и иные способные реагировать в ответ на присутствие этих веществ в тест-среде. Исключение составляют системы распознавания и формирования реакций сверхчувствительности (СВЧ), которые запускаются, согласно последним исследованиям, при контактах уже тесно связанных фитопатогенов и растений-хозяев. В то же время вещества, играющие важную роль в создании устойчивости, и в частности в СВЧ, как показано в ряде обзорных работ, имеют определенный набор сайтов. Среди них можно выделить мембраны, процессы фотосинтеза, дыхания, в том числе электрон-транспортные цепи, и ряд других (Dix, 1979; Татаринцев и др., 1984; Рощина, Рощина, 1989; Anderson, 1991; Appel, 1992).

В связи с этим можно считать оправданным использования одного из широко применяемых в биотестировании объектов - одноклеточных зелёных водорослей, и в частности Chlorella vulgaris, в качестве тест-организма защитного потенциала растений к фитопатогенам. В настоящее время в исследованиях физиологического состояния и стрессовых реакций растений широко применяются методы, основанные на

измерении и анализе замедленной флуоресценции хлорофилла (ЗФ) (Гольд и др., 1984; Renger, Schreiber, 1986; Веселовский, Веселова, 1990).

Выбор клубней картофеля Solanum tuberosum в качестве объекта исследований обусловлен важностью этой сельскохозяйственной культуры, а также соображениями доступности и легкости его подготовки к исследованиям.

На основании всего вышеизложенного нам представляется перспективным оценить защитный потенциал клубней картофеля с помощью регистрации действия их гомогенатов на показатели замедленной флуоресценции хлорофилла водоросли хлорелла. Благодаря введению нового относительного показателя ЗФ (Grigoriev et al., 1995; 1997; Григорьев, Бучельников, 1997), разработанного в нашей лаборатории, не зависящего от мутности изучаемого раствора, появилась возможность оценки интегральной фитотоксичности сока клубней.

В связи с этим, данная работа посвящена изучению влияния компонентов клеточного сока клубней ряда сортов и их гибридных линий на выход замедленной флуоресценции хлорофилла водоросли хлорелла в зависимости от состояния тест-организма, интенсивности возбуждающего света, состава тест-среды и др. с целью:

1) выявления природы факторов, ответственных за формирование фитотоксического эффекта сока клубней картофеля;

2) изучения механизмов действия защитных соединений, характерных для клубней картофеля;

3) определения возможности оперативной оценки устойчивости клубней разных сортов картофеля к фитопатогенам;

4) выработки рекомендаций по использованию ЗФ для оценки иммунного потенциала клубней картофеля.

Работа выполнялась на кафедре экологии Красноярского государственного университета под руководством к.б.н., профессора КрасГУ Ю.С.Григорьева в период с 1994-98 гг. Исследования по теме работы были поддержаны следующими грантами: грант Красноярского краевого Фонда науки (4Б0294, 1995г.), грант по программе МНТК "Биотехнология" (1994-1997 гг.), стипендиями молодых ученых Красноярского краевого фонда науки (1996-97).

В заключение выражаю свою искреннюю благодарность моему руководителю кандидату биологических наук, профессору КрасГУ Ю.С. Григорьеву за руководство и помощь в проведении работы, а также в целом всем сотрудникам кафедры экологии. Особую признательность выражаю И.С. Кравчуку и Н. Прокопьеву за неоценимый вклад в осуществление проведенных исследований и их оформление.

ГЛАВА 1. ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ К ФИТОПАТОГЕНАМ.

Существование огромного числа фитопатогенных микроорганизмов не ограничивает жизненность высших растений и их фитоиммунитет является скорее правилом, а восприимчивость - исключением (Горленко, 1973; Харборн, 1985; Телитченко, Остроумов, 1991). Отмечается, что из большого разнообразия паразитарных микроорганизмов, способных проникать в растение, каждый вид поражается лишь относительно небольшим их числом, по отношению же ко всем остальным растение обладает так называемым видовым иммунитетом (Метлицкий, 1976, 1982 и др.).

Следует однако заметить, что до последнего времени значительное внимание специалистов было сосредоточено лишь на изучении биохимической природы сортовой устойчивости, т.е. устойчивости к фитопатогенам, которые в ходе эволюции сумели преодолеть видовой иммунитет и стали грозными врагами культурных растений. Между тем, как отмечается в (Метлицкий, 1976; Росс, 1989; Lyon, 1998), исследование биохимических механизмов видового иммунитета и их своевременная оценка должны способствовать выявлению устойчивости растения в целом.

1.1. Особенности физиолого-биохимических механизмов покоя клубней

картофеля

Проблеме изучения физиологии и биохимии такой важной сельскохозяйственной культуры как картофель посвящено значительное количество монографий и обзорных статей (Вечер, Гончарик, 1973, Метлицкий, 1976 и др.).

Покой клубней картофеля, подобно состоянию покоя практически всех видов сосудистых растений, разделяется на два отчетливо наблюдаемых периода: естественный (глубокий) и вынужденный (Гусев, 1982). Различия между ними можно кратко охарактеризовать способностью выхода из него при благоприятных внешних условиях (Кораблева, 1990).

Известно, что степень устойчивости растений к фитопатогенам тесно связывают с физиологическим состоянием их тканей и органов и, в частности, с эндогенным ритмом процессов роста (Метлицкий и др., 1969; Барская и др., 1972; Вечер, Гончарик, 1973). Как правило, молодые, активно растущие растения обладают гораздо менее высокой устойчивостью к болезням, чем уже сформировавшиеся (Барская и др., 1972; Бейли, 1985). Клубни картофеля (строение клубня приведено на Рис. 1) также более устойчивы к патогенам в состоянии глубокого покоя, когда подавлен рост меристематических тканей - "глазков". Однако состояние покоя свойственно не всему клубню, а лишь его меристеме. Паренхимные ткани покоящихся клубней находятся в состоянии активной жизнедеятельности, о чем, в частности, свидетельствует их более активная реакция на поранение (образование раневой перидермы, биосинтез крахмала, фенолов и др.) по сравнению с клубнями, вышедшими из покоя (Гусев, Метлицкий, 1982).

Продолжительность периода покоя клубней картофеля является генетическим признаком сорта, а также зависит от условий внешней среды, при которых происходит формирование клубней и последующее их хранение (Метлицкий, 1972; Muller., Borger, 1981; Росс, 1989).

Во время покоя, как показано в работах (Метлицкий, 1976; Рубин, Аксенова, 1976; Озерецковская, 1990; Appel, 1991; Lyon, 1998; Partridge, 1998), блокируется ряд биохимических процессов, сопровождающих

0 2,5 мм

0 50 мм

Рис. 1. Схематическое строение клубня картофеля. 1а - эпидермис с отдельными участками перидермы; 16 - перидерма; 2 - кора; 3 - наружняя флоэма; 4 - ксилема; 5 - внутренняя флоэма; 6 - сердцевина. Вверху диаграмма, характеризующая соотношение отдельных тканей клубня в радиальном направлении (Гусев, Метлицкий, 1982).

нормальный рост клеток. Это происходит благодаря действию эндогенных ингибиторов роста, среди которых обнаружены фенольные соединения (ФС) - хлорогеновая и кофейная кислоты, скополетин и соединение терпеноидной природы - абсцизовая кислота (Метлицкий и др., 1969, 1972; Rhodes, 1979). Так, во время глубокого покоя в тканях клубней картофеля накапливаются скополетин и кофейная кислота, содержание которых в момент выхода из покоя уменьшается (Кораблева и др., 1969; Кораблева и др., 1990). Оба этих соединения в период глубокого покоя подавляют рост растительной ткани и спор

микроорганизмов (Запрометов, 1988; 1993; Рощина, Рощина, 1989). В этот период происходит также и падение общего содержания ФС в клубнях (рис. 2). Помимо этого имеет место и тканеспецифичность содержания этих соединений (рис. 3).

Механизм действия природных ингибиторов роста связан с угнетением процесса окислительного фосфорилирования, что приводит к обеднению клетки макроэргическими соединениями, а также со стимуляцией дыхания и инактивацией ИУК (Кораблева, 1990).

Кроме того, различные полифенолы инактивируют ферменты углеводного обмена и вызывают изменения в азотном и фосфорном обмене (Lyon, 1998). Как показывают исследования, окончание покоя клубней характеризуется началом синтеза нуклеиновых кислот (Кораблева и др., 1969; Метлицкий, Озерецковская, 1973; Lyon, 1998), репрессия которого в период глубокого покоя происходит под действием фенольных ингибиторов роста (Кораблева и др., 1972).

14 т

з 12

i-Q

^ « • 1П

е * s 10

§ I 3

Э § 8 -1

S S

Си О

<и Он 2 6

st о я °

о е

о я

53 4

0

+

+

УШ IX X XI ХП I П Ш IV V VI Месяцы определения

Рис. 2. Общее содержание ФС в клубнях картофеля сорта Любимец в период покоя (Васюкова, Метлицкий, 1969).

2

У меристем хранящихся клубней картофеля существует

определенный ритм активности окислительных ферментов. Их

активность падает по мере прохождения глубокого покоя (сентябрь-

январь) и повышается в период подготовки к прорастанию (февраль-

апрель) (Васюкова, Метлицкий, 1969). В паренхиме клубней активность

этих ферментов почти не меняется (Метлицкий, 1972; Кораблева, 1990).

0,8 у —кожура

мякоть

VIII IX X XI XII I II III IV Месяцы определения

V VI

Рис. 3. Общее содержание ФС в разных тканях клубней картофеля сорта Любимец (Васюкова, Метлицкий, 1969).

С окончанием глубокого покоя и прорастания клубней в запасающей паренхиме преобладают реакции гидролиза, в результате которых растущие ткани снабжаются легкорастворимыми и физиологически активными веществами (Muller, Borger, 1981; Смит, 1985; Озерецковская, 1990). В этот период ткани клубней значительно менее устойчивы к заражению фитопатогенами (Смит, 1985; Ingham, 1976). Это было показано при изучении устойчивости клубней к совместимым расам Phytophtora infestans (Mont) de Вагу (Метлицкий, 1972; 1973; Вечер, Гончарик, 1973; Кораблева, 1990).

1.2. Механизмы иммунитета картофеля Solanum tuberosum L.

Принято считать (Горленко, 1973; Вечер, Гончарик, 1973; Котова, 1990), что если при видовом иммунитете устойчивость растений к паразитарным микроорганизмам является абсолютной, то при сортовом иммунитете защитные силы растений более ограничены. Так один сорт будучи устойчивым к одной расе паразита может поражаться другой (Ащайе, Дьяков, 1976; Озерецковская и др., 1994). Это происходит вследствие того, что каждый ген устойчивости ответственен за невосприимчивость растения не вообще к возбудителю болезни, грибу, бактерии или вирусу, а лишь к отдельным его разновидностям. В то же время, большинство патогенных микроорганизмов представляют собой популяции, состоящие из нескольких физиологических рас, иногда значительно различающихся по вирулентности (Горленко, 1973; Росс, 1985; Котова, 1990).

Изучение устойчивости картофеля к разным расам фитофторы показало, что она контролируется соответствующими генами устойчивости (R-генами) (Ащайе, Дьяков, 1976). Количество этих генов обуславливает устойчивость к тому или иному числу рас патогена (Метлицкий, 1976). Эти данные в полной мере соответствуют концепции Флора "ген на ген" (Thompson and Burdon, 1992), согласно которой каждому гену устойчивости растения (R-гену) комплементарен соответствующий ген вирулентности патогена (Метлицкий и др., 1969; 1972; 1976; Озерецковская, 1990).

Однако на практике наряду с устойчивостью, обусловленной R-генами, особенно в последнее время в связи с повсеместным распространением высоковирулентных рас гриба фитофторы (Котова, 1990), большое значение имеет полевая, или полигенная устойчивость, направленная не против каких-то определенных конкретных рас или

видов фитопатогеииых микроорганизмов, а против всех одновременно. В этом случае предполагается не полная несовместимость, а лишь относительная устойчивость. В работах (Гусев, Метлицкий, 1982; Росс, 1985) показано, что при полевой устойчивости поражение происходит медленнее, спорообразование растягивается и тем са