Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Протекторная фнукция амарантина при действии УФ-А облучения

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Протекторная фнукция амарантина при действии УФ-А облучения"

На правах рукописи

РГо ОД

- 8 СЕН т

гинс

Мурат Сабнровнч

ПРОТЕКТОРНАЯ ФУНКЦИЯ АМАРАНТИНА ПРИ ДЕЙСТВИИ УФ-А ОБЛУЧЕНИЯ

03.00.12-физиология растений 03.00.02- биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2000

Работа выполнена в ГП НИИ «Полюс» и лаборатории физиологии и биохимии растений в НИИ селекции и семеноводства овощных культур РАСХН.

I

Научный руководитель: доктор биологических наук

профессор Э.А. Гончарова

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

профессор И.М. Магомедов

доктор технических наук профессор В.Н. Красильников

Ведущая организация: Агрофизический институт РАСХН

Защита состоится 26 мая 2000 г. в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д 020.18.02 при Государственном научном центре РФ - Всероссийском научно-исследовательском институте растениеводства им. Н.И. Вавилова по адресу: 190000, Санкт-Петербург, ул. Большая Морская, 44. Факс (812) 311-87-62

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского НИИ растениеводства им Н.И. Вавилова

Автореферат разослан«20» апреля 2000 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор биологических наук, Э.А. Гончарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность исследования. Амарантин - красный пигмент растений рода АтагатЬиБ (порядок Сешгозрегтае) относится к группе беталаиновых пигментов, а именно, бетацианинам, который способен накапливаться в.значительных количествах в различных органах растения. По своей природе пигмент относится к алкалоидам, многие из которых являются физиологически активными соединениями. Выяснение способности амарантина проявлять биологическую активность в модельных системах может помочь в познании роли амарантина в жизнедеятельности растения.

Биологическая роль бетацианинов и, в частности, амарантина до сих пор не ясна. Предполагается, что беталаиновые пигменты способны выполнять защитную функцию при стрессах. Однако механизмы защитно-приспособительных реакций для этих пигментов неизвестны. Пластидным пигментам высших растений отводится важная роль в адаптации к различным экологическим стрессам (Удовенко, 1979,1981; Гончарова, 1986,1995). Учитывая, что родиной красноли-стных форм амаранта являются высокогорные районы Латинской Америки и Юго-западной Азии (Соуаз, 1996), где растения подвергаются интенсивной солнечной радиации, особенно в ультрафиолетовом диапазоне, актуальными являются исследования биологического действия длинноволнового УФ-А света на содержание амарантина и фотосинтетических пигментов в листьях амаранта. Знание количественных закономерностей изменения содержания амарантина в условиях фотостресса и их взаимосвязи с накоплением пластидных пигментов имеют существенное теоретическое и практическое значение.

Цель п задачи исследований. Целью настоящей работы является изучение механизмов протекторной функции пигмента амарантина при действии УФ-А света.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:

1. Изучить физико-химические свойства амарантина и его биологическую активность.

2. Изучить содержание амарантина и пластидных пигментов в семядольных листьях проростков амаранта при действии света, темноты и УФ-А света.

3. Исследовать действие дополнительного к естественному освещению УФ-А света, на содержание пигментов в листьях разного возраста амаранта.

4. Изучить антиоксидактную активность амарантина и возможные механизмы его действия.

Научная новизна исследования. Впервые показана способность УФ-А света индуцировать биосинтез амарантина в семядольных листьях этиолированных проростков амаранта. Обнаружено, что биологическая эффективность воздействия одинаковых потоков УФ-А радиации на содержание амарантина и пластидных пигментов различна для листьев неодинакового возраста.

Впервые выявлена антиокислительная активность амарантина в водной системе гемоглобин-НгСЬ-люминол, в которой амарантин является эффективным перехватчиком активных форм кислорода, а в гетерогенной системе липо-сом, пигмент является ингибитором свободнорадикальных реакций перекисно-го окисления липидов мембран липосом, индуцированных ионами Ре2+. Обнаружено, что амарантин ингибирует образование супероксид радикалов в системе с использованием пептида глицилтриптофана и фотосенсибилизатора рибофлавина, инициирующего окисление глицилтриптофана преимущественно по радикальному пути с участием О?

Впервые в модельной системе с изолированными хлоролластами обнаружено ингибирующее (5х10'5 М) и стимулирующее (5х10"8 М) действие амарантина на электронный транспорт по нециклическому и псевдоциклическому пути. Выявлено неоднозначное влияние амарантина на показатели медленной индукции флуоресценции и термолюминесценции: при концентрации амарантина 10"5 М относительная светосумма полосы А уменьшалась в 2 раза, а при концентрации 10~6М - увеличивалась на 40%, что свидетельствовало о различной эффективности функционирования ФС2 в присутствии амарантина.

Научна-практическая значимость работы. Полученные результаты имеют прежде всего теоретическое значение, расширяя наши представления о

возможности регуляции синтеза амарантина и фотосинтетических пигментов УФ-А светом в листьях проростков и вегетирующик растений амаранта, а также биологической и антиоксидантной активности амарантина и механизмах его возможного действия.

Получение амарантина из листьев краснолистных видообразцов амаранта, выяснение особенностей их образования при действии УФ-А радиации и от возраста растения может найти применение в промышленной биотехнологии для получения растительного пищевого красителя, экономически более эффективного по сравнению со свекольным. Запатентован способ получения красителя «Амфикра» из листьев амаранта (патент N 2118971), антиоксидантные свойства (патент N 2140432) и получен гигиенический сертификат на его использование. Амарантин как водорастворимый антиоксидант может найти применение в пищевой промышленности в качестве пищевой добавки, а также в клинике, где практически отсутствуют натуральные водорастворимые антиоксидан-ты.

Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы докладывались и демонстрировались на I, II и III Международных симпозиумах "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования" (Пущино, 1995, 1997, 1999); Международной конференции по действию УФ- и синего света (Марбург, 1996); I Всероссийской конференции фотобиологов (Пущино, 1997), XII Международном конгрессе фотобиологов (Вена,1997), II съезде фотобиологов (Пущино, 1998).

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 22 работы.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, экспериментальной части, содержащей три главы, заключения, выводов и списка литературы.

Работа изложена на страницах машинописного текста и содержит 8 таблиц, 46 рисунков. Список литературы включает 230 источников, из которых 91 принадлежит зарубежным авторам.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Обзор литературы.

В первой части раздела представлены сведения о распространении бета-лаиновых пигментов в растительном мире, их классификации, структуре, биохимической функции, а также путях биосинтеза бетацианинов и его световом контроле. Во втором разделе представлены сведения о влиянии ультрафиолетового облучения на содержание пигментов, жизнедеятельность растений и их защитно-приспособительных реакциях, а в третьем - представлен обзор по ан-тиоксидантам, и их роли в процессе свободнорадикального окисления.

2. Объекты и методы.

Объектами исследования являлись проростки и растения краснолистных видообразцов амаранта - Amaranthus tricolor L., Amaranthus cruentus L., и других видообразцов. Семена были получены из мировой коллекции растительных ресурсов Всероссийского НИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова.

Этиолированные проростки проращивали из семян в темноте и на свету в течение 7 суток при температуре 27°С в чашках Петри на дисках из фильтровальной бумаги в 3-4 слоя, смоченных водой. Растения выращивали в сосудах в оранжерее и открытом грунте: на опытных полях ВНИИССОК и Пушкинских лабораторий ВИР.

Содержание хлорофиллов а и Ь, и каротиноидов определяли спектро-фотометрически в этанольных и ацетоновых экстрактах растительного материала, рассчитывая по формулам (Lichtentaller et al., 1982). Количество амаран-тина в водных растворах определяли с использованием коэффициента молярной экстинкции 5,6 х 104 (Piatelly et al., 1969).

Потенциальную способность электронтранспортной цепи (ЭТЦ) осуществлять перенос электронов от воды к ДХФИФ, НАДФ, на феррицианид калия или молекулярный кислород определяли потенциометрическим и спектроскопическим методами в условиях раздельного функционирования каждого из этих акцепторов. (Лысенко с соавт., 1987).

Антиоксидантную активность амарантина . определяли хемилюминес-центным (ХЛ) методом в водной системе НЬ-ЬЬОг-люмшгол (Теселкин с соавт., 1997) и в липидной, гетерогенной системе, представляющей собой суспензию мембран липосом, сформированных из суммарной фракции фосфолипидов желтка яиц (Дремина с соавт., 1993). Для исследования антиоксидантных свойств амарантина был использован фотохемилюминесцентный метод, моделирующий окисление белков в присутствии фотосенсибилизатора рибофлавина (Лозовская, Сапежинский, 1993). Активность супероксиддисмутазы (СОД), определяли как указано в работе (Giannopolitis, Ries, 1977), глютатионредуктазы (ГР) определяли по методу (Yoyoce, Hess, 1980) и содержание малонового ди-альдегида (МДА) измеряли в экстрактах листьев по методу (Андреева и др., 1988).

Источником длинноволнового УФ-А света служила экспериментальная люминесцентная лампа АЭ-30 с максимумом излучения при 353 нм, мощностью 30 Вт. Лампа изготовлена в лаборатории люминофоров института ГИ-РЕДМЕТ. Освещенность естественного света составляла от 5 до 40 клк. Измерения ХЛ осуществляли на хемилюминометре ХЛМ-3 «БИКАП», Москва. Кинетика ХЛ обрабатывалась с помощью системы Macintosh LC II-MacLab/2e (ADJnstruments, Австрия). Для работы использовали спектрофотометры: «Hitachi» 557 (Япония), «SpecordUV WIS» (Karl Zeiss ГДР), «СФ-16» (Россия).

В таблицах и на графиках приведены результаты средних арифметических величин и стандартные ошибки для трех независимых экспериментов.

З.Экспернментальная часть.

3.1. Физико-химические свойства и биологическая активность амарантина.

Первым этапом работы явилось исследование количества пигментов у красноокрашенных видообразцов амаранта., направленное на выявление перспективных форм с высоким содержанием амарантина. По интенсивности окраски листьев, стебля и соцветия растