Исследование взаимодействия с лигандами цитокининовых рецепторов арабидопсиса и кукурузы

Кривошеев, Дмитрий Михайлович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование взаимодействия с лигандами цитокининовых рецепторов арабидопсиса и кукурузы
ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Исследование взаимодействия с лигандами цитокининовых рецепторов арабидопсиса и кукурузы"

На правах рукописи

005047392 <{ С ,

Кривошеее Дмитрий Михайлович

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С ЛИГАНДАМИ ЦИТОКИНИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ АРАБИДОПСИСА И КУКУРУЗЫ

03.01.05-физиология и биохимия растений

1 3 ДЕК 2012

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2012

005047392

Работа выполнена в лаборатории сигнальных систем контроля онтогенеза им. академика М.Х. Чайлахяна Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, г. Москва

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор биологических наук,

профессор Романов Георгий Александрович

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Лось Дмитрий Анатольевич, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, лаборатория молекулярных основ внутриклеточной регуляции, заведующий лабораторией

Голдепкова-Павлова Ирина Васильевна, доктор биологических наук, доцент, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук, группа геномики растений, руководитель группы

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Санкт-Петербургский государственный университет, Биолого-почвенный факультет

Защита состоится 27 ноября 2012 г. в 13 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 002.210.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук по адресу: 127276, Москва, ул. Ботаническая, 35. Факс: (499) 977-80-18, e-mail m-azarkovich@ippras.ru; ifi-@ippras.ru ,

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук.

Автореферат разослан «25» октября 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

Азаркович Марина Ивановна

Актуальность проблемы. Исследования молекулярных механизмов действия фитогормонов, в том числе цитокининов, заметно активизировались в последнее десятилетие. В случае цитокининов это связано в первую очередь с обнаружением рецепторов этих фитогормонов и возможностью манипуляции генами рецепторов в различных модельных системах. Особый интерес к цитокининам связан с их участием как в росте и развитии растения, так и в адаптации к неблагоприятным факторам среды. Однако, несмотря на большой прогресс в исследованиях структуры и функционирования рецепторов цитокининов, в данной области остается еще много нерешенных проблем. В частности, неизвестны структурные особенности рецепторных белков, которые обуславливают их лигандную специфичность. Неясна роль липидного микроокружения в формировании лиганд-связывающих свойств рецепторов. Непонятны причины, по которым некоторые соединения, близкие по структуре к природным цитокининам и способные специфично связываться с рецептором, не вызывают трансдукции гормонального сигнала и подавляют действие цитокининов. В целом до конца не выяснены причины множественности цитокининов и их рецепторов в клетке, а также биологическая роль различий лигандной специфичности рецепторов. Ответы на эти вопросы важны для понимания молекулярных механизмов действия цитокининов, что обуславливает актуальность данного направления исследований.

Цель и задачи исследования. Цель данной работы - охарактеризовать индивидуальные рецепторы цитокининов из арабидопсиса и кукурузы по их взаимодействию с разнообразными лигандами; выявить аминокислотные остатки - возможные детерминанты лигандной специфичности рецепторов.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

• провести скрининг различных синтетических соединений, близких по структуре к природным цитокининам, на способность связываться с индивидуальными рецепторами из арабидопсиса и кукурузы in vitro, а также на способность проявлять цитокининовую активность в модельных системах in vivo;

• исследовать лиганд-связывающие свойства индивидуальных рецепторов цитокининов в составе растительных мембран;

• выяснить роль отдельных аминокислотных остатков в пределах гормон-связывающего CHASE домена рецептора в формировании его лигандной специфичности.

Научная новизна работы. В цитокининовых тест-системах, в том числе, с использованием индивидуальных рецепторов цитокининов АНКЗ и CRE1/AHK4 арабидопсиса и ZmHKl и ZmHK2 кукурузы, исследован широкий спектр природных цитокининов и близких по структуре синтетических веществ. У ряда синтетических соединений впервые обнаружена цитокининовая активность.

Обнаружен новый конкурентный рецепторный антагонист цитокининов Ы6-(бензилоксиметил)аденозин (БОМА), который способен специфически связываться с рецептором CRE1/AHK4, конкурируя с цитокининами за сайт связывания, но не вызывая трансдукции гормонального сигнала.

Разработана новая гомологичная модельная система на основе мембран из листьев Nicotiana benthamiana, экспрессирующих трансгены индивидуальных рецепторов цитокининов, которая позволяет изучать лиганд-связывающие свойства рецепторов в составе растительных мембран.

Впервые проведено сравнение лиганд-связывающих свойств рецепторов цитокининов в двух различных модельных системах: гетерологичной на основе сферопластов, полученных из трансгенных Е. coli, и гомологичной на основе мембран, выделенных из растений N. benthamiana.

Впервые исследована роль отдельных аминокислотных остатков в гормон-связывающем CHASE-домене рецепторов цитокининов в формировании их лигандной специфичности.. С помощью метода ПЦР получены различные варианты рецептора ZmHKl с точечными мутациями, приводившими к изменению его лиганд-связывающих свойств.

Практическая ценность. Разработанная гомологичная модельная система на основе мембран N. benthamiana может быть использована для изучения свойств других рецепторов, связанных с мембранами, в микроокружении, близком к существующему in vivo.

Обнаруженные новые соединения с предпочтительным сродством к индивидуальным рецепторам цитокининов могут быть использованы для избирательного воздействия на те части растения, где преобладают указанные рецепторы.

Информация о структуре нового антагониста цитокининов №-(бензилоксиметил)аденозина (БОМА) в сочетании с данными о структуре других известных конкурентных антагонистов цитокининов может быть использована при разработке новых более эффективных рецепторных антагонистов цитокининов. Эти соединения в перспективе могут быть использованы как для научных исследований, так и в агропроизводстве и биотехнологии.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на XXIII Международной зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2011); Международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2011); VII Съезде Общества физиологов растений России и Международной молодежной научной школе "Физиология растений -фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий" (Нижний Новгород, 2011); Научно-практической конференции "Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения" (Новый Свет, Украина, 2011); 3-ем Международном симпозиуме "Клеточная сигнализация у растений" (Казань, 2011); VII Международной научной конференции "Регуляция роста, развития и продуктивности растений" (Минск, Беларусь, 2011); Международной конференции «Биология - наука XXI века» (Москва, 2012); 54th Annual Maize Genetics Conference (Портленд, США, 2012); 3rd International Symposium "Intracellular Signaling and Bioactive Molecules Design" (Львов, Украина, 2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, включая 3 статьи в зарубежном и отечественных рецензируемых журналах.

Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения и пяти глав: обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, заключение и выводы, а также списка цитируемой литературы. Материалы диссертации изложены на 179 страницах машинописного текста, содержат 10 таблиц и 27 рисунков. Список литературы включает 215 источников, в т.ч. 203 в зарубежных изданиях.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Особенности экспериментальных моделей. Для исследования свойств рецепторов цитокининов in vitro использовали трансгенные бактерии Е. coli, экспрессирующие гены индивидуальных рецепторов цитокининов арабидопсиса или кукурузы, а также мембраны листьев табака Nicotiana benthamiana, транзиентно трансформированных генами рецепторов цитокининов. Кроме того, для биотестов in planta использовали модельные системы на основе проростков арабидопсиса Arabidopsis thaliana, трансформированных геном РARRs:GUS, и проростков амаранта Amaranthus caudatus. Эти системы дают четкую, быструю и специфическую реакцию на воздействие цитокининов и основаны на индукции экспрессии цитокинин-зависимых генов или трансгенов.

Модельные системы на основе трансгенной Е. coli. Для изучения взаимодействия индивидуальных рецепторов цитокининов с различными лигандами использовали модельную систему, содержащую один из клонированных цитокининовых рецепторов. Такой системой служили бактерии Е. coli, штамм KMI001, трансформированные плазмидами pIN-IIIA3-AHK4, pSTV28-AHK3, pIN-IIIA3-ZmHKl или pIN-IIIA3-ZmHK2, экспрессирующими гены рецепторов цитокининов арабидопсиса AHK4/CREI, АНКЗ (Suzuki et al., 2001) или кукурузы ZmHKl, ZmHK2 (предоставлены T. Mizuno и H. Sakakibara, Япония, соответственно). У данного штамма Е. coli рецепторы цитокининов замещают близкую по структуре сенсорную гистидинкиназу бактерии RcsC, инактивированную мутацией, и проявляют цитокинин-зависимую функциональную активность (Suzuki et al., 2001; Spichal et al., 2004; Yonekura-Sakakibara et al., 2004).

Гомологичная модельная система на основе мембран N. benthamiana. Для исследования лиганд-связывающих свойств индивидуальных рецепторов цитокининов в составе растительных мембран была разработана модельная система на основе микросомальной фракции, выделенной из листьев N. benthamiana. В составе плазмиды pB7FGW2 гены рецептора АНКЗ или ZmHKl встраивали в бактерии Agrobacterium tumefaciens. Данные бактерии использовали для трансформации N. benthamiana путем инфильтрации бактериальной суспензии в листья. На пятые сутки после трансформации из листьев выделяли микросомальную фракцию мембран, которую использовали

для исследования лиганд-связывающнх свойств рецепторов. Специфическое связывание меченого гормона мембранами, выделенными из растений, подвергнутых трансформации, было на порядок выше, чем мембранами растений, не подвергнутых трансформации. Это позволило пренебречь вкладом в связывание собственных рецепторов N. benthamiana.

Анализ характеристик взаимодействия гормонов с рецепторами проводили на основе разработанного варианта радиолигандного метода с использованием сферопластов трансгенных бактерий или микросомальной фракции мембран растений, трансформированных генами рецепторов цитокининов. В качестве меченого лиганда применяли [2-3Н]-«;/?анс-зеатин (-600 ГБк/ммоль).

Модельные системы на основе трансгенного арабидопсиса. Проростки трансгенного Рmrs'-GUS арабидопсиса содержали репортерный ген GUS под контролем цитокинин-зависимого промотора гена ARR5 (предоставлены J.J. Kieber, США). Эти проростки реагируют на цитокинин активацией экспрессии репортерного гена, что позволяет количественно оценивать гормональную индукцию генной экспрессии (D'Agostino et al., 2000; Romanov et al., 2002). Время инкубации проростков с гормоном составляло 5 часов.

Также в работе использовали двойные мутанты арабидопсиса. экспрессирующие один из трех рецепторов цитокининов и несущие конструкцию PAmj:GUS (предоставлены T. Schmiillmg, Германия), что дало возможность изучать активность индивидуальных рецепторов m planta.

Активность репортерного фермента GUS определяли количественно флуоресцентным методом (Зверева & Романов, 2000; Spichal et al., 2004).

Сайт-специфический мутагенез. Введение сайт-специфических мутаций, направленно заменяющих отдельные аминокислоты рецептора, осуществляли многостадийным методом на основе ПЦР. Детали метода показаны на рис. 8. Наличие мутаций было подтверждено с помощью секвенирования ДНК.

Математические и статистические методы. Константы диссоциации комплексов гормон-рецептор рассчитывали по Cheng & Prusoff (1973) на основе данных, полученных в конкурентных опытах, с применением опции Pharmacology программы SigmaPIot 9.0. Статистический анализ экспериментальных результатов проводили с помощью программ Microsoft Excel и T-TEST. На графиках и гистограммах представлены средние арифметические значения ± стандартные ошибки.

РЕЗУЛЬТАТЫ

I. Исследование лиганд-связывающих свойств рецепторов цитокининов с применением синтетических производных аденина

Для исследования лиганд-связывающих свойств рецепторов цитокининов из арабидопсиса и кукурузы было использовано более 30 лигандов - производных аденина, как природных цитокининов, так и близких к ним по структуре синтетических соединений (предоставлены С.Н. Михайловым, ИМБ РАН). В качестве модельной системы служили трансгенные бактерии Е. coli, экспрессирующие индивидуальные рецепторы цитокининов. Для облегчения взаимодействия цитокининов с рецепторами у бактерий удаляли внешнюю оболочку, получая так называемые сферопласты. О сродстве лигандов к рецепторам судили по их способности вытеснять меченый гормон из комплекса с рецептором. Важным параметром лиганд-рецепторного взаимодействия является сродство рецептора к лиганду, которое характеризуется константой диссоциации комплекса лиганд-рецептор (KD). Для определения кажущихся KD были получены концентрационные зависимости вытеснения исследуемыми лигандами меченого транс-зеатина из комплекса с рецептором. Чем сильнее рецептор связывает лиганд, тем меньше значение Ко комплекса.

