Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Лиганд-связывающие свойства и субклеточная локализация цитокининовых рецепторов
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений
Автореферат диссертации по теме "Лиганд-связывающие свойства и субклеточная локализация цитокининовых рецепторов"
На правах рукописи
Ломин Сергей Николаевич
ЛИГАНД-СВЯЗЫВАЮЩИЕ СВОЙСТВА И СУБКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ ЦИТОКИНИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ
03 00 12-физиология и биохимия растений
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степе
С 003170ЭТО
кандидата биологических наук
Москва-2008
003170970
Работа выполнена в лаборатории сигнальных систем контроля онтогенеза им. академика М X Чайлахяна Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН
НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор биологических наук, профессор
Романов Георгий Александрович
ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ доктор биологических наук доктор биологических наук
Клячко Нелла Леопольдовна Патрушев Лев Иванович
ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ
Биологический факультет Московского государственного университета им MB Ломоносова
Защита состоится 17 июня 2008 г. в 11-00 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 002.210 01 при Институте физиологии растений им К А Тимирязева РАН по адресу 127276, Москва, ул Ботаническая, 35. Факс. (495) 977-80-18, e-mail ifr@ippras ru
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Института физиологии растений им. К А. Тимирязева РАН
Автореферат разослан « /Г» мая 2008 г
Ученый секретарь
совета по защите докторских
и кандидатских диссертаций,
кандидат биологических наук
МИ Азаркович
Актуальность проблемы. Анализ механизмов рецепции и трансдукции гормональных сигналов является важным и актуальным направлением исследований гормональной регуляции высших организмов, в том числе растений Среди фитогормонов особое значение имеют цитокинины, которые регулируют метаболизм и деление клеток, а также рост, морфогенез и старение растений Цитокинины представлены in vivo рядом соединений близкой структуры, но с разной биологической активностью Для этого класса фитогормонов в последние годы идентифицированы мембранные рецепторы, гены первичного ответа, основные элементы сигнальной трансдукции и ферменты биосинтеза (обзоры см Романов, 2002, Heyl & Schmulling,
2003, Sakakibara, 2006) Однако многие аспекты молекулярного механизма действия цитокининов еще малоизучены и продолжают активно исследоваться.
У всех изученных растений рецепторы цитокининов представляют собой семейство близкородственных белков - мембранных гистидинкиназ, подобных сенсорным гистидинкиназам одноклеточных организмов Показано, что эти рецепторы могут иметь различное физиологическое значение in planta (Higuchi et al, 2004, Nishimura et al,
2004, Riefler et al, 2006) Одной из важнейших характеристик рецептора является его лигандная специфичность, во многом определяющая режим функционирования рецептора в клетке Также важным фактором реализации действия рецепторов в растении является их субклеточная локализация. Однако эти аспекты системы восприятия цитокининового сигнала клеткой оставались до последнего времени практически не изучены
Цели и задачи исследования. Целью данной работы было изучить лиганд-связывающие свойства индивидуальных рецепторов цитокининов у разных видов растений и субклеточную локализацию рецепторных белков
Для достижения цели были поставлены следующие задачи
изучить лигавд-связывающие свойства индивидуальных цитокининовых рецепторов арабидопсиса и кукурузы, клонированных в Е coli, с помощью радиолигандного метода,
- выяснить, как установленные свойства рецепторов проявляются при передаче цитокининового сигнала на гены первичного ответа m planta,
- исследовать субклеточную локализацию рецепторов в органах растений.
Научная новизна работы. Впервые проведены количественные исследования лиганд-связывающих свойств ряда индивидуальных рецепторов цитокининов арабидопсиса и кукурузы. В ходе работы обнаружено, что рецепторы различаются по своей лигандной специфичности и другим параметрам Эти различия могут быть связаны с физиологической функцией и характером экспрессии рецепторов в растении Обнаружены черты сходства и различия свойств рецепторов цитокининов из разных видов растений
Впервые приведены строгие доказательства того, что цитокинины-производные аденина и цитокинины-производные фенилмочевины связываются с рецепторным белком в одном и том же сайте
Впервые проведен анализ субклеточной локализации рецепторов цитокинина в растении радиолигандным методом и обнаружены рецепторы не только в составе плазмалеммы, но и в составе эндомембран клетки.
Практическое значение работы. Полученные результаты в перспективе могут найти применение в генноинженерной биотехнологии при создании растений с определенными хозяйственно-ценными признаками Предложенный подход для анализа лиганд-связывающих свойств индивидуальных цитокининовых рецепторов, клонированных в Е coli, может быть полезен в работе по изучению свойств других эукариотических мембранных рецепторов Использованная модельная система на основе двойных мутантов арабидопсиса по рецепторам цитокининов является удобным инструментом для исследований функциональных свойств отдельных
цитокининовых рецепторов in planta Данные фундаментального характера о лиганд-связывающих свойствах рецепторов цитокининов могут быть использованы для подготовки лекционного материала при чтении курсов физиологии, биохимии и молекулярной биологии растений в высших учебных заведениях, а также послужить базой для дальнейших исследований в данном направлении
Апробация работы. Основные положения работы доложены на XII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005» (Москва, 2005), Годичном собрании Общества физиологов растений России, Международной конференции «Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия» (Вологда, 2005), VI Международном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пущино, 2005), 9-ой Международной школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2005), Международных конференциях «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2005, 2007), 2nd International symposium «Auxin, Cytokinin and Plant Development» (Прага, Чешская Республика, 2005), Международном симпозиуме «Сигнальные системы клеток растений роль в адаптации и иммунитете» (Казань, 2006); VI Съезде общества физиологов растений России, Международной конференции «Современная физиология растений от молекул до экосистем» (Сыктывкар, 2007), 2nd International symposium «Plant Growth Substances Intracellular Hormonal Signaling and Applying in Agriculture» (Киев, Украина, 2007), V Международной научной конференции «Регуляция роста, развития и продуктивности растений» (Минск, Беларусь, 2007) и других
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 25 печатных работ (еще одна в печати), включая 4 статьи в отечественном и зарубежных рецензируемых журналах
Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения и пяти глав обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, а также заключения, выводов и списка цитируемой литературы Материалы диссертации изложены на
190 страницах машинописного текста, содержат 1 таблицу и рисунков Список литературы включает 2/'2 источник 0 é, из которых зарубежной литературы -
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Особенности экспериментальных моделей. Основные эксперименты проведены на следующих модельных системах растительной на основе трансгенного арабидопсиса, и бактериальной, на основе трансформированной Е coli Эти системы дают четкую, быструю и специфическую реакцию на воздействие цитокининов и основаны на индукции экспрессии цитокинин-зависимых генов и/или трансгенов Для получения препаратов мембран использовали также корни и листья растений кукурузы
Модельные системы на основе трансгенного арабидопсиса. Проростки трансгенного Parrs GUS арабидопсиса содержали репортерный ген GUS под контролем цитокинин-зависимого промотора гена ARR5 (предоставлены J J. Kleber, США) Эти проростки реагируют на цитокинин активацией экспрессии репортерного гена, что позволяет количественно следить за гормональной индукцией экспрессии генов (D'Agostino et al, 2000, Romanov et al, 2002) Время инкубации проростков с гормоном составляло 5 часов
Помимо удобства работы с репортерным ферментом тест-система трансгенного арабидопсиса позволяет оценивать эффект цитокининов и по содержанию транскриптов индивидуальных (транс)генов первичного ответа, таких, как ARR5 или GUS Время инкубации с гормоном в этом случае сокращается до 30-40 минут.
Также в работе использовали двойные мутанты арабидопсиса, экспрессирующие один из трех рецепторов цитокининов и несущие конструкцию VARR5 GUS (предоставлены Т Schmulling, ФРГ), что дало возможность оценивать работу индивидуальных рецепторов m planta Эти мутанты по цитокининовым рецепторам были использованы и для анализа субклеточной локализации рецепторов
Модельные системы на основе трансгенной Е. coli. Для
изучения взаимодействия рецепторов цитокининов с веществами, обладающими цитокининовой активностью, требовалась модель, содержащая не всю группу рецепторов, а отдельный тип цитокининового рецептора Такой моделью послужили бактерии Е coli, штамм KMI001, трансформированные плазмидами pIN-III-AHK4, pSTV28-AHK3, pIN-III-ZmHKl, pIN-III-ZmHK2, pIN-III-ZmHK3a, экспрессирующими гены рецепторов цитокининов арабидопсиса AHK4/CRE1, АНКЗ (Suzuki et al, 2001) и кукурузы ZmllKl, ZmHK2, ZmHK3a (предоставлены T Mizuno и Н Sakakibara, Япония), соответственно У данного штамма Е coli рецепторы цитокининов замещают близкую по структуре сенсорную гистидинкиназу бактерии RcsC, инактивированную мутацией, и проявляют цитокинин-зависимую функциональную активность (Suzuki et al, 2001, Spichal et al, 2004, Yonekura-Sakakibara et al, 2004) Бактериальная хромосома содержала также репортерный ген lacZ (кодирующий /?-галактозидазу) под cps-промотором, восприимчивый к сигналу от RcsC (Yamada et al, 2001)
Дополнительно в работе использовали бактерии штамма BL21DE3pLys, трансформированные плазмидами pDONR211, экспрессирующими CHASE-домены или мутантные по CHASE-домену рецепторы AHK4/CRE1 (Heyl et al, 2007)
Анализ характеристик взаимодействия гормонов с рецепторами проводили с использованием живых трансгенных бактерий, на основе разработанного варианта радиолигандного метода На графиках ерш и dpm означают имп/мин и расп/мин, соответственно
Мембранные фракции получали путем
ультрацентрифугирования очищенных гомогенатов растительных тканей и разделяли в смеси (1 1, w/w) декстрана Т500 и полиэтиленгликоля 3350 (Sigma), которые при концентрации 6 2% (w/w) образуют две фазы
Активность репортерных ферментов GUS и lacZ определяли количественно флуоресцентным методом (Зверева & Романов, 2000, Spichal et al, 2004)
РЕЗУЛЬТАТЫ
I. Лиганд-связывшощие свойства рецепторов цитокининов
Исследование взаимодействия мембранного рецептора с лигандами обычно проводится на препаратах очищенных мембран, содержащих данный рецептор. Чтобы избежать долгих и затратных процедур, необходимых для получения указанных мембранных препаратов, мы предложили модификацию радиолигандного метода, позволяющую изучать связывание прямо на интактных трансгенных бактериях, экспрессирующих эукариотический белок-рецептор. В качестве радиоактивного лиганда использовали [2-3Н]отранозеатин (-600 ГБк/ммоль), высокомеченый аналог активного природного цитокинина. Клоны, экспрессирующие рецепторы цитокининов, были способны специфически связывать гормон, тогда как клоны, несущие пустую плазмиду, проявляли только неспецифическое связывание (рис. 1)-
АНК4-КЛОНЫ АНКЗ-клоны pIN III-кпоны
контроль
Рис. 1. Связывание [3Н]нг/«шс-зеатина с трансгенной Е. coli, экснрессирующей рецепторы цитокинина АНК4 или АНКЗ. ТВ - тотальное связывание, NS - неспецифическое связывание, Bs - специфическое связывание
Мы провели конкурентные опыты с немечеными лигандами на бактериальных клонах, экспрессирующих рецепторы AHK4/CRE1 или АНКЗ. Среди широкого спектра различных регуляторов только цитокинин (транс-зеатин) вытеснял связанную метку (рис. 2). Следовательно, экспрессируемые в Е. coli растительные рецепторы связывают цитокинин специфично.
Рис. 2. Вытеснение меченого цитокинина из комплекса с рецептором различными немечеными веществами-регуляторами.
- транс-зеатш, ИУК -индолилуксусная кислота, 2,4-0
- 2,4-дихлорофенокси уксусная кислота, АБК - абсцизовая кислота, ГК - гиббереллины, цАМФ - циклический аденозинмонофосфат. Концентрация спермина
- 17.3 мкМ, всех остальных веществ - 8.6 мкМ.
|-0 От ЧЛ^Спер^гр
Корректность метода была дополнительно проверена путем сравнения результатов конкурентных опытов, выполненных с мембранами традиционным способом и непосредственно с интактными бактериями. Картины вытеснения оказались сходными, что подтвердило адекватность предложенного подхода для поставленных задач.
Важным параметром гормон-рецепторного взаимодействия является сродство рецептора к гормону, которое характеризуется константой диссоциации комплекса. Для определения констант диссоциации получали концентрационные зависимости связывания меченого транс-зеатина, либо концентрационные зависимости
вытеснения меченого гормона немеченым Результаты представляли в координатах Скэтчарда (рис 3) и по тангенсу угла наклона получаемых прямых определяли константы диссоциации.
Рис. 3. Примеры определения констант диссоциации рецепторов цитокининов к /ярянс-зеатину методом Скэтчарда. и - несвязанный гормон, В5 -специфично связанный гормон
В целом, константы диссоциации находятся в пределах, характерных для гормон-рецепторного связывания (10'7-10"12 М) Усредненная АГВ для АНКЗ соответствовала 1 3 нМ, для АНК4/СШ31 -3 9 нМ Клонированные СНАБЕ-домены рецептора, которым отводится роль узнавания и связывания гормона, были способны связывать транс-зеатин с высоким сродством, близким к таковому у полноразмерных рецепторов Рецепторы кукурузы также проявили высокое сродство к транс-зеатину. Константа диссоциации для рецептора гтНК2 составляла 1 2 нМ, для гтНКЗа -70 нМ Рецептор кукурузы гшНК1 имел самое низкое сродство к транс-зеатину (83 нМ) среди всех
изученных рецепторов, однако и это значение находилось в пределах, соответствующих гормон-рецепторному взаимодействию.
Представление данных по связыванию в координатах Хилла и Бьеррума показало, что связывание происходит некооперативно по простому механизму, а сайты связывания каждого из рецепторов гомогенны
Мы изучили лигандную специфичность цитокининовых рецепторов арабидопсиса и кукурузы Для этого проводили эксперименты по вытеснению меченого трапе-зеатина различными немечеными цитокининами и их производными Конкурентная активность лиганда позволяет судить о его сродстве к рецептору В целом, для рецепторов арабидопсиса лигандная специфичность оказалась сходной, ряды активности для АНКЗ и AHK4/CRE1 выглядят как
АНКЗ fZ>TD>iZR>DZ>iP>cZ>BA>iPR>AcZ>Ade>/ZOG
AHK4/CRE1 fZ>iP>TD~/ZR>iPR>BA>DZ>cZ>AcZ>Ade>rZOG (iZ - mpanc-iaxi hh,TD - тидиазурон, iZR - тракс-зеатинрибозид, DZ -дигидрозеатин, lP - изопентениладенин, cZ - г^ис-зеатин, BA - бензиладенин, lPR -изопентениладенинрибозид, AcZ - mpawc-зеатин-О-ацетил, Ade - аденин, iZOG -пг/мнс-зеатин-О-глюкозид)
Существенной разницы между полноразмерным рецептором AHK4/CRE1 и его изолированным CHASE-доменом не наблюдалось, что указывает на консервативность этой характеристики рецепторных белков При этом для отдельных гормонов наблюдались существенные различия сродства к рецепторам Так, изопентениладенин вытеснял метку гораздо более эффективно в случае рецептора AHK4/CRE1, чем в случае рецептора АНКЗ Дигидрозеатин, наоборот, гораздо более эффективно связывался рецептором АНКЗ (рис 4). АНК2 (CHASE-домен), как и AHK4/CRE1, активно связывал изопентениладенин
Концентрация цитокинина, нМ
Рис. 4. Цитокининовые рецепторы арабидопсиса АНЮ и АНК4/СЯЕ1 различаются по лигандной специфичности, й - транс-зеатш, 1Р -изопентениладенин, Т>1 - дигидрозеатин
Аналогично были протестированы рецепторы кукурузы Ряды активности для рецепторов кукурузы выглядят как
2лШЛ, ортолог АНК4/СИЕ1, предпочитал изопентениладенин, в то время как 2т11К2, ортолог АНКЗ, наоборот, эффективно связывал транс-зеатин, но гораздо слабее другие цитокинины (рис 5) Особенностью 2тНК1 было эффективное связывание бензиладенина, а также отсутствие заметной разницы по взаимодействию с транс- и цис-формами зеатина Рецептор 7тНКЗа, так же как и 2шНК1, предпочитал изопентениладенин. Таким образом, у филогенетически далеких видов растений проявляются определенные закономерности лигандной специфичности цитокининовых рецепторов Рецепторы можно подразделить на две группы (таблица)' предпочитающие (АНК4/СЯЕ1 и гшНК1) или слабо связывающие изопентениладенин (АНКЗ и 2шНК2) По данным литературы, рецепторы первой группы экспрессируются преимущественно в корне, тогда как рецепторы второй группы - в листе
Концентрация цитокинина, мкМ
Рис. 5. Цитокининовые рецепторы кукурузы ZmHKl и ZmHK2 различаются по лигандной специфичности. tZ - транс-зеатн, iP -изопентениладенин, cZ - цис-зеатин, ВА - бензиладенин
Важно было проверить, проявляется ли выявленная на бактериальной модели разница в лигандной специфичности в способности рецепторов избирательно реагировать на различные цитокинины m planta. Мы провели серию экспериментов на двойных
Таблица Сродство рецепторов цитокининов арабидопсиса и кукурузы к tZ и iP
Рецептор KD
tz iP
АНЮ 1.3 нМ 150 нМ
AHK4/CRE1 3.9 нМ 17 нМ
ZmHKl 83 нМ 5 нМ
ZmHK2 1.2 нМ 120 нМ
мутантах арабидопсиса по рецепторам цитокининов Так как у арабидопсиса имеется три рецептора цитокинина, то при инактивации двух из них в растении остается функционировать только один рецептор и появляется возможность изучать индивидуальные рецепторы хп planta
Для удобства эти мутанты названы здесь по тому рецептору, который в них экспрессируется Дополнительно мутанты имели генетическую конструкцию репортерного гена GUS под промотором гена первичного ответа на цитокинин ARR5. В ответ на цитокинин промотор активируется, и по активности GUS можно судить о работе цитокининового рецептора В этих экспериментах были испытаны два цитокинина транс-зе&тш и изопентениладенин В случае клона AHK4/CRE1 оба цитокинина действовали одинаково эффективно, сходство активностей отмечено и для клона АНК2, но в случае клона АНКЗ изопентениладенин активировал экспрессию гена ?arrs GUS гораздо менее эффективно, чем транс-зезлт (рис 6) Таким образом, результаты экспериментов in planta качественно согласуются с данными по связыванию, полученными на бактериях
Концентрация цитокинина, мкМ
Рис. 6. Активация цитокинин-чувствительного трансгена Рarrs GUS в двойных мутантах арабидопсиса по рецепторам цитокининов под действием /ирвнс-зеатина и изопентениладенина. tZ - mpatic-izmwtt, iP -изопентениладенин
Помимо цитокининов-производных аденина, известны синтетические производные фенилмочевины, такие, как тидиазурон (рис 7), действующие на растения подобно цитокининам Тидиазурон был испытан ранее в бактериальных тестах на индукцию активности репортерного трансгена (Spichal et al, 2004) и в наших опытах по вытеснению меченого транс-зеатина В обоих случаях тидиазурон проявил себя как сильный цитокинин
В связи с тем, что тидиазурон имеет иное строение по сравнению с цитокининами-производными аденина, оставалось неясным, связываются ли оба типа гормонов с одним сайтом на рецепторе или эти сайты различны Для ответа на этот вопрос мы получили концентрационную зависимость связывания меченого транс-зеатина рецептором (АНКЗ или АНК4/СКЕ1) в отсутствие и в присутствии фиксированной концентрации тидиазурона Данные представлены в виде линейных зависимостей в двойных обратных координатах (рис 7). На графиках видно, что прямые пересекаются практически на оси ординат. Это означает, что гормоны связываются с рецептором в одном и том же сайте.
1400 ~~ 1200
носи
г=сх си. Чгпг-М'
/
транс-зеатин
ОЧ-^-::
тидиазурон
0,0 0,5 1,0 1,5 2 0 Концентрация [3Н]транс-зеатина1, нМ 1 Рис. 7. Идентификация сайта связывания тидиазурона. Данные по связывапшо представлепы в двойных обратных координатах. Черные кружки -эксперимент без тидиазурона, белые кружки - эксперимент с 36 нМ тидиазурона
Мы исследовали влияние некоторых физико-химических факторов на связывание цитокинина рецепторами. Одним из важнейших факторов
клеточного метаболизма является рН среды Выяснилось, что рН (в интервале 5-9) неодинаково влияет на взаимодействие разных рецепторов с гормоном (рис 8) Можно разделить рецепторы на две условные группы те, на которые изменение рН оказывает слабое влияние (АНК4/СКЕ1, его СНАБЕ-домен и 2шНК2), и те, на которые изменение рН оказывает сильное влияние (АНКЗ, СНАБЕ-домен АНК2 и ZmHKl) Интересно, что минимум связывания рН-зависимых рецепторов находился при рН 5 С учетом того, что кислый рН свойственен наружной стороне плазмалеммы, можно предположить, что некоторые цитокининовые рецепторы могут функционировать на внутренних мембранах клетки
с!ртх 10' 25,0
V
МЕС
-О— Трис
7 8 9 10
рЫ
Рис. 8. рН-зависимости связывания транс-зеатяна с различными рецепторами
II. Субклеточная локализация рецепторов цитокининов
Для выяснения субклеточной локализации рецепторов был проведен анализ их присутствия на плазматической и внутренних мембранах радиолигандным методом Мембранные фракции разделяли с помощью водной полимерной двухфазной системы в смеси декстрана Т500 и полиэтиленгликоля 3350 После первого разделения мембраны еще дважды очищали путем повторных разделений в такой же смеси Микросомы плазматической мембраны накапливались в верхней
полиэтиленгликолевой фазе, а микросомы других мембран - в нижней декстрановой. Чистоту мембранных фракций тестировали различными методами: с помощью определения активности ферментов-маркеров мембран (рис. 9) и Вестерн-блотинга белков-маркеров мембранных фракций. Результаты тестирования подтвердили то, что верхняя фаза (Ш) обогащена плазматической мембраной, а нижняя фаза (ЬЗ) -внутренними мембранами.
Рис. 9. Тестирование качества разделения мембранных фракций из побегов мутанта арабидопсиса аИк2-5/сге1-2 с помощью определения активности маркерных ферментов
В опытах по связыванию меченого транс-зеатина было установлено, что очищенные мембранные фракции способны специфически связывать цитокинин. Хотя высокоаффинное связывание гормона мембранами было существенно ниже высокоаффинного связывания гормона трансформированными бактериями, это мембранное связывание было достаточным для количественных определений.
Мы проанализировали связывание транс-зеатина с мембранными фракциями из двойного мутанта арабидопсиса, экспрессирующего только рецептор АНКЗ. Специфическое связывание присутствовало в обеих мембранных фракциях с некоторым преимуществом внутренних мембран (рис. 10). С учетом того, что внутренних мембран в клетке, по крайней мере, в 20 раз больше, чем плазмалеммы, большая часть рецепторов АНКЗ должна находиться на внутренних мембранах.
га т.
ь ■■ из (ПМ)
^ 250 - 1233 13 (ВМ)
из (ПМ)
Рис. 10. Анализ
субклеточной
локализации
рецептора АНКЗ по
связыванию
[3Н]/я/м/(с-зеатина
мембранными
фракциями.
ПМ -плазматическая
мембрана,
ВМ - внутренние
мембраны.
Опыт 1
Опыт 2
Аналогичные опыты с мембранами кукурузы указывают на присутствие цитокининовых рецепторов как на плазмалемме, так и на внутренних мембранах. При этом в листьях содержание рецептора (предположительно 2тНК2, см. далее) существенно выше на плазматической мембране (рис. 11). Не исключено, что в этом случае рецепторы цитокининов находятся в основном на плазмалемме.
Мутантов кукурузы по цитокининовым рецепторам пока не получено, поэтому мембраны из растений кукурузы могли содержать цитокининовые рецепторы разных типов. Однако важно было оценить, какие именно рецепторы превалируют на тех или иных фракциях мембран. Поэтому мы решили проанализировать те лиганд-связывающие свойства мембранных препаратов, по которым индивидуальные рецепторы кукурузы проявляли наибольшие различия. Попытка использовать различия в рН-зависимости связывания не дала положительных результатов, т.к. зависимости связывания гормона мембранами от рН сильно отличались от аналогичных зависимостей, полученных на бактериях. Видимо, этот признак достаточно лабилен и во многом зависит от липидного окружения рецептора.
Цитокининовые рецепторы кукурузы существенно различаются по лигандной специфичности связывания, причем этот признак
га х
15
Н
го 03 т
го го ц
о. (в
£ ю
1000
800
а> о з: о
I Ч-
ш с т с п о-
=г а>
и
600
400
200
Корни Листья
Рис. 11. Уровень связывания цитокинина с мембранными фракциями из корней и листьев кукурузы. ПМ - плазматическая мембрана, ВМ - внутренние мембраны.
ПМ
ВМ
представляется достаточно стабильным. В частности, сильные различия отмечены для бензиладенина. Он активно связывается с рецептором 2тНК1, но слабо - с рецептором 7тНК2. Мы протестировали (конкурентным методом) интенсивность связывания бензиладенина и транс-зеатина с мембранными фракциями из листьев и корней кукурузы. Оказалось, что мембранные фракции из листьев связывают бензиладенин относительно слабее, чем мембранные фракции из корней (рис. 12). Особенности лигандной специфичности мембранных фракций из листьев могут объясняться доминированием рецептора ZmШL2, тогда как фракции из корней, по всей видимости, включают смесь рецепторов в сравнимых пропорциях. Из литературы известно (Уопекига-БакаклЬага ег а1., 2004), что в корне уровень экспрессии генов 2тНК1 и 2тНК2 примерно одинаковый, в то время как в листе уровень экспрессии '¿тНК2 по крайней мере в 2 раза выше уровня экспрессии 2тНК1. Эти данные хорошо согласуются с нашими результатами по связыванию (рис. 12).
Известно (вакаЫЬага, 2006), что транс-зеатин и его рибозид синтезируются в главным образом в корне и затем по ксилеме транспортируются в побег, тогда как в побеге синтезируются в основном
Концентрация цитокинина, мкМ Концентрация цитокинина, мкМ
Рис. 12. Лигандная специфичность мембранных фракций из корней и листьев кукурузы. # - транс-зеатн, ВА - бензиладенин
изопентениладенин и его рибозид, которые по флоэме распространяются по всему растению В последнее время было установлено, что рецепторы цитокининов экспрессируются по-разному и выполняют разные физиологические функции в растении У арабидопсиса, к примеру, рецептор АНКЗ в большей степени экспрессируется в побеге и отвечает за «листовые» эффекты цитокининов (рост и старение листьев, формирование хлоропластов и др), тогда как рецептор АНК4/СИЕ1 превалирует в корне и отвечает за действие цитокининов на корень (ингибирование скорости его роста и образования боковых корней) Наши данные о присутствии специфических цитокинин-связывающих сайтов на препаратах мембран подтвердили представления о различиях в составе рецепторного аппарата из разных органов (корни, листья) растений Так, у кукурузы лиганд-связывающие свойства мембран свидетельствуют о доминировании рецептора Zm}íK2 (ортолога АНКЗ) в листьях, но не в корнях растений Важным фактом является
обнаружение в наших исследованиях различий в лигандной специфичности связывания между индивидуальными рецепторами цитокининов, в первую очередь по взаимодействию с зеатиновыми и изопентенильными формами цитокининов Анализ индивидуальных рецепторов арабидопсиса и кукурузы выявил определенные общие закономерности, в частности относительно низкое сродство изопентенильных форм цитокининов к «листовым» рецепторам и достаточно высокое - к «корневым» рецепторам Особенно ярко эти различия проявились для рецепторов кукурузы ZmHKl («корневого») и ZmHK2 («листового») (рис 5, табл)
На основе вышеприведенных фактов и данных литературы можно предложить следующую модель участия цитокининов в межорганном информационном обмене Транс-зеатш и его рибозид синтезируются в корне, затем по ксилеме транспортируются в побег и здесь взаимодействуют с «листовыми» рецепторами (АНКЗ арабидопсиса или ZmHK2 кукурузы), «настроенными» на восприятие именно транс-зеатина В побеге, в свою очередь, синтезируются изопентениладенин и его рибозид, они транспортируются далее по флоэме по всему растению На побег (листья) изопентенильные цитокинины действуют слабо, т к. «листовые» рецепторы малочувствительны к этим формам цитокининов Зато в корне изопентенильные цитокинины активно взаимодействуют с «корневыми» рецепторами (АНК4/С11Е1 арабидопсиса и 2тНК1 кукурузы), высокочувствительными к изопентениладенину Так может осуществляться обмен сигналами между корнем и побегом с участием разных форм цитокининов. Корни, в частности, могут таким способом сигнализировать побегу о благоприятных условиях произрастания и наличии необходимых питательных элементов Поступающие наверх по ксилеме «корневые» цитокинины зеатинового типа передают сигнал для активации роста и жизнедеятельности побега То, что рецепторы могут находиться как на плазматической, так и на внутренних мембранах, может являться механизмом, предотвращающим взаимодействие с гормонами, синтезируемыми в той же самой клетке, или связанным с особенностями межклеточного транспорта цитокининов
выводы
1 Предложен и прошел успешные испытания количественный метод исследования гормон-связывающих свойств цитокининовых рецепторов с использованием интактных трансгенных бактерий, экспрессирующих функционально активный рецепторный белок или его гормон-связывающий домен
2 Экспрессируемые в бактериях цитокининовые рецепторы связывают транс-зеатин и другие активные цитокинины высокоаффинно, специфично и некооперативно Рассчитаны константы связывания цитокининов с рецепторами, значения KD для транс-зеатина находятся в наномолярном диапазоне Цитокинины-производные фенилмочевины связываются с рецептором в том же сайте, что и природные цитокинины-производные аденина
3 Цитокининовые рецепторы арабидопсиса и кукурузы проявляют черты сходства в лигандной специфичности, при этом рецептор кукурузы ZmHKl отличается сравнительно низким сродством к транс-зеатину и относительно высоким - к г/ис-зеатину
4. Цитокининовые рецепторы различаются по лигандной специфичности. В частности, «листовые» рецепторы АНКЗ и ZmHK2 имеют низкое сродство к изопентенильным формам цитокининов, а «корневые» рецепторы AHK4/CRE1 и ZmHKl - высокое Соответствующие различия проявляются также in planta у двойных мутантов арабидопсиса, экспрессирующих один из трех рецепторов цитокининов
5 В модельной системе установлено различие цитокининовых рецепторов по рН-зависимости связывания цитокинина У рН-зависимых рецепторов (АНКЗ, АНК2-СНА8Е-домен и ZmHKl) максимальное связывание гормона происходит в щелочной области рН, а минимальное - в кислой (рН 5)
6 В очищенных мембранных препаратах из арабидопсиса и кукурузы выявлены сайты специфического связывания транс-зеатина с помощью радиолигандного метода Это связывание высокоаффинно и характеризуется рН-зависимостью и лигандной специфичностью
7 Высокоаффинные сайты находятся как на плазмалемме, так и на внутренних мембранах клеток Гормон-связывающие свойства мембран различаются в зависимости от источника их получения.
8 Полученные данные позволили обосновать гипотезу о роли функциональных различий цитокининовых рецепторов при дальнедистанционной гормональной коммуникации между корнем и побегом растений В результате стал более понятным биологический смысл существования разных форм цитокининов и их рецепторов в растении.
Список работ, опубликованных по теме диссертации:
1 Romanov G А , Spichal L , Lomin S N, Strnad M , Schmulling Т. A live cell hormone-binding assay on transgenic bacteria expressing a eukaryotic receptor protein Analytical Biochemistry, 2005, V 347, pp 129134
2 Romanov G A, Lomin S N, Schmulling T Biochemical characteristics and ligand-binding properties of Arabidopsis cytokinin receptor AHK3 compared to CRE1/AHK4 as revealed by a direct binding assay. Journal of Experimental Botany, 2006, V 57, pp 4051-4058
3. Ломин CH, Романов ГА. Анализ гормон-рецепторного взаимодействия Теоретические и практические аспекты Физиология растений, 2008, Т. 55, № 2, стр 283-299
4 Romanov G А, Lomin S N, Rakova N Y , Heyl A , Schmulling T Does NO play a role in cytokinin signal transduction9 FEBS Lett, 2008, V 582, pp 874-80
5 Ломин С H, Романов Г А Изучение молекулярных аспектов синтеза амарантина // VI Международный симпозиум «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования», 13-16 июня 2005 г Пущино // Москва, 2005, материалы симпозиума, Т И, стр 122-125
6 Ломин С Н, Ракова Н Ю , Романов Г А Трансгенный арабидопсис как модель для изучения ранних эффектов цитокинина //
Международный симпозиум «Физиология трансгенного растения и
проблемы биобезопасности», Москва, 29 ноября - 3 декабря 2004,
тезисы докладов, стр 50
7 Ломин С H., Шмюллинг Т, Романов Г.А. Изучение физико-химических свойств рецепторов цитокининов АНКЗ, АНК4 на модели трансгенной Е coli II XII Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2005», Москва, 12-15 апреля 2005 г , секция биология, тезисы докладов, стр. 136-137.
8 Романов Г А , Ломин С H Фосфолипаза Д - возможный участник трансдукции цитокининового и светового сигналов у растений // Годичное собрание Общества физиологов растений России, Международная конференция «Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия», Вологда, 19-23 сентября 2005 г, тезисы докладов, стр 149.
9 Ломин СН, Романов Г.А Изучение регуляции экспрессии гена первичного ответа на цитокинин ARR5 с помощью кинетико-ингибиторного анализа // 9-я Международная школа-конференция молодых учёных «Биология - наука XXI века», Пущино, 18-22 апреля 2005 г, сборник тезисов, стр 38
10 Романов Г А , Ломин С H, Шмюллинг Т Гормон-связывающие характеристики цитокининовых рецепторов арабидопсиса И Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино, 6-9 июня 2005 г, материалы конференции, стр 380-381
11 Ломин С H, Романов Г А Кинетико-ингибиторный анализ в исследовании гормонально-индуцированной экспрессии генов // Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино, 6-9 июня 2005 г., материалы конференции, стр 408-411.
12. Romanov GA, Spichal L, Lomin SN, Stmad M, Schmulhng T. Ligand specificity of cytokimn receptors from Arabidopsis, Biologia Plantarum, 2005, V 49 Suppl., «2-nd International symposium «Auxin, Cytokmin and Plant Development», Prague, Czech Republic, July 7-12,2005, Abstracts, pp S19
13 Ломин С H, Болякина Ю П, Гетман И А , Ракова Н.Ю , Мартинец Я., Романов Г А Анализ участия «не-канонических» интермедиатов в цитокининовом сигналинге // 2-ой Международный симпозиум «Сигнальные системы растений, роль в адаптации и иммунитете», Казань, 27-30 июня 2006 г, тезисы докладов, стр 193-194
14 Ломин СН, Куликова ВВ, Карпова ГМ, Рифлер М, Романов ГА Первичный ответ цитокининов усиливается диметилсульфоксидом // Международный симпозиум «Рецепция и внутриклеточная
сигнализация», Пущино, 5-7 июня 2007 г, материалы конференции, стр 322-324
15. Kulikova VV, Bolyakina YuP, Lomin SN. Dimethylsulfoxide selectively strengthens the cytokimn action in Arabidopsis И Second international symposium «Plant Growth Substances Intracellular Hormonal Signaling and Applying in Agriculture», Kiev, Ukraine, 8-12 October, 2007, Abstracts, pp. 51
16 Lomin SN., Sakakibara H, Romanov GA Two maize cytokmin receptors, ZmHKl and ZmHK2, have different ligand-binding properties // Second international symposium «Plant Growth Substances Intracellular Hormonal Signaling and Applying in Agriculture», Kiev, Ukraine, 8-12 October, 2007, Abstracts, pp 52
17 Болякина Ю П, Куликова В В , Ломин С Н., Романов Г А Влияние диметидсульфоксида на первичные эффекты цитокинина на трансгенных линиях арабидопсиса, дефектных по двум из трех рецепторов цитокининов // V Международная научная конференция «Регуляция роста, развития и продуктивности растений», Минск, Беларусь, 28-30 ноября 2007 г, материалы конференции, стр 26
18 Болякина Ю П , Куликова В В , Ломин С Н, Романов Г А Специфичность влияния диметилсульфоксида на первичные эффекты цитокинина у трансгенных линий арабидопсиса, дефектных по двум из трех рецепторов цитокининов // 2-й Всероссийский симпозиум «Физиология трансгенного растения и проблемы биобезопасности», Москва, 22-25 декабря 2007 г, тезисы докладов, стр 21
19. Карпова Г.М, Ломин СН, Рифлер М, Романов ГА Изучение роли фосфолипаз в передаче сигнала цитокининов при использовании трансгенных растений арабидопсиса // 2-й Всероссийский симпозиум «Физиология трансгенного растения и проблемы биобезопасности», Москва, 22-25 декабря 2007 г, тезисы докладов, стр. 45
20 Юдина А В , Ломин С Н, Рифлер М., Романов Г А Использование трансгенных растений Arabidopsis lhahana для определения влияния компонентов среды выращивания на чувствительность к цитокининам // 2-й Всероссийский симпозиум «Физиология трансгенного растения и проблемы биобезопасности», Москва, 22-25 декабря 2007 г, тезисы докладов, стр 91
21 Карпова Г.М , Ломин С.Н , Рифлер М , Романов Г А Фосфолипазы С и Д - возможные участники трансдукции сигнала цитокининов // VI Съезд общества физиологов растений России и Международная конференция «Современная физиология растений от молекул до
экосистем», Сыктывкар, 18-24 июня 2007 г, материалы Съезда, стр 291292
22 Ломин С.Н., Куликова В.В , Карпова Г M, Рифлер M, Романов Г.А Диметилсульфоксид избирательно усиливает эффект цитокининов in planta H VI Съезд общества физиологов растений России и Международная конференция «Современная физиология растений: от молекул до экосистем», Сыктывкар, 18-24 июня 2007 г, материалы Съезда, стр 316-317
23 Юдина А В , Ломин С H, Рифлер M , Романов Г А Влияние условий выращивания двойных мутантов Arabidopsis thaliana по цитокининовым рецепторам на цитокининовую чувствительность растений // VI Съезд общества физиологов растений России и Международная конференция «Современная физиология растений от молекул до экосистем», Сыктывкар, 18-24 июня 2007 г, материалы Съезда, стр 398-399
24. Ломин С.Н Цитокинины - производные фенилмочевины -связываются с одним и тем же сайтом рецепторного белка // VI Съезд общества физиологов растений России и Международная конференция «Современная физиология растений, от молекул до экосистем», Сыктывкар, 18-24 июня 2007 г, материалы Съезда, стр 318-319
25. Ломин С Н., Йонекура-Сакакибара К, Сакакибара X, Романов Г А. Кукурузные рецепторы цитокининов имеют различные лиганд-связывающие свойства II IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 11-15 мая 2008 г, материалы Съезда, стр 174.
26 Romanov G А , Lomin S.N Hormone-binding assay using living bacteria expressing eukaryotic receptors, Methods m Molecular Biology, Plant Hormone Protocols (2nd Ed ), Humana Press, Totowa, USA, 2008 (принято в печать)
Подписано в печать 12 05 2008 г Печать трафаретная
Заказ №386 Тираж 130 экз
Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56, (499) 788-78-56 www autoreferat ru
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ломин, Сергей Николаевич
Список условных сокращений
Введение
Обзор литературы
1. Цитокинины
1.1 Химическая структура цитокининовИ
1.2 Функциональная активность цитокининов
1.3 Действие цитокининов на ткани и органы растения■
1.4 Действие цитокининов на клеточном уровне
2. Метаболизм цитокининов
2.1 Изопентенилтрансферазы
2.2 Синтез mpcmc-зеатина
2.3 Активация цитокининов
2.4 Инактивация цитокининов. Образование конъюгатов
2.5 Катаболизм цитокининов. Цитокининоксидазы
3. Транспорт цитокининов
4. Передача цитокининового сигнала
4.1 Двухкомпонентные системы передачи сигнала
4.2 Рецепторы цитокининов
4.3 Трансдукция сигнала
4.3.1 Факторы-фосфотрансмитгеры.•
4.3.2 Регуляторы ответа В-типа
4.3.3 Транскрипционные факторы CRF
4.4 Гены первичного ответа на цитокинин
4.4.1 Регуляторы ответа А-типа
4.4.2 Другие гены первичного ответа на цитокинин
4.5 Возможное участие эукариотических компонентов в передаче сигнала цитокинина
4.5.1 Фосфолипазы С и D
4.5.2 Участие кальция в передаче сигнала
4.5.3 Участие N0 в передаче сигнала
5. Теоретические основы изучения гормон-рецепторного взаимодействия
5.1 Теоретические основы определения аффинности и концентрации рецепторов
5.2 Радиолигандный метод
5.3 Взаимодействие нескольких лигандов с одним сайтом. Конкурентное связывание
5.4 Более сложные варианты взаимодействия гормона с рецепторами
Материалы и методы
1. Реактивы
2. Модельные системы
2.1 Модельные системы на основе Е. coli
2.2 Модельные системы на основе трансгенного арабидопсиса
6.3.3 Определение активности пирофосфатазы (маркера вакуоли) 7. Вестерн-блотинг
2.3 Модельная система на основе амаранта
2.4 Модельная система на основе кукурузы
3. Радиолигандный метод
3.1 Метод анализа связывания гормона с живыми клетками
3.2 Метод анализа связывания гормона с мембранами растительных клеток
4. Анализ состава цитокининов методом тонкослойной хроматографии
5. Анализ активности репортерных генов
5.1 Анализ активности (З-глюкуронидазы (GUS) флюориметрическим способом
5.2 Анализ активности галактозидазы (LacZ) флюориметрическим способом
5.3 Анализ активности галактозидазы (LacZ) в колониях трансгенных бактерий после индукции цитокининами
6. Выделение мембран растительных клеток
6.1 Выделение микросомальной фракции для анализа активности фосфолипаз D
6.2 Выделение мембран растительных клеток в водной двухфазной системе
6.3 Определение активности маркерных ферментов растительных мембран
6.3.1 Определение активности H*-A ТФазы плазмалеммы
6.3.2 Определение активности антимицин А-нечувствительной NAD(P)H-зависимой цитохром с редуктазы (маркер эндоплазматического ретикулума)
8. Нозерн-блотинг
9. Выделение ДНК из растений
9.1 Метод Dellaporta et al.,
9.2 СТАВ-метод
10. Выделение РНК из растений
10.1 Выделение РНК с TRIzoI-om
11. Анализ инсерционных мутантов с помощью PCRЮ
12. Биотест по влиянию цитокининов на рост корнейЮ
13. Фармакологический анализ
13.1 Эксперименты с арабидопсисом
1.3.5 Определение сайта связывания тидиазурона
1.4 Лиганд-связывающие свойства рецепторов кукурузы ZmHKl, ZmHK2, ZmHK3a
13.2 Эксперименты с амарантом I®
14. Анализ активности различных типов фосфолипаз D in vitro
14.1 Анализ активности PLD^
14.2 Анализ активности PLDp и у
14.3 Анализ активности PLD6 Ю
Результаты и обсуждение
1. Лиганд-связывающие свойства рецепторов цитокининов
1.1 Способность различных цитокининов активировать ген cpswLacZ в E.'coli, экспрессирующей рецепторы ZmHKl и ZmHK
1.2 Алгоритм исследований по изучению лиганд-связыващих свойств рецепторов
1.3 Лигандная специфичность рецепторов арабидопсиса AHK4/CRE1, АНКЗ, АНК
1.3.1 Специфичность связывания транс-зеатина рецепторами AHK4/CRE1 и
1.3.2 Связывание цитокинина CHASE-доменами рецепторов АНК2, АНКЗ и AHK4/CRE
1.3.3 Константы диссоциации комплексов рецепторов AHK4/CRE1, АНКЗ и CHASE-доменов АНК2 и AHK4/CRE1 с транс-зеатином
1.3.4 Лигандная специфичность связывания рецепторов AHK4/CRE1, АНКЗ и CHASE-доменов АНК2 и AHK4/CREI с различным цитокининами, кажущиеся константы связывания
1.4.1 Константы диссоциации рецепторов ZmHKl, ZmHK2, ZmHK3a для т/?днс-зеатина
1.4.2 Лигандная специфичность связывания рецепторов ZmHKl, ZmHK2, ZmHK3a, кажущиеся константы связывания
1.5 Оценка возможности меболических превращений цитокининов в ходе
1.6 Влияние некоторых физико-химических факторов на лиганд-связывающие свойства рецепторов цитокининов
1.6.1 Влияние температуры на связывание транс-зеатина рецепторами AHK4/CRE1 и АНКЗ
1.6.2 Влияние солей одновалентных и двухвалентных катионов на связывание
1.6.3"Влияние рН среды инкубации на связывание меченого транс-зеатина и лигандную специфичность связывания
1.7 Способность различных цитокининов активировать экспрессию гена первичного ответа ARR5 в проростках двойных мутантов арабидопсиса по рецепторам цитокининов
2. Субклеточная локализация рецепторов цитокининов
3. Исследование влияния некоторых компонентов различных сигнальных путей на ранние эффекты цитокининов
3.1 Возможное участие оксида азота
2.1 Анализ связывания меченого цитокинина с различными мембранными фракциями мутанта арабидопсиса ahk2-5 crel
2.2 рН-зависимость связывания меченого цитокинина мембранными фракциями кукурузы^
2.3 Лигандная специфичность связывания цитокининов с различными , мембранными фракциями кукурузы
3.2 Возможное участие фосфолипаз D и С
3.2.1 Действие ингибиторов фосфолипазы D, первичных спиртов и LPE/LPI
3.2.2 Влияние цитокинина на активность различных типов фосфолипаз D (PLD)
3.2.3 Мутанты по фосфолипазам D
3.2.4 Возможное участие фосфолипазы С
4. Общее обсуяедение
Выводы
Введение Диссертация по биологии, на тему "Лиганд-связывающие свойства и субклеточная локализация цитокининовых рецепторов"
Анализ механизмов рецепции и трансдукции гормональных сигналов является важным и актуальным направлением исследований гормональной регуляции высших организмов, в том числе растений. Среди фитогормонов особое значение имеют цитокинины, которые регулируют метаболизм и деление клеток, а также рост, морфогенез и старение растений. Цитокинины представлены in vivo рядом соединений близкой структуры, но с разной биологической активностью. Для этого класса фитогормонов в последние годы идентифицированы мембранные рецепторы, гены первичного ответа, основные элементы сигнальной трансдукции и ферменты биосинтеза (обзоры см. Романов, 2002; Heyl & Schmulling, 2003; Sakakibara, 2006). Однако многие аспекты молекулярного механизма действия цитокининов еще. малоизучены и продолжают активно исследоваться.
Основными повсеместно распространенными цитокининами являются производные аденина: транс-зеатин, изопентениладенин, дигидрозеатин и их дериваты (Мок & Мок, 2001). Общепризнано, что основным местом их образования является корень, но они могут также синтезироваться и в других частях растения, в основном в зонах деления клеток. При этом транс-зеатин синтезируется в основном в корне (Takei et al., 20046), а изопентениладенин - большей частью в побеге (Miyawaki et al., 2004; Takei et al., 2004a). Также цитокинины по-разному транспортируются по растению: трякс-зеатиновые в основном перемещаются по ксилеме, а изопентенильные — по флоэме (Hirose et al., 2008). Таким образом, в различных органах растения присутствуют различные типы (наборы) цитокининов. Это позволяет думать, что отдельные формы цитокининов выполняют неравнозначные физиологические функции в растении. В связи с этим остро встаёт вопрос о лигандной специфичности и других свойствах рецепторов цитокининов.
У всех изученных растений рецепторы цитокининов представляют собой семейство близкородственных белков - мембранных гистидинкиназ, подобных сенсорным гистидинкиназам одноклеточных организмов. Показано, что эти рецепторы могут иметь различное физиологическое значение in planta (Higuchi et al., 2004; Nishimura et al., 2004; Riefler et al., 2006).
До начала наших исследований лигандную специфичность рецепторов изучали полуколичественными методами, по индукции репортерного гена (Inoue et al., 2001; Suzuki et al., 2001; Spichal et al., 2004 и др.). При этом прямых количественных исследований с помощью радиолигандного метода практически не было, видимо, по причине сложности и трудоемкости получения очищенных мембран, сохраняющих функционально-активные рецепторы. До сих пор был исследован только один рецептор цитокининов арабидопсиса AHK4/CRE1, при этом с очень ограниченным набором цитокининов (Yamada et al., 2001). Таким образом, к началу наших исследований лиганд-связывающие свойства рецепторов цитокининов были изучены явно недостаточно.
Также важным фактором реализации действия рецепторов в растении является-их субклеточная локализация. Однако эти аспекты системы восприятия цитокининового сигнала клеткой оставались до последнего времени были также практически не изучены. Что касается других гормонов растений, то для них такие данные были получены в самые последние годы. Было показано, что рецепторы ауксинов и гиббереллинов являются растворимыми белками и находятся, по всей видимости, в ядре (Kepinski et al., 2005; Dharmasiri et al., 2005; Ueguchi-Tanaka et al., 2005; Nakajima et al., 2006; Griffiths et al., 2007), рецепторы этилена локализуются! на мембранах эндоплазматическом ретикулума (Chen et al., 2002; Ma et al., 2006), а рецепторы брассиностероидов - как на плазмалемме, так и на эндосомах (Geldner et al., 2007). Что касается абсцизовой кислоты, то она обладает как растворимыми внутриклеточными рецепторами (Razem et al., 2006; Shen et al., 2006), так и рецептором-трансмембранным белком, находящимся на плазмалемме (Liu. et al., 2007). Информация о локализации цитокининовых рецепторов»скудна и основана либо на биоинформатических оценках (Inoue et al., 2001), либо на единичных косвенных данных (Kim et al., 2006). При этом предполагалось, что цитокининовые рецепторы локализуются на плазмалемме. Однако, исходя из вышеприведенных данных для других рецепторов фитогормонов, нельзя было исключить, что рецепторы цитокининов локализуются на различных типах мембран клеток растений.
Ещё одной важной проблемой механизма действия цитокинина является внутриклеточное поведение гормонального сигнала до первичных молекулярных мишеней. В настоящее время общепринято, что основным путём передачи сигнала являются белки так называемой двухкомпонентной системы бактериального типа (Kakimoto, 2003). Однако имеются данные о том, что в передаче цитокининового сигнала участвуют также оксид азота (Scherer et al., 2000) и фосфолипаза D (Romanov et al., 2002; 2003). Поэтому вопрос об участии элементов истинно эукариотеческого сигналинга во внутриклеточной трансдукции сигнала цитокининов является актуальным.
Главной целью данной работы было изучить лиганд-связывающие свойства индивидуальных рецепторов цитокининов у разных видов растений и субклеточную локализацию рецепторных белков.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
- изучить лиганд-связывающие свойства индивидуальных цитокининовых рецепторов арабидопсиса и кукурузы, клонированных в Е. coli, с помощью радиолигандного метода;
- выяснить, как установленные свойства рецепторов проявляются при передаче цитокининового сигнала на гены первичного ответа in planta\
- исследовать субклеточную локализацию рецепторов в органах растений.
Дополнительно была проверена возможность участия оксида азота и фосфолипаз во внутриклеточной трансдукции цитокининового сигнала до генов первичного ответа.
ОБЗОР ЛИТЕРА ТУРЫ
1. Цнтокинины
Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Ломин, Сергей Николаевич
ВЫВОДЫ
1. Предложен и прошел успешные испытания количественный метод исследования гормон-связывающих свойств цитокининовых рецепторов с использованием интактных трансгенных бактерий, экспрессирующих функционально активный рецепторный белок или его гормон-связывающий домен.
2. Экспрессируемые в бактериях цитокининовые рецепторы связывают транс-зеатин и другие активные цитокинины высокоаффинно, специфично и некооперативно. Рассчитаны константы связывания цитокининов с рецепторами, значения KD для транс-зеатина находятся в наномолярном диапазоне. Цитокинины-производные фенилмочевины связываются с рецептором в том же сайте, что и природные цитокинины-производные аденина.
3. Цитокининовые рецепторы арабидопсиса и кукурузы проявляют черты сходства в лигандной специфичности, при этом рецептор кукурузы ZmHKl отличается сравнительно нйзким сродством к транс-зеатину'и относительно высоким - к цис-зеатину.
4. Цитокининовые рецепторы различаются по лигандной специфичности. В частности, «листовые» рецепторы АНКЗ и ZmHK2 имеют низкое сродство к изопентенильным формам цитокининов, а «корневые» рецепторы AHK4/CRE1 и ZmHKl - высокое. Соответствующие различия проявляются также in planta у двойных мутантов арабидопсиса, экспрессирующих один из трех рецепторов цитокининов.
5. В модельной системе установлено различие цитокининовых рецепторов по рН-зависимости связывания цитокинина. У рН-зависимых рецепторов (АНКЗ, АНК2-CHASE-домен и ZmHKl) максимальное связывание гормона происходит в щелочной области рН, а минимальное - в кислой (рН 5).
6. В очищенных мембранных препаратах из арабидопсиса и кукурузы выявлены сайты специфического связывания т/>а»с-зеатина с помощью радиолигандного метода. Это связывание высокоаффинно и характеризуется рН-зависимостью и лигандной специфичностью.
7. Высокоаффинные сайты находятся как на плазмалемме, так и на внутренних мембранах клеток. Гормон-связывающие свойства мембран различаются в зависимости от источника их получения.
8. Полученные данные позволили обосновать гипотезу о роли функциональных различий цитокининовых рецепторов при дальнедистанционной гормональной коммуникации между корнем и побегом растений. В результате стал более понятным биологический смысл существования разных форм цитокининов и их рецепторов в растении.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ломин, Сергей Николаевич, Москва
1. Бернье Ж., Корбезье JL, Перийе К. (2002) Процесс цветения: поиск регуляторных факторов у Sinapis alba. Физиология растений, 49: 500-506.
2. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика: Практический курс. (1999) М.: ФАИР-ПРЕСС, 720 с.
3. Гетман И.А. (2003) Ранние эффекты цитокининов в модельной системе проростков амаранта: Дисс. канд. биол. наук, М.: РУДН, 132 с.
4. Гудвин Т., Мсрсер Э. (1986) Введение в биохимию растений. М: Мир, 2, 304 с.
5. Дерфлинг (1985) Гормоны растений. Системный подход. М: Мир, 392 с.
6. Зверева С.Д., Романов Г.А. (2000) Репортерные гены для генетической инженерии растений: характеристика и методы тестирования. Физиология растений, 47, 479-488.
7. Иванова Е.Г., Шепеляковская А.О. (1999) Биосинтез цитокининов аэробными метилотрофными бактериями: Новые данные. Материалы IV Пущинской конференции молодых ученых, Пущино.
8. Калинин Ф.А. (1984) Биологически активные вещества в растениеводстве. Киев: Наукова Думка, 320 с.
9. Карначук Р.А., Головацкая И.Ф. (1998) Гормональный статус, рост и фотосинтез растений, выращенных на свету разного спектрального состава. Физиология растений, 45, 6: 925-934.
10. Клячко H.JI. (1985) Постгранскрипционная регуляция синтеза белка фитогормонами. Автореф. дисс. до кт. биол. наук, Москва.
11. Константинова Т.Н., Аксенова Н.П., Голяновская С.А., Сергеева Л.И., Романов Г.А.1999) Действие ауксина (ИУК) и цитокинина (кинетина) на клубнеобразование картофеля в культуре in vitro. Доклады Академии Наук, Общая Биология, 369, 708-711.
12. Куликова А.Л., Куликов А.Ю., Ерохина М.А., Клячко H.JI. (2001) Зависимость доли цитоскелет-связанных полисом от физиологического состояния растений. Физиология растений, 48, 705-711.
