Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммуноанализ в изучении содержания и распределения гормонов при стрессе

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Иммуноанализ в изучении содержания и распределения гормонов при стрессе"

Па правах рукописи

^ Оч*

Мустафина Аэлита Рауфовна

ИММУНОАНАЛИЗ В ИЗУЧЕНИИ СОДЕРЖАНИЯ И РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ГОРМОНОВ ПРИ СТРЕССЕ

Специальность 03.00.12 - Физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа 1997

Работа выполнена в Институте биологии Уфимского научного центра Российской Академии наук.

Научные руководители - доктор биологических наук

Г. Р.Кудоярова - кандидат медицинских наук С.Ю.Веселов

Официальные оппоненты - доктор биологических наук,

ведущий научный сотрудник Н.Л.Клячко

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник А. Ю.Кулагин

Ведущая организация - Московский государственный

университет им.М.Ломоносова

«/1997 г. в

ГО

Защита диссертации состоится _" /¿/-¿^^ 1997 г. в

на заседании диссертационного совета К 064.13.09 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук в Башкирском государственном университете по адресу: 450074, Уфа, ул. Фрунзе, 32, биологический факультет Башкирского государственного университета С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Башкирского государственного университета.

Автореферат разослан '" • " 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, Г. Г. Кузяхметов

кандидат биологических наук

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Приспособление растений к неблагоприятным условиям окружающей среды традиционно вызывает интерес у физиологов растений. Изучению этого процесса посвящено большое количество работ как у нас в стране, так и за рубежом. Известно, что фито-гормоны играют активную роль в формировании реакции растительного организма в ответ на внешнее воздействие (Пустовойтова, 1978, Pilaris, Reid. 1985; Жирмунская. Шаповалов, 1987; Salisbury, Marinos, 1985; Jackson. 1993). Данные, полученные в лаборатории физиологии растений УНЦ РАН показывают, что изменение их количества может быть установлено уже через несколько минут после начала воздействия (Кудоярова и др., 1990), что указывает на необходимость анализа детальной динамики гормонов. Однако к началу выполнения данной работы существовали методические сложности в определении гормонов, связанные ¡сак с трудоемкостью одних методов анализа (физико-химические), или недостаточной точностью и воспроизводимостью других (биотестирование). Все это затрудняло проведение количественного анализа большого количества образцов одновременно. Разработка иммунологических методов определения фитогормо-нов, и, в частности, твердофазного иммуноферментного метода, позволяет решить многие проблемы.

Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в разработке высокочувствительного и специфичного экспресс-метода иммуноферментного определения ауксинов, цитокининов и абсцизовой кислоты, а также исследовании влияния водного и теплового стрессов на динамику данных фитогормоноь в растения/, пшеницы, кукурузы и табака. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

- оценка достаточности очистки индолилуксусной и абсцизовой

- о -

кислот по модифицированной схеме экстракции для обеспечения надежности иммуноанализа;

- изучение специфичности и воспроизводимости метода твердофазного иммуноферментного анализа ИУК, АБК и цитокининов;

- исследование эффективности сочетания тонкослойной хроматографии и иммуноанализа для количественного определения отдельных производных цитокинина зеатина;

- изучение быстрого и длительного гормональных ответов растений пшеницы, кукурузы и табака на неблагоприятные воздействия;

- сопоставление динамики разных гормонов при стрессе с целью выявления их возможного взаимодействия.

Научная новизна. Показано, что использование минимального объема экстрагента на каждой стадии экстракции и реэкстракции ИУК и АБК увеличивает надежность анализа за счет освобождения образца от компонентов, являющихся причиной специфической интерференции.

Продемонстрировано, что сочетание тонкослойной хроматографии (ТСХ) и иммуноферментного анализа (ИФА) позволяет разделять и количественно определять нуклеотид, 9-М-глюкозид, рибозид и свободное основание зеатина.

Применение ТСХ-ИФА позволило зарегистрировать быстрые (в течение 15-30 минут) изменения в спектре иммунореактивных цитокининов в побегах растений кукурузы и пшеницы при их подвядании.

Обнаружена связь между засухоустойчивостью растений разных сортов пшеницы и их способностью накапливать ИУК в зоне меристемы и АБК - в листовой пластинке.

Показано, что локальное внесение удобрений, повышающее засухоустойчивость растений, снижало уровень накопления АБК, индуци-

рованное недостатком влаги в почве.

Практическая ценность. Разработанный вариант определения гормонов с помощью ИФА после адекватной очистки растительного материала находит широкое применение в различных лабораториях исследовательских институтов и ВУЗов.

Показано, что метод отбора цитокинияподобных соединений по их способности взаимодействовать с антителами к цитокининам позволяет быстро проводить скрининг веществ, потенциально способных повышать устойчивость растений.

Апробация работы. Основные положения работа доложены на конференциях: "Математическая научная конференция" (Казань, 1988), "Вопросы медицинской биотехнологии и иммунопрепаратов" (Уфа, 1988), 3 Всесоюзной конференции молодых ученых по физиологии растительной клетки (Петрозаводск, 1988), "Актуальные проблемы физиологии растений и генетики" (Киев, 1989). 14 съезде по общей и прикладной химии (Москва, 1989), "Изучение и рациональное использование природных ресурсов" (Уфа, 1989), 1 школе-семинаре "Имму-ноформентный анализ регуляторов роста растений: приложение к физиологии растений и экологии" (Уфа, 1989), 4 Всесоюзной конференции молодых ученых по физиологии растительной клетки (Минск, 1990), з съезде Всесоюзного общества физиологов растений (Санкт-Петербург, 1993), Международном симпозиуме "Физиология абсцизовой кислоты. 30 лет исследований" (Пущино, 1993), 9 Конгрессе Федерации европейских обществ физиологов растений (Брно, 1994). 4 Симпозиуме ВВПЕ и комиссии по физиологии растений КНБВ (Дипенбик. 1993), 10 конференции по экстракции (Уфа, 1994). конференции "Физиолого-биохимическая основа физиологии растений" (Пенза, 1996). 10 Конгрессе Федерации Европейских обществ физио-

логов растений (Флоренция, 1996).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения. четырех глав, выводов и списка цитированной литературы из 168 наименований, из них 125 на иностранных языках. Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста, включает в себя 7 таблиц и 17 рисунков.

Автор сердечно благодарит научных руководителей д.б.н. Гюзель Радомесовну Кудоярову и к.м.н. Станислава Юрьевича Весело-ва за ценные практические и теоретические рекомендации при работе над диссертацией, а такие друзей и коллег д.б.н. Н.Л.Егуткина, к.б.н. Р.Г.Фархутдинова, Л.В.Высоцкую, И.Р.Теплову, А. Н. Митричен-ко и C.B.Залозного за поддержку на всех этапах работы.

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Семена растений табака Nicotiana tobaccum h. сорта Petit Havana, гибрида кукурузы Zea mays ¿.Краснодарский 395 ТВВЛ и пшеницы Тг. durum L. сорта Безенчукская 139 проращивали в течение 3-х суток в темноте при 24° С, а затем переносили на светоплощад-ку с освещенностью 18000 лк и 14-часовым световым периодом. Растения пшеницы и кукурузы росли на питательном растворе Хоглан-да-Лрнона, а растения табака - в сосудах с почвой, которые периодически поливали тем же раствором. В опытах 10 % раствор полиэти-ленгликоля готовили на жидкой питательной среде. Засухоустойчивость оценивали по способности изолированных побегов, подсушенных в темноте при 24° С до потери ими 30 % сырой массы, регенерировать корни.

При проведении вегетационных опытов растения пшеницы выращивали в сосудах, набитых смесью почвы и песка (2:1). Семена высевали на глубине 5 см. Нитрофоску (состава Н:Р:К= 17:16:17) из расчета 0,15 г д. в. на 1 кг смеси перемешивали равномерно или вносили экраном на глубину 8-10 см.

Экстракций ИУК, АБК и цитокикинов проводили по приведенной ниже схеме в 3-5 биологических повторениях по 5-10 растений в каждом.

С целью очистки и концентрирования гормонов растительный материал гомогенизировали и экстрагировали 80 %-ным этанолом в соотношении 1:10 в течение 16 часов- при 4° С. Спиртовьй экстракт отделяли центрифугированием, упаривали до водного остатка, отделяли аликвоту для определения цитокининов и после разведения остальной части водного остатка и его подкисления до рН 2-3 1 н НС1 экстрагировали ИУК и АБК двазкды диэтиловым эфиром в соотношении 1:5 (органическая фаза/водная фаза). Из объединенной органической фазы гормоны реэкстрагировали 1 % гидрокарбонатом натрия, взятым в соотношении 1:3 (водная фаза/органическая фаза). Органическую фазу отделяли и отбрасывали, а из водной (после подкисления до рН 2-3) вновь дважды извлекали ИУК и АБК диэтиловым эфиром и метилировали ее диазометаном.

Тонкослойную хроматографию (ТСХ) цитокининов после их очистки на С-18 картридже (Varían, USA) проводили в системе растворителей бутанол: аммиак:вода (6:1:2). После детекции в УФ-свете положения метчиков, которые добавляли к половине экстракта, содержимое зон элюировали 0,1 М фосфатным буфером (рН 7,0). После удаления силикагеля путем центрифугирования в надосадочной жидкости определяли содержание цитокининов с помощью иммуноанализа.

Иммуноферментннй анализ проводили в лунках полистиролового планшета (фирма "ЫпЬго", Англия). На первом этапе конъюгат гормона сорбировали на твердой фазе в течение 1,5 часов при 37°С. После 3-кратной промывки физиологическим раствором, содержащем 0,05 % твина 20. в лунки вносили антисыворотку к гормону, разведенную физиологическим раствором, содержащем 0,5% бычьего сывороточного альбумина и 0.05 % твина 20. вместе с раствором стандарта гормона. В ряд лунок предварительно добавляли различные количества веществ, иммунореактивность которых необходимо было оценить. После инкубации в течение 1 ч при 37° С количество антител, специфически связанных на планшете, оценивали с помощью бараньих антител против иммуноглобуллинов кролика, меченных пероксидазой. Количество иммуносорбированных антител определяли по пожелтению субстрата (0,4 мг/мл ортофенилендиамина в 0,06 М фосфатном буфере рН 5,3. содержащем 0,006 % перекиси водорода). Оптическую плотность раствора после фиксации серной кислотой измеряли на микрофотометре (ТиегЧек [Швсап, Англия) при длине волны 492 нм. Иммуноанализ проводили в 4-6 химических повторениях.

Статистическую обработку проводили на ЭКВМ "Искра-1256" по стандартным программам. Достоверность результатов оценивали по критерию Стыодента. На рисунках и в таблицах представлены средние значения и их ошибки.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1. Оценка специфичности разработанных тест-систем для определения ИУК и зеатина показала, что они были высокочувствительны

к производным соответствующих гормонов, имели некоторое, хотя и низкое сродство к их аналогам и не реагировали с другими соединениями. Поскольку некоторые производные гормонов, например их глю-козиды также способны реагировать с антителами, для количественного определения гормонов их необходимо отделять от других имму-нореактивных компонентов. В случае ИУК и АБК эта задача решалась с использованием экстракционной очистки. Как видно из рисунка 1, в неочищенном экстракте наряду с самой ИУК присутствовали еще 2 компонента, способных реагировать с сывороткой к ауксинам. Это глюкозиды и нейтральные эфиры гормона, которые обнаруживаются соответственно в первой и последней зонах хроматограммы. Однако, как видно из рисунка, в результате экстракции эфиром и реэкстрак-ции содой нам удалось избавиться от всех иммунореактивных компонентов кроме ИУК. Эффективность модифицированной нами схемы очистки достигалась за счет уменьшения объема экстрагента на каждой стадии экстракции и реэкстракции, что приводило к его концентрированию и увеличению селективности извлечения.

Поскольку производные зеатина близки друг к другу по физико-химическим свойствам, нам не удалось разделить их с помощью экстракционной очистки. Для разделения цитокининов мы применили тонкослойную хроматографию. Как видно из рисунка 2. в экстракте из растений пшеницы присутствуют 4 мажорных компонента, способных реагировать с сывороткой к рибозиду зеатина. Они совпадают по положению с метчиками нуклеотида, Э-И-глюкозида, рибозида и свободного основания зеатина. что свидетельствует о специфичности метода. т.к. коммерческие препараты данных соединений реагируют с сывороткой к рибозиду зеатина, которую мы использовали в своей работе. Таким образом, сочетание ТСХ и ИФА позволяет нам измерять

>.

IX О

с; ге ш

ш

О

4 ■

3,5 |

2 3'

2,5 1

■з

•х. 2!

га

а

1,5

1

X

0,5 -

0

И

¿я

и

IV

>

Рис. 1. Распределение иммунореактивного материала на бумажной хроматограмме из грубого этанольного экстракта (4), первичного эфирного экстракта (3), гидрокарбоната соды (2) и вторичного эфирного экстракта (1) из сухих семян кукурузы.

о о.

л

о ^

I 1-СЗ X

* т

о. ш

ф ч

о О

160 140 + 120 100

80

60 +

40

20

х со

О-

со

ЯГ

Рис. 2. Содержание иммунореактивных форм цитокининов в экстракте из растений пшеницы

концентрацию данных соединений в растениях. Это весьма важно, т.к. нуклеотиды являются запасной формой гормона, 9-Ы-глюкозид формой необратимой инактивации, рибозиды - траспортной формой, а сам зеатин - активной формой гормона. Мерить их концентрацию традиционными методами очень сложно. Использование иммуноанализа дает уникальую возможность оценить динамику метаболитов цитокининов и тем самым исследовать механизм регуляции их концентрации при стрессе.

3.2. Спектр цитокининов пои дегидратации. Как видно из рисунка 3 а, дегидратация проростков пшеницы приводила к очень быстрым сдвигам в спектре цитокининов. Он резко изменялся уже через пятнадцать минут после извлечения растений из питательного раствора. Возрастал уровень глюкозида, и снижалось содержание нуклеотида зеатина. Известно, что основная часть цитокининов синтезируется в корнях растений. Поэтому можно было думать, что изменение в содержании цитокиш-шоз связаны со снижением их поступления из корней из-за дефицита воды. Однако суммарное содержание цитокининов в побеге оставалось практически постоянным на протяжении эксперимента. Поэтому наблюдаемые изменения в спектре цитокининов скорее всего свидетельствуют о процессах, которые происходят в самом побеге. Накопление глюкозидов говорит о том, что при дегидратации усиливается конъюгирование зеатина. Однако концентрация свободного основания оставалась постоянной. За счет чего мог поддерживаться его уровень? Поскольку при стрессе мы наблюдали уменьшение концентрации нуклеотида зеатина. можно думать, что уровень зеатина поддергивался за счет освобождения гормона из данной запасной формы.

3500

" 11 -

Рис. 3. Содержание гормонов в побегах двухнедельных проростков пшеницы (а) и кукурузы (б), подвергнутых дегидратации

сумм. ЦК

1200

1

'контроль !

I I

а 30 минут | дегидратации |

_| ^аи

АБК сумм, цк ЗН ЗГ ЗР

Иначе реагировали на дегидратацию проростки кукурузы (см. рис.3 б). У них мы наблюдали резкое снижение концентрации зеатина и его рибозида. Причиной данного явления могло быть как уменьшение поступления гормона из корней, так и активация его превращения в неиммунореактивные формы в самом побеге по отношению к используемой нами сыворотке.