Таблица 1. Кажущиеся константы диссоциации (нМ) комплексов лигандов-производных аденина с рецепторами цитокининов арабидопсиса и кукурузы, в составе сферопластов Е. coli. Структурные формулы веществ приведены на рис. 1. (римскими цифрами обозначены номера соединений).

Лиганд Рецептор

CRE1/ АНК4 АН КЗ ZmHKl ZmHK2

транс-зеатин (tZ) 2,4 0,2 33,9 0,3

цис-зеатин (cZ) 93,9 44,2 35 8,6

Мь-бензиладенозин (I) 11,3 6,3 2,9 13,3

Мь-(2-пропинил)аденозин (IV) 9234 2467 5391 31,1

1М6-(бензилоксиметил)аденозин (VI) 243 3123 203,4 1706

0&-бензилинозин (VII) 206 17,8 18,6 70,4

HN-X

К 1 II III IV V VI Vil

Рис. 1. Цитокининовая активность синтетических производных аденина в амарантовом биотесте (А), биотесте по определению GUS-активности у Parrs:GUS-арабидопсиса (Б) и способность этих лигандов вытеснять меченый транс-зеатин (/Z*) из комплекса с рецептором CRE1/AHK4 (В). А, Б: концентрация веществ 5 мкМ, контролем служил ]Мб-бензиламинопурин (БАП). БО - вариант без обработки. В: концентрация веществ 9 мкМ, контролем служил транс-зеатин. Везде контроль принят за 100%. Названия І, IV, VI и VII см. табл. 1. II — ~Н6-{цис)-(4-окси-2-бутенил)аденозин; III - 1Ч6-(4-окси-2-бутинил)аденозин; V - N6-[(l-метил-1,2,3-триазол-4-ил)метил]аденозин. Структура VII приведена полностью. R — рибоза.

Полученные результаты (табл. 1) подтвердили различия в лигандной специфичности между рецепторами цитокининов. Было установлено, что между ортологами существует сходство в лигандной специфичности по отношению не только к природным, но и к отдельным синтетическим цитокининам. Так, ортологи АНК4 и ZmHKl связывали N6-(бензилоксиметил)аденозин сильнее, чем ортологи АНКЗ и ZmHK2. Было установлено, что соединение Ы6-(2-пропинил)аденозин обладает избирательным сродством по отношению к ZmHK2, в то время как с остальными исследованными рецепторами связывается крайне слабо.

Параллельно с опытами по связыванию многие из лигандов, особенно новых производных аденина, испытывали в биотестах на цитокининовую активность (рис. 1). Такими специфическими биотестами служили биотест по определению GUS-активности у Рл;да-'СС5'-арабидопсиса и амарантовый биотест. Результаты показали четкую положительную корреляцию между сродством лиганда к рецептору, т.е. его способностью вытеснять меченый транс-зеатп, и способностью этого же соединения вызывать цитокинин-специфичный ответ в экспериментах in planta. Однако наряду с такой общей корреляцией обнаружились и исключения. В частности, N6-(бензилоксиметил)аденозин (сокращенно названный БОМА), эффективно вытеснял зеатин из комплекса с рецептором CRE1/AHK4, но при этом не вызывал существенной активации репортерного гена GUS под промотором ARRS. Было сделано предположение, что в отношении данного рецептора БОМА может действовать как антицитокинин.

II. Антицитокининовая активность БОМА

Обнаружение новых антицитокининов представляет большой интерес, так как до последнего времени в литературе было описано всего два антицитокинина (PI-55 и LGR-991), действующие конкурентно на уровне рецепторов (Spichal et al., 2009; Nisler et al., 2010). Нами была исследована способность БОМА подавлять физиологическое действие типичного цитокинина БАП (рис. 2). Положительным контролем служил известный антицитокинин PI-55 (предоставлен L. Spichal, Чешская республика). В эксперименте использовали двойные мутанты Рлмл.'0£/5-арабидопсиса, которые экспрессировали лишь один из трех рецепторов цитокининов. БОМА

достоверно ингибировал действие БАП при совместном добавлении этих веществ к проросткам, экспрессировавшим только CRE1/AHK4. При этом эффекты БОМА и антицитокинина PI-55 практически совпали, что служит прямым подтверждением антицитокининовых свойств БОМА. Антицитокининовый эффект БОМА, как и PI-55, отсутствовал на проростках, экспрессирующих АНКЗ как единственный рецептор цитокининов, что было ожидаемо, исходя из низкого сродства БОМА к этому рецептору (табл. 1). Таким образом, антицитокининовая активность БОМА проявлялась в отношении рецептора CRE1/AHK4, но не АНКЗ, что еще раз подчеркивает выраженную лигандную специфичность рецепторов.

Антицитокининовый эффект БОМА зависел от дозы этого соединения, точнее, от соотношения между используемыми концентрациями БАП и БОМА (рис. 3,А). При концентрации 50 мкМ, превышающей концентрацию БАП в 500 раз, БОМА подавлял активацию рецептора CRE1/AHK4 цитокинином на 5060%, тогда как при низких соотношениях эффект БОМА был выражен гораздо слабее.

Для того, чтобы проверить, конкурируют ли БОМА и природные цитокинины за один и тот же сайт связывания на рецепторе CRE1/AHK4, была изучена концентрационная зависимость связывания этим рецептором меченого транс-зеатина в отсутствие и в присутствии БОМА. Данные представлены в виде линейных зависимостей в двойных обратных координатах (рис. 3,Б). Расположение точки пересечения прямых в непосредственной близости от оси ординат свидетельствует о том, что БОМА и транс-зеатин действительно связываются с одним и тем же сайтом на рецепторе CRE1/AHK4. Таким образом, БОМА является конкурентным рецепторным антагонистом цитокининов.

Компьютерное моделирование взаимодействия БОМА с гормон-связывающими сайтами рецепторов подтвердило возможность нахождения БОМА внутри сайта, несмотря на больший размер боковой цепи. Было проведено сравнение связывания БОМА и БАП с обоими рецепторами (рис. 4). В случае CRE1/AHK4 расположение адениновых частей БОМА и БАП было сходным, но взаимодействие атома N1 с молекулой воды у БОМА ухудшено, кроме того, положение фенильных остатков этих лигандов было различным. В случае АНКЗ, у которого полость сайта меньше по объему, моделирование показало аналогичное расположение фенильных остатков БОМА и БАП в сайте

связывания. В связи с этим адениновый фрагмент БОМА слегка выталкивался из сайта, а водородная связь с изолейцином-287 реализовалась не через К9, а через Кроме того, исчезала возможность образования водородной связи 1М1 с молекулой воды. Все эти изменения взаимодействия с рецептором приводили к уменьшению сродства БОМА к белку, особенно в случае рецептора АНКЗ, что хорошо согласуется с полученными экспериментальными данными о сродстве БОМА к этим рецепторам (табл. 1).

Таким образом, в результате данного исследования к двум недавно найденным антицитокининам (Р1-55 и ЬСЯ-991) добавился третий антагонист цитокининового рецептора СЛЕ1/АНК4. Он отличается по структуре от обнаруженных ранее наличием остатка кислорода в цепочке атомов, соединяющей ароматическое кольцо с Ы6 аденина, а также отсутствием заместителей в бензольном кольце.

контроль БОМА PI-55 БОМА PI-55

Рис. 2. Действие БОМА (50 мкМ) и PI-55 (50 мкМ) на активацию GUS цитокинином в двойных мутантах ahk2/ahk3 (вверху) и ahk2/ahk4 (внизу) арабидопсиса. Повышение GUS-активности под действием БАП (0,1 мкМ) служило контролем (принято за 100%).

N -(бензилоксиметил)аденозин (БОМА)

R - рибоза

БАП, 0,1 мкМ

контроль

концентрация БОМА, мкМ

Рис. 3.

А. Действие БОМА в различных концентрациях на активацию GUS цитокинином в двойных мутантах ahk2/ahk3 арабидопсиса. Повышение GUS-активности под действием БАП (0,1 мкМ) служило контролем (принято за 100%).

БАП, 0.1 мкМ

3,0 2,5

s 2'°

т" 1,5 X

J 1,0

0,5 0,0

Б. Идентификация сайта связывания БОМА. Данные представлены в двойных обратных координатах.

[Ь] - концентрация свободного транс-зеатина;

[ЬЯ] - концентрация транс-зеатина, связанного рецептором.

0,0

0,1

0,2

[L], нМ "

Рис. 4. Пространственные модели взаимодействия БОМА (серый цвет) и БАП (розовый цвет) с сайтом связывания рецепторов АНКЗ (слева) и СЯК 1/АНК4 (справа). Красная стрелка указывает на изолейцин-287 рецептора АНКЗ. Молекулярный докинг выполнен при участии Д.И. Осолодкина (МГУ).

III. Исследование лиганд-связывающих свойств рецепторов цитокининов в составе растительных мембран

Поскольку ранее для исследования свойств рецепторов цитокининов использовали гетерологичные системы на основе дрожжей и бактерий, было важно проверить, сохраняются ли выявленные свойства рецепторов при их нахождении в составе мембран растений. Для ответа на этот вопрос нами была разработана гомологичная модельная система (рис. 5).

Ген рецептора

АН КЗ-СИ'

или гтНКІ-ЄГР

в составе плазмиды рВ7РС\У2

Agrobacterшm Ште/асіет

КісоНапа ЬегіИатіапа Экспрессия генов рецепторов

Центрифугирование „ (100000 я, 30 мин)

Микросомальная фракция

Гомогенизация листьев, Центрифугирование (10000 10 мин)

Использование в экспериментах по связыванию с меченым /2

супернатант, дебрис-

іи мин;

Рис. 5. Процедура получения мембран из растений Июойапа Ьеп1Иат1апа, транзиентно экспрессирующих гены цитокининовых рецепторов арабидопсиса или кукурузы.

Ген интересующего нас рецептора в составе плазмидного вектора встраивали в клетки агробактерий, которые затем использовались для трансформации растений N. ВешИатгапа. Поскольку к гену рецептора был «пришит» ген зеленого флуоресцирующего белка (ОБР), об экспрессии встроенного гена можно было судить по флуоресценции ОБР. Из листьев трансформированных растений выделяли микросомальную фракцию мембран. Эти мембраны затем использовали для изучения лиганд-связывающих свойств индивидуальных рецепторов цитокининов.

Результаты сравнения гетерологичной и гомологичной тест-систем показали наличие как черт сходства, так и определенных различий между системами. Для рецептора АНКЗ было установлено, что при рН 5 связывание практически отсутствует, оптимум рН наблюдался в диапазоне от 6,5 до 9,5 (рис. 6). Эти данные согласуются с данными, полученными ранее в бактериальной системе (Romanov et al., 2006). При комнатной температуре (23°С) наблюдалось более высокое связывание, чем при температуре 0°С. Ранее на бактериях были получены противоположные данные. Было также показано, что состояние равновесия наступает после 20 мин инкубации.

Для рецептора ZmHKl было установлено, что с увеличением рН связывание практически линейно увеличивается, что согласуется с данными, полученными ранее в бактериальной системе. Существенных различий в связывании меченого гормона при комнатной температуре (23°С) и при 0°С не наблюдалось. Состояние равновесия наступало уже в течение первых 20 мин инкубации. Следует отметить, что все вариации температуры и рН оказывали влияние на тотальное, но не на неспецифическое связывание.

Таблица 2. Кажущиеся константы диссоциации (нМ) комплексов гормон-рецептор для рецепторов АНКЗ и ZmHKl в гомологичной (на основе мембран N. benthamiana) и в гетерологичной (на основе сферопластов Е. coli) модельных системах.

Модельная система Рецептор Лиганд(цитокинин)

tz cZ ІР БАП DZ Ade

Гомологичная АНКЗ 3,1 849 22,1 154 27,6 37290

ZmHKl 2,7 1,9 0,1 0,3 37,9 46070

Гетерологичная АНКЗ 0,2 44,2 1,6 19,8 0,9 3560

ZmHKl 33,9 35 2,5 3,4 519 24850

Здесь и далее используются следующие обозначения цитокининов: t'L - транс-зеатин; cZ - цис-зеяпш; iP - изопентениладенин; DZ - дигидрозеатин; TD -тидиазурон; Ade - аденин.

2500

5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5 MES-NaOH Tris-HCI

20 40 60 Время, мин

Рис. 6. Влияние pH (слева) и температуры (справа) на связывание меченого траис-зеатина (tZ*) рецепторами АНКЗ и ZmHKl в составе растительных мембран. Тотальное связывание обозначено сплошными линиями, неспецифическое -пунктирными. DPM (здесь и далее) - распад/мин.

Большой интерес представляло изучение в условиях разных модельных систем лигандной специфичности рецепторов цитокининов. Это исследование было проведено с применением ряда известных цитокининов-оснований и их рибозидов. В отношении оснований закономерности, полученные ранее в системе на основе сферопластов Е. coli, воспроизвелись и на растительных мембранах как с рецептором АНКЗ, так и с ZmHKl (табл. 2). Таким образом, ряды аффинности, полученные для цитокининов-оснований в разных модельных системах, полностью совпали:

АНКЗ (в мембранах N. benthamiana)-. tZ > ІР = DZ > БАП > cZ > Ade

АНКЗ (в сферопластах E. coli): tZ > ІР = DZ > БАП > cZ> Ade

ZmHKl (в мембранах N. benthamiana): ІР > БАП > tZ ~ cZ > DZ > Ade

ZmHKl (в сферопластах E. coli): ІР > БАП > tZ ~ cZ > DZ > Ade

4000

3500

3000

2500

2000

- 1500

ей

О 1000

* 500

V 0

а 5500

г* 5000

и 4500

4000

3500

3000

2500

2000

* О

" -o

U,1 1 II) 100 1000 1000« концентрация лиганда, нМ

_ ТВ ..... NS

- І/ ..... tZR

- ІР ..... iPR

- PEA ..... PEAR

Рис. 7. Кривые концентрационной зависимости вытеснения меченого тронс-зеатина (tZ*) из комплекса с рецептором АНКЗ цитокининами-основаниями и соответствующими рибозидами (R) в условиях гомологичной (А) и гетерологичной (Б) модельных систем. ТВ - тотальное связывание; NS - неспецифическое связывание.

PEA - М6-(2-фенилэтил)аденин:

PEAR - Ы6-(2-фенилэтил)аденозин (соответствующий PEA рибоз ид)

Однако в отношении рибозидов проявились существенные различия между модельными системами: в опытах со сферопластами Е. coli рибозиды активно вытесняли меченый зеатин из комплексов с рецепторами, тогда как в случае растительных мембран были практически неактивны (рис. 7). Одним из объяснений наблюдаемого эффекта может быть наличие в клетках бактерий неспецифической гликозидазы, которая отщепляет рибозу и превращает цитокинины в основания.

III. Влияние точечных мутаций в гормон-связывающелг CHASE домене рецептора ZmHKl на его лигандную специфичность

Известно, что рецепторы цитокининов заметно отличаются друг от друга по лигандной специфичности (Romanov et al., 2006; Lomin et al., 2011). В частности, ZmHK 1 примерно с одинаковым сродством связывает цис- и транс-зеатины (табл. 1), в отличие от других исследованных рецепторов (в т.ч. ZmHK2), для которых константы сродства к этим гормонам различаются на порядок. Чтобы приблизиться к пониманию того, почему те или иные рецепторы имеют различные предпочтения к разным формам цитокининов, были проведены замены отдельных аминокислот в лиганд-связывающем CHASE-домене рецептора ZmHKl. Для выбора заменяемых аминокислот было проведено предварительное сравнение аминокислотных последовательностей CHASE-домена рецепторов арабидопсиса и кукурузы с использованием биоинформатической программы Clustal W2. Было сделано предположение, что в гормон-связывающем сайте рецептора ZmHKl должны находиться либо уникальные аминокислоты, либо отсутствующие у рецептора ZmHK2; именно они и обуславливают лигандную специфичность ZmHKl. После того, как такие аминокислоты были найдены, из них были выбраны те, которые предположительно взаимодействуют с молекулой цитокинина (с использованием структурных данных Hothorn et al., 2011).

Далее выбранные аминокислоты заменяли следующим образом: аспарагин-110 на серин (N110S), глутамин -116 на валин (Q116V), изолейцин-176 на валин (1176V). Замену производили на те аминокислоты, которые в соответствующих позициях присутствуют в рецепторе ZmHK2. Схема получения мутаций представлена на рисунке 8. Гены рецепторов с точечными мутациями, встроенные в плазмидные векторы, вводили в агробактерии, которые затем использовали для трансформации растений N. benthamiana (рис. 5). Мембраны, выделенные из этих растений, использовали в экспериментах по связыванию с меченым /яранс-зеатином. Результаты этих экспериментов демонстрируют, что введение точечных мутаций в CHASE-домен рецептора ZmHK 1 действительно меняет его лигандную специфичность (рис. 9). Было показано, что замены аспарагина-110 на серин (N110S) и изолейцина-176 на валин (I176V) приводят к снижению аффинности рецептора к г/мс-зеатину, замена глутамина-116 на валин (Q116V) - к увеличению аффинности к тидиазурону. Кроме того, было установлено, что замена аргинина-163 на серин (R163S) не приводит к

изменению лигандной специфичности рецептора. Различия в лигандной специфичности между мутантными рецепторами и рецепторами дикого отражены в соответствующих рядах аффинности:

7тНК1 (дикий тип): іР > БАП > й ~ сЪ > ТО > ОЪ N110 8: ІР > БАП > ҐЬ^ сЪ> ТО >

О 116 V: ¡р > бап >а~сг~ то>ог

Я 163 Э: ІР > БАП > сЪ> ТО > ОХ 1 176 V: ІР > БАП сЪ>ТО>ОХ

ПЦР-стадия 2 (20 циклов)

ПЦР-стадия 3 (25 циклов)

✓

Рестрикция.встраивание в плазмиду pB7FWG2

Введение плазмиды в агробактерии, используемые для трансформации N. bentliamiana

Рис. 8. Схема получения точечных мутаций (показаны черными точками) в рецепторе ZmHKl. EcoR 1 и Spe ! - сайты рестрикции в составе праймеров.

Наиболее распространенным способом получения мутаций в растениях in vivo является обработка последних химическими мутагенами. Ученые из SALK Института (США) получили данным методом мутанты кукурузы с весьма

характерным фенотипом (рис. 10). У этих растений наблюдались атипичные разрастания по краям листовых пластинок, а также избыточное количество волосков по краям листьев и листовых влагалищ (Chudalayandi et al., in preparation). Данная мутация получила название Hairy Sheath Frayed 1 (Hsfl).

4000 3500 3000 2500 2000

S 1500 a looo

s* 500 а о

= 4500 S 4000 и 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0

6000 5000 4000 3000 2000 1000

10 ItX) 1000 10000

Концентрация гормона, нМ

- ТВ - tZ - ІР —

---NS - cZ - DZ

10 100 1000 10000

БАП TD

Рецептор дикого типа

Q 116 V

N 110 S

I 176 V

Рис. 9. Влияние точечных мутаций в СНАЗЕ-домене рецептора 2тНК1 на его лигандную специфичность. ТВ - тотальное связывание; N8 - неспецифическое связывание.

Было установлено, что фенотип Hsfl вызван изменениями рецептора цитокининов ZmHKl. Были выявлены три отдельные точечные мутации в лиганд-связывающем (CHASE) домене рецептора, каждая из которых

приводила к описанному фенотипу: замены пролина-190 на лейцин (Р190Ь), глутамата-236 на лизин (Е236К) и лейцина-238 на фенилаланин (Ь238Р) (рис. 10). Нами были получены отдельные бактериальные клоны Е. соїі, каждый из которых экспрессировал один из мутантных рецепторов. На этих клонах провели опыты по оценке лиганд-связывающих свойств мутантных рецепторов. Мутации Е236К и Ь238Р приводили к значительному усилению аффинности рецепторов ко всем лигандам, кроме тидиазурона (ТЭ), который по своей химической структуре далек от других испытанных соединений и не содержит адениновой части (табл. 3). Это привело к тому, что тидиазурон в случае мутантных рецепторов смещался в конец рядов аффинности:

гшНКІ (дикий тип): ІР > БАП > \.Ъ ~ о,Ъ > ТЭ > ЪЪ Е 236 К: \?>Ь\Y\>\Z~cZ>DZ>TX) ь 238 Р: \р>БАп>гг~сг>ог>тп

р 190 Ь: \?>ькп>\г~сг>т>тъ

86 SPPAI DQDTFAKYTA RTSFERPLLN GVAFAQRVFH 121 HEREMFESQQ GWVMNTMQRE PAPPQVEYAP VIFSQDTVSY LARIDMMSGE EDRENIFRAR 181 TTGKAVLTNP FRLLGSNHLG WLTFAVYRP DLPADASVEQ RVEATIGYLG GAFDVESLVE 241 NLLSKLAGNQ DIWNVYDVT NASDAMVXYG

Рис. 10. Фенотип растений кукурузы дикого типа (WT) и растений с мутацией Hsfl (вверху), а также аминокислоты в CHAS Е-домене рецептора ZmHKl, отдельные точечные мутации по которым приводят к этому фенотипу (выделены красным цветом) (внизу). Белыми стрелками показаны характерные разрастания по краям листовой пластинки, белыми треугольниками - волоски на краях листьев и листовых влагалищ.

Таблица 3. Влияние мутаций в CHASE-домене на лиганд-связывающие свойства рецептора ZmHKl в составе сферопластов Е. coli (А) или мембран N. benthamiana (Б)

Мутация Кажущиеся Ко комплексов гормон-рецептор, нМ

tz сЪ ІР БАП TD DZ

дикий тип 33,9 35 2,5 3,4 62,3 519

Е 236 К 2 2,3 0.2 0,3 43.5 30.1

L 238 F 4,5 2.6 0,2 0.3 40.9 28.5

дикий тип 2.7 1.9 0.1 0.3 8.9 37.9

Р 190 L 0.2 0,3 0.02 0.03 8.4 1,6

100 kDa

55 kDa

Рис. 11. Проверка наличия рецепторов ZmHKl, с точечными мутациями L238F (3), P190L (4) и Е236К (5). в мембранах трансгенных бактерий Е. coli с помощью вестерн-блотинга. Мембраны бактерий, экспрессировавших ген рецептора ZmHKl дикого типа (1), служили положительным контролем, а ZmHK2 (2) - отрицательным. Верхние бэнды соответствуют по мол. массе рецепторам ZmHKl, нижние — продуктам их деградации.

Аналогичные данные были получены для рецептора с мутацией P190L (табл. 5), но только в модельной системе на основе мембран табака, поскольку бактериальная система оказалась неэффективна: бактерии, содержавшие ген рецептора ZmHKl с данной мутацией, не были способны связывать меченый транс-зеатин. Кроме того, они отличались задержкой роста, что могло свидетельствовать о токсичности продукта этого трансгена для бактерий. Вестерн-блотинг с использованием антител против ZmHKl показал, что в бактериях, содержащих ген рецептора ZmHKl с заменой пролина-190 на

лейцин, этот белок не накапливался в необходимых количествах (рис. 11). В целом эта серия данных говорит о том, что мутации, ведущие к изменению лиганд-связывающих свойств рецепторов цитокининов, могут приводить in vivo к характерным изменениям фенотипа растений.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Лиганд-связывающие свойства рецепторов играют важную роль в механизме восприятия гормонального сигнала клеткой. С целью изучения лигандной специфичности индивидуальных рецепторов цитокининов мы применили несколько подходов. В цитокининовых тест-системах, в том числе с использованием индивидуальных рецепторов арабидопсиса и кукурузы, был исследован большой набор природных цитокининов и близких по структуре синтетических веществ. У ряда синтетических соединений впервые обнаружена цитокининовая активность; выявлены также соединения с избирательным сродством к отдельным рецепторам. Обнаружен новый антицитокинин - N6-(бензилоксиметил)аденозин (БОМА), который проявил свойства конкурентного антагониста цитокининов на уровне взаимодействия с рецептором CRE1/AHK.4. Разработанная модельная система на основе микросом из листьев табака, активно экспрессирующего трансгены цитокининовых рецепторов арабидопсиса или кукурузы, позволила изучить лиганд-связывающие свойства индивидуальных рецепторов в составе растительных мембран, т.е. в условиях, близких к естественным. Впервые проведено исследование роли отдельных аминокислот в пределах гормон-связывающего CHASE-домена рецептора в формировании его лигандной специфичности. С помощью метода ПЦР получен ряд новых вариантов рецептора ZmHKl с точечными мутациями, приводившими к изменению его лиганд-связывающих свойств, в том числе лигандной специфичности.

Полученные результаты дают основу для понимания молекулярных основ высокоспецифичного взаимодействия цитокининов с рецепторами и показывают возможность направленного воздействия на свойства и активность рецепторов.

выводы

1. В ходе скрининга синтетических производных аденина, близких по структуре к природным цитокининам, выявлены новые соединения, которые обладают цитокининовой активностью, а также соединения с избирательным сродством к отдельным рецепторам цитокининов.

2. При сравнении лиганд-связывающих свойств 4-х рецепторов цитокининов: СІІЕ1/АНК4, АНКЗ арабидопсиса и 2тНК1, 2тНК2 кукурузы выявлены существенные различия между рецепторами по сродству к ряду природных и синтетических лигандов.

3. Установлено, что синтетическое соединение Ы6-(бензилоксиметил) аденозин (БОМА) проявляет антицитокининовую активность, поскольку способно подавлять действие цитокининов, конкурируя с ними за сайт связывания на рецепторе СЯЕ1/АНК4, но не вызывая трансдукции гормонального сигнала.

4. Разработана растительная модельная система для тестирования свойств индивидуальных рецепторов цитокининов с использованием мембран листьев растений табака, транзиентно экспрессирующих трансгены рецепторов.

5. Охарактеризована кинетика связывания цитокинина рецепторами АНКЗ и ІК1 в составе растительных мембран; установлено, что оптимальное

связывание цитокинина рецептором АНКЗ происходит при рН 6,5-9,5 (23°С), тогда как 2шНК1 отличается квазилинейным увеличением связывания цитокинина с повышением рН от 5 до 9,5.

6. Установлено, что в случае цитокининов-оснований лигандная специфичность рецепторов АНКЗ и ЕтНКІ в растительной (гомологичной) модельной системе не отличается от лигандной специфичности в бактериальных (гетерологичных) модельных системах. Показано, что рибозиды цитокининов значительно хуже связываются рецепторами в гомологичной модельной системе, чем в гетерологичных системах.

7. Методом ПЦР получены варианты рецепторов кукурузы гтНКІ с точечными мутациями в СНА8Е-домепе. Установлено, что точечные мутации отдельных аминокислот влияют на лиганд-связывающие свойства рецептора, повышая его сродство к лигандам (Р190Ь, Б236К, Ь238Б), а также изменяя лигандную специфичность рецептора.

8. Результаты работы показывают возможность избирательного воздействия на индивидуальные рецепторы цитокининов in planta путем подбора соответствующих лигандов, а также изменения лиганд-связывающих свойств рецепторов путем точечных мутаций CHASE-домена.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Kolyachkina S.V., Tararov V.l., Alexeev С.S., Krivoshecv D.M., Romanov G.A., Stepanova E.V., Solomko E.S., Inshakov A.N., Mikhailov S.N. Nf'-substituted adenosines. Cytokinin and antitumor activities // Collection of Czechoslovak Chemical Communications, 2011, V. 76, N. 11, pp. 1361-1378.

2. Кривошеее Д.М., Колячкина C.B., Михайлов С.H., Ванюшин Б.Ф., Романов Г.А. ^-(бензилоксиметшОаденозин - новый антицитокинин, антагонист для рецептора CRE1/AHK4 арабидопсиса // Доклады Академии наук. Биохимия, биофизика, молекулярная биология, 2012, Т. 444, № 6, стр. 687-690.

3. Ломин С.Н., Крпвошссв Д.М., Стеклов М.Ю., Осолодкин Д.И., Романов Г.А. Свойства рецепторов и особенности сигналинга цитокининов // Acta Naturae, 2012, T.

4. №3(14), стр. 34-48.

4. Романов Г.А., Ломин С.Н., Кривошеев Д.М., Гетман И.А. Использование рецепторов цитокининов для поиска новых соединений с цитокининовой и антицитокининовой активностью // Международная конференция «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация», Пущино, 24-26 мая 2011 г., сборник статей, стр. 809814.

5. Колячкина C.B., Алексеев К.С., Кривошеев Д.М. Получение ^'-замещенных аденозинов и их цитокининовая активность // XXIII Международная зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", Москва, 7-10 февраля 2011 г., тезисы докладов и стендовых сообщений, стр. 125.

6. Кривошеев Д.М., Колячкина C.B., Алексеев К.С., Ломин С.Н., Гетман И.А. Тараров В.И., Михайлов С.Н., Романов Г.А. Поиск новых соединений с цитокининовой активностью на основе синтетических ^'-производных аденозина // Научно-практическая конференция "Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения". Новый Свет, Украина, 23-28 мая 2011 г., тезисы докладов, стр. 99.

7. Романов Г.А., Ломин С.Н., Кривошеев Д.М., Стеклов М.Ю., Гетман И.А., Болякина Ю.П. Аппарат рецепции цитокининов арабидопсиса: основные свойства и следствия // 3-ий Международный симпозиум "Клеточная сигнализация у растений", Казань, 28 июня - 1 июля 2011 г., тезисы докладов, стр. 154-155.

8. Кривошеее Д.М., Колячкина С.В., Алексеев К.С., Ломин С.Н., Гетман И.А., Тараров В.И., Михайлов С.Н., Романов Г.А. Анализ цитокининовой активности синтетических Ыб-производных аденозина // VII Съезд Общества физиологов растений России "Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий". Нижний Новгород, 4-10 июля 2011 г., материалы докладов, часть 1, стр. 383.

9. Кривошеек Д.М., Колячкина С.В., Алексеев К.С., Гетман И.А., Ломин С.Н., Тараров В.И., Михайлов С.Н., Романов Г.А. (2011) Новые синтетические Nf'-производные аденозина с цитокининовой активностью // VII-я Международная научная конференция "Регуляция роста, развития и продуктивности растений", Минск, Беларусь, 26-28 октября 2011 г., материалы конференции, стр. 114.

10. Chudalayandi S., Moss-Taylor, L., Cahill J., Petefish A., Krivosheev D., Lomin S., Romanov G., Muszynski M. Genetic and Biochemical analysis of Hairy Sheath Frayed mutation // 54lh Annual Maize Genetics Conference, Portland, USA, 15-18 March, 2012, Program and Abstracts, p. 64.

11. Кривошеев Д.М., Колячкина C.B., Михайлов C.H., Тараров В.И., Романов Г.А. Ы6-(бензилоксиметил)аденозин - новое соединение с антицитокининовой активностью // Международная конференция «Биология - наука XXI века», Москва, 24 мая 2012 г., материалы конференции, стр. 428-430.

12. Krivosheev D.M., Getman I.A., Romanov G.A. N6-(benzyloxymethyl)adenosine is an antagonist of cytokinin receptor CRE1/AHK4 of Arabidopsis // 3rd International Symposium Intracellular Signaling and Bioactive Molecules Design, Lviv, Ukraine 17-23 September, 2012, Abstracts, p. 26.

13. Steklov M.Yu., Osolodkin D.I., Krivosheev D.M., Lomin S.N., Mikhailov S.N., Palyulin V.A., Zefirov N.S., Romanov G.A. Explanation of the ligand-binding preferences of six different cytokinin receptors from arabidopsis maize based on structural peculiarities of their CHASE domains // 3rd International Symposium Intracellular Signaling and Bioactive Molecules Design, Lviv, Ukraine, 17-23 September, 2012, Abstracts, p. 54.

14. Кривошеее Д.М., Ломин C.H., Романов Г.А. Разработка модельной системы для изучения лиганд-связывающих свойств индивидуальных рецепторов цитокининов в составе растительных мембран на основе трансгенных растений табака // IV Всероссийский симпозиум «Трансгенные растения: технологии создания, биологические свойства, применение, биобезопасность», Москва, 19-23 ноября 2012 г. (принято в печать)

15. Ломин С.Н., Стеклов М.Ю., Кривошеев Д.М., Осолодкин Д.И., Романов Г.А. Использование направленного точечного мутагенеза для выявления аминокислот, обуславливающих лигандную специфичность рецепторов цитокининов // IV Всероссийский симпозиум «Трансгенные растения: технологии создания, биологические свойства, применение, биобезопасность», Москва, 19-23 ноября 2012 г. (принято в печать)

Подписано в печать:

24.10.2012

Заказ № 7746 Тираж -150 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кривошеев, Дмитрий Михайлович

Список условных сокращений

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРТЫ

1. Открытие цитокининов и их химическая структура

2. Физиологическое действие цитокининов

3. Метаболизм цитокининов

4. Открытие рецепторов цитокининов

5. Двухкомпонентные системы передачи сигнала

6. Доменная структура рецепторов цитокининов

7. Трансдукция цитокининового сигнала и вовлеченные белки

8. Субклеточная локализация рецепторов

9. Лиганд-связывающие свойства рецепторов

10. Распределение рецепторов цитокининов в растении и их физиологическая роль

11. Влияние мутаций на активность рецепторов

12. Пространственная структура рецептора

13. Синтетические аналоги цитокининов, взаимосвязь между структурой соединений и их цитокининовой активностью

13.1 Влияние положения боковой цепи и заместителей в адениновом гетероцикле на цитокининоеую активность соединений

13.2 Влияние модификаций пуринового гетероцикла на цитокининоеую активность соединений

13.3 Влияние модификаций боковой цепи на цитокининоеую активность соединений

13.4 Производные мочевины и амидов

14. Антицитокинины

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Реактивы

2. Модельные системы

2.1 Модельные системы на основе Е. Coli

2.2 Модельные системы на основе трансгенного арабидопсиса

2.3 Модельная система на основе амаранта

3. Сайт-специфичный мутагенез методом ПЦР

4. Получение химически-компетентных клеток Е. coli

5. Химическая трансформация Е. coli

6. Выделение плазмид из Е. coli

7. Рестрикция

8. Получение химически компетентных А. tumefaciens GV

9. Трансформация химически компетентных А. tumefaciens

10. Трансформация растений Nicotiana benthamiana

11. Получение сферопластов

12. Выделение мембран растительных клеток

13. Радиолигандный метод анализа связывания цитокининов с рецепторами в составе бактерий и сферопластов

14. Радиолигандный метод анализа связывания цитокининов с рецепторами в составе растительных мембран

15. Анализ активности ß-глюкуронидазы (GUS) в проростках Рarrs'GUS арабидопсиса

16. Вестерн-блотинг

17. Биотест на цитокининовую активность с проростками амаранта (амарантовый биотест)

18. Компьютерное моделирование сайта связывания цитокининов

19. Математические и статистические методы анализа

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Исследование цитокининовой активности синтетических производных аденина и их способности связываться с рецепторами цитокининов

2. Антицитокининовая активность БОМА

3. Исследование свойств рецепторов цитокининов в составе растительных мембран

4. Влияние точечных мутаций в СНА8Е-домене на лиганд-связывающие свойства рецептора 2тНК

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование взаимодействия с лигандами цитокининовых рецепторов арабидопсиса и кукурузы"

Исследования молекулярных механизмов действия фитогормонов, в том числе цитокининов, заметно активизировались в последнее десятилетие. В случае цитокининов это связано в первую очередь с обнаружением рецепторов этих фитогормонов и возможностью манипуляции генами рецепторов в различных модельных системах. Кроме того, были идентифицированы ферменты биосинтеза этих гормонов, основные элементы трансдукции цитокининового сигнала и гены первичного ответа. Данным открытиям способствовала расшифровка генома первого растения - арабидопсиса, в связи с чем впервые рецепторы цитокининов были обнаружены именно у растений данного вида. В настоящее время рецепторы цитокининов идентифицированы более чем у 30 видов растений. Установлено, что рецепторы цитокининов являются трансмембранными мультидоменными белками, обладающими гистидинкиназной активностью и подобными сенсорным гистидинкиназам прокариот и одноклеточных эукариот. В геноме растений обнаружено несколько гомологичных генов рецепторов, т.е. рецепторы цитокининов присутствуют в виде нескольких изоформ. К примеру, у арабидопсиса имеется три таких изоформы, а у кукурузы и сои их число доходит до 7-8. Эти изоформы различаются по распределению в органах и тканях растений. Таким образом, цитокининовая система регуляции характеризуется множественностью не только цитокининов, но и рецепторов. Биологический смысл этой множественности стал проясняться только в последнее время, благодаря исследованиям лигандной специфичности индивидуальных рецепторов цитокининов. Данные исследования привели к обнаружению существенных различий в способности отдельных рецепторов связывать те или иные природные цитокинины. При этом различия в лигандной специфичности наблюдались как между разными типами рецепторов из одного растения, так и между рецепторами из растений разных видов (Romanov et al., 2006; Lomin et al., 2011). Эти данные послужили основой гипотезы о роли различий лигандной специфичности рецепторов в межорганной коммуникации между корнем и побегом. Следует отметить, что исследования лиганд-связывающих свойств рецепторов цитокининов проводили с применением различных подходов, в условиях как in vivo, так и in vitro. В частности, ряд параметров взаимодействия гормон-рецептор был установлен с использованием трансгенных бактерий и дрожжей (Yamada et al., 2001; Spichal et al., 2004; Romanov et al., 2005, 2006; Heyl et al., 2007; Romanov & Lomin, 2009; Lomin et al., 2011).

Существенный вклад в понимание механизмов взаимодействия цитокининов с рецепторами внесло установление пространственной структуры лиганд-связывающего CHASE-домена рецептора CRE1/AHK4 (Hothorn et al., 2011). Тем не менее особенности строения рецепторов цитокининов, которые отвечают за различия в лигандной специфичности между ними, остаются пока неизвестными.

В целом, несмотря на большой прогресс в исследованиях структуры и функционирования рецепторов цитокининов, в данной области остается еще много нерешенных проблем. В частности, неясна роль липидного микроокружения в формировании лиганд-связывающих свойств рецепторов. Непонятны причины, по которым некоторые соединения, близкие по структуре к природным цитокининам и способные специфично связываться с рецептором, не вызывают трансдукции гормонального сигнала и подавляют действие цитокининов. Неизвестны структурные особенности рецепторных белков, которые обуславливают их лигандную специфичность. До конца не выяснены причины многообразия цитокининов и их рецепторов в клетке, а также биологическая роль различий лигандной специфичности рецепторов. Ответы на эти вопросы важны для понимания молекулярных механизмов действия цитокининов, что обуславливает актуальность данного направления исследований.

В связи с этим, цель данной работы - охарактеризовать индивидуальные рецепторы цитокининов из арабидопсиса и кукурузы по их взаимодействию с разнообразными лигандами; выявить аминокислотные остатки - возможные детерминанты лигандной специфичности рецепторов.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Кривошеев, Дмитрий Михайлович

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Лиганд-связывающие свойства рецепторов играют важную роль в механизме восприятия гормонального сигнала клеткой. С целью изучения лигандной специфичности индивидуальных рецепторов цитокининов из арабидопсиса и кукурузы мы использовали несколько подходов. Вначале мы провели скрининг ряда производных аденина, близких по структуре к природным цитокининам, на способность связываться с индивидуальными рецепторами разных видов растений, а также вызывать типичный цитокининовый эффект в модельных тест-системах. Всего было использовано более 30 различных соединений, большинство из них было протестировано на цитокининовую активность впервые. В ходе скрининга были выявлены синтетические соединения, обладающие избирательным сродством к индивидуальным рецепторам цитокининов, рецепторам-ортологам или рецепторам из растений одного вида. Таким образом, показана возможность избирательного воздействия на индивидуальные рецепторы цитокининов in planta путем подбора соответствующих лигандов.

В целом подтверждена корреляция между сродством лиганда к рецептору и способностью этого же соединения вызывать цитокинин-специфичный ответ в тест-системах. Однако наряду с такой общей корреляцией обнаружились и исключения: М6-бензилоксиметиладенозин (БОМА) был способен связываться с рецептором CRE1/AHK4, но при этом обладал очень слабой цитокининовой активностью в биотестах. В ходе прямых экспериментов было установлено, что данное соединение способно подавлять физиологический эффект, вызванный типичным цитокинином БАП. Кроме того, было показано, что БОМА и природные цитокинины связываются с одним и тем же сайтом на рецепторе CRE1/AHK4. Таким образом, обнаруженное нами соединение БОМА является новым конкурентным антагонистом рецептора CRE1/AHK4.

Поскольку характеристики гормон-рецепторного взаимодействия могут зависеть не только от свойств самих рецепторов, но и от их микроокружения в составе мембран, важной задачей было изучение лиганд-связывающих свойств рецепторов цитокининов в составе растительных мембран. Для этого нами была разработана новая гомологичная тест-система, в которой стало возможным изучать индивидуальные рецепторы цитокининов в составе растительных мембран, получаемых из листьев Шсойапа ЬеШкатгапа. С применением этой системы были исследованы свойства рецептора АНКЗ из арабидопсиса и 2тНК1 из кукурузы. Результаты, полученные в данной гомологичной системе, сравнивались с данными, полученными в гетерологичных (бактериальных) системах. Между результатами, полученными в разных системах, обнаружено как сходство, так и различия. Сходные результаты получены в отношении рН-зависимости связывания гормона и лигандной специфичности рецепторов (АНКЗ и 2тНК1) к различным природным цитокининам-основаниям. Различия касались количественных значений констант сродства рецепторов к лигандам, способности рецепторов связывать рибозиды цитокининов и влияния температуры на связывание гормонов. Следует отметить, что по ряду причин провести анализ лиганд-связывающей способности рецепторов в условиях гетерологичной (бактериальной) системы не всегда возможно. В то же время использование разработанной нами новой гомологичной (растительной) системы позволяет сделать это.

Одним из направлений изучения взаимосвязи между строением и функциональными свойствами рецепторных белков является исследование влияния мутаций на эти свойства. Для выявления причин особенностей лигандной специфичности рецептора (на примере 2тНК1) нами были проведены эксперименты, в ходе которых осуществлялась замена отдельных аминокислот в лиганд-связывающем СНА8Е-домене данного рецептора. Заменяемые аминокислоты были выбраны с использованием биоинформатических методов и с учетом данных о структуре гормон-связывающего сайта рецептора СКЕ1/АНК4. Было показано, что точечные мутации большей части выбранных аминокислот действительно вызывают изменение лигандной специфичности рецептора 2тНК1. Замены аспарагина-110 на серин или изолейцина на валин приводили к тому, что рецептор с этими мутациями связывал й и сЪ с различным сродством, в отличие от рецептора дикого типа. Таким образом, замены аминокислот ЪтНКЛ на те, которые в данных позициях присутствуют в 7тНК2, делали мутантный рецептор сходным по лпгандной специфичности с 2тНК2. Замена глутамина-116 на валин приводила к тому, что 2шНК1 связывал ТБ приблизительно с таким же сродством, что ийи сЪ. Таким образом, в ходе нашей работы был получен ряд отдельных точечных мутаций в СНАБЕ-домене рецептора 2тНК1 и изучено влияние данных мутаций на его лиганд-связывающие свойства. Следует отметить, что нам впервые удалось с помощью направленного точечного мутагенеза вызвать изменение лигандной специфичности рецептора цитокининов.

Кроме того, нами были исследованы лиганд-связывающие свойства рецепторов 2тНК1, содержащих точечные мутации, приводящие к появлению фенотипа Я?/7 у растений кукурузы. Такими мутациями были замены пролина-190 на лейцин, глутамата-236 на лизин и лейцина-238 на фенилаланин. Мы показали, что все эти мутации влияют на лиганд-связывающие свойства рецептора, вызывая значительное увеличение его сродства к цитокининам, производным аденина, но не к ТО.

Все полученные нами данные в сочетании со сведениями о пространственной структуре сайта связывания рецептора цитокинина С11Е1/АНК4 и использованием компьютерного моделирования приближают нас к пониманию молекулярных механизмов взаимодействия цитокининов с рецепторами, важных для лигандной специфичности рецепторов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кривошеев, Дмитрий Михайлович, Москва

1. Зверева С.Д., Романов Г.А. (2000) Репортерные гены для генетической инженерии растений: характеристика и методы тестирования. Физиология растений, 44, 479-488.

2. Колесников Я.С., Нохрина К.П., Кретинин C.B., Волотовский И.Д., Мартинец Я., Романов Г.А., Кравец B.C. (2012) Молекулярная структура и механизмы регуляции активности фосфолипазы D клеток растений и животных. Биохимия, 77, 5-20.

3. Ломин С.Н., Романов Г.А. (2008) Анализ гормон-рецепторного взаимодействия. Теоретические и практические аспекты. Физиология растений, 55, 283-299.

4. Ломин С.Н., Кривошеев Д.М., Стеклов М.Ю., Осолодкин Д.И., Романов

5. Г.А. (2012) Свойства рецепторов и особенности сигналинга цитокининов. Acta Naturae, 4, 34-48.

6. Лось Д.А. (2001) Восприятие сигналов биологическими мембранами: сенсорные белки и экспрессия генов. Соросовский образовательный журнал, 7,1-9.

7. Лось Д.А. (2010) Сенсорные системы цианобактерий. М.: Научный мир, 218 с.

8. Лутова Л.А., Ежова Т.А., Додуева И.Е., Осипова М.А. (2010) Генетика развития растений, ред. Инге-Вечтомов. С.Г. С.-Петербург.: Н-Л, 431 с.

9. И. Романов Г.А. (2009) Как цитокинины действуют на клетку. Физиология растений, 56, 295-319.

10. Романов Г.А. (2011) Открытие рецепторов и биосинтеза цитокининов: как это было (к 10-летней годовщине события). Физиология растений, 58, 1-5.

11. Abe Н., Uchiyama М. (1978) Relative cytokinin activity of 3-methyl substituted adenylate cytokinins. Agric. Biol. Chem., 42,487-489.

12. Acharya В., Assmann S. (2009) Hormone interactions in stomatal function. Plant Mol. Biol., 69, 451-462.

13. Anantharaman V., Aravind L. (2001) The CHASE domain: a predicted ligand-binding module in plant cytokinin receptors and other eukaryotic and bacterial receptors. Trends Biochem. Sci., 26, 579-582.

14. Argueso C.T., Ferreira F.J., Kieber J.J. (2009) Environmental percepyion avenues: the interaction of cytokinin and environmental response pathways. Plant Cell Environ., 32, 1147-1160.

15. Ashikari M., Sakakibara H., Lin S., Yamamoto T., Takashi T., Nishimura A.2005) Cytokinin oxidase regulates rice grain production. Science, 309, 741-745.

16. Barton M.K. (2001) Twenty years on: the inner workings of the shoot apical meristem, a development dinamo. Dev. Biol, 341, 95-113.

17. Bartrina I, Otto E, Strnad M, Werner T, Schmulling T. (2011) Cytokinin regulates the activity of reproductive meristems, flower organ size, ovule formation, and thus seed yield in Arabidopsis thaliana. Plant Cell., 23, 69-80.