13. Курсанов А Л. (1976) Транспорт ассимилятов в растении. М.: Наука, 646 с.
14. Митриченко А.Н. (1998) Динамика и распределение цитокининов в проростках пшеницы при изменениях температуры. Физиология растений, 45, 468-471.
15. Мустафипа А.П., Кудоярова Г.Р., Веселов Ю.С. (1997) Изменение спектра иммунореактивных форм цитокининов в обезвоженных проростках пшеницы и кукурузы. Известия АН: Серия биологическая, 6, 750-754.
16. Патрушев Л.И. (2000) Экспрессия генов. М.: Наука, 527 с.
17. Полевой В.В. (1985) Фитогормоны., JI.: изд-во Ленингр. университета, 284 с.
18. Ракова Н.Ю. (2005) Особенности регуляции цитокининами экспрессии генов первичного ответа. Дисс. канд. биол. наук, Москва, 144 с.
19. Розен В.Б., Смирнов А.Н. (1981) Рецепторы и стероидные гормоны М.: Изд-во МГУ.
20. Романов Г.А. (1990) Цитокинины и тРНК: новый взгляд на старую проблему. Физиология растений, 37, 1196-1209.
21. Романов Г.А. (1992) Модель гормонально-организуемого пролиферативного роста: аналогии с ростом растения. Онтогенез, 1992: 228-236.
22. Романов Г.А., Гетман И.А., Шмюллинг Т. (1999) Быстрая активация транскрипции ядерных генов необходима для индуцированного цитокининами образования бетацианина в проростках амаранта. Докл. АН, 365, 832-835.
23. Романов Г. А. (2002) Рецепторы фитогормонов. Физиология растений, 49, 552-560.
24. Уэринг Ф.Ф. (1984) Физиология клубнеобразования и роль фитогормонов. Гормональнаярегуляция онтогенеза растений. М.: Наука, с. 55-70.>
25. Чайлахян М.Х. (1964) Факторы генеративного развития растения. Тимирязевские чтения XXV. М.: Наука, 58 с.
26. Чайлахян М.Х., Хрянин В.Н. (1982) Пол растений и его гормональная регуляция. М.: Наука, 173 с.
27. Чернядьев И.И. (1993) Фотосинтез и цитокинины. Прикладная биохимия и микробиология, 29, 644-675.
28. Чернядьев И.И. (1997) Фотосинтез растений в условиях водного стресса и протекторное влияние цитокининов. Прикладная биохимия и микробиология, 33, 5-17.
29. Чернядьев И.И. (2000) Онтогенетические изменения фотосинтетического аппарата и влияние цитокининов. Прикладная биохимия и микробиология, 36, 611-625.
30. Achazi К. (2006) Cytokininantwort und natiirliche Blattseneszenz in Cytokininrezeptor-Mutanten und cytokinindefizienten Pflanzen. Дипломная работа, Берлин, 119 р.
31. D'Agostino I.B, Deruere J., Kieber J.J. (2000) Characterization of the response of the Arabidopsis response regulator gene family to cytokinin. Plant Physiology, 124, 1706-17.
32. Aloni R., Langhans M., Aloni E., Dreieicher E., Ullrich C.I. (2005) Root-synthesized cytokinin in Arabidopsis is distributed in the shoot by the transpiration stream. J. Exp. Bot., 56, 1535-44.
33. Anantharaman V, Aravind L. (2001) The CHASE domain: a predicted ligand-binding module in plant cytokinin receptors and other eukaryotic and bacterial receptors. Trends Biochem Sci., 26, 579582.
34. The Arabidopsis Genome Initiative: Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. (2000) Nature, 408, 796-815. Genes Dev. 14, 2938-43.
35. Astot C„ Dolezal K., Nordstro A., Wang Q., Kunkel Т., Moritz Т., Chua N.-H., ran Sandberg
36. G. (2000) An alternative cytokinin biosynthesis pathway. PNAS, 97, 14778-14783.
37. Armstrong D.J. (1994) Cytokinin oxidase and the regulation of cytokinin degradation. In DWSMok, MCMok, eds, Cytokinins:Chemistry, Activity, and Function. CRC Press, Boca Raton, FL, pp. 139-154.
38. Auer C.A., Cohen J.D. (1993) Identification of a Benzyladenine Disaccharide
39. Conjugate Produced during Shoot Organogenesis Petunia Leaf Explants. Plant Physiology, 102,541.545.
40. Auer C.A. (1997) Cytokinin conjugation: recent advances and patterns in plant evolution. Plant Growth Regul., 23, 17-32.
41. Austin-Brown S.L., Chapman K.D. (2002) Inhibition of phospholipase Da by N-Acylethanolamines. Plant Physiology, 129, 1892-1898.
42. Belligni M.V. and Lamattina L. (2001) Nitric oxide in plants: the history is just beginning. Plant Cell Env., 24,267-278.
43. Bernier G., Houssa C., Iacqmard A. (1994) Regulation of the cell cycle by cytokinins. In: Cytokinins, Chemistry, Activity and Function. Eds Мок D. & Мок M.C. Corvallis, Oregon: CRC Press, pp. 197-211.
44. Biddington N.L. & Thomas Т.Н. (1973) A modified Amaranthus betacyanin bioassay for the rapid determination of cytokinins in plant extracts. Planta, 111, 183-186.
45. Bilyeu, K.D., Cole, J.L., Laskey, J.G., Riekhof, W.R., Esparza, T.J., Kramer, M.D., and Morris, R.O. (2001) Molecular and biochemical characterization of a cytokinin oxidase from maize. Plant Physiology, 125, 378-386.
46. Blatt M.R., Thiel G., Trentham D.R. (1990) Reversible inactivation of K+ channels of Vicia stomatal guard cells following the photolysis of caged inositol 1,4,5-trisphosphate. Nature, 346, 766-769.
47. Bonhomme F., Kurz В., Melzer S., Bernier G., Jacqmard A. (2000) Cytokinin and gibberellin activate SaMADS A, a gene apparently involved in regulation of floral transition in Sinapsis alba. The Plant Journal, 24, 103-111.
48. Boonman A., Prinsen E., Gilmer F., Schurr U., Peeters A.J., Voesenek L.A., Pons T.L. (2007) Cytokinin import rate as a signal for photosynthetic acclimation to canopy light gradients. Plant Physiology, 143, 1841-52.
49. Bradford M.M. (1976) A rapid and sensitive method for quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 72, 248-254.
50. Brandstatter I., Kieber J.J. (1998) Two genes with similarity to bacterial response regulators are rapidly and specifically induced by cytokinin in Arabidopsis. Plant Cell, 10, 6, 1009-1019.
51. Bruce M.I., Zwar J.A. (1966) Cytokinin activity of some substituted ureas and thioureas. Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci., 165, 245-265.
52. Brzobohaty В., Moore I., Kristoffersen P., Bako L., Campos N., Schell J., Palme K. (1993) Release of active cytokinin by a bglucosidase localized to the maize root meristem. Science, 262, 1052-1054.
53. Biirkle L., Cedzich A., Dopke C., Stransky H., Okumoto S., Gillissen В., Kiihn C., Frommer
54. W.B. (2003) Transport of cytokinins mediated by purine transporters of the PUP family expressed in phloem, hydathodes, and pollen of Arabidopsis. Plant J., 34, 13-26.
55. Campos N., Bako L., Feldwisch J., Schell J., Palme K. (1992) A protein from maize labeled with azido-IAA has novel b-glucosidase activity. The Plant Journal, 2, 675-684.
56. Carimi F., Zottini M., Costa A., Cattelan I., De Michele R., Terzi M. and Lo Schiavo F. (2005) NO signalling in cytokinininduced programmed cell death. Plant Cell Env., 28, 1171-1178.
57. Carter S. G., Karl D. W. (1982) Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation. J. Biochem. Biophys. Methods, 7, 7-13.
58. Сагу A. J., Liu W., Howell S. H. (1995) Cytokinin Action is Coupled to Ethylene in Its Effects on the Inhibition of Rootand Hypocotyl Elon ation in A ra bidopsis thaliana Seedlings, Plant Physiology, 107, 1075-1 082.
59. Che P., Gingerich J., Lall S., Howell S.H. (2002) Global and hormone-induced gene expression changes during shoot development in Arabidopsis. The Plant Cell, 14, 2771-2785.
60. Chen C.M., Kristopeit S.M. (1981a) Metabolism of Cytokinin : DEPHOSPHORYLATION OF CYTOKININ RIBONUCLEOTIDE BY 5'-NUCLEOTIDASES FROM WHEAT GERM CYTOSOL. Plant Physiology, 67, 494-498.
61. Chen C.M., Kristopeit S.M. (1981b) Metabolism of Cytokinin: Deribosylation of Cytokinin Ribonucleoside by Adenosine Nucleosidase from Wheat Germ Cells. Plant Physiology, 68, 10201023.
62. Chen, C.-M. & Leisner, S.M. (1984) Modification of Cytokinins by Cauliflower Microsomal Enzymes. Plant Physiology, 75, 442^46.
63. Chen C.-M. (1997) Cytokinin biosynthesis and interconversions. Physiol. Plant., 101, 665-673.
64. Chen M.H., Takeda S., Yamada H., Ishii Y., Yamashino Т., Mizuno T. (2001) Characterization of the RcsC—>YojN—>RcsB phosphorelay signaling pathway involved in capsular synthesis in Escherichia coli. Biosci Biotechnol Biochem., 65, 2364-2367.1.>
65. Chen Y.F., Randlett M.D., Findell J.L., Schaller G.E. (2002) Localization of the ethylene receptor ETR1 to the endoplasmic reticulum of Arabidopsis. J. Biol. Chem., 277, 19861-19866.
66. Cheng, Y.C. and Prusoff, W.H. (1973) Relationship between the Inhibitor Constant (Ki) and the Concentration of Inhibitor Which Causes 50% Inhibition of an Enzymatic Reaction, Biochem. Pharmacol. Med., 22, 3099-3108.
67. Clarke S.F., McKenzieM.J., Burritt D.J., Guy P.L., Jameson P.E. (1999) Influence of white clover mosaic potexvirus infection on the endogenous cytokinin content of bean. Plant Physiology, 120, 547-552.
68. Corbesier L., Prinsen E., Jacqmard A., Lejeune P., Van Onckelen H., Perilleux C., Bernier G.2003) Cytokinin levels in leaves, leaf exudate and shoot apical meristem of Arabidopsis thaliana during floral transition./. Exp. Bot., 54, 2511-2517.
69. Correa-Aragunde N., Graziano M., Lamattina L. (2004) Nitric oxide plays a central role in determining lateral root development in tomato. Planta, 218, 900-905.
70. Correa-Aragunde N., Graziano M., Chevalier C., Lamattina L. (2006) Nitric oxide modulates the expression of cell cycle regulatory genes during lateral root formation in tomato. J. Exp. Bot., 57, 581-588.
71. Deji A., Sakakibara H., Ishida Y., Yamada S., Komari Т., Kubo Т., Sugiyama T. (2000) Genomic organization and transcriptional regulation of maize ZmRRl and ZmRR2 encoding cytokinin-inducible response regulators. Biochim Biophys Acta., 1492, 216-220.
72. Dellaporta S.L., Wood, and Hicks J.B. (1983) A plant DNA minipreparation: version II. Plant Molecular Biology Reporter, 1, 19-21.
73. Dello Ioio R., Linhares F.S., Scacchi E., Casamitjana-Martinez E., Heidstra R., Costantino P., Sabatini S. (2007) Cytokinins determine Arabidopsis root-meristem size by controlling cell differentiation. CurrBiol., 17, 678-682.
74. Desikan R., Cheung M.K., Bright J., Henson D., Hancock J.T., Neill S.J. (2004) ABA, hydrogen peroxide and nitric oxide signalling in stomatal guard cells. J. Exp. Bot., 55, 205-212.
75. Dharmasiri N., Dharmasiri S., Estelle M. (2005) The F-box protein TIR1 is an auxin receptor. Nature, 435,441-445.
76. Dong H., Niu Y., Zhang D. (2008a) Effect of cotton rootstock on endogenous cytokinins and abscisic acid in xylem sap and leaves in relation to leaf senescense. J. Exp. Bot., 59, 1295-304.
77. Dong C.H., Rivarola M., Resnick J.S., Maggin B.D., Chang C. (2008b) Subcellular co-localization of Arabidopsis RTE1 and ETR1 supports a regulatory role for RTE1 in ETR1 ethylene signaling. Plant J., 53, 275-286.
78. Dortay H., Mehnert N., Biirkle L., Schmulling Т., Heyl A. (2006) Analysis of protein interactions within the cytokinin-signaling pathway of Arabidopsis thaliana. FEBSJ., 273, 4631-4644.
79. Du L., Jiao P., Chu J., Jin G., Chen M., Wu P. (2007) The two-component signal system in rice (Oryza sativa L.): A genome-wide study of cytokinin signal perception and transduction. Genomics, 89, 697-707.
80. Dutta R., Yoshida Т., Inouye M. (2000) The critical role of the conserved Thr247 residue in the functioning of the osmosensor EnvZ, a histidine kinase phosphotase, in Escherichia coli. The Journal of biological chemistry, 275, 38645-38653.
81. Esen A. (1992) Purification and partial characterization of maize (Zea mays L) b-glucosidase. Plant Physiology, 98, 174-182.
82. Esen A., Stetler D.A. (1993) Subcellular localization of maize /?-glucosidase. Maize Genetics Cooperative Newsletter, 67, 19-20.
83. Estruch J.J., Granell A., Hansen G., Prinsen E., Redig P., Van Onckelen H., Schwarz-Sommer Z., Sommer H., Spena A. (1993) Floral development and expression of floral homeotic genes are influenced by cytokinins. The Plant Journal, 4, 379-384.
84. Faiss M., Zalubilova J., Strnad M., Schmulling T. (1997) Conditional transgenic expression of the ipt gene indicates afunction for cytokininsin paracrine signaling in whole tobacco plants. The Plant Journal, 12, 401-415.
85. Feelisch M. (1998) The use of nitric oxide donors in pharmacological studies. Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology, 358, 113-122.
86. Foo E., Morris S.E., Parmenter K., Young N., Wang H., Jones A., Rameau C., TurnbuII C.G.N., Beveridge C.A. (2007) Feedback regulation of xylem cytokinin content is conserved in pea and Arabidopsis. Plant Physiology, 143, 1418-1428.
87. Franco-Zorrilla J.M., Martin A.C., Solano R., Rubio V., Leyva A., Paz-Ares J. (2002) Mutations at CRE1 impair cytokinin-induced repression of phosphate starvation responses in Arabidopsis. The Plant Journal, 32, 353-360.
88. Franco-Zorrilla J.M., Gonzalez E., Bustos R., Linhares F., Leyva A., Paz-Ares J. (2004) The transcriptional control of plant responses to phosphate limitation. Journal of Experimental Botany, 55,285-293.
89. Franco-Zorrilla J.M., Martin A.C., Leyva A., Paz-Ares J. (2005) Interaction between phosphate-starvation, sugar, and cytokinin signaling in Arabidopsis and the roles of cytokinin receptors CRE1/AHK4 and АНКЗ. Plant Physiology, 138, 847-857.
90. Fuerst R. A. U. A., Soni R., Murray J. A. H., Lindsey K. (1996) Modulation of Cyclin Transcript Levels in Cultured Cells of Arabidopsis thaliana Plant Physiology, 112, 1023-1033.
91. Galichct A., Hoyerova K., KaminekM., Gruissem W. (2008) Farnesilation directs AtIPT3 subcellular localization and modulates cytokinin biosinthesis in Arabidopsis. Plant Physiology, 146, 1155-1164.
92. Geldner N., Hyman D.L., Wang X., Schumacher K., Chory J. (2007) Endosomal signaling of plant steroid receptor kinase BRI1. Genes Dev., 21, 1598-1602.
93. Gaudino R.J., Pikaard C.S. (1997) Cytokinin induction of RNA polymerase I transcription in Arabidopsis thaliana. J. Biol. Chem., 272, 6799-804.
94. Gillissen В., Biirkle L., Andre В., Kiihn C., Rentsch D., Brandl В., Frommer W.B. (2000) A New Family of High-Affinity Transporters for Adenine, Cytosine, and Purine Derivatives in Arabidopsis. The Plant Cell, 12, 291-300.
95. Glover B.J., Torney K., Wilkins C.G., Hanke D.E. (2008) CYTOKININ INDEPENDENT-1 regulates levels of different forms of cytokinin in Arabidopsis and mediates response to nutrient stress. J Plant. Physiol, 165, 251-261.
96. Golan A., Tepper M., Soudry E., Horwitz B. A., Gepstein S. (1996) Cytokinin, Acting through Ethylene, Restores Gravitropism to Arabidopsis Seedlings Crown under Red Light, Plant Physiology. 112, 901-904.
97. Golovko A'., Sitbon F., Tillberg E., Nicander B. (2002) Identification of a tRNA isopentenyltransferase gene from Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology, 49, 161-169.
98. Gonzalez-Rizzo S., Crespi M., Frugier F. (2006) The Medicago truncatula CRE1 Cytokinin Receptor Regulates Lateral Root Development and Early Symbiotic Interaction with Sinorhizobium meliloti. The Plant Cell, 18, 2680-2693.
99. Grossman A., Takahashi H.' (2001) Macronutrient utilization by photosynthetic eukaryotes and the fabric of interactions. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 52, 163— 210.
100. Gu R., Zhao L., Zhang Y., Chen X., Bao J., Zhao J., Wang Z., Fu J., Liu Т., Wang J., Wang
101. G. (2006) Isolation of a maize beta-glucosidase gene promoter and characterization of its activity in transgenic tobacco. Plant Cell Rep., 25, 1157-1165.
102. Hagiwara D., Sugiura M., Oshima Т., Mori H., Aiba H., Yamashino Т., Mizuno T. (2003) Genome-wide analyses revealing a signaling network of the RcsC-YojN-RcsB phosphorelay system in Escherichia coli. J. Bacteriol., 185, 5735-5746.
103. Hahm S.H., Saunders M.J. (1991) Cytokinin increases intracellular Ca2+ in Funaria: detection with Indo-1. Cell Calcium., 12, 675-681.
104. Hake S., Smith H.M.S., Holtan H., Magnani E., Mele G., Ramirez J. (2004) The role of KNOX genes in plant development. Ann. Rev. Cell Dev. Biol., 20, 125-151.
105. Hanano S., Domagalska M.A., Nagy F., Davies S.J. (2006) Multiple phytohormones influence distinct parameters of the plant circadian clock. Genes to Cells, 11, 1381-1392.
106. Hass C., Lohrmann J., Albrecht V., Sweere U., Hummel F., Yoo S.D., Hwang I., Zhu Т., Schafer E., Kudla J., Harter K. (2004) The response regulator 2 mediates ethylene signalling and hormone signal integration in Arabidopsis. EMBOJ., 23, 3290-302.
107. Hay A., Kaur H., Hedden P., Hake S., Tsiantis M. (2002) The gibberellin pathway mediates KNOTTED 1-type homeobox function in plants with different body plans. Curr. Biol., 12, 15571565.
108. Hejatko J., Pernisova M., Eneva Т., Palme K., Brzobohaty B. (2003) The putative sensor histidine kinase CKI1 is involved in female gametophyte development in Arabidopsis. Mol. Genet. Genomics, 269, 443-453.
109. Heyl A., Schmiilling T. (2003) Cytokinin signal perception and transduction. Curr. Opin. Plant Biol., 6,480-488.
110. Heyl A., Wulfetange K., Pils В., Nielsen N., Romanov G.A., Schmiilling T. (2007) Evolutionary proteomics identifies amino acids essential for ligand-binding of the cytokinin receptor CHASE domain. BMC Evol Biol. 7:62.
111. Hill A.V. (1910) The Possible Effects of the Aggregation of the Molecules of Hemoglobin on Its Oxygen Dissociation Curve. J. Physiol., 40, IV-VII.
112. Hirose N., Makita N., Kojima M., Kamada-Nobusada Т., Sakakibara H. (2007) Overexpression of a type-a response regulator alters rice morphology and cytokinin metabolism. Plant and Cell Physiology, 48, 523-539.
113. Hirose N., Takei K., Kuroha Т., Kamada-Nobusada Т., Hayashi H., Sakakibara H. (2008) Regulation of cytokinin biosynthesis, compartmentalization and translocation. J Exp. Bot., 59, 7583.
114. Holub J., Hanus J., Hanke D.E., Strnad M. (1998) Biological activity of cytokinins derived from ortho- and meta-hydroxybenzyladenine. Plant Growth Regul., 26., 109-115.
115. Horgan R., Hewett E.W., Purse J.G., Wareing P.F. (1973) A new cytokinin from Populus x robusta. Tetrahedron Lett., 30, 2827-2828.
116. Hou В., Lim E.-K., Higgins G.S., Bowles D.J. (2004) N-Glucosylation of Cytokinins by Glycosyltransferases of Arabidopsis thaliana. The Journal of Biological Chemistry, 279, 4782247832.
117. Houba-Herin, N., Pethe, C., d'Alayer, J., Laloue, M. (1999) Cytokinin oxidase from Zea mays: Purification, cDNA cloning and expression in moss protoplasts. Plant J., 17, 615-626.
118. Hu, Y. Bao F., Li J. (2000) Promotive effect of brassinosteroids on cell division involves a distinct CycDJ-induction pathway in Arabidopsis. Plant J., 24, 693-701.
119. Ни. X., Neill S.J., Tang Z., Cai W. (2005) Nitric oxide mediates gravitropic bending in soybean roots. Plant Physiology, 137, 663-670.
120. Jasinski S., Piazza P., Craft J., Hay A., Woolley L., Rieu I., Phillips A., Hedden P., Tsiantis M.2005) KNOX action in Arabidopsis is mediated by coordinate regulation of cytokinin and gibberellin activities. Curr. Biol., 15, 1560-1565.
121. Jain. M., TyagbA.K. and'Khurana, J.P. (2006) Molecular characterization and differential expression of cytokinin-responsive type-A response regulators in rice (Oryza sativa). BMC Plant Biol., 6: I.
122. Jefferson R.A:, .Kavanagh T.A., Bevan МЛУ. (1987) GUS fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBOJ., 6, 3901-3907.
123. Jung K.W., Oh S.-I:, Kim Y.Y., Yoo K.S., Cui M'Hi, and Shin J.S. (2008) Arabidopsis Histidine-containing Phosphotransfer Factor 4 (AHP4) Negatively Regulates Secondary Wall Thickening of the Anther Endothecium during Flowering. Mol. Cells, 25, 294-300.
124. Kakimoto T. (1996) CKI1, a histidine kinase homolog implicated in cytokinin signal transduction. Science, 274; 982-985. •
125. Kakimoto T. (2001) Identification of plant cytokinin biosynthetic enzymes as dimethylallyl diphosphate:ATP/ADP isopentenyltransferases. Plant and Cell Physiology, 42, 677-685.
126. Kakimoto T. (2003) Biosynthesis of cytokinins. J. Plant Res., 116: 233-239.
127. Kasahara Hij.TakeuK., Ueda. N., Hishiyama-S., Yamaya Т., Kamiya Y., Yamaguchi S., Sakakibara H. (2004) Distinct Isoprenoid Origins of cis- and trans-Zeatin Biosyntheses in" Arabidopsis. The Journal of Biological Chemistry, 279, 14049-14054.
128. Kepinski S., Leyser O. (2005) The Arabidopsis F-box protein T1R1 is an auxin receptor. Nature, 435,446-451. ,
129. Kiba Т., TaniguchbM;, Imamura A., Ueguchi C., Mizuno Т., Sugiyama Т. (1999) Differential expression of genes for response regulators in response to cytokinins and nitrate in Arabidopsis thaliana. Plant and Cell Physiology, 40,s 767-771.
130. KibaiT., Yamada H:, Sato S., Kato;T., Tabata S., Yamashino Т., Mizuno Т. (2003) The type-A response regulator ARR15, acts as a negative regulator in the cytokinin-mediated signal transduction in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiology, 44; 868-874.
131. Kim H.J:, Ryu H., Hong S.Hi, Woo H.R., Lim P.O.-, Lee I:C., Sheen J:, Nam H.G., Hwang I. (2006) Cytokinin-mediated control of leaf longevity by АНКЗ through phosphorylation of ARR2 in Arabidopsis. PNAS, 103, 3814-819.
132. Klumpp S., Krieglstein J. (2002) Phosphorylation and dephosphorylation of histidine residues in proteins. Eur. J. Biochem., 269, 1067-1071.
133. Klyachko N.L., Erokhina M.A. (2003) Phytohormones and cytoskeleton. In: Phytohormones in Plant Biotechnology and Agriculture. Eds Machackova I., Romanov G.A. Kluwer Academic Publishers, Dordecht/Boston/London, pp. 249-253.
134. Koretke K.K., Lupas A.N., Warren P.V., Rosenberg M., Brown J.R. (2000) Evolution of two-component signal transduction. Mol. Biol. EvoL, 17, 1956-1970.
135. Krall L., Raschke M., Zenk M.H., Baron C. (2002) The Tzs protein from Agrobacterium tumefaciens C58 produces zeatin riboside 5'-phosphate from 4-hydroxy-3-methyl-2-(E)-butenyl diphosphate and AMP. FEBS Lett., 527, 315-318.
136. Kravets V.S., Kretynin S.V., Kolesnikov Y.V., Machachkova I., Romanov G.A., Martinec J.
137. Role phospholipase D in the mechanism of cytokinin action // Acta Physiologiae Plantarum. 2004. Vol. 26. P. 32.
138. Kristoffersen P., Brzobohaty В., Hohfeld I., Bako L., Melkonian M., Palme K. (2000) Developmental regulation of the maize Zm-p60.1 gene encoding a /?-glucosidase localized to plastids. Planta, 210, 407-415.
139. Kurakawa Т., Ueda N., Maekawa M., Kobayashi K., Kojima M., Nagato Y., Sakakibara H., Kyozuka J. (2007) Direct control of shoot meristem activity by a cytokinin activating enzyme. Nature, 455, 652-656.
140. Ma В., Cui M.L., Sun H.J., Takada K., Mori H., Kamada H., Ezura H. (2006) Subcellular localization and membrane topology of the melon ethylene receptor CmERSl. Plant Physiology, 141, 587-597.
141. Mahonen A.P., Bonke M., Kaupinnen L., Riikonen M., Benfey P.N., Helariutta Y. (2000) A novel two-component hybrid molecule regulates vascular morphogenesis of the Arabidopsis root. Genes and Development, 14, 2938-2943.
142. Mahonen A.P., Bonke M., Kauppinen L., Riikonen M., Benfey^P.N., Helariutta Y. (2001) A novel two-component hybrid molecule regulates vascular morphogenesis of the Arabidopsis root. Plant Cell Physiol., 42, 231-235.
143. Mahonen A.P., Higuchi M., Tormakangas K., Miyawaki K., Pischke M.S., Sussman M.R., Helariutta Y., Kakimoto T. (2006b) Cytokinins regulate a bidirectional phosphorelay network in Arabidopsis. Curr Biol, 16, 1116-1122.
144. Martin R.C., Мок M.C., Мок D.W.S. (1993) Cytolocalization of zeatin O-xylosyltransferase in Phaseolus. PNAS, 90, 953-957.
145. Martin R.C., Мок M.C., Мок D.W.S. (1999a) Isolation of a cytokinin gene, ZOG1, encoding zeatin O-glucosyltransferase from Phaseolus lunatus. PNAS, 96, 284-289.
146. Martin R.C., Мок M.C., Мок D.W.S. (1999b) A Gene Encoding the Cytokinin Enzyme Zeatin O-Xylosyltransferase of Phaseolus vulgaris. Plant Physiology, 120, 553-557.
147. Martinec J., Feltl Т., Scanlon C.H., Lumsden P.J., Machackova I. (2000) Subcellular localization of a high affinity binding site for D-myo-inositol 1,4,5-trisphosphate from Chenopodium rubrum. Plant Physiology, 124, 475-83.
148. Mason M.G., Li J., Mathews D.E., Kieber J.J., Schaller G.E. (2004) Type-B response regulators display overlapping expression patterns in Arabidopsis. Plant Physiology, 35, 927-937.
149. Mason M.G., Mathews D.E., Argyros D.A., Maxwell B.B., Kieber J.J., Alonso J.M., Ecker J.R., Schaller G.E. (2005) Multiple type-B response regulators mediate cytokinin signal transduction in Arabidopsis. Plant Cell, 17, 3007-3018.
150. Matsuda O., Watanabe C., Iba K. (2001) Hormonal regulation of tissue-specific ectopic expression of an Arabidopsis endoplasmic reticulum-type omega-3 fatty acid desaturase (FAD3) gene. Planta, 213, 833-840.
151. Mauney J.R., Hillman W.S., Miller C.O., Skoog F., Clayton R.A., Strong F.M. (1952) Bioassay, purification and properties of a growth factor from coconut. Physiol Plant., 5, 485—497.
152. Mayer K.F.X., Schoof H., Haecker A., Lenhard M., Jurgens G., Laux T. (1998) Role of WUSCHEL in regulating stem cell fate in the Arabidopsis shoot meristem. Cell, 95, 805-815.
153. Medvedev S.S., Markova I.V., Krylova E.A., Kuznetsova Y.N., Getman I.A., Schmulling Т., Romanov G.A. Participation of Ca2+ ions in early stages of cytokinin action // Acta Physiologiae Plantarum. 2004. Vol. 26. P. 43.
154. Miller C., Skoog F. (1953) Chemical control of bud formation in tobacco stem segments. Am. J. Bot., 40, 768-773.
155. Miller С. О., Skoog F., Von Saltza M. H., Strong F. M. (1955) Kinetin, a cell division factor from deoxyribonucleic acid. J. Amer. Chem. Soc., 77, 1392.
156. Miyata S., Urao Т., Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K. (1998) Characterization of genes for two-component phosphorelay mediator with a single Hpt domain in Arabidopsis thaliana. FEBS Lett., 437, 11-14.
157. Mira-Rodado V., Sweere U., Grefen C., Kunkel Т., Fejes E., Nagy F., Schafer E., Harter K.2007) Functional cross-talk between two-component and phytochrome В signal transduction in Arabidopsis. J. Exp. Bot., 58, 2595-607.
158. Miyawaki K., Matsumoto-Kitano M., Kakimoto T. (2004) Expression of cytokinin biosynthetic isopentenyltransferase genes in Arabidopsis: tissue specificity and regulation by auxin, cytokinin, and nitrate. Plant J., 37, 128-38.
159. Miyazawa Y., Kato H., Muranaka Т., Yoshida S. (2002) Amyloplast formation in cultured tobacco BY-2 cells requires a high cytokinin content. Plant Cell Physiol., 43, 1534-41.
160. Мок M.C., Мок D.W.S., Armstrong D.J., Shudo K., Isogai Y., Okamoto T. (1982) Cytokinin activity ofN-phenyl-N'-l,2,3-thiadiazol-5-ylurea (Thidiazuron). Phytochemistry, 21, 1509-1511.
161. Мок M.C., Мок D.W.S. (1985) The metabolism of I4C.-thidiazuron in callus tissues of Phaseolus lunatus. Physiol. Plant., 65, 427-432.
162. Мок D.W.S. and Мок M.C. (1994) Cytokinins: Chemistry, Activity and Function. CRC Press, Boca Raton, FL.
163. Мок D.W.S., Мок M.C. (2001) Cytokinin metabolism and action. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mo I. Biol., 52: 89-118.
164. Morris, R.O., Bilyeu, K.D., Laskey, J.G., Cheikh, N.N. (1999) Isolation of a gene encoding a glycosylated cytokinin oxidase from maize. Biochem. Biophys. Res. Commun., 255, 328-333. '
165. Motyka V., Faiss M., Strnad M., Kaminek M., Schmiilling T. (1996) Changes in Cytokinin Content and Cytokinin Oxidase Activity in Response to Derepression of ipt Cene Transcription in Transgenic Tobacco Calli and Plants. Plant Physiology, 112, 1035-1043.
166. Mougel C., Zhulin I.B. (2001) CHASE: an extracellular sensing domain common to transmembrane receptors from prokaryotes, lower eukaryotes and plants. Trends Biochem Sci., 26, 582-584.
167. Miiller В., Sheen J., (2007) Arabidopsis cytokinin signaling pathway. Sci. STKE, 2007(407), cm5.
168. Murray J.D., Karas B.J., Sato S., Tabata S., Amyot L., Szczyglowski K.A. (2007) Cytokinin Perception Mutant Colonized by Rhizobium in the Absence of Nodule Organogenesis. Science, 315, 101-103.
169. Murgia I., Delledonne M. and Soave C. (2002) Nitric oxide mediates ironinduced ferritin accumulation in Arabidopsis. Plant J., 30, 521-528.
170. Naito N., Kiba Т., Koizumi N., Yamashino Т., Mizuno T. (2007) Characterization of a unique GATA family that responds to both light and cytokinin in Arabidopsis thaliana. Biosci. Biotechnol. Biochem., 21, 1557-1560.
171. Nakamura A., Kakimoto Т., Imamura A., Suzuki Т., Ueguchi C., Mizuno T. (1999) Biochemical characterization of a putative cytokinin-responsive His-kinase, CKI1, from Arabidopsis thaliana. Biosci. Biotechnol. Biochem., 63, 1627-1630.
172. Nishimura C., Ohashi Y., Sato S., Kato Т., Tabata S., Ueguchi C. (2004) Histidine kinase homologs that act as cytokinin receptors posses overlapping functions in the regulation of shoot and root growth in Arabidopsis. Plant Cell, 16, 1365-77.
173. Oka A., Sakai H., Iwakoshi S. (2002) His-Asp phosphrelay signal transduction in higher plants: receptors and response regulators for cytokinin signaling in Arabidopsis thaliana. Genes Genet. Syst., 77, 383-391.
174. Van Overbeek J., Conklin M.E., Blakeslee A.F. (1941) FACTORS IN COCONUT MILK ESSENTIAL FOR GROWTH AND DEVELOPMENT OF VERY YOUNG DATURA EMBRYOS. Science, 94, 350-351.
175. Parani M., Rudrabhatla S., Myers R., Weirich H., Smith В., Leaman D.W.,Goldman S.L.2004) Microarray analysis of nitric oxide responsive transcripts in Arabidopsis. Plant Biotech. J., 2, 359-366.
176. Pareek A., Singh A., Kumar M., Kushwaha H.R., Lynn A.M., Singla-Pareek S.L. (2006) Whole-genome analysis of Oryza sativa reveals similar architecture of two-component signaling machinery with Arabidopsis. Plant Physiology, 142, 380-397.
177. Papon N., Clastre M., Andreu F., Gantet P., Rideau M., Greche J. (2002) Expression of CrCRKl, a cDNA encoding a histidine kinase receptor homologue in Cathranthus roseus (L.)G.Don., Journal Experimental Botany, 53, 1989-1990.
178. Papon N., Oudin A., Vansiri A., Rideau M., Chenieux J.-C., Creche J. (2003) Differential expression of two type-A response regulators in plants and cell cultures of Catharanthus roseus (L.) G. Don .Journal of Experimental Botany, 54, 1793-1795.
179. Parani M., Rudrabhatla S., Myers R., WeirichH'., Smith В., Leaman D.W., Goldman* S.L.2004) Microarray analysis of nitric oxide responsive transcripts in Arabidopsis. Plant Biothechnology Journal., 2, 359-366.
180. Paul M.J., Pellny Т.К. (2004) Regulation of Carbon Metabolism. Carbon metabolite feedback regulation of leaf photosynthesis and development. Journal of Experimental Botany, 54, 539-547.
181. Petit J.M;, van, Wuytswinkel O., Briat J.F., Lobreaux S. (2001) Characterization of-an iron-dependent regulatory sequence involved in the transcriptional control of AtFerl and ZmFerl plant ferritin genes by iron. J. Biol Chem., 276, 5584-5590/s
182. Pischke M.S., Jones L.G., Otsuga?D., Fernandez D.E., Drews G.N., Sussman M.R: (2002) An Arabidopsis histine kinase is essential for megagametogenesis. PNAS, 99, 15800-15805.
183. Plowman G.D., Sudarasnam S., Bingham J., Whyte D., Hunter T. (1999) The protein kinases of Caenorabditis elegans. A model for signal transduction in multicellular organisms. PNAS, 96, 13603-13610.
184. Pons T.L., Jordi W., Kuiper D. (2001) Acclimation of plants to light gradients in leaf canopies: evidence for a possible role for cytokinins transported in the transpiration stream. Journal of Experimental Botany, 360, 1563-1574.
185. Rashotte, A.M., Carson S.D.B., To J.P.C., Kieber J.J. (2003) Expression profiling of cytokinin action in Arabidopsis. Plant Physiology, 132, 1998-2011.
186. Rashotte A.M., Mason^M.G., Hutchison C.E., Ferreira F.J., Schaller G.E., Kieber J.J. (2006) A subset of Arabidopsis AP2 transcription factors mediates cytokinin responses in concert with a two-component pathway. PNAS, 103, 11081-11085.
187. Razem F.A., EI-Kereamy At, Abrams S.R., Hill R.D. (2006) The RNA-binding protein FCA is an abscisic acid receptor. Nature, 439, 290-294.
188. Reiser V., Raitt D.C., Saito H: (2003) Yeast osmosensor Slnl and plant cytokinin receptor Crel respond to change in turgure pressure. The Journal of Cell Biology, 61, 1035-1040.
189. Repp A., Mikami K., Mittmann F., Hartmann E. (2004) Phosphoinositide-specific phospholipase С is involved in cytokinin and gravity responses in the moss Physcomitrella patens. The Plant Journal, 40, 250-259.
190. Riefler M., Novak J., Strnad M., Schmulling T. (2006) Arabidopsis cytokinin receptor mutants reveal functions in shoot growth, leaf senescence, seed size, germination, root development and cytokinin metabolism. Plant Cell, 18, 40-54.
191. Riou-Khamlichi, C. Huntley, R., Jacqmard, A. Murray, J.A.H. (1999) Cytokinin activation of Arabidopsis cell division through a D-type cyclin. Science, 283, 1541-1544.
192. Riou-Khamlichi, C., Menges, M., Healy, J. M., Murray, J. A. (2000) Sugar control of the plant cell cycle: differential regulation of Arabidopsis D-type cyclin gene expression. Mol. Cell. Biol., 20, 4513-4521.
193. Robbins W.J. & Hervey A. (1971) Cytokinin and growth of excised roots of Bryophyllum calycinum. PNAS, 68: 347-348.
194. Rolle R.S. & Chism G.W.(1986)Isolation of cytokinin nucleosidases from ripe tomato fruit. J. FoodBiochem.,10, 275-283. ,
195. Rolle R.S. & Chism G.W. (1989) Kinetic Comparison of Cytokinin Nucleosidase Activity Isolated from Normally Ripening and Mutant Tomato Varieties. Plant Physiology, 91, 148-150.j
196. Romanov G.A., Getman I.A., Schmulling T. (2000b) Investigation of early cytokinin effects in a rapid Amaranthus seedling test. Plant Growth Regulation, 32, 337-344.
197. Romanov G.A., Kieber J. J., Schmulling T. (2002) A rapid cytokinin response assay in Arabidopsis indicates a role for phospholipase D in cytokinin signaling. FEBS Letters, 515, 39-43.
198. Romero-Puertas M.C., PerazzoIIi M., Zago E.D. and Delledonne M. (2004) Nitric oxide signaling functions in plant-pathogen interactions. Cell Microbiol., 6, 795-803.
199. Rosenthal H.E. (1967) A Graphic Method for the Determination and Presentation of Binding Parameters in Complex Systems. Anal. Biochem., 20, 525-532.
200. Ryu S.B., Karlosson B.H., Ozgen M., Plata J.P. (1997) Inhibition of phospholipase D by lysophosphatidylethanolamine a lipid-derived senescence retardant. PNAS, 94, 12717-12721.
201. Saenz L., Jones L.H., Oropeza C., Vlacil D., Strnad M. (2003) Endogenous isoprenoid and aromatic cytokinins in different plant parts of Cocos nucifera (L.). Plant Growth Regal., 39., 205215.
202. Salome , P.A., To, J.P., Kieber, J.J. and McClung, C.R. (2006) Arabidopsis response regulators ARR3 and ARR4 play cytokinin-independent roles in the control of circadian period. Plant Cell, 18, 55-69.
203. Sakai H., Aoyama Т., Bono H., Oka A. (1998) Two-component response regulators from Arabidopsis thaliana contain a putative DNA-binding motif. Plant Cell Physiol., 39, 1232-1239.
204. Sakai H., Aoyama Т., Oka A. (2000) Arabidopsis ARR1 and ARR2 response regulators operate as transcriptional activators. Plant J., 24, 703-711.
205. Sakai H., Honma Т., Aoyama Т., Sato S., Kato Т., Tabata S., Oka A. (2001) ARR1, a transcription factor for genes immediately responsive to cytokinins. Science, 294, 1519-1521.
206. Sakakibara H., Suzuki M., Takei K., Deji A., Taniguchi M., Sugiyama T. (1998) A response-regulator homologue possibly involved in nitrogen signal transduction mediated by cytokinin in maize. Plant Journal., 14, 337-344.
207. Sakakibara H. (2006) Cytokinins: activity, biosynthesis, and translocation. Annual Review of Plant Biology, 57,431-449.
208. Sakamoto Т., Kamiya N., Ueguchi-Tanaka M., Iwahori S., Matsuoka M (2001) KNOX homeodomain protein directly suppresses the expression of a gibberellin biosynthesis gene in the tobacco shoot apical meristem. Genes Dev., 15, 581-590.
209. Sakamoto Т., Sakakibara H., Kojima M:, Yamamoto Y., Nagasaki H., Inukai Y., Sato Y., Matsuoka M. (2006) Ectopic expression of KNOTTED 1-like homeodomain protein induces expression of cytokinin biosynthesis genes in rice. Plant Physiology, 142, 54-62.
210. Sambrook J., Russell D.W. (2001) Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Ed 3. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
211. Saunders M.J., Hepler P.K. (1983) Calcium antagonists and calmodulin inhibitors block cytokinin-induced bud formation in Funaria. Dev. Biol., 99, 41-49.
212. Scatchard G. (1949) The Attraction of Protein for Small Molecules and Ions, Ann. New York Acad. Sci., 51, 660-672.
213. Scherer G.F.E. & Hoik A. (2000) NO donors mimic and NO inhibitors inhibit cytokinin action in betalaine accumulation in Amaranthus caudatus. Plant Growth Regiil., 32, 345-350.
214. Schluepmann H., Pellny Т., van Dijken A., Smeekens S., Paul M. (2003) Trehalose 6-phosphate is indispensable for carbohydrate utilization and growth in Arabidopsis thaliana. PNAS, 100, 68496854.
215. Schmitz R.Y., Skoog F., Playtis A.J., Leonard N.J. (1972) Cytokinins: synthesis and biological activity of geometric and position isomers of zeatin. Plant Physiology, 50, 702-705.
216. Shantz E.M., Steward F.C. (1955) The identification of compound A from coconut milk as 1,3-diphenylurea. J: Am. Chem. Soc., 77, 6351-6353.
217. Schmiilling Т., Werner Т., Riefler M., Krupkova E., Bartrina у Manns I. (2003) Structure and function of cytokinin oxidase/dehydrogenase genes of maize, rice, Arabidopsis and other, species. J. Plant Res., 116, 241-252.
218. Schumaker K.S. & Gizinski M.J. (1993) Cytokinin stimulates dihydropyridine-sensitive calcium uptake in moss protoplasts. PNAS, 90, 10937-10941.
219. Schumaker K.S. & Gizinski M.J. (1995) 1,4-dihydropiridine binding sites in moss plasma membranes. The Journal of Biological Chemistry, 270, 23461-23467.
220. Sentoku N., Sato Y., Kurata N., Ito Y., Kitano H., Matsuoka M. (1999) Regional expression of the rice KNl-type homeobox gene family during embryo, shoot, and flower development.-Plant Cell, 11, 1651-1664.
221. Shen Y.Y., Wang X.F., Wu F.Q., Du S.Y., Cao Z., Shang Y., Wang X.L., Peng C.C., Yu X.C., Zhu S.Y., Fan R.C., Xu Y.H., Zhang D.P. (2006) The Mg-chelatase H subunit is an abscisic acid receptor. Nature, 443, 823-826.
222. Shudo K. (1994) Chemistry of phenylurea cytokinins. In D.W.S Мок, M.C. Мок, eds, Cytokinins: Chemistry, Activity, and Function. CRC Press, Boca Raton, FL, pp. 35-42.
223. Skoog F., Miller C.O. (1957) Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro. Symp.Soc.Exp.BioI., 54, 118-130.
224. Skoog F., Hamzi H.Q., Szweykowska A.M., Leonard N.J., Carraway K.L., Fujii Т., Helgeson J.P., Loeppky R.N. (1967) Cytokinins Structure/activity relationships. Phytochemistry, 6, 11691192.
225. Skoog F., Armstrong D.J. (1970) Cytokinins. Annu Rev Plant Physiol, 21, 359-384.
226. Smith A.R., Van Staden J. (1978) Changes in endogenous cytokinin levels in kernels of Zea mays L. during imbibition and germination. Journal of Experimental Botany, 29, 1067-1075.
227. Stals H. & Inze D. (2001) When plant cells decide to divide? TRENDS in Plant Science, 6, 359364.
228. Strnad M. (1997) The aromatic cytokinins. Physiol Plant, 101, 674-688.
229. Sun J., Niu Q.-W., Tarkowski P., Zheng В., Tarkowska D., Sandberg G., Chua N.-H., Zuo J.2003) The Arabidopsis AtIPT8/PGA22 Gene Encodes an Isopentenyl Transferase That Is Involved in De Novo Cytokinin Biosynthesis. Plant Physiology, 131, 167-176.
230. Suzuki Т., Imamura A., Ueguchi C., Mizuno T. (1998) Histidine-containing phosphotransfer transducers implicated in His-to-Asp phosphorelay in Arabidopsis. Plant Cell Physiol., 39, 12581268.
231. Suzuki Т., Miwa K., Ishikawa K., Yamada H., Aiba H., Mizumo T. (2001) The Arabidopsis sensor, AHK4, can respond to cytokinins. Plant and Cell Physiology, 42, 107-13.
232. Sweere U., Eichenberg K., Lohrmann J., Mira-Rodado V., Biiurle I., Kudla J., Nagy F., Schiifer E., Harter K. (2001) Interaction of the response regulator ARR4 with phytochrome В in modulating red light signaling. Science, 294, 1108-1 III.
233. Takagi M., Yokota Т., Murofushi N., Saka H., Takahashi N. (1989) Quantitative changes of free-base, riboside, ribotide and glucoside cytokinins in developing rice grains. Plant Growth Regul., 8, 349-364.
234. Takei K, Sakakibara H, Sugiyama T. (2001a) Identification of genes encoding adenylate isopentenyltransferase, a cytokinin biosynthesis enzyme, in Arabidopsis thaliana. J. Biol. Chem., 276, 26405-26410.
235. Takei K., Yamaya Т., Sakakibara H. (2003a) A method for separation and determination of cytokinin nucleotides from plant tissues. J. Plant Res., 16, 265-269.
236. Takei K., Dekishima Y., Eguchi Т., Yamaya Т., Sakakibara H. (2003b) A new method for enzymatic preparation of isopentenyladenine-type and /rara-zeatin-type cytokinins with radioisotope-labeling. J. Plant Res., 116, 259-263.
237. Takei K., Yamaya Т., Sakakibara H. (2004a) Arabidopsis CYP735A1 and CYP735A2 encode cytokinin hydroxylases that catalyze the biosynthesis of trans-Zeatin. J Biol Chem., 279, 4186641872.
238. Takei K., Ueda N., Aoki K., Kuromori Т., Hirayama Т., Shinozaki K., Yamaya Т., Sakakibara
239. H. (2004b) AtIPT3 is a key determinant of nitrate-dependent cytokinin biosynthesis in Arabidopsis. Plant Cell Physiol., 45, 1053-1062.
240. Tanaka Y., Suzuki Т., Yamashino Т., Mizuno T. (2004) Comparative studies of the AHP histidine-containing phosphotransmitters implicated in His-to-Asp phosphorelay in Arabidopsis thaliana. Biosci. Biotechnol. Biochem., 68, 462-465.
241. Tanaka M., Takei K., Kojima M., Sakakibara H., Mori.H. (2006) Auxin controls local cytokinin biosynthesis in the nodal stem in apical dominance. The Plant Journal, 45, 1028-1036.
242. Taniguchi M., Kiba Т., Sakakibara H., Ueguchi C., Mizuno Т., Sugiyama T. (1998) Expression of Arabidopsis response regulator homologs is induced by cytokinins and nitrate. FEBS Lett., 429, 259-62.
243. Taniguchi M., Sasaki N., Tsuge Т., Aoyama Т., Oka A. (2007) ARR1 Directly Activates Cytokinin Response Genes that Encode Proteins with Diverse Regulatory Functions. Plant Cell Physiol., 48, 263-277.
244. Thomas J.C. & Katterman F.R. (1986) Cytokinin Activity Induced by Thidiazuron. Plant Physioogy, 81,681-683.
245. Tirichine L., Sandal N., Madsen L.H., Radutoiu S., Albrektsen A.S., Sato S., Asamizu E., Tabata S., Stougaard J. (2007) A Gain-of-Function Mutation in a Cytokinin Receptor Triggers Spontaneous Root Nodule Organogenesis. Science, 315, 103 -107.
246. Toyama Т., Teramoto H., Takeba G. (1996) The level of mRNA transcribed from psaL, which encodes a.subunit of photosystem I, is increased by cytokinin in darkness in etiolated cotyledons of cucumber. Plant Cell Physiol., 37, 1038-41.
247. Tun N;N., Hoik A; & Scherer G.F.E. (2001) Rapid increase of NO release in plant cell cultures induced by cytokinin. FEBS Lett., 509, 174-176.
248. Tun N:N., Santa-Catarina C., Begum ,Т., Silveira V., Handro Floh E. and Scherer G.F.2006) Polyamines induce biosynthesis of nitric oxide (NO) in Arabidopsis thaliana seedlings. Plant Cell Physiol., Al, 346-354.
249. Tun. N.N., Livaja M., Kieber J.J., Scherer G.F.F. (2008) Zeatin-induced nitric oxide (NO) biosynthesis in Arabidopsis thaliana mutants of NO biosynthesis and'of two-component signaling genes. New Phytologist, 178, 515-531.
250. Ueguchi C., Koizumi >H., Suzuki Т., Mizuno T. (2001a) Novel family of sensor histidine kinase genes-in Arabidopsis thaliana. Plant and Cell Physiology, 42, 231-235.
251. Ueguchi C., Sato S., Kato Т., Tabata S. (2001b) The AHK4 gene involved in the.cytokinin-signaling pathway as a direct receptor molecule in Arabidopsis. Plant Cell Physiology, 42; 751-755*.
252. Ueguchi-Tanaka M.', Ashikari M., Nakajima Mi, Itoh H., Katoh E., Kobayashi M., Chow T.Y., Hsing Y.I., Kitano H., Yamaguchi I., Matsuoka, M. (2005) GIBBERELL1N INSENSITIVE DWARF 1 encodes a soluble receptor for gibberellin. Nature, 437, 693-698.
253. Urao Т., Miyata S., Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K. (2000) Characterization of genes for two-component phosphorelay mediators with a single HPt domain in Arabidopsis thaliana. FEBSLett., 478,227-232.
254. Vankova R. (1999) Cytokinin glycoconjugates: distribution, metabolismand function. In M Strnad, P Pec, E Beck, eds, Advances in Regulation of Plant Growth and Development. Peres Company, Prague, pp. 67-78.
255. Veach Y.K., Martin R.C., Мок D.W.S., Malbeck J., Vankova R., Мок M.C. (2003) O-Glucosylation of cw-zeatin in maize. Characterization of genes, enzymes, and endogenous cytokinins. Plant Physiology, 131, 1374-1380.
256. Venglat S.P., Sawhney V.K. (1996) Benzylaminopurine induces phenocopies of floral meristem and organ identity mutants in wild-type Arabidopsis plants. Planta, 198, 480-487.
257. Vogel J.P., Woeste K.E.,.TheoIogis A., Kieber J.J. (1998) Recessive and dominant mutations in the ethylene biosynthetic gene ACS5 of Arabidopsis confer cytokinin insensitivity and ethylene overproduction, respectively. PNAS, 95, 4766-71.
258. Wendehenne D., Pugin A., Klessig D.F. and Durner J. (2001) Nitric oxide: comparative synthesis and signaling in animal and plant cells. Trends Plant Sci., 6, 177-183.
259. Wendehenne D., Durner J., Klessig D.F. (2004) Nitric oxide: a new player in plant signaling and defence responses. Current Opinion in Plant Biology, 7, 449-455.
260. Werner Т., Motyka V., Strnad M., Schmulling T. (2001) Regulation of plant growth by cytokinin. PNAS, 98, 10487-10492.
261. Wolanin P.M., Thomason P.A., Stock J.B. (2002) Histidin protein kinases: key signal tranducers outside the animal kingdom. Genome biology. 3, 134. (Zhu and Inoue, 2004).
262. Yagisawa F., Mori Т., Higashiyama Т., Kuroiwa H., Kuroiwa T. (2003) Regulation of Brassica rapa chloroplast proliferation in vivo and in cultured leaf disks. Protoplasma, 222, 139-48.
263. Yamada H., Koizumi N., Nakamichi N., Kiba Т., Yamashino Т., Mizuno T. (2004) Rapid response of Arabidopsis T87 cultured cells to cytokinin through His-to-Asp phosphorelay signal transduction. Biosci. Biotechnol. Biochem., 68, 1966-1976.
264. Yanai O., Shani E., Dolezal K., Tarkowski P., Sablowski R., SandbergG., Samach A., Ori N.2005) Arabidopsis KNOXI proteins activate cytokinin biosynthesis. Curr Biol, 15, 1566-1571.
265. Yonekura-Sakakibara K., Kojima M., Yamaya Т., Sakakibara H. (2004) Molecular characterization of cytokinin-responsive histidine kinases in maize. Differential ligand preferences and response to cis-zeatin. Plant Physiology, 134, 1654-61.
266. Yu X., Sukumaran S., Marton L. (1998) Differential Expression of the Arabidopsis Nial and Nia2 Genes Cytokinin-Induced Nitrate Reductase Activity Is Correlated With Increased Nial Transcription and mRNA Levels. Plant Physiology, 116, 1091-1096.
267. Zemojtel Т., Frohlich Т., Palmieri M.C., Kolanczyk M., Mikula I., Wyrwicz L.S., Wanker E.E., Mundlos S., Vingron M., Martasek P. and Durner J. (2006) Plant nitric oxide synthase: a never-ending story? Trends Plant Sci., 11, 524-525.
268. Zhang, K. Letham, D.S. John, P.C. (1996) Cytokinin controls the cell cycle at mitosis by stimulating the tyrosine dephosphorylation and activation of p34cdc2-like HI histone kinase. Planta, 200, 2-12.
269. Zottini M., Costa A., De Michele R., Ruzzene M., Carimi F. and Lo Schiavo L. (2007) Salicylic acid activates nitric oxide synthesis in Arabidopsis. J. Exp. Bot., 58, 1397-1405.d^71. БЛАГОДАРНОСТИ
-
Ломин, Сергей Николаевич
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2008
-
ВАК 03.00.12
- Исследование структурных основ лигандной специфичности рецепторов цитокининов
- Исследование взаимодействия с лигандами цитокининовых рецепторов арабидопсиса и кукурузы
- Регуляция транскрипции цитокинин-связывающим белком 70 кД кукурузы
- Анализ роли малой ГТФ-азы RАВ7 в эндоцитозе рецептора эпидермального фактора роста
- Новый тип протеолитического процессинга урокиназы