В чем могла быть причина наблюдаемых различий в реакции растений пшеницы и кукурузы на подвядание? Как известно, кукуруза относится к растениям С-4 типа и по этой причине она хорошо приспособлена к полному закрытию устьиц при дегидратации. В этом ее отличие от растений пшеницы, которая относится к растениям С-3 типа. Известно также, что цитокинины предотвращают закрытие устьиц. Все это позволяет нам предполагать, что резкое снижение содержания активной Форш цитокининов у растений кукурузы при дегидратации отражает готовность данных растений полностью закрыть свои устьица.

В целом наши результаты говорят о том, что содержание цитокининов может очень быстро меняться при стрессе и метаболизм цитокининов играет важную роль в быстрой регуляции концентрации гормона. Эти данные носят приоритетный характер.

Одновременно с изменением содержания цитокининов мы также наблюдали накопление АБК в проростках при дегидратации (см. рис. 3 а,б). Известно, что АБК является антагонистом цитокининов. Например, она вызывает закрытие устьиц. Поэтому как накопление АБК у растений пшеницы, так и снижение уровня зеатина у растений кукурузы приводит к одному результату - уменьшению устьичной проводимости.

3.3. Гормональная реакция на тепловой шок у растений табака. Возрастание концентрации ЛБК и последующее снижение уровня цито-кининов мы также наблюдали в растениях табака под влиянием теплового шока (см. рис. 4). Полученные нами результаты оценки динамики АЕК при тепловом шоке соответствуют данным литературы (Таланова и др., 1990) . В литературе есть также сведения о том. что АБК может индуцировать синтез белков теплового шока. Поэтому можно полагать, что накопление АБК, которое мы наблюдали в наших опытах, было важным звеном в цепи защитных реакций растений. Известно также, что цитокикины поддерживают высокий уровень метаболизма в клетках растений. Поэтому то уменьшение концентрации цитокини-нов, которое нам удалось обнаружить, может способствовать поддержанию относительно низкого уровня метаболизма при стрессе.

3.4. Относительное содержание гормонов в разных частях растения при стрессе. Хотя снижение уровня метаболических процессов - это характерная реакция на стресс, тем но менее не во всех органах растения она проявляется в равной степени. По данным Н.М.Жирмунской и А.А.Шаповалова (1987), в тех органах, где есть клетки меристемы, при стрессе сохраняется относительно высокий уровень метаболизма. Эта реакция позволяет сохранить жизнеспособность меристемы, которая обеспечивает восстановление ростовых процессов после возвращения в оптимальные для роста условия. Наши результаты указывают на возможную роль гормонов в дифференциальной регуляции уровня метаболизма в разных органах растения при стрессе. На рисунке 5 представлена динамика содержания ИУК и ЛБК при дегидратации. Как видно из рисунков, возрастание уровня АБК в тканях побегов пшеницы сорта Эритроспермум 841 было незначитель-

Рис. 4. Содержание АБК (а,б) и цитокининов (в,г) в побегах контрольных (а,в) и подвергавшихся действию высокой температуры (6,г) проростках табака (возраст растений 1 месяц)

250

Ш -г

х ° т га

5 5

Й 121

О О * $

* г

о. о Ч

О О

2 3 4

Время после воздействия, ч

ним. Причем в основании побега, где находятся клетки меристемы, уровень накопления данного гормона был несколько ниже, чем в листовой пластинке. И, наоборот, содержание ИУК. т.е. гормона стимулирующего типа действия, было значительно выше в основании побега. чем в листовой пластинке. Обнаруженные нами различия в уровне гормонов могли быть тем регулирующим фактором, который обеспечивал распределение ограниченных ресурсов в пользу клеток меристемы. Описанная гормональная реакция была характерна для растений сорта Эритроспермум 841, которые были выбраны из-за их высокой способности к регенерации корней у подсушенных изолированных побегов. У другого сорта, который не отличался в данном тесте повышенной засухоустойчивостью (Саратовская 29), мы обнаружили несколько иную картину (см. рис. 5 ) . У них был высокий уровень накопления АБК в меристематической зоне. Сравнение гормональной реакции растений сортов, различающихся по устойчивости к дефициту влаги, подтверждает роль гормонов в обеспечении резистентности.

3.5. Динамика содержания АБК и цитокининов в побегах и корнях проростков пшеницы при длительном действии водного стресса. Изучая реакцию растений на дегидратацию, мы полностью лишали растения воды. При таких жестких условиях длительное наблюдение за растениями было невозможно. Поэтому в следующей серии экспериментов мы использовали осмотик полиэтиленгликоль (ПЭГ) в качестве модели для изучения менее резкого действия дефицита влаги. В предварительных опытах была подобрана концентрация ПЭГ (10 %). при которой снижение транспирации не сопровождалось ингибировани-ем роста растений пшеницы. Как видно из рисунка 6. [¡од влиянием ПЭГ сначала происходило снижение концентрации зеатина в побегах и

- 16 -

Рис. 5. Содержание ИУК (а) и АБК (б) в недельных проростках пшеницы при дегидратации

ф

X

О

ь о га а.

ш <

(о

X та £ а. а> Ч о О

1 - листовая пластинка, сорт Эритроспермум 341

2 - основание стебля, сорт Эритроспермум 841

3 - листовая пластинка, сорт Саратовская 29 4 - основание стебля, сорт Саратовская 29

корнях растений по сравнению с контролем. Однако затем наблюдалось возрастание уровня цитокининов, и в конце эксперимента у растений, росших на среде с ПЭГ было даже больше гормонов, чем в контроле (динамика изменения концентрации рибозида зеатина имела сходный характер). Как известно, растения способны компенсировать высокую осмотическую силу питательного раствора, в частности, путем повышения осмотического потенциала самих клеток. Это достигается за счет изменения активности физиологических процессов, в регуляции которых принимают участие цитокинины. Все это позволяет предполагать, что накопление цитокининов вслед за их снижением отражает способность растения приспосабливаться к росту на среде с полиэтиленгликолем.

3.6. Накопление АБК под влиянием засухи у растений пшеницы на фоне равномерного и локального внесения удобрений. До сих пор были представлены результаты опытов, в которых объектом для изучения служили молодые проростки. Но мы также изучали реакцию на водный стресс у более зрелых растений. В таблице представлены данные о содержании АБК в листьях растений пшеницы в фазе выхода в трубку. Растения выращивали на фоне равномерного и локального внесения удобрений. Многолетние исследования, которые проводились под руководством д.б.н.В.К.Трапезникова, показали, что локальное внесение удобрений повышает засухоустойчивость растений (Трапезников, 1983; Усов и др., 1988). Поэтому было интересно сравнить уровень накопления АБК под влиянием засухи у растений, произрастающих на фоне равномерного и гетерогенного распределения удобрений в корнеобитаемой среде.

12

Рис. 6. Влияние водного стресса, индуцированного полиэтиленгликолем, на концентрацию зеатина в

побегах (а) и корнях (б) проростков пшеницы. Растения пересаживали на раствор ПЭГ в возрасте 10 дней.

ю ■

гз I

л V- о

ГО у

«и га 5

о о.

к ^

а-

го ^ О. Л 4

н о

X

о а

X

о

б--

2 -■

контроль, опыт

10

20

30

40

50

60

35 •

30 •

го

X - 25

3 -О

н О

ГО О

0) ГО 20

п 5

к «

§ §.15

2.3

н О X

ш

10

3" X

о

5 --

5*

I

-ь

10

20 30 40

Время воздействия, часы

50

60

/

о

Таблица.

Влияние влагообеспеченности и способа внесения удобрений (ЫРК) на содержание АБК в листьях растения пшеницы в фазе выхода в трубку

1 1 1 I | Уровень влагообеспеченности 1 1 1 1

1 г 1 Сорт I 1 (_ 60 1 1 % 1 30 % I 1 1

1 Г 1 1 | 1 1 локальное | | 1 1 1 равномерное| локальное 1 равномерное[ ' ' 1

[Саратовская 29 16+3 10+2 640+80 1100+200 |

(Московская 35 31+5 23+4 590+90 900+200 |

|Безенчукская 139 1 24+7 7+2 830+120 1200+300 | 1

Как видно из таблицы, у всех трех сортов пшеницы уменьшение влагообеспеченности приводило к резкому возрастанию содержания АБК, которое мы оценивали через три недели после снижения уровня полива в опытном варианте. Вместе с тем уровень накопления АБК был значительно ниае в листьях растений локального варианта по сравнению с равномерным. Как известно, стимулом для накопления АБК является дегидратация клеток. Полученные нами результаты говорят о том, что на фоне засухи клетки растений локального варианта были, вероятно, лучше обеспечены водой, чем у растений равномерного варианта. Данные результаты подтверждают предположение о том. что уровень накопления АБК при стрессе позволяет судить о

засухоустойчивости растений. Представляет интерес тот Факт, что в отсутствии стресса, т.е. в том случае, когда растения росли на фоне 60 % от полной полевой влагоемкости, наблюдалась обратная картина и больше АБК было как раз у растений локального варианта по сравнению с равномерным. Таким образом, пытаясь оценить устойчивость по уровню АБК, необходимо учитывать при каких условиях растут растения.

Итак, результаты, которые мы получили при изучении действия водного стресса различной интенсивности и продолжительности, а также теплового шока на растения нескольких видов и сортов, подтверждают участие гормонов в реакции растений на стресс и расширяют представление о механизмах регуляции концентрации гормонов при стрессе.

вьводы

1. Показана специфичность тест-системы, основанной на определении цитокининов с помощью антител к рибозиду зеатина. Продемонстрировано, что использование тонкослойной хроматографии перед иммуноанализом позволяет разделять и количественно определять содержание в растениях как свободного зеатина, так и его рибозида, 9-Н-глюкозида и нуклеотида.

2. Использование модифицированной схемы экстракции в сочетании с иммуноанализом обеспечивает специфичность и надежность определения ИУК и АБК в растениях пшеницы, кукурузы и табака.

3. Обнаружено, что обезвоживание растений пшеницы и кукурузы приводит к быстрому (в течение 15-30 минут) изменению спектра

цитокининов. В побегах растений пшеницы наблюдалось накопление 9-И-глюкозида зеатина и уменьшение содержания его нуклеотида, в то время как у растений кукурузы - снижение концентрации всех идентифицируемых иммунореактивных форм.

4. Сравнение сортов пшеницы , различающихся по устойчивости к водному стрессу, показало связь между выживаемостью подсушенных растений и накоплением АБК в листовой пластинке и ИУК - в основании побега растений.

5. Обнаружено, что при действии водного дефицита, индуцированного полиэтиленгликолем, вслед за снижением содержания цитоки-нинов в побегах и корнях растений пшеницы наблюдается возрастание уровня форм данного гормона, что может быть важным фактором поддержания ростовых процессов при водном стрессе.

6. Выявлено, что локальное внесение удобрений, т.е. воздействие, повышающее засухоустойчивость растений, снижает уровень индуцированного засухой накопления АБК.

7. Разработан метод отбора веществ, повышающих устойчивость растений к обезвоживанию, на основе использования иммунофермент-ной тест-системы для определения цитокининов.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Кудоярова Г.Р., Вееелов С.Ю.. Каравайко Н.Н., Гюли-Заде В. 3., Чередова Е.П.. Мустафина А. Р., МошковИ. Е., КулаеваО.Н. Иммуноферментная тест-система для определения цитокининов // Физиология растений.. 1990,- Т. 37, вып. 1.- С. 193-199.

2. Кудоярова Г. Р.. Веселое С. Ю., Чередова Е.П., Гюли-Заде В.3.. Мустафина А.Р. Способ отбора регуляторов роста растений ци-

токининовой и ауксиновой природы // Авторское свидетельство N 1640654. 1990.

3. Вельдер Я.Л., Кудоярова Г. Р., Мустафина А. Р.. Данилова

H.А., Мифтахов М.С., Гюли-Заде В.З., Иванов К.И.. Трапезников В.К.. Толстиков Г.А. 1-(3-бензилокси-4-фенокси-1Е-бутенил)бензи-мидазол в качестве регулятора засухоустойчивости растений // Авторское свидетельство N 1601995. 1990.

4. Кудоярова Г. Р., КофЭ.М.. Гюли-Заде В. 3.. ЕгуткинН.Л., Мустафина А.Р., Чередова Е.П.. Веселов С.Ю. Специфичность иммуно-ферментного анализа ауксинов. Значение экстракционной очистки растительного материала/ В сб.: Иммуноферментный анализ регуляторов роста растений: применение в физиологии растений и экологии.-Уфа. 1990. с. 22-33.

5. Кудоярова Г. Р., Мустафина А. Р., Жирмунская Н. М., Горбунова В.Ю. Взаимосвязь между выживаемостью и распределением гормонов в растениях пшеницы при обезвоживании/ В сб.: Иммуноферментный анализ регуляторов роста растений: применение в физиологии растений и экологии.- Уфа, 1990. с.41-46.

6. Veselov S.Yu.. Kudoyarova G.R.. Egutkin M.L.. Gyuli-Zade V.Z., Mustafina A. R., KofE.M. Modified solvent partitioning scheme providing increased specificity and rapidity of immunoassay for indole-3-acetic acid //Physiol.Plant. 1992. - V. 86, N

I,- P. 93-96.

7. Мустафина A.P., Кудоярова Г.P. Хроматографическое распределение иммунореактивных форм цитокининов. экстрагированных из обезвоженных проростков кукурузы// III съезд Всероссийского общества физиологов растений. 1993, C.-I16.. с. 684.

8. Mustafina A. R.. Kudoyarova G. R.. Usmanov I.U., Veselov

S.U., Lomachenko N. ABA content in plants of different wheat cul-tivars and their drought resistance//Int. Symp."Physiology of ABA". (Pushchino, September. 1993), Pushchino, p.70.

9. Mustafina A.R., Kudoyarova G.R. Distribution of ABA and IAA in dehydrated wheat shoots and their ability to regenerate root systera//Int. Symp. "Physiology of ABA", (Pushchino, September, 1993). Pushchino, p. 40.

10. Kudoyarova G., Mustafina A.. Shakirova F, VeselovS., Teplova I.. Valcke R. What kind of relation is their between ABA content in plants and their stress resistanse?// 4th Symp.of VVPE and Comission for PI. Phys. of KNBV, Diepenbeek. 1993, p. 43.

11. Mustafina A.R.. Kudoyarova G.R. The effect of dehydration on chromatographic distribution of immunoreactive forms of cytokines extracted from seedilings of Zea mays L.//Biologia Plan-tarum. 1994.- V. 36 (s). - P. 33.

12. Веселов С.Ю., Кудоярова Г. P., Мустафина A. P., Вальке P. Сравнение динамики содержания эндогенных цитокининов в побегах трансгенных и нетрансформированных проростков табака под влиянием теплового шока//Физиология растений. 1995.- Т.42, вып. 5. - С. 694-697.

13. Mustafina A.. Kudoyarova G.. Veselov D., Veselov S. Hormonal responses of wheat seedlings to polyethylene glycol-induced water deficiency// Fifth symposium international society of root research. Root demographics and their efficiencie in sustainable agriculture, grasslands, and forest ecosystems. Madren Conference Center-Clemson, South Carolina. July 14-18. 1996, p. 115.

14. Mustafina A. Rarnazanova C., Habibullina G. The effect of water stress on cytokinins content in wheat seedlings supplied

with different level of mineral nutrition// Plant Physiology and Biochemistry, 1996, special issue. P. 245.

15. Mustafina A.R., Mitrichenko A.N. The influence of heat shock on ABA and cytokinins content in tobacco plants// Annual symposium. Physical-chemical basis of plant physiology, 5-8 February,' 1996, Penza. Pushchino, 1996. P. 54.

16. Mustafina A., Veselov S.. Valcke R., Kudoyarova G. Contents of abscisic acid and cytokinins in shoots during dehydration of wheat seedlings// Biologia Plantarum. 1998.- V. 40 (in press).