Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль гормонов в быстрой реакции растений пшеницы на неблагоприятные воздействия

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Роль гормонов в быстрой реакции растений пшеницы на неблагоприятные воздействия"

г

Г'"'! Нл Т7ПЯНЯТ ПХ'ТСППИРИ

: ......1.................

ВЕСЕЛОВ ДМИТРИЙ СТАНИСЛАВОВИЧ

РОЛЬ ГОРМОНОВ В БЫСТРОЙ РЕАКЦИИ РАСТЕНИЙ ПШЕНИЦЫ НА НЕБЛАГОПРИЯТНЫЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ

03,00,12 - Физиолпгич пягтений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации па соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа -1999

Работа выполнена в Институте биологии Уфимского научного центра сийской Академии наук.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук В.К.Трапезников

доктор биологических наук Ф.М.Шакирова

кандидат биологических на Т.Н.Пустовойтова

Биологический институт

Санкт-Петербургского

университета

Защита состоится 1/.Г2-1999 г. в М часов на заседании диссертациош совета К 064.13.09 при Башкирском государственном университете по адр 450074, г. Уфа, ул. Фрунзе, 32, биологический факультет, ауд.332.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Башкирского госуда венного университета.

Автореферат разослан " 17, " ноября 1999 г.

Ученый секретарь диссерта- /(^ЙЛ

ционного совета, к.б.н л) а' Г.Г.Кузяхметов

/7^/. П^ о

и. Обнаружено, что быстрее торможение роста побега при добавление ПЭГ в тщательную среду связано со ~толь же быстрым снижением содержания цитокининов побеге, в то время как резкое иигибиродокие транспнрации в большей стспсни бусловлено накоплением АБК.

Установлено, что 8-дневные проростки пшеницы сорта Безекчукская 139 в зчение около 1 ч получают из корней количество цитокининов, равное их содер-;анито п побеге.

Обнаружено, что повышенное содержание АБК в побегах растений при до-авлении ПЭГ в питательную среду характерно не только для растений с живыми,

0 и убитыми корнями, что свидетельствует о роли побега в обеспечении накопле-ия гормона.

Практическая ценность. Изучение динамики концентрации эндогенных ормонов при действии стрессовых факторов может быть полезным для разработки екомендаций по применению гормонов в качестве регуляторов устойчивости рас-ений. Опыты с экзогенным зеатином свидетельствуют о целесообразности исполь-овашгя цитокининов для повышения устойчивости растений к токсичным метал-;ам.

Апробация работы. Основные положения представлены на 5 симпозиуме международного общества по исследованию корней (СНА, Южная Каролина, 1996),

1 симпозиуме Российского общества физиологов растений «Физико-химические >сновы физиологии растений и биотехнология» (Москва, 1997), Научно-фактической конференции «Биологические проблемы в высшей школе. Проблемы i решения» (Бирск, 1998), 11 Конгрессе Федерации Европейских Обществ Физио-югов растений (Варна, 1998), IV съезде общества физиологов растений России Москва, 1999).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения и списка литературы. Объем основного текста работы составляет ■{Ц. стр., включает 20 рисунков и 10 таблиц. Список использованной литературы :остоит из I¿3 У наименований.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проводили на растениях яровой твердой пшеницы (Triticum durum L., сорта Безенчукская 139) в лабораторных условиях на водной культуре.

Семена проращивали в темноте в течение 2 сут на дистиллированной воде с доб. лением 10"5 М С?СЬ, при температуре 24 °С. На третьи сутки проростки Переса» вали на 10 %-ную среду Хогланда-Арнона-1 и выращивали при освещенности 180 лк и 14-часовой продолжительности светового дня. Опыты проводили с суточными проростками. В питательную среду добавляли ацетат кадмия до коне ной концентрации 10 мг/л питательного раствора. В некоторых случаях за 2 ч добавления кадмия в питательную среду вносили зеатин так, чтобы его конечн концентрация составляла I мг/л. В опытах по изучению влияния осмотика испо; зовали 15 %-ный раствор ПЭГ 6000.

Через 1 ч после внесения кадмия с помощью селективных электродов по уб ли ионов калия и нитратов из питательной среды определяли скорость их поглои ния растениями. Транспирацию определяли весовым методом.

Для регистрации роста использовали аналоговый индуктивный электроме? нический датчик перемещений. Измерительный сигнал датчика непрерывно заг сывали на самопишущем приборе типа КСП- 4.

Для определения содержания гормонов растительный материал гомогенн: ровали и экстрагировали 80 %-ным этанолом. Спиртовой .экстракт отделяли це трифугированием и упаривали до водного остатка.

Цитокинины, содержащиеся в аликвоте водного остатка, концентрировали наносили на пластину для тонкослойной хроматографии, которую проводили в а теме растворителей бутанол: аммиак: вода (6:1:2). Положение на хроматограм "зеатина, его рибозида, 9М-пиокозида и нуклеотида определяли с помощью соотвс сгвующнх метчиков. После элюции гормонов в течение ночи из соответствующ зон фосфатно-солевым буфером (рН 7,4) их содержание определяли с помоЩ1 иммуноферментного анализа (ИФА).

Экстракцию АБК из аликвоты водного остатка проводили по методу, огшсс ному Кислиным с соавт. (1982). Содержание АБК определяли с помощью ИФА (К доярова с соавт., 1986).

Для определения содержания гормонов в ксилемном соке проростки разре: ли и побег соединяли с корнями с помощью силиконовой трубочки. Эту операщ проводили под водой, чтобы избежать попадания воздуха в сосуды и трубоч! Данная процедура существенным образом не влияла на скорость транспирации р; тений. Концентрацию гормонов в корневом экссудате определяли с помощью ИФ Поступление гормона из корней рассчитывали по формуле Уп= С'Утр, где Уп- сь

сть доставки цитокиншю; из корней (нг цитокининов/растение в час), С - кон-нтрация цитокининов в ксддсином соке (нг/мкл пасоки), a Vrp- скорость трансрации (мкл воды/растение в час) (Jackson, 1993).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Динамика содержания цитокининов в связи с рефляцией поглощения и поте-[ воды у растений на фоне действия токсичных концентраций ионов кадмия.

Изучению действия на растения токсичных металлов уделяется много внима-1Я в связи с усиливающимся загрязнением ими окружающей среды (Lindberg and ingstrand, 1985; Somashekaraiah et al, 1992; Ferret et al, 1993; Larsson et al, 1998). лявлено, что в первую очередь мишенью для их повреждающего действия стано-тг.я корни (''и;;г6\\г. vctc™ пост косней и насчитается поглотительная активность), ¡наружено также снижение активности фотосинтеза и др. процессов, которые идут побегах. При этом изменениям концентрации гормонов в растениях уделялось не-(статочно внимания (Бессонова и др., 1985; Zizarova, Hclub, 1993: Masson et al, !94). Пытаясь восполнить дефицит знаний по данному вопросу, мы провели срав-пельное изучение динамики содержания цитокининов и некоторых физиологиче-:их показателей у проростков пшеницы. Выбор цктокиггнноа качестве теста был язан с тем, что по данным литературы (Бессонова и др., 1985) эти гормоны иовы-ают устойчивость растений к тяжелым металлам.

Использование высокочувствительного датчика роста позволило установить, 'о уже через час после добавления кадмия в питательную среду скорость роста орого листа снижалась в 2 раза по сравнению с исходной (от 31±3 мкм/мин до (±2 мкм/мин). Пониженная скорость роста сохранялась еще в течение 1 ч, а затем тоисходило ее постепенное восстановление почти до исходных значений (25±3 км/мин- спустя 3 ч после добавления кадмия).

Таблица 1.

Поглощение ионов контрольными и обработанными кадмием пророст-

Концентрация Cd Поглощение ионов, дМ/проросток ч

в питательной среде, мг/л 1 ч 3 ч

N03" NOj' К+

0 65+7 43+3 50+6 65+4

10 26+4 19+2 45+4 59+7

Для оценки влияния кадмия на физиологическую активность корней с помо-ыо соответствующих селективных электродов (по убыли N0/ и К*" из питательной

среды) была определена способность проростков пшеницы поглощать ионы. Ока лось, что добавление в среду ацетата кадмия снижало поглотительную способно! корней на 40-60 %, что проявлялось уже через 1ч после добавления ионов кадми питательную среду (таблица 1). Быстрое ингибирование поглотительной функ^ корней естественно, т.к. именно они первыми вступали в контакт с повреждают агентом. Через 3 ч скорость поглощения ионов корнями опытных растений восс навливалась до уровня контроля.

Так же быстро добавление кадмия в питательную среду отражалось и транспирации растений (рис. 1). По истечении первого часа она снижалась по ср нению с контролем почти в 2 раза, и сохранялась таковой в течение последующ' часа. Однако затем картина менялась: транспирации у растений, обработанных к мием, возрастала до уровня контроля и даже несколько превышала его.

Время после добавления Сс! в среду,ч

Рис. 1. Транспирация проростков пшеницы в контроле (светлые колонки) и среде с кадмием (темные колонки)

Поскольку поглощение воды сопряжено с поглощением ионов, наруше поступления ионов в растения под влиянием кадмия вполне могло быть причи ингибирования поглощения воды и соответствующего уменьшения транспира1 Наши результаты вполне соответствуют данным литературы о снижении вод

распада в листе АБК, поступающей из корней, составляет всего несколько десять минут (Zhang et al, 1997). Поэтому можно предполагать, что снижение скорос распада гормона даже при неизменном уровне синтеза должно приводить к бы рому накоплению АБК. Однако большинство исследователей-анализировали сод жание гормонов в лучшем случае через несколько часов после воздействия, и ли: немногие занимались изучением быстрых изменений концентрации гормонов (I доярова и др., ¡990; Полевой и др. 1996; Tillberg, 1999).

Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в том, чтобы изучр механизм и функциональное значение быстрых изменений концентрации цикл нинов и ЛБК при действии осмотика полиэтиленгликоля (ПЭГ) и токсичной кс центрации кадмия на проростки пшеницы. Для достижения поставленной цели i обходимо было решить следующие задачи:

1. Провести сравнительное изучение влияния кадмия на скорость рос транспирацию, поглощение элементов питания и содержание цитокининов в но* гах и корнях и ксилемном экссудате проростков пшеницы.

2. Оценить' влияние добавления ПЭГ в питательную среду на скорость рос транспирацию и содержание цитокининов и АБК в побегах и корнях прорость пшеницы и их ксилемном экссудате.

3. Сопоставить динамику содержания АБК у проростков пшеницы с живы и убитыми корнями в ответ на осмотический шок для выявления роли побего! корней в регуляции содержания АБК.

4. На основе определения концентрации цитокининов в ксилемном сом скорости транспирации рассчитать скорость поступления гормонов из корней в ] бег.

5. Сопоставить продолжительность периода, в течение которого в ответ внешние воздействия появляются изменения в содержании цитокининов в побе ко скоростью поступления цитокининов из корней, что позволит оценить р< транспорта гормонов в контроле быстрых гормональных реакций у растений.

| Научная новизна. Показано, что первоначальное снижение концентрат цитокининов в проростках пшеницы в ответ на действие ионов кадмия в токсичг концентрации сопровождается снижением транспирации, ингибированием рост; поглощения ионов калия и нитратов. Восстановление активности перечислена процессов происходило на фоне резкого возрастания содержания цитокининов ; в побегах и корнях, так и ксилемном соке и, по всей видимости, было их следст

ОБЩА.^ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Общепризнанно, что гормоны играют вг.жную роль в (алтации растений к условиям обитания. Предполагается, что они выполняют ункцию химических мессснджеров, которые транспортируются из одной части ютения в другую, обеспечивая скоординированную реакцию на организменном ;овне (Jackson, 1993). Физиологическая роль гормонов в основном реализуется че-:з изменение их концентрации. Известно, что при неблагоприятных условиях >ычно снижается концентрация гормонов стимулирующего типа действия (напри-;р, цитокининов) и возрастает концентрация гормонов - ингибиторов роста (на-тимер, АБК) (Salisbury. Marinos. 1985: Жолкевич, Пустовойтова, 1993). Полагают, -о эти изменения концентрации гормонов приводят к торможению роста, снижено транспирации и другим процессам, которые обеспечивают выживание расте-¡й при неблагоприятных условиях. Поэтому не удивителен интерес исследовате-:й к изучению о механизма регуляции концентрации гормонов. Значение гормо-итьного контроля транспирации при стрессе связано с тем, что при большинстве ^благоприятных воздействий возникает проблема поддержания водного баланса, е прекращаются дискуссии о месте синтеза ARK, которая к, частности, регулирует крытие устьиц (Härtung et al, 1988; Zhang, Davies, 1991;Zong etal, 1996), а также о ш, реагируют ли устьица на изменение концентрации АБК в ксилемном соке или глее важна скорость доставки гормона из корней за единицу времени (Tardieu, avies, 1992; Govving et al, 1993; Jarvis, Davies , 1997; Zhang et al, 1997). Все чаще Нуждается возможная роль дальнейших превращений АБК в регуляции ее кон-лгграции (Trejo et al, 1993). Пути метаболизма цитокининов изучены достаточно ;тапьно (Letham, 19S3, Horgan, 1992; Binns, 1994). Тем не менее конкретных сведе-ш о том, как при стрессе регулируется концентрация цитокининов, не так уж мно->. Они, в основном, сводятся к информации о снижении содержания данных гор-1 онов в ксилемном соке растений при ряде неблагоприятных воздействий (Ky;aer<í, >62; Jackson; 1993). /

Весьма важно также получить ответ на вопрос о том, насколько быстро мо;|кет еняться концентрация гормонов в растении. В некоторых случаях ответная р|сак-м появляется уже через несколько десятков минут после введения экзогенного >рмона в растение (Шакирова и др., 1982; Silverman et al, 1998; Guilfoyle, 19:98). [ожег ли с такой же скоростью изменяться концентрация эндогенного гормона, пускающая быструю ответную реакцию? По последним данным, скорость полу-

эоводимости корней под влиянием токсичных металлов (Вагсе1о е1 а1, 1996). Вме-:е с тем, очевидно, что ограничение транспирашш связано с регуляцией устьичной зоводимости. Каким же образом мог осуществляться ее контроль? Представляло кже интерес выяснить, чем могло быть вызвано последующее возрастание трансфации у растений под воздействием кадмия.

Изучение динамики общего содержания цитокининов в побегах и корнях попало их первоначальное снижение сразу после добавления кадмия в питательную 1еду (рис. 2). Однако затем уровень гормона возрастал и через 3 ч уже превышал о содержание у растений в контроле.

О 1 2 3 24

Время действия кадмия, ч

Рнс.2. Влияние кадмия на суммарное содержание цитокининов в побегах и корнях проростков пшеницы.

Первоначальное снижение уровня цитокининов, вероятно, было результатом гибирования синтеза гормонов в поврежденных корнях.растений. Кроме того, о могло бьгть следствием активации распада гормона под влиянием кадмия. Дак-(е литературы свидетельствуют о том, что кадмий индуцирует развитие окисли-тьного стресса (С1ц81ег8 е1 а!, 1996). Он проявляется в накоплении в тканях актив-го кислорода, способного окислять цитокинины. По нашим данным, у проростков ]еницы, обработанных кадмием, активность пероксидазы в побегах и корнях воз-сгала в 1,5-2 раза, что свидетельствует о развитии окислительного стресса. Это азываст на то, что первоначальное снижение содержания цитокининов под влияем кадмия могло быть следствием активации распада гормона.

Последующее накопление цитокииинов, вероятно, является индикатором р вития активной ?ащитной реакции растений. Содержание цитокииинов у обра: танных кадмием растений не просто возвращалось до исходного уровня, а под! малось выше контрольных значений. За (Лет какого механизма это могло проис; дить?

Определение содержания отдельных форм цитокииинов в побегах и корь растений через 3 ч после добавления кадмия в питательную среду выявило (рис. увеличение уровня зеатина, его нуклсотида и 9-М-глюкозида. Однако, наиболее . ко этот эффект проявлялся в случае рибозида зеатина, содержание которого в по! гах возрастало в 3 раза по сравнению с растениями в контроле.

►J3

о о ее S

О Си

о

К

к о н

S =f

о. 1) Ci

о

а

500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 О

л.

^ rS- _ i\ . сев.™ !

_L_i_1. «-EBBEimill!!-1 ; L~ —ИШ I

Cd побег Контроль Cd корень Контроль побег корень

Рис. 3. Содержание отдельных форм цитокииинов в побегах и корнях пророс ков пшеницы через 3 ч после добавления кадмия в питательную среду

Поскольку рибозид зеатина считается транспортной формой цитокинин можно было предположить, что на этой стадии гормонального ответа возрастг поступление гормона из корней, т.е. органа, где они преимущественно продуди] ются (Кулаева, 1962; Ногеал, 1992). Наше предположение подтверждают результа определения' концентрации гормонов в ксилемном соке. Концентрация зеатинг

з рибознда была значите.": -лю выше п пасоке, собранной у растений через 3 ч по: добавления кадмия по с^&ьдению с контрольными (рис. 4). На основании даи-1х об ¡шивжллй фанспирацаи и »онцсн фации цитокикикоз s пасскс сылн рас-итаны значения интенсивности поступления цитокининов из корней (см. расчет-ю формулу в методической части), которые составили 86 и 31 нг/проросток/ ч для ытных и контрольных растений соответственно. Эти величины значительно ире-сходят показатели для взрослых растений (Wagner, Beck, 1994).

СЗ

о.

H

о я

о

700 600

500 [

i

400 "у 300 т

I

200 т

i

100 j о 4

Т г

F

]озн; ¡■зг | |НЗР| [□з |

m

Cd

Контроль

ис. 4. Концентрация цитокининов в ксилемном экссудате проростков пшеницы собранном через 3 ч после добавления кадмия в питательный раствор.

Полученные нами результаты свидетельствуют о высокой скорости обмена тгокининов, содержащихся е побеге, на гормоны, поступающие из корней. Следо-1тельно их повышенная продукция в корнях и увеличение поступления цитокини-эв в побег вполне могли привести к тому возрастанию содержания гормонов, ко-)рое началось в промежутке между 2 и 3 ч после добавления кадмия в питатель-ую среду.

Таким образом, вслед за снижением содержания цитокининов, которое могло ыть результатом индуцированного кадмием возрастания окислительного потен-

циала тканей, разворачивалась активная реакция растения, обеспечившая компен торное увеличение продукции цитокининов корнями и их транспорта в побег.

Обращает на себя внимание сходство в изменении содержания гормоно! интенсивности транспирации. Как снижение, так и последующее возраста: транспирации происходило параллельно с соответствующим изменением содер-ния гормонов. Как известно, цитокинины могут способствовать открытию уст! (Blackman, Davies, 1985), и тем самым усиливать транспирацию. Это дает нам ос: ванне предполагать, что снижение уровня цитокининов могло способствовать ог ничению потери воды, поглощение которой было нарушено под действием кадм В свою очередь возраст'ание уровня цитокининов, которое мы зарегистрировали рез 3 ч после начала воздействия, могло быть тем фактором, который обеспечи тому же сроку подъем уровня транспирации. Однако увеличение одной устьич! проводимости могло привести лишь к усилению потери воды и водному дефищ: Увеличение скорости роста, которое было бы невозможно при дефиците воды, с детельствует о том, что растения оказались способны не только активизиров транспирацию, но и поглощать достаточное количество воды. Могло ли способ вовать этому обнаруженное нами накопление цитокининов в корнях? Данные ли ратуры о способности цитокининов влиять на водную проводимость корней (Лял Лукьянова, 1993) не противоречат этому предположению.

Известно, что обработка цитокининами повышает устойчивость растени токсическому действию тяжелых металлов (Бессонова и др., 1985). Эти данные тературы дают основание предполагать что обнаруженное нами увеличение сод жания эндогенного гормона было защитной реакцией, направленной на повыше: устойчивости растений. Данное предположение подтверждают наши опыты с j тениями, которые предварительно были обработаны раствором зеатина. У та растений первоначальное ингибирование роста побега было выражено гораздо с бее (вместо снижения скорости роста в 2 раза прирост второго листа уменьши лишь на 20 %: от 31 до 24 мкм/мин), что указывает на защитное действие цитс нинов

Индуцированное цитокининами повышение устойчивости растений к де{ вию тяжелого металла могло быть связано не только с влиянием гормона на cocí ние устьиц и проводимость корней. В связи с нашими результатами представл: интерес данные литературы об индукции цитокининами экспрессии генов, ср которых обнаружен ген, кодирующий пептид, имеющий структуру, сходную с '

ми животных и бактерий, участвующих в детоксикации тяжелых металлов migocki, 1991). Не исключен»что цитокииины, накопление которых было обна-'жено во второй фазе oiueia проростков пшенлцы яд действие кадмия, принимают тстие в индукции этого гена.

Динамика содержания гормонов в связи с транспираиией и ростом растений неницы при действии ПЭГ.

Добавление ПЭГ в питательную среду - наиболее широко используемый егю-)б имитации водного стресса. По некоторым данным, ростовой ответ в побеге ожно обнаружить уже через 15 мин после добавления этого осмотика (Chazen, eumann, 1994). При длительном действии ПЭГ обнаружено накопление АБК в гю-:гах и корнях растений (Baker, Lachno, 1986; Griffits et al, 1997; Atanasov et al, /98). Представляло интерес выяснить могу! ли гормоны участвовать в быстрой рс-сции на повышение осмотического потенциала питательного раствора.

Поскольку добавление ПЭГ е питательную среду затрудняет поглощение во-ы, представляло интерес оценить ее содержание в растениях. Как видно из табл. 2, же через 10 мин содержание воды в корнях опытных растений было ниже, чем у астений в контроле (ошибка средней не превышала 0,1 %, поэтому различия в 1 % достоверны). Различий в оводненности побегов к этому времени еще не наблюда-ось. Но они четко проявились через 20 мин, и через 30 мин оводненность побега в пыте достигла минимума, после чего вновь начала возрастать и постепенно верну-ось к уровню контроля.

Таблица 2.

Содержание воды в проростках пшеницы при обработке ПЭГ, %.

Часть растения Вариант Время действия ПЭГ, мин

0 10 20 30 40 50

побег Контроль 92 92 92 . 92 92 92

Опыт 92 92 90 89 91 92

корень Контроль 94 94 94 94 94 94

Опыт 94 93 93 93 93 94

Под влиянием ПЭГ транспирация неуклонно снижалась, начиная с первых 10 шн воздействия и вплоть до 40 мин (рис. 5). Между 30 - 40 мин ингибирование ранспирации было особенно заметно. .За этот период скорость транспирации 'меньшилась в 2 раза, т.е. во столько же раз, что и за предыдущие 30 мин. (рис. 5).

Однако затем она начала резко возрастать, и ее значения превысили в конце эксг римента уровень транспирации контрольных растений.

i' 0 20 40 I

| Время действия ПЭГ, мин '

Рис. 5. Скорость транспирации (2) и поглощения воды (3) при добавлении П;

Га в питательный раствор. В контроле (1) скорость поглощения во-ды=транснирац1Ш,т.к. оводнсиность не меняется.

Снижение содержания воды в растении в ндчале эксперимента свидетельств ет о том, что в этот период потери воды превысили ее поглощение. В конце же оп та возрастание оводпенности побега указывает на то, что скорость поглощения г ды была выше, чем скорость транспирации.

Рост листа практически останавливался (от 25 мкм/мин до 0) за первые 10 нут воздействия и не возобновлялся в течение 1 ч. Однако затем наблюдалось вс становление ростовых процессов на уровне, составляющем около 50 % от исхо/ц го (12-13 мкм/мин) (Рис 6).

Таким образом, водный стресс, вызванный добавлением ПЭГ в питательн] раствор сначала подавлял рост и транспирацию, а затем происходило восстанови ние этих процессов (частичное в случае роста). Поскольку хорошо известно, гормоны способны влиять как на ростовые процессы, так и на состояние устьиц, представлялось интересным сопоставить изменения в концентрации цитокинино] АБК с активностью этих процессов. Роль АБК в адаптации к дефициту воды xoj шо известна из литературы (Reid, Wample, 1995; Пусовойтова и др, 1996; Jacks< 1993; Jones, 1997). Цитокининам в этом плане уделяется меньше внимания. Поэто представляло интерес оценить изменения концентрации двух гормонов однов; менно.

н

<_>

о а, л н о о п. о ¡й и

35 30 25 20 15 10 5 0 -5 -10

; ] Г 7 -

1 \ ! \

1

! ! }

1 1 1 1

ПЭГ\ 1 : /

1 ; Л

! ^ 1 Л^ и/

-у ~ у

20 40 60 ВО 100 Время роста, мин

120

140

Рис. 6. Скорость роста листа проростков пшеницы до и после добавления ПЭГ в питательную среду

Наблюдения показали, что под влиянием осмотического шока содержание ци-зкининсв в побегах скачала резко снижалось и оставалось низким в течение 30

ГИ1 иУодии

пгу ППЛТ^ГТАииПЙ и Я Ы\П ГТРТД иг»

эрмона (рис. 7). В последующие 30 мин содержание цитокининов в побеге также эзрастало и к концу эксперимента их содержание было на уровне контрольных астениях.

120 100^

^ггЛ

-К, побег

- ПЭГ, ! побег

0 20 40 60 Время действия ПЭГ, мин

Рис. 7. Влияние ПЭГ на содержание цитокининов в побегах и корнях проростков пшеницы.

Содержание АБК в побегах с начале эксперимента в отличие от концентра: цитокшшаов возрастало. Накопление АБК сначала происходило медленно, но за: (в интервале между 20 и 30 мин от начала воздействия) происходил резкий подт уровня гормона, вслед за которым его содержание столь же быстро снижалось п ти до исходного уровня. В корнях было зарегистрировано резкое возрастание держания АБК, концентрация которой оставалась высокой до конца э'ксперима (рис. 8).

; 0 10 20 30 40 50 60

I Время действия ПЭГа, мин.

!—Контроль, побег - -е- - ПЭГ,побег \

> ! I

I I ■—*— Контроль, корень, - - - х- ■ • ПЭГ, корень \

Рис. 8. Влияние ПЭГ на содержание АБК в проростках пшеницы.

Результаты измерения концентрации гормонов в ксилемном соке, взятом анализ через 20 минут после введения осмотика в питательную среду показали, ч ПЭГ вызывал увеличение концентрации АБК (от 120 до 360 нг/мл) и снижение кс центрации цитокининов с 1240 до 900 нг/мл. Зная скорость транспирации, котора; течение 10 мин, предшествующих сбору ксилемного сока, составляла в контроле мкл/растение, и 15 икл/растение-в опыте, можно рассчитать скорость поступлен цитокининов из корней за 10 мин, которая составляет 25 и 13,5 нг/растение соотв< ственно (см. формулу в методическом разделе). Аналогично можно рассчитать сь рость поступления АБК.

Представляет интерес сопоставить индуцированные ПЭГ изменения в содс жании гормонов и активности других физиологических процессов. При этом нес ходимо учитывать, что, с одной стороны, гормоны способны влиять на транспир цию и поглощение воды, а, с другой стороны, водный потенциал клеток в свою о>:

дь может влиять,на метс-.'.-олизм гормонов (Trejo et al, 1993; Zhang et al, 1998). ¡едовагельно, не всегда просто установить, какие из наблюдаемых эффектов яв-ются причиной, а какие - следствием.

■ Хорошо известно, что падение водного потенциала клеток стимулирует син-5 в них АБК (Pierce, Raschke, 1980). В наших экспериментах одним из самых рзн-х эффектов было падение содержание воды в корнях. Сам этот эффект легко объ-нить тем, что возрастание осмотического потенциала питательного раствора при-дило к дисбалансу между способностью корня поглощать воду и ее оттоком из рня в побег. Вслед за тем мы обнаружили накопление АБК. Наши результаты в четании с данными литературы позволяют предполагать, что дефицит воды в етках корпя активировал синтез в них АБК. Об этом же говорит увеличение кон-нтрации гормона в ксилемнои соке. Хотя скорость ксилемного потока в первые мин действия ПЭГ снижалась примерно в 1,5 раза, из-за высокой концентрации рмона, скорость его поступления в побег была выше, чем у растений в контроле и iraa обеспечить наблюдаемое в этот период накопление АБК в побегах. Однако гем (между 20 и 30 мин) резко увеличился угол наклона кривой, отражающей изделие содержания АБК во времени. Поскольку при этом скорость транспираци-ного потока продолжала снижаться, можно считать, что определенный вклад в копление АБК в этот период вносит сам побег. Интерес к этому периоду ответной акции на ПЭГ связан с тем, что именно в это время обнаружен максимум АБК, торый предшествует наиболее резкому торможению трапепирации между 30 и 40 [H. Как видно из таблицы 2, в побеге содержание воды также падало, и снижение дного потенциала клеток побега могло быть причиной синтеза АБК или снижс-;я скорости ее распада. Для того, чтобы оценить вклад самого побега в регуляцию держания АБК при действии ПЭГ, мы провели опыт с растениями, у которых рни были убиты кратковременным погружением в кипящую воду.

Из рис. 9 следует, что само отмирание клеток корня вызывало резкое накоп-ние АБК в побеге (для сравнения см. уровень содержания АБК у контрольных стений - рис. 8 и 9). Причиной этого изменения могло быть поступление АБК из итых клеток. Однако этот эффект не был предметом изучения в данной работе. 1С интересовала реакция таких растений на последующее добавление ПЭГ. Со-ржание АБК у контрольных растений с убитыми корнями (в питательный раствор торых ПЭГ не добавляли) постепенно снижалось, что свидетельствует о ее расиа-. У обработанных ПЭГ растений снижение уровня АБК замедлялось, и ее стано-

вилось больше, чем у контрольных, растений. Это указывает на возможность т что ПЭГ замедлят распад АБК. Такое предположение согласуется с данными Л1 ратуры о том, что скорость распада АБК в побеге зависит от водного потенцр (Тге_р й а1, 1993). Не исключено также, что дополнительное количество АБК мс синтезироваться в побеге. Но, так или иначе, и активация синтеза АБК, и сниже скорости ее распада могли у данных растений происходить только в побеге, скольку корни у них были уби ты кипячением и не могли активно реагировал последующее воздействие ПЭГ. Эти данные дают нам основание предполагать, и в случае растений с живыми корнями какая-то часть АБК в ответ на действие 1 накапливается благодаря процессам, которые происходят в самом побеге.

V Ж О

! M

! <

! к

I s

1 --г

! ®

I а.

1200 -у 1000 3 800 ¡600

к <ц

S fe

S °

Р с »

10 20 Время, мин

30

Рис. 9. Влияние ПЭГ на содержание АБК в побегах растений с убитыми ко£ ми (контроль - растения с убитыми корнями, в питательный раствор кото{

ПЭГ не добавляли)

О

Представляет ингерес тот факт, что вслед за пиком АБК было зарегистр вано наиболее резкое снижение транспирации. Эти результаты указывают на можную роль АБК в ограничении потери воды при действии ПЭГ. Как извести устьичную проводимость могут влиять не только АБК, но и цитокинины (Mans: McAinsh, 1995). Поэтому, снижению транспирации могло также способствс уменьшение содержания цитокининов, которое было обнаружено в побеге в нг эксперимента. Расчет соотношения концентрации АБК и цитокининов показы что изменение этого показателя при стрессе еще более значительно, чем каж гормона в отдельности.

Как известно, цитокш;:>ны необходимы также для поддержания роста побега таева, 1973). Снижение содержания цитокининов происходило очень быстро. ;нно это изменение могло способствовать подавлению роста побега. Роль ЛБК в л случае менее очевидна, поскольку пик ее содержания приходится на период, ;а рост уже 20 мин как полностью прекратился.

Таким образом, функциональное значение быстрого снижения уровня цито-инов не вызывает сомнений. Представляет интерес обсудить, каким образом в ere могло так быстро снизиться содержание цитокининов. Сопоставление дан; о влиянии ПЭГ на содержание цитокининов в побегах и корнях растений потает заметить, что падение уровня гормона в побеге сопровождалось его накоп-ием в корнях. Поэтому, самое простое объяснение заключается в ингибировании испорта цитокининов. Этому объяснению соответствуют данные о снижении центрации цитокининов в ксилемном соке. Учитывая снижение транспирацион-

0 потока, скорость поступления цитокининов в побег окажется еще более низ-

Контрольные растения за 1 ч получали из корней то количество цитокининов, орое примерно равно их содержанию в побегах. Отсутствие накоплення цитоки-iOB в побегах контрольных растений говорит о том, что скорость превращения х гормонов в побеге была равна скорости их поступления из корней. Поскольку

1 постоянной скорости метаболизма цитокининов даже полное прекращение их туплеиия из корней могло привести к снижению содержания цитокининов в по-е в 2 раза только через 0,5 ч, наблюдаемое снижение содержания цитокининов в >еге уже через 10 мин после добавления ПЭГ, может указывать на то, что в побе-5ыстрее происходил распад цитокининов.

Из таблицы 3 видно, что через 10 мин после начала воздействия изменилось •тношенис между свободным зеатином и его нуклеотидом в побеге, что свидс-ьствует об отклонениях в метаболизме цитокининов. Не исключено, что одно-:менно происходило ускорение распада гормона за счет повышения активности гокининоксидазы (Hare, Van Staden, 1994). Это могло привести к быстрому сни-чшо уровня гормона в побеге. В связи с этим представляет интерес природа сиг-ia, который исходит из корней и влияет на метаболизм цитокининов в побеге, зестно, что высокая скорость распространения характерна для гидравлических ■налов (Полевой и др., 1996). Как уже отмечалось ранее, снижение водного по-циала может влиять на метаболизм гормонов. Однако этому предположению

противоречит тот факт, что через 10 мин после начала действия ПЭГ содержа воды в побеге не отличалось от контроля, хотя к этому времени концентрация щ кининов уже снизилась. Быстрое распространение характерно не только для ; равлических, но и электрических сигналов, вызывающих изменения в соотноше метаболитов гормонов (Кудоярова и др, 1990; Полевой и др., 1996). Известно та] что осмотический шок индуцирует распространение электрических сигн; (Fromm et al, 1995). Все это позволяет предполагать, что именно электрический нал, который распространялся из корней под влиянием ПЭГ, мог индуцировать тивацию распада цитокининов в побеге.

Таблш

Содержание зеатина (3) и его нуклеотида (ЗН) (% от суммарного соде икания зсат:;;;а, его рцбознда, глмкцзида и нуклеотида) в побегах прорпстх пшеницы через 10 минут после добавления в питательную среду ПЭГ.

Варианты 3 ЗН

Контроль 63,7 11,5

Опыт 13,8 48,3

Во второй фазе ответа на действие ПЭГ происходило возвращение почти характеристик к уровню контроля. Возрастала транспирация, оводненность и глощение воды корнями, возобновлялся рост, содержание цитокининов в по увеличивалось, а АБК - снижалось. Все это указывает на участие гормоном в от растений на осмотический шок. Возрастание концентрации цитокининов и сн! ние уровня АБК могут способствовать активации роста и транспирации, так же накопление АБК и снижение уровня цитокининов могли тормозить рост и вызы снижение транспирации. Вместе с тем, как и в случае действия кадмия, одно то увеличение транспирации, т.е. потери воды, не могло обеспечить восстановл водного баланса. Очевидно, что восстановление оводненности побега не возмс без усиленного поглощения воды корнями. Гормоны участвуют в регуляции з процесса. Известно, что АБК способствует восстановлению тургора (Griffiths < 1996) и адаптации к осмотическому стрессу при действии ПЭГ. Таким образом строе накопление АБК в корнях при действии ПЭГ не просто отражает усил синтеза химического мессенджера, посылаемого в побег. Очевидно, АБК такж обходима корням для приспособления к условиям повышенного осмотическое тенциала питательного раствора. То же самое, вероятно, относится к цитокиш

с уже отмечалось, они мо.ут влиять на водную проводимость корней. Кроме то-извеетная способность цитокининов активировать метаболизм и аттрагировать имиляты играет важную роль для поддержания метаболической составляющей щспорта воды (Жолкевич и др., 1989).

Итак, сравнительное изучение результатов введения в питательную среду ио-з кадмия и ПЭГ свидетельствует о сходном характере вызванных этими воздей-1иями изменений концентрации гормонов за счет их транспорта, синтеза или активации, которые являются частью общего регуляторного механизма, обеспе-зающего, снижение повреждающего воздействия этих неблагоприятных факто-з на растения.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что реакция на введение в питательную среду ионов кадмия в ицентрации, не превышающей адаптивных возможностей проростков пшеницы, еет четко выраженный двухфазный характер. На первом этапе быстрое снижение держания цитокининов в побегах и корнях, сопровождается ингибированием рос-и транспирации, в то время как на втором - происходит повышение содержания эмона и восстановление ростовой функции и транспирации.

2. Предобработка растений зеатином снижает ростингибиругащее действие цмия. Данный факт в сочетании с результатами анализа содержания разных форм токининов указывает на их участие в повышении устойчивости растений к дейст-ю кадмия.

3. Обнаружено, что уже через 20 мин после добавления ПЭГ в питательный створ скорость поступления цитокининов из корней и их содержание в побегах стений пшеницы снижается в 2 раза, что сопровождается столь же быстрым по-влением роста растений и уменьшением уровня транспирации.

4. Показано, что увеличение концентрации АБК в ксилемном соке и скорости поступления из корней в побег является одним из факторов, приводящих к нако-

1ению АБК в побеге при осмотическом шоке.

5. Поддержание повышенного содержания АБК у растений с убитыми корня-1 на фоне осмотического шока указывает на важную роль метаболических ьре-^ащений данного гормона, которые в этих условиях происходят в самом побеге.

6. Первоначальное снижение уровня цитокининов и накопление АБК в побеге ж действии ПЭГ сопровождается ингибированием транспирации, которая затем

быстро восстанавливается на фоне снижения уровня ЛБК и возрастания содержа цитокининов, что указывает на роль данной пары гормонов в сиюминутной per ции транспирации при осмотическом шоке.

7. Быстрое изменения, концентрации АБК и цитокининов в корнях расте при действии ПЭГ является результатом как уменьшения оттока гормонов из 1 ней, так и изменения скорости их метаболизма в корнях. Повышенноесодержа АБК и цитокининов в корнях может быть важным фактором, обеспечивают адаптацию растений к высокому осмотическому потенциалу питательной среды.

Автор выражает сердечную благодарность своему научному руководит д.б.н. Трапезникову В.К. за постоянную помощь на всех этапах выполнения рабе к.б.н. Дедову A.B. - за предоставление сконструированного им высокочувствит( ного ростового датчика, особую признательность - к.б.н. Мустафиной А.Р. за i стороннюю поддержку и помощь.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Mustafina A., Kudoyarova G., Veselov D., Vesclov S. Hormonal response of wl seedlings to polyethelene glycol-induced water deficiency//Root demographics their efficiency in sustainable agriculture, grasslands, and forest ecosystems. Abstr of fifth Symposium of International Society of Root Research (July 14-18, 1996). ] dren Conference Centre-Clemson, South Carolina, 1996. - P. 115.

2. Весело в Д.С., Дедов A.B., Джексон M. Влияние ионов кадмия на рост по£ пшеницы и его обеспеченность цитокининами//Физико-химическис основы зиологии растеиий и биотехнологии. Тезисы 3-его ежегодного симпозиума I сийского общества физиологов растений (27-28 июня 1997 г., Москва). М., И - С. 49.

3. Mustafina A.R., Kudoyarova G.R., Veselov D.S., Veselov S.Yu. Hormonal and gro response of wheat seedlings on PEG-induccd water stress// Proceedings of the : Symposium of the International Society of Root Research. Kluwer Acad. Publ. : recht, 1998. -P.619-625.

4. Веселов Д.С., Мустафина А.Р. Быстрый ответ побегов проростков пшеницы кратковременное действие полиэтиленгликоля// Биологические науки в выс! школе. Проблемы и решения. Материалы Всероссийской научно-практичес конференции (Бирск, май 1998). Изд-во Бирского пед. Университета: г. Бирс

С. 45-47

Веселов Д. С., ФахрисламсЕ Р.Г. Effect of cadmium on ions uptake, transpiration and cytokinins content in wheat seedlings// Abstracts of the 11th Congress of Federation of European Society for Plant Physiology (Varna, Bulgaria, 7-11 September 1998), Bulgarian Journal of Plant Physiology P.74.

Веселов Д.С., Фахрисламов Р.Г. Влияние кадмия на поглощение ионов, транспи-рациго и содержание цитокининов в проростках пшеницы. Агрохимия, 1999, № 10.-С. 274-282.

Мустафина А.Р., Веселов Д.С. Быстрый гормональный и ростовой ответы проростков пшеницы на обработку полиэтиленгликолем. Тез. докл. конф. «Регуляторы роста и развития растений» 1999, с. 55.

Мустафина А.Р., Веселов Д.С., Сабиржанова И.Б., Кудоярова Г.Р. Быстрая гормональная реакция на осмотический шок у проростков пшеницы. Тез. докл. IV съезда ВОФР, Москва 1999, с. 425.

Лиц. па издат. деят. МП № 0187 от 08.10.96.

Уч.-изд. л. 19,9. Компьютерный набор. Тираж 80. Заказ № 69 Отпечатано на ризографе

Лиц. на полиф. деят. Б № 848076 от 11.09.96 450000, г.Уфа, ул.Октябрьской революции, За Отпечатано в типографии БГПИ

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Веселов, Дмитрий Станиславович, Уфа

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК УФИМСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ

На правах рукописи ВЕСЕЛОВ ДМИТРИЙ СТАНИСЛАВОВИЧ

РОЛЬ ГОРМОНОВ В БЫСТРОЙ РЕ А КЦИ И ИИ И И РАСТЕНИЙ ПШЕНИЦЫ НА НЕБЛАГОПРИЯТНЫЕ

ВОЗДЕЙСТВИЯ

ч '

с

(Специальность 03.00.12 - Физиология растений)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: д.б.н. В.К.Трапезников

Уфа - 1999

1

I .ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6

1.1.Характеристика цитокининов и АБК....................................................................................6

1.1.1 .Цитокинины.............................................................................................................6

1.1.1.1 .Биосинтез цитокининов.....................................................................................7

1.1.1.2.Метаболизм цитокининов.................................................................................8

1.1.2. Абсцизовая кислота (АБК)...................................................................................18

1.1.2.1 .Биосинтез..........................................................................................................19

1.1.2.2.Дальнейшие превращения АБК.......................................................................21

1.1.2.3.Влияние обмена веществ на физиологическую активность...........................23

1.1.2.4. Локализация и регулирование метаболизма...................................................27

1.2. Гормоны как регуляторы водного баланса......................................................28

1.2.1 .Гормоны и поведение устьиц................................................................................29

1.2.1.1.Образование и распределение абсцизовой кислоты в связи с функционированием устьиц............................................;...........................................29

1.2.1.2.Механизм действия АБК на устьица...............................................................32

1.2.1.3.Цитокинин ы.....................................................................................................36

1.2.2.Гормоны и интегрированный ответ растений на водный стресс........................37

1.2.2.1.Корн и................................................................................................................37

1.2.2.2. Листья...................................................................................................................................39

2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..............................................40

2.1. Условия выращивания растений и проведения экспериментов........................40

2.2. Методы исследования...............................................................................................40

2.2.1 Измерение роста растений.....................................................................................40

2.2.3. Экстракция, очистка и концентрирование гормонов..........................................41

2.2.4. Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА).............................................42

2.2.5.Определение содержания гормонов в ксилемном соке.......................................42

2.2.6.0пределение активности кислой пероксидазы.....................................................43

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ......................................................44

3.1.Динамика содержания цитокининов в связи с регуляцией поглощения и потери воды у растений на фоне действия токсичных концентраций Ионов кадмия..............................................................................................................................44

3.2.Динамика содержания гормонов и физиологических показателей у растений пшеницы при действии ПЭГ.........................................................................................,57

3.2.1. Быстрые реакции на ПЭГ......................................................................................68

ЗАКЛЮЧЕНИЕ....................................................................................................89

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ:....................................97

2

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность. Общепризнанно, что гормоны играют важную роль в адаптации растений к условиям обитания. Предполагается, что они выполняют функцию химических мессенджеров, которые транспортируются из одной части растения в другую, обеспечивая скоординированную реакцию на организменном уровне (Jackson, 1993). Физиологическая роль гормонов в основном реализуется через изменение их концентрации. Известно, что при неблагоприятных условиях обычно снижается концентрация гормонов стимулирующего типа действия (например, цитокининов) и возрастает концентрация гормонов - ингибиторов роста (например, АБК) (Salisbury, Marinos, 1985; Жолкевич, Пустовойтова, 1993). Полагают, что эти изменения концентрации гормонов приводят к торможению роста, снижению транспирации и другим процессам, которые обеспечивают выживание растений при неблагоприятных условиях. Поэтому не удивителен интерес исследователей к изучению о механизма регуляции концентрации гормонов. Значение гормонального контроля транспирации при стрессе связано с тем, что при большинстве неблагоприятных воздействий возникает проблема поддержания водного баланса. Не прекращаются дискуссии о месте синтеза АБК, которая в, частности^ регулирует закрытие устьиц (Härtung et al, 1988; Zhang, Davies, 1991; Zong et al, 1996), а также о том, реагируют ли устьица на изменение концентрации АБК в ксилемном соке или более важна скорость доставки гормона из корней за единицу времени (Tardieu, Davies, 1992; Gowing et al, 1993; Jarvis, Davies , 1997; Zhang et al, 1997). Все чаще обсуждается возможная роль дальнейших превращений АБК в регуляции ее концентрации (Trejo et al, 1993). Пути метаболизма цитокининов изучены достаточно детально (Letham, 1983, Horgan, 1992; Binns, 1994). Тем не менее конкретных сведений о том, как при стрессе регулируется

3

концентрация цитокининов, не так уж много. Они, в основном, сводятся к информации о снижении содержания данных гормонов в ксилемном соке растений при ряде неблагоприятных воздействий (Кулаева, 1962; Jackson; 1993).

Весьма важно также получить ответ на вопрос о том, насколько быстро может меняться концентрация гормонов в растении. В некоторых случаях ответная реакция появляется уже через несколько десятков минут после введения экзогенного гормона в растение (Шакирова и др., 1982; Silverman et al, 1998; Guilfoyle, 1998). Может ли с такой же скоростью изменяться концентрация эндогенного гормона, запускающая быструю ответную реакцию? По последним данным, скорость полураспада в листе АБК, поступающей из корней , составляет всего несколько десятков минут (Zhang et al, 1997). Поэтому можно предполагать, что снижение скорости распада гормона даже при неизменном уровне синтеза должно приводить к быстрому накоплению АБК. Однако большинство исследователей анализировали содержание гормонов в лучшем случае через несколько часов после воздействия, и лишь немногие занимались изучением быстрых изменений концентрации гормонов (Кудоярова и др., 1990; Полевой и др. 1996; Tillberg, 1999).

Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в том, чтобы изучить механизм и функциональное значение быстрых изменений концентрации цитокининов и АБК при действии осмотика полиэтиленгликоля (ПЭГ) и токсичной концентрации кадмия на проростки пшеницы. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести сравнительное изучение влияния кадмия на скорость роста, транспирацию, поглощение элементов питания и содержание цитокининов в побегах и корнях и ксилемном экссудате проростков пшеницы.

4

2. Оценить влияние добавления ПЭГ в питательную среду на скорость роста, транспирацию и содержание цитокининов и АБК в побегах и корнях проростков пшеницы и их ксилемном экссудате.

3. Сопоставить динамику содержания АБК у проростков пшеницы с живыми и убитыми корнями в ответ на осмотический шок для выявления роли побегов и корней в регуляции содержания АБК.

4. На основе определения концентрации цитокининов в ксилемном соке и скорости транспирации рассчитать скорость поступления гормонов из корней в побег.

5. Сопоставить продолжительность периода, в течение которого в ответ на внешние воздействия появляются изменения в содержании цитокининов в побеге, со скоростью поступления цитокининов из корней, что позволит оценить роль транспорта гормонов в контроле быстрых гормональных реакций у растений.

Научная новизна. Показано, что первоначальное снижение концентрации цитокининов в проростках пшеницы в ответ на действие ионов кадмия в токсичной концентрации сопровождается снижением транспирации, ингибированием роста и поглощения ионов калия и нитратов. Восстановление активности перечисленных процессов происходило на фоне резкого возрастания содержания цитокининов как в побегах и корнях, так и ксилемном соке и, по всей видимости, было их следствием. Обнаружено, что быстрое торможение роста побега при добавление ПЭГ в питательную среду связано со столь же быстрым снижением содержания цитокининов в побеге, в то время как резкое ингибирование транспирации в большей степени обусловлено накоплением АБК.

Установлено, что 8-дневные проростки пшеницы сорта Безенчукская 139 в течение около 1 ч получают из корней количество цитокининов, равное их содержанию в побеге.

5

Обнаружено, что повышенное содержание АБК в побегах растений при добавлении ПЭГ в питательную среду характерно не только для растений с живыми, но и убитыми корнями, что свидетельствует о роли побега в обеспечении накопления гормона.

Практическая ценность. Изучение динамики концентрации эндогенных гормонов при действии стрессовых факторов может быть полезным для разработки рекомендаций по применению гормонов в качестве регуляторов устойчивости растений. Опыты с экзогенным зеатином свидетельствуют о целесообразности использования цитокининов для повышения устойчивости растений к токсичным металлам.

Апробация работы. Основные положения представлены на 5 симпозиуме международного общества по исследованию корней (СНА, Южная Каролина, 1996), 3 симпозиуме Российского общества физиологов растений «Физико-химические основы физиологии растений и биотехнология» (Москва, 1997), Научно-практической конференции «Биологические проблемы в высшей школе. Проблемы и решения» (Бирск, 1998), 11 Конгрессе Федерации Европейских Обществ Физиологов растений (Варна, 1998), IV съезде общества физиологов растений России (Москва, 1999).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ.

6

1.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ

1.1.Характеристика цитокининов и АБК.

1.1.1 .Цитокинины

Первый природный цитокинин был выделен в 1963 Letham (Letham, 1963) из незрелых семян Zea mays. После его идентификации вещество получило название зеатин. Цитокинины являются производными 6-аминопурина с замещением по аминогруппе при шестом атоме углерода пуринового кольца. Они образуются главным образом в кончике корня растения и транспортируются по ксилеме в надземные органы, о чем свидетельствует то, что эти гормоны обнаружили в пасоке растений (Henson, Wareing, 1984). Цитокинины были определены (Whitty, and Hall, 1974) «как вещества, которые в комбинации с ауксином стимулируют деление клеток и которые взаимодействуют с ауксином, определяя направления диффе-ренцировки клеток». Разнообразие эффектов цитокининов привело к формированию представления о том, что они (цитокинины) играют важную роль практически на всех этапах жизни растений (Horgan, 1992). Наиболее специфическим действием цитокининов является стимуляция клеточного деления. Они также стимулируют рост боковых побегов (Aung, 1986; Li, Bangerth, 1990), активируют прорастание семян и задерживают процессы старения (Kende, 1964; Тао et al., 1983), ингибируют рост корней в длину (Блохин, 1986; Van Staden, Harty, 1988) и формирование боковых корней (Дерфлинг, 1985), оказывают влияние на фотосинтетический аппарат, световые реакции фотосинтеза и метаболизм углерода (Чернядьев, 1993), транспорт ассимилятов (Борзенкова, Зорина, 1990) влияют на биосинтез нуклеиновых кислот и белков (Кулаева, 1982; Шакирова и др., 1982; Palni, 1983; Van Staden, Drewes, 1991), метаболизм азота (Кузнецов и др., 1986).

7

1.1.1.1.Биосинтез цитокинтов Регуляция концентрации гормонов на клеточном уровне - важный аспект функционирования гормональной системы. Концентрация гормонов зависит от скорости их синтеза, метаболизма и быстроты поступления в клетки и выхода из них.

Общепризнано, что биосинтез цитокининов начинается с присоединения диметилаллилпирофосфата в Н6 положении аденозинмонофосфата (АМФ) при помощи изопентенилтрансферазы (1р^, с образованием цито-кининриботида, Ы6У2-изопентенилАМР ([913.-5 Т]1Р). У бактерий Agrobacterium Штг/ааепз идентифицирован ген, кодирующий фермент, который катализирует эту реакцию (АЫуобЫ е1 а1, 1984; ВисИтапп е1 а1, 1985). Изопентенилтрансферазная активность обнаружена в тканях многих растений (Но^ап, 1992). Однако до сих пор не удалось добиться достаточной степени очистки этого фермента из растений, которая позволила бы охарактеризовать его субстратную специфичность и идентифицировать соответствующий ген.

Поскольку субстратом для данного фермента является фосфорили-рованное производное аденита, предполагается, что цитокинины могут появляться в растении в процессе модификации рибонуклеиновых кислот (Мс Оа\у, 1987; МагесЬа1-Бгоиагс1 е! а1., 1993). Это предположение подтверждает присутствие цитокининов в составе некоторых транспортных и рибосомальных РНК. Гидролиз модифицированных РНК может быть источником появления свободных цитокининов в растении. Известно, что в составе РНК содержатся в основном цис-формы гормона, в то время как свободные цитокинины - это в основном транс-формы. Однако этот факт не может служить опровержением того, что синтез свободных цитокининов идет через модификацию нуклеиновых кислот. Дело в том. что по последним данным возможно взаимопревращение цис- и транс-форм цитокини-

8

нов (Binns, 1994). Тем не менее этот вопрос остается открытым. Против данной гипотезы свидетельствует тот факт, что клетки, которые при культивировании in vitro не могли расти без добавления экзогенных цитокини-нов, тем не менее содержали достаточно цитокининов в составе их РНК (Letham, Palm, 1983).

1.1.1.2.Метаболизм цитокининов

Формирование свободных цитокининов начинается с биосинтеза [9R-5'P] iP (нуклеотида изопентениладенина) Это соединение может рассматриваться как предшественник остальных двадцати или около того свободных цитокининов. По всей видимости [9R-5'P]iP быстро и стереоспеци-фически гидроксилируются с образованием производных зеатина (Z). Это гидроксилирование является первым важным метаболическим превращением. С него начинаются многие метаболические реакции с последовательным образованием агликонов, глюкозидов, рибозидов, риботидов, конъюгатов аминокислот, а также продуктов его восстановления и окисления. Эти метаболические события могут быть подразделены на четыре большие группы, а именно: конъюгирование, гидролиз, восстановление и окисление. Локализация этих процессов обсуждается с использованием информации о ферментах, катализирующих специфические реакции. Кроме того сделана попытка определить роль различных метаболитов в регулировании проявления цитокининовой активности.

Конъюгаты

Рибозиды и Риботиды

Рибозиды цитокинина и их 5!моно ди- и три- фосфаты - вероятно, наиболее часто встречающиеся в природе цитокинины (Letham et al., 1983; McGaw et al., 1984; Scott, Horgan 1984). Рибоза всегда присоединяется в 9 положении пуринового кольца. Когда меченный по углероду зеатин вводили в растения, основными продуктами его превращения в растении были

9

[9R]Z (рибозид зеатина), и [9R-5'P]Z (нуклеотид зеатина) (Laloue, Fox, 1989). Дальнейшие исследования показали, что нуклеотиды являются доминирующими метаболитами сразу же после введения зеатина, но затем может происходить быстрый гидролиз этих соединений с образованием более устойчивых и менее активных продуктов (то есть, N-глюкозидов или продуктов окисления боковой цепи). Также был изучен метаболизм введенных извне [9R]Z и [9R]iP. Показано, что вновь за фосфорилированием следовал гидролиз и дальнейшие метаболические превращения (Letham et al., 1982; Chen, 1982). Процессы взаимного превращения основания цито-кинина, рибозидов и нуклеотидов имеют чрезвычайно большое значение для всех изученных тканей растений, и имеется доказательство, что их может катализировать та же самая система ферментов, которая метаболизи-рует основание, рибозид и нуклеотид аденина. Однако, участвующие в этих реакциях ферментативные системы были намного хуже охарактеризованы, чем приведенные выше процессы биосинтеза или процессы деградации, которые обсуждаются далее. Метаболические превращения, катализируемые 5 '-нуклеотидазой и нуклеозидазой, были обнаружены в экстрактах семян пшеницы (Chen, Kristopeit, 1981; Chen, Kristopeit, 1981), а также листьев и корней томатов (Burch, Stuchbury, 1986; Burch, Stuchbury, 1986), но в каждом случае ферменты имели более низкое сродство к Ш-замещенному пурину чем к немодифицированным азотистым основаниям и их производным. То что взаимные превращения цитокинина катализируют ферменты, метаболизирующие пурины, также было подтверждено с помощью исследования результатов введения экзогенных цитокининов in vivo (Laloue, Pethe, 1982). Тем не менее мы все еще понимаем очень немного относительно контроля этих процессов in vivo. В частности концентрации аденина, аденозина и аденозинмонофосфата (АМФ) в клетках обычно намного выше, чем соответствующих цитокининов. Однако, было высказано пред-

10

положение, что даже те ферменты, которые имеют довольно низкое сродство к цитокининам, тем не менее все же могут катализировать их взаимопревращение с достаточно высокой скоростью, принимая во внимание низкое содержание этих гормонов в растениях (Stuchbury, Burch, 1987).

Фермент аденинфосфорибозилтрансфераза, вероятно, играет главную роль в превращении аденина в AMP в растениях. Фермент,