18. Beier D., Gross R. (2006) Regulation of bacterial virulence by two-component systems. Curr. Opin. Microbiol., 9, 143-152.

19. Bilyeu, K.D., Cole, J.L., Laskey, J.G., Riekhof, W.R., Esparza, T.J., Kramer, M.D., Morris, R.O. (2001) Molecular and biochemical characterization of a cytokinin oxidase from maize. Plant Physiology, 125, 378-386.

20. Bradford M.M. (1976) A rapid and sensitive method for quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 72,248-254.

21. Brandstatter I., Kieber J.J. (1998) Two Genes with Similarity to Bacterial Response Regulaors Are Repidly and Specifically Induced by Cytokinin in Arabidopsis. Plant Cell, 10, 1009-1019.

22. Caesar K., Thamm A.M., Witthoft J., Elgass K., Huppenberger P., Grefen C., Horak J., Harter K. (2011) Evidence for the localization of the Arabidopsis cytokinin receptors AHK3 and AHK4 in the endoplasmic reticulum. J. Exp. Bot., 62, 5571-5580.

23. Catlett N.L., Yoder O.C., Turgeon B.G. (2003) Whole-genome analysis of two-component signaling transduction genes in fungal pathogens. Eucaryot Cell, 2, 11511161.

24. Chen C.M., Smith O.C., McChesney J.D. (1975) Biosynthesis and cytokinin activity of 8-hydroxy and 2,8-dihydroxy derivatives of zeatin and N6-(A2-isopentenyl)adenine. Biochemistry, 14, 3088-3093.

25. Chen Y.-F., Randlett M.D., Findell J.L., Schaller G.E. (2002) Localization of the ethylene receptor ETR1 to the endoplasmic reticulum of Arabidopsis. J. Biol. Chem., 277,19861-19866.

26. Cheng Y.C., Prusoff W.H. (1973) Relationship between the inhibitor constant (Ki) and the concentration of inhibitor which causes 50% inhibition of an enzymatic reaction. Biochem. Pharmacol. Med., 22, 3099-3108.

27. Clement N.R., Gould J.M. (1981) Pyranine (8-Hydroxy-l,3,6-pyrenetrisulfonate) as a probe of internal aqueous hydrogen ion concentration in phospholipid vesicles. Biochemistry, 20, 1534-1538.

28. Corbesier L., Prinsen E., Jackmard A., Lejeune P., van Onckelen H., Perilleux C., Bernier G. (2003) Cytokinin levels in leaves, leaf exudate and shoot apical meristem of Arabidopsis thaliana during floral transition. J. Exp. Bot., 54,2511-2517.

29. D'Agostino IB, Deruere J, Kieber JJ. (2000) Characterization of the Response of the Arabidopsis Response Regulator Gene Family to Cytokinin. Plant Physiol., 124, 1706-1717.

30. Dammann L.G., Leonard N.J., Schmitz R.Y., Skoog F. (1974) Cytokinins: synthesis of 2-, 8-, and 2,8-substituted 6-(3-methyl-2-butenylamino)purines and their relative activities in promoting cell growth, Phytochemistry, 13, 329-336.

31. Dello Ioio R., Linhares F.S., Scacchi E., Casamitjana-Martinez E., Heidstra R., Costantino P., Sabatini S. (2007) Cytokinins determine Arabidopsis root-meristem size by controlling cell differentiation. Curr. Biol., 17, 678-682.

32. Dello Ioio R., Nakamura K., Moubayidin L., Perilli S., Taniguchi M., Morita M.T., Aoyama T., Costantino P., Sabatini S. (2008) A genetic framework for the control of cell division and differentiation in the root meristem. Science, 322, 1380-1384.

33. Deng Y., Dong H., Mu J., Ren B., Zheng B., Ji Z., Yang W.C., Liang Y., Zuo

34. J. (2010) Arabidopsis histidine kinase CKI1 acts upstreamof histidine phosphotransfer proteins to regulate female gametophytedevelopment and vegetative growth. Plant Cell, 22, 1232-1248.

35. Dortay H., Mehnert N., Bürkle L., Schmülling T., Heyl A. (2006) Analysis of protein interactions within the cytokinin-signaling pathway of Arabidopsis thaliana. FEBSJ.,213,4631-4644.

36. Frebort L, Kowalska M„ Hluska T., Frebortovä J., Galuszka P. (2011) Evolution of cytokinin biosynthesis and degradation. J. Exp. Bot., 62, 2431-2452.

37. Frebortova J., Novak O., Frebort L, Jorda R. (2010) Degradation of cytokinins by maize cytokinin dehydrogenase is mediated by free radicals generated by enzymatic oxidation of natural bensoxazinones. Plant J., 61,467-481.

38. Ferreira F.G., Kieber J.J. (2005) Cytokinin signaling. Curr. Opin. Plant Biol., 8, 518-525.

39. Franco-Zorrilla J.M., Martin A.C., Solano R., Rubio, V., Leyva, A., Paz-Ares

40. J. (2002) Mutations at CRE1 impair cytokinin-induced repression of phosphate starvation responses in Arabidopsis. Plant J., 32,353-360.

41. Galichet A., Hoyerova K., KaminekM., Gruissem W. (2008) Farnesilation directs AtIPT3 subcellular localization and modulates cytokinin biosinthesis in Arabidopsis. Plant Physiology, 146, 1155-1164.

42. Gan S., Amasino R.M. (1995) Inhibition of leaf senescence by autoregulated production of cytokinin. Science, 270, 1986-1988.

43. Gonzalez-Rizzo S., Crespi M., Frugier F. (2006) The Medicago truncatula CRE1 cytokinin receptor regulates lateral root development and early symbiotic interaction with Sinorhizobium meliloti. Plant Cell, 18,2680-2693.

44. Gordon S.P., Chickarmane V.S., Ohno C., Meyerowitz E.M. (2009) Multiple feedback loops through cytokinin signaling control stem cell number within the Arabidopsis shoot meristem. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 106, 16529-16534.

45. Grefen C., Stadele K., Ruzicka K., Obrdlik P., Harter K., Horak J. (2008) Subcellular localization and in vivo interactions of the Arabidopsis thaliana ethylene receptor family members. Mol. Plant, 1, 308-320.

46. Gupta S., Rashotte A.M. (2012) Down-stream components of cytokinin signaling and the role of cytokinin throughout the plant. Plant Cell Rep., 31, 801-812.

47. Ha S., Vankova R., Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K., Tran L.S. (2012) Cytokinins: metabolism and function in plant adaptation to environmental stresses. Trends Plant Sci., 17, 172-179.

48. Hamant O., Nogue F., Belles-Boix E., Jublot D., Grand jean O., Traas J., Pautot V. (2002) The KNAT2 homeodomain protein interacts with ethylene and cytokinin cignaling. Plant Phisiol., 130, 657-665.

49. Hecht S.M., Leonard N.J., Schmitz R.Y., Skoog F. (1970) Cytokinins: influence of side-chain planarity of N6-substituted adenines and adenosines on their activity in promoting cell growth. Phytochemistry, 9, 1907-1913.

50. Hecht S.M., Bock R.M., Schmitz R.Y., Skoog F., Leonard N.J. (1971) Cytokinins: development of a potent antagonist. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 68, 26082610.

51. Henderson T.R., Frihart C.R., Leonard N.J., Scmitz R.Y., Skoog F. (1975) Cytokinins with different connecting links between purine and isopentenyl or benzyl groups. Phytochemistry, 14,1687.

52. Heyl A., Schmiilling T. (2003) Cytokinin signal perception and transduction. Cur. Opin. Plant Biol., 6,480-488.• 'A'

53. Heyl A., Wulfetange K., Pils B., Nielsen N., Romanov G.A., Schmiilling T.2007) Evolutionary proteomics identifies amino acids essential for ligand-binding of the cytokinin receptor CHASE domain. BMCEvol. Biol., 7, 62.

54. Heyl A., Riefler M., Romanov G.A., Schmulling T. (2012) Properties, functions and evolution of cytokinin receptors. Eur. J. Cell Biol., 91,246-256.

55. Higuchi M., Kakimoto T., Mizuno T. (2009) Cytokinin sensing systems using microorganisms. Plant Hormones: Methods and Protocols, 2nd Edition. Methods in Molecular Biology. Humana Press., 495, 101-109.

56. Hirose N., Takei K., Kuroha T., Kamada-Nobusada T., Hayashi H., Sakakibara H. (2008) Regulation of cytokinin biosynthesis, compartmentalization and translocation. J. Exp. Bot., 59, 75-83.

57. Hosoda K., Imamura A., Katoh E., Hatta T., Tachiki M., Yamada H., Mizuno T., Yamazaki T. (2002) Molecular structure of the GARP family of plant Myb-related DNA binding motifs of the Arabidopsis response regulators. Plant Cell., 14,2015-2029.

58. Hothorn M., Dabi T., Chory J. (2011) Structural basis for cytokinin recognition by Arabidopsis thaliana histidine kinase 4. Nat. Chem. Biol, 7, 766-768.

59. Hua J., Meyerowitz E.M. (1998) Ethylene responses are negatively regulated by a receptor gene family in Arabidopsis thaliana. Cell, 94,261-271.

60. Hwang I., Sheen J. (2001) Two-component circuitry in Arabidopsis cytokinin signal transduction. Nature, 413, 383-389.

61. Imamura A., Hanaki N., Umeda H., Nakamura A., Suzuki T., Ueguchi C., Mizuno T. (1998) Response regulators implicataed in His-to-Asp phosphotramsfer signaling in Arabidopsis. PNAS, 95,2691-2696.

62. Inoue T., Higuchi M., Hashimoto Y., Seki M., Kobayashi M., Kato T., Tabata S., Shinozaki K., Kakimoto T. (2001) Identification of CRE1 as a cytokinin receptor from Arabidopsis. Nature, 409, 1060-1063.

63. Ito Y., Kurata N. (2006) Identification and characterization of citokinin signaling gene families in rice. Gene, 382, 57-65.

64. Iwamura H., Masuda N., Koshimizu K., Matsubara S. (1979) Cytokinin-agonistic and antagonistic activities of 4-substituted-2-methylpyrrolo2,3-d.pyrimidines, 7-deaza analogs of cytokinin-active adenine derivatives. Phytochemistry, 18,217-222.

65. Iwamura H., Fujita T., Koyama S., Koshimizu K., Kumazawa Z. (1980) Quantitative structure-relationship of cytokinin-active adenine and urea derivatives. Phytochemistry, 19,1309-1319.

66. Iwamura H. (1994) Cytokinin antagonists: synthesis and biological activity. In Cytokinins: Chemistry, Activity, and Function. Edited by Mok D.W.S. and Mok M.C. pp. 43-55, CRC Press, Boca Raton.

67. Jain M., Tyagi A.K., Khurana J.P. (2006) Molecular characterization and differential expression of cytokinin-responsive type-A response regulators in rice (Oryza sativa). BMC Plant Biol., 6,1 -11.

68. Jasinski S., Piazza P., Craft J., Hay A., Woolley L., Rieu I., Phillips A., Hedden P., Tsiantis M. (2005) KNOX action in Arabidopsis is mediated by coordinate regulation of cytokinin and gibberellin activities. Curr. Biol., 15, 1560-1565.

69. Jefferson R.A., Kavanagh T.A., Bevan M.W. (1987) GUS fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J., 6,3901-3907.

70. Kakimoto T. (1996) CKI1, a histidine kinase homolog implicated incytokinin signal-transduction. Science, 21 A, 982-985.

71. Kakimoto T. (2001) Identification of plant cytokinin biosynthetic enzymes as dimethylallyl diphosphate:ATP/ADP isopentenyltransferases. Plant and Cell Physiology, 42, 677-685.

72. Kakimoto T. (2003) Perception and signal transduction of cytokinins. Annu. Rev. Plant Biol, 54, 605-627.

73. Kaminek M., Paces V., Corse J., Challice J.S. (1979) Effect of stereospecific hydroxylation of N -(A -isopentenyl)adenosine on cytokinin activity. Planta, 145, 239243.

74. Karanov E., Alexieva V., Golovinsky E., Haimova M. (1993) Cytokinin and anticytokinin activity of some 4-substituted lH-pyrazoles and 8-aza analogues of adenine. Plant Growth Regul., 13, 7-11.

75. Kasahara H., Takei K., Ueda N., Hishiyama S., Yamaya T., Kamiya Y., Yamaguchi S., Sakakibara H. (2004) Distinct Isoprenoid Origins of cis- and trans-Zeatin Biosyntheses in Arabidopsis. The Journal of Biological Chemistry, 279, 1404914054.

76. Kieber J.J., Schaller G.E. (2010) The perception of cytokinin: a story 50 years in the making. Plant Physiol., 154,487-492.

77. Kim H.J., Ryu H., Hong S.H., Woo H.R., Lim P.O., Lee I.C., Sheen J., Nam H.G., Hwang I. (2006) Cytokinin-mediated control of leaf longevity by AHK3 through phosphorylation of ARR2 in Arabidopsis. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 103, 814-819.

78. Kolyachkina S.V., Tararov V.I., Alexeev C.S., Krivosheev D.M., Romanov G.A., Stepanova E.V., Solomko E.S., Inshakov A.N., Mikhailov S.N. (2011) N6-substituted adenosines. Cytokinin and antitumor activities. Collect. Czech. Chem. Commun76, 1361-1378.

79. Kowalska M., Galuszka P., Frebortova J., Sebela M., Beres T., Hluska T.2010) Vacuolar and cytosolic cytokinin dehydrogenases of Arabidopsis thaliana: Heterologous expression, purification and properties. Phytochemistry, 71, 1970-1980.

80. Kulaeva O.N., Fedina A.B., Klyachko N.L. (1968) Specific features of protein synthesis in plant leaves (Effect of age and cytokinins). Agrochimica, 13,1-2.

81. Kurakawa T., Ueda N., Maekawa M., Kobayashi K., Kojima M.,Nagato Y., Sakakibara H., Kyozuka J. (2007) Direct control of shoot meristem activity by a cytokinin-activating enzyme. Nature, 445, 652-655.

82. Kuroha T., Ueguchi C., Sakakibara H., Satoh S. (2006) Cytokinin receptors are required for normal development of auxin-transporting vascular tissues in the hypocotyl but not in adventitious roots. Plant Cell Physiol., 47,234-243.

83. Laemmli U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227, 680-685.

84. Lara M.E.B., Garcia M.C.G., Fatima T., Ehne R., Lee T.K., Proels R., Tanner W., Roitsch T. (2004) Extracellular invertase is an essential component of cytocinin-mediated delay of senescence. Plant Cell, 16, 1276-1287.

85. Laureys F., Dewitte W., Witters E., Van Montagu M., Inze D., Van Onckelen

86. H. (1998) Zeatin is indispensable for the G2-M transition in tobacco BY-2 cells. FEBS Lett., 426, 29-32.

87. Leibfried A., To J.P., Busch W., Stehling S., Kehle A., Demar M., Kieber J.J., Lohmann J.U. (2005) WUSCHEL controls meristem function by direct regulation of cytokinin-inducible response regulators. Nature, 438, 1172-1175.

88. Letham D.S. (1963) Zeatin, a Factor Inducing Cell Division isolated from Zea mays. Life Sci., 2, 569-573.

89. Letham D.S., Parker C.W., Gordon M.E. (1972) Regulators of cell division in plant tissues. XIV. The cytokinin activities and metabolism of 6-acylaminopurines. Physiol. Plant., 27, 285-290.

90. Li X., Mo X., Shou H., Wu P. (2006) Cytokinin-mediated cell cycling arrest of pericycle founder cells in lateral root initiation of Arabidopsis. Plant Cell Physiol., 47, 1112-1123.

91. Lomin S.N., Yonekura-Sakakibara K., Romanov G.A., Sakakibara H. (2011) Ligand-binding properties and subcellular localization of maize cytokinin receptors. Journal of Experimental botany, 62, 5149-5159.

92. Mähönen A.P., Bonke M., Kauppinen L., Riikonen M., Benfey P.N., Helariutta Y. (2000) A novel two-component hybrid molecule regulates vascular morphogenesis of the Arabidopsis root. Genes Dev., 14,2938-2943.

93. Mähönen A.P., Bishopp A., Higuchi M., Nieminen K.M., Kinoshita K., Törmäkangas K., Ikeda Y., Oka A., Kakimoto T., Helariutta Y. (2006a) Cytokinin signaling and its inhibitor AHP6 regulate cell fate during vascular development. Science, 6, 94-98.

94. Mähönen A.P., Higuchi M., Törmäkangas K., Miyawaki K., Pischke M.S., Sussman M.R., Helariutta Y., Kakimoto T. (2006b) Cytokinins regulate a bidirectional phosphorelay network in Arabidopsis. Curr. Biol., 16,1116-1122.

95. Mason M.G., Mathews D.E., Argyros D.A., Maxwell B.B., Kieber J.J., Alonso J.M., Ecker J.R., Schaller G.E. (2005) Multiple Type-B Response Regulators Mediate Cytokinin Signal Transduction in Arabidopsis. Plant Cell, 17,3007-3018.

96. Matsubara S. (1980) Structure-activity relationships of cytokinins. Phytochemistry, 19,2239-2253.

97. Matsubara S. (1990) Structure-activity relationships of cytokinins. Plant Sciences, 9, 17-57.

98. Matsumoto-Kitano M., Kusumoto T., Tarkowski P., Kinoshita-Tsujimura K., Vaklavikova K., Miyawaki K., Kakimoto T. (2008) Cytokinins are central regulators of cambial activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105,20027-20031.

99. Maxwell B.B., Kieber J.J. (2005) Plant Hormones: Biosynthesis, Signal Transduction, Action! P.J. Davies, ed. Dordrecht, The Netherlands: Kluwer Academic Publishers, 321-349.

100. Merewitz E., Gianfagna T., Huang B. (2010) Effects of SAG12-ipt and HSP18.2-ipt expression on cytokinin production, root growth and leaf senescence in creeping bentgass exposed to drought stress. J. Am. Soc. Hortic. Sci., 135,230-239.

101. Mik V., Sziicova L., Smehilova M., Zatloukal M., Dolezal K., Nisler J., Gruz J., Galuszka P., Strnad M., Spichal L. (2011) N9-substituted derivatives of kinetin: Effective anti-senescence agents. Phytochemistry, 72, 821-831.

102. Miller C.O., Skoog F., von Saltza N.M., Strong F.M. (1955) Kinetin, a cell division factor from deoxyribonucleic acid. J. Am. Soc., 77,1329-1334.

103. Miyawaki K., Matsumoto-Kitano M., Kakimoto T. (2004) Expression of cytokinin biosynthetic isopentenyltransferase genes in Arabidopsis: tissue specificity and regulation by auxin, cytokinin, and nitrate. Plant J., 37, 128-38.

104. Mok D.W.S., Mok M.C. (2001) CYTOKININ METABOLISM AND ACTION. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 52, 89-118.

105. Mougel C., Zhulin I.B. (2001) CHASE: an extracellular sensing domain common to transmembrane receptors from prokaryotes, lower eukaryotes and plants. Trends Biochem. Sci., 26, 582-584.

106. Miiller B. (2011) Generic signal-specific responses: cytokinin and context-dependent cellular responses. J. Exp. Bot., 62, 3273-3288.

107. Muller-Dieckmann H.J., Grantz A.A., Kim S.H. (1999) The structure of the signal receiver domain of the Arabidopsis thaliana ethylene receptor ETR1. Structure, 7, 1547-1556.

108. Nieminen K., Immanen J., Laxell M., Kauppinen L., Tarkowski P., Dolezal K., Tahtiharju S., Elo A., Decourteix M., Ljung K., et al. (2008) Cytokinin signaling regulates cambial development in poplar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105,20032-10037.

109. Nishimura C., Ohashi Y., Sato S., Kato T., Tabata S., Ueguchi C. (2004) Histidine kinase homologs that act as cytokinin receptors possess overlapping functions in the regulation of shoot and root growth in Arabidopsis. Plant Cell., 16, 1365-1377.

110. Nisler J., Zatloukal M., Popa L, Dolezal K., Strnad M., Spichal L. (2010) Cytokinin receptor antagonists derived from 6-benzylaminopurine. Phytochemistry, 71, 823-830.

111. Pareek A., Singh A., Kumar M., Kushwaha H.R., Lynn A.M., Singla-Pareek

112. S.L. (2006) Whole genome analysis of Oryza sativa reveals similar architecture of two component signaling machinery with Arabidopsis. Plant Physiol, 142, 380-397.

113. Pas J., von Grotthuss M., Wyrwicz L.S., Rychlewski L., Barciszewski J.2004) Structure prediction, evolution and ligand interaction of CHASE domain. FEBS Letters, 576,287-290.

114. Pils B., Heyl A. (2009) Unraveling the evolution of cytokinin signaling. Plant Physiol., 151,782-791.

115. Pischke M.S., Jones L.G., Otsuga D., Fernandez D.E., Drews G.N., Sussman

116. M.R. (2002) An Arabidopsis histine kinase is essential for megagametogenesis. PNAS, 99, 15800-15805.

117. Punwani J.A., Hutchison C.E., Schaller G.E., Kieber J.J. (2010) The subcellular distribution of the Arabidopsis histidine phosphotransfer proteins is independent of cytokinin signaling. Plant J., 62,473-482.

118. Quail P.H. (2002) Photosensory perception and signalling in plant cells: new paradigms? Curr. Opin. Cell Biol, 14, 180-188.

119. Rashotte A.M., Carson S.D.B., To J.P.C., Kieber J.J. (2003) Expression profiling of cytokinin action in Arabidopsis. Plant Physiol, 132, 1998-2011.

120. Rashotte A.M., Goertzen L.R. (2010) The CRF domain defines cytokinin response factor proteins in plants. BMC Plant Biol, 10, 74-83.

121. Riefler M., Novak O., Strnad M., Schmulling T. (2006) Arabidopsis cytokinin receptor mutants reveal functions in shoot growth, leaf senescence, seed size, germination, root development, and cytokinin metabolism. Plant Cell, 18,40-54.

122. Riou-Khamlichi, C. Huntley, R., Jacqmard, A. Murray, J.A.H. (1999) Cytokinin activation of Arabidopsis cell division through a D-type cyclin. Science, 283, 1541-1544.

123. Rivero R.M., Kojima M., Gepstein A., Sakakibara H., Mittler R., Gepstein S., Blumwald E. (2007) Delayed leaf senescence indused extreme drought tolerance in flowering plant. Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 104, 19631-19636.

124. Romanov G.A., Getman I.A., Schmulling T. (2000) Investigation of early cytokinin effects in a rapid Amaranthus seedling test. Plant Growth. Regul., 32, 337-344.

125. Romanov G.A. Kieber J.J., Schmulling T. (2002) A rapid cytokinin response assay in Arabidopsis indicates a role for phospholipase D in Cytokinin Signalling. FEBS Lett., 515, 39-43.

126. Romanov G.A., Spichal L., Lomin S.N., Strnad M., Schmulling T. (2005) A live cell hormone-binding assay on transgenic bacteria expressing a eukaryotic receptor protein. Anal. Biochem., 347,129-134.

127. Romanov G.A., Lomin S.N., Schmulling T. (2006) Biochemical characteristics and ligand-binding properties of Arabidopsis cytokinin receptor AHK3 compared to CRE1/AHK4 as revealed by a direct binding assay. J. Exp. Bot., 57,4051-4058.

128. Romanov G.A., Lomin S.N. (2009) Hormone-binding assay using living bacteria expressing eukaryotic receptors. Plant Hormones: Methods and Protocols, 2nd Edition, Methods in Molecular Biology. Humana Press., 495, 111-120.

129. Romanov G.A. (2012) Cytokinins. McGraw Hill Encyclopedia of Science & Technol. USA, 5,205-207.

130. Saenz L., Jones L.H., Oropeza C., Vlacil D., Strnad M. (2003) Endogenous isoprenoid and aromatic cytokinins in different plant parts of Cocos nucifera (L.). Plant Growth Regul., 39., 205-215.

131. Sakai H., Aoyama T., Bono H., Oka A. (1998) Two-component response regulators from Arabidopsis thaliana contain a putative DNA-binding motif. Plant Cell Physiol., 39,1232-1239.

132. Sakai H., Aoyama T., Oka A. (2000) Arabidopsis ARR1 and ARR2 response regulators operate as transcriptional activators. Plant J., 24,703-711.

133. Sakamoto T., Sakakibara H., Kojima M., Yamamoto Y., Nagasaki H., Inukai Y., Sato Y., Matsuoka M. (2006) Ectopic expression of KNOTTED 1-like homeodomain protein induces expression of cytokinin biosynthesis genes in rice. Plant Physiology, 142, 54-62.

134. Seguela M., Briat J-F., Vert G., Curie C. (2008) Cytokinins negatively regulate the root iron aptake machinery in Arabidopsis through a growth-dependent pathway. Plant J., 55,289-300.

135. Schaller G.E., Kieber J.J., Shiu S.-H. (2008) Two-component signaling elements and histidyl-aspartyl phosphorelays.77ze Arabidopsis Book, 6,1-12.

136. Schaller G.E., Shiu S.-H., Armitage J.P. (2011) Two-component systems and their co-option for eukaryotic signal transduction. Current Biol., 21, R320-R330.

137. Shani E. et al (2006) The role of hormones in shoot apical meristem function. Curr. Opin. Plant Biol., 9,484-489.

138. Schepens I., Duek P., Fankhauser C. (2004) Phytochrome-mediated light signalling in Arabidopsis. Curr. Opin. Plant. Biol., 7, 564-569.

139. Shaw G., Smallwood B.M., Seward F.C. (1968) Synthesis and cytokinin activity of the 3-, 7- and 9-methyl derivatives of zeatin. Experientia, 24, 1089-1090.

140. Shi X., Rashotte A.M. (2012) Advances in upstream players of cytokinin phosphorelay: receptors and histidine phosphotransfer proteins. Plant Cell Rep., 31, 789799.

141. Shimizu R., Iwamura H., Matsubara S., Fujita T. (1989) Development of s-triazine anticytokinins and their quantitative structure-activity relationship. J. Agric. Food Chem., 37, 236-240.

142. Shimizu-Sato S., Tanaka M., Mori H. (2009) Auxin-cytokinin interactions in the control of shoot branching. Plant Mol. Biol., 69,429-435.

143. Skinner C.G., Shive W. (1957) Effect of some isomeric purine analogues on germination of lettuce seed. Plant Physiol., 32, 500-501.

144. Skoog F., Miller C. (1957) Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissue cultured in vitro. Symp. Soc. Exp. Biol., 11, 118-131.

145. Skoog F., Hamzi H.Q., Szweykowska A.M., Leonard N.J., Carraway K.L., Fujii T., Helgeson J.P., Loeppky R.N. (1967) Cytokinins: structure/activity relationships. Phytocheistry, 6, 1169-1192.

146. Skoog F., Schmitz R.Y., Hecht S.M., Frye R.B. (1975) Anticytokinin activity of substituted pyrrolo2,3-<i.pyrimidines. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 3508-3512.

147. Soni R., Carmichael J.P., Shah Z., Murray J.A.H. (1995) A family of cyclin D homologs from plants differentially controlled by growth regulators and containing the conserved retinoblastoma protein interaction motif. Plant Cell, 7, 85-103.

148. Sparkes I.A., Runions J., Kearns A., Hawes C. (2006) Rapid, transient expression of fluorescent fusion proteins in tobacco plants and generation of stably transformed plants. Nature protocols., 4,2019-2025.

149. Spichal L., Werner T., Popa I., Riefler M., Schmulling T., Strnad M. (2009) The purine derivative PI-55 blocks cytokinin action via receptor inhibition. FEBS J., 276, 244-253.

150. Spichal L. (2011) Bacterial assay to study plant sensor histidine kinases. Plant Kinases: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Springer Science-EBusiness Media, 779, 139-147.

151. Strasser B., Sanchez-Lamas M., Yanovsky M.J., Casal J.J., Cerdan P.D.2010) Arabidopsis thaliana life without phytochromes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107, 4776-4781.

152. Stock A.M., Robinson V.L., Goudreau P.N. (2000) Two-component signal transduction. Annu. Rev. Biochem., 69, 183-215.

153. Stolz A., Riefler M., Lomin S.N., Achazi K., Romanov G.A., Schmulling T.2011) The specificity of cytokinin signalling in Arabidopsis thaliana is mediated by differing ligand affinities and expression profiles of the receptors. Plant J., 67, 157-168.

154. Strnad M. (1997) The aromatic cytokinins. Physiol Plant, 101, 674-688.

155. Sugiyama T., Kitamura E., Kubokawa S., Kobayashi S., Hashizume T., Matsubara S. (1975) Synthesis and cytokinin activity of N-acylaminodeazapurines. Phytochemistry, 14,2539-2543.

156. Sun J., Niu Q.-W., Tarkowski P., Zheng B., Tarkowska D., Sandberg G., Chua N.-H., Zuo J. (2003) The Arabidopsis AtIPT8/PGA22 Gene Encodes an Isopentenyl Transferase That Is Involved in De Novo Cytokinin Biosynthesis. Plant Physiology, 131, 167-176.

157. Suzuki T., Miwa K, Ishikawa K., Yamada H., Aiba H., Mizuno T. (2001) The Arabidopsis sensor His-kinase, AHK4, can respond to cytokinins. Plant Cell Physiol., 42, 107-113.

158. Takahashi S., Shudo K., Okamoto T., Yamada K., Isogai Y. (1978) Cytokinin activity of N-phenyl-N'-(4-pyridyl)urea derivatives. Phytochemistry, 17, 1201-1207.

159. Takei K, Sakakibara H, Sugiyama T. (2001a) Identification of genes encoding adenylate isopentenyltransferase, a cytokinin biosynthesis enzyme, in Arabidopsis thaliana. J. Biol Chem., 276,26405-26410.

160. Takei K., Dekishima Y., Eguchi T., Yamaya T., Sakakibara H. (2003) A new method for enzymatic preparation of isopentenyladenine-type and frww-zeatin-type cytokinins with radioisotope-labeling. J. Plant Res., 116, 259-263.

161. Takei K., Ueda N., Aoki K., Kuromori T., Hirayama T., Shinozaki K., Yamaya T., Sakakibara H. (2004a) AtIPT3 is a key determinant of nitrate-dependent cytokinin biosynthesis in Arabidopsis. Plant Cell Physiol, 45, 1053-1062.

162. Takei K., Yamaya T., Sakakibara H. (2004b) Arabidopsis CYP735A1 and CYP735A2 encode cytokinin hydroxylases that catalyze the biosynthesis of trans-Zeatin. J Biol Chem., 279,41866-41872.

163. Tanaka Y., Suzuki T., Yamashino T., Mizuno T. (2004) Comparative studies of the AHP histidine-containing phosphotransmitters implicated in His-to-Asp phosphorelay in Arabidopsis thaliana. Biosci. Biotechnol. Biochem., 68, 462-465.

164. TanakaY., Sano T., Tamaoki M, Nakajima N., Kondo N., Hasezawa S. (2006) Cytokinin nad auxin inhibit abscisic acid-induced stomatal closure by enhancing ethylene production in Arabidopsis. J. Exp. Bot., 57,2259-2266.

165. Taniguchi M., Sasaki N., Tsuge T., Aoyama T., Oka A. (2007) ARR1 directly activates cytokinin response genes that encode proteins with diverse regulatory functions. Plant Cell Physiol., 48,263-277.

166. To J.P., Haberer G., Ferreira F.J., Deruere J., Mason M.G., Schaller G.E., Alonso J.M., Ecker J.R., Kieber J.J. (2004) Type-A Arabidopsis response regulators are partially redundant negative regulators of cytokinin signaling. Plant Cell., 16, 658671.

167. To J.P., Kieber J.J. (2008) Cytokinin signaling: two-components and more. Trends Plant Sci., 13, 85-92.

168. Tokunaga H., Kojima M., Kuroha T., Ishida T., Sugimoto K., Kiba T., Sakakibara H. (2012) Arabidopsis lonely guy (LOG) multiple mutants reveal a central role of the LOG-dependent pathway in cytokinin activation. Plant J., 69, 355-365.

169. Ueguchi C., Koizumi H., Suzuki T., Mizuno T. (2001a) Novel family of sensor histidine kinase genes in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol., 42,231-235.

170. Ueguchi C., Sato S., Kato T., Tabata S. (2001b) The AHK4 gene involved in the cytokinin-signaling pathway as a direct receptor molecule in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol., 42, 751-755.

171. Urao T., Yakubov B., Satoh R., Yamaguchi-Shinozaki K., Seki M., Hirayama T., Shinozaki K. (1999) A transmembrane hybrid-type histidine kinase in Arabidopsis functions as osmosensor. Plant Cell, 11, 1743-1754.

172. Urao T., Miyata S., Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K. (2000) Characterization of genes for two-component phosphorelay mediators with a single HPt domain in Arabidopsis thaliana. FEBSLett., 478,227-232.

173. Voinnet O., Rivas S., Mestre P., Baulcombe D. (2003) An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the pi 9 protein of tomato bushy stunt virus. Plant J., 33,949-956.

174. Werner T., Motyka V., Strnad M., Schmulling T. (2001) Regulation of plant growth by cytokinin. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 98, 10487-10492.

175. Werner T., Kollmer I., Bartrina I., Hoist K., Schmulling T. (2006) New insights into the biology of cytokinin degradation. Plant Biol, 8, 371-381.

176. Werner T., Hoist K., Pors Y., Guivarc'h A., Mustroph A., Chrique D., Grimm B., Schmulling T. (2008) Cytokinin deficiency causes distinct changes of sink and source parameters in tobacco shoots and roots. J.Exp.Bot., 59,2659-2672.

177. Werner T, Schmulling T. (2009) Cytokinin action in plant development. Curr Opin Plant Biol., 12,527-538.

178. West A.H., Stock A.M. (2001) Histidine kinases and response regulator proteins in two-component signaling systems. Trends Biochem. Sci., 26, 369-376.

179. Wohlbach D.J., Quirino B.F., Sussman M.R. (2008) Analysis of the Arabidopsis Histidine Kinase ATHK1 Reveals a Connection between Vegetative Osmotic Stress Sensing and Seed Maturation. Plant Cell., 20, 1101-1117.

180. Wolanin P.M., Thomason P.A., Stock J.B. (2002) Histidine protein kinases: key signal transducers outside the animal kingdom.Genome Biol., 3, 3013.1-3013.8.

181. Wulfetange K., Lomin S.N., Romanov G.A., Stolz A., Heyl A., Schmulling T.2011b) The cytokinin receptors of Arabidopsis are located mainly to the endoplasmic reticulum. Plant Physiol., 156, 1808-1818.

182. Yonekura-Sakakibara K., Kojima M., Yamaya T., Sakakibara H. (2004) Molecular characterization of cytokinin-responsive histidine kinases in maize. Differential ligand preferences and response to cis-zeatin. Plant Physiol., 134, 16541661.

183. Zalabâk D., Pospisilovâ H., Smehilovâ M., Mrizovâ K., Frébort I., Galuszka

184. P. (2012) Genetic engineering of cytokinin metabolism: Prospective way to improve agricultural traits of crop plants. Biotechnol. Advances, Epub. http://dx.doi.org/10.10167j.biotechadv. 2011.12.003.

185. Zhang Z., Hendrickson W.A. (2010) Structural characterization of the predominant family of histidine kinase sensor domains. J. Mol. Biol., 400,335-353.1. БЛАГОДАРНОСТИ

Информация о работе

Кривошеев, Дмитрий Михайлович
кандидата биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.01.05

Диссертация

Исследование взаимодействия с лигандами цитокининовых рецепторов арабидопсиса и кукурузы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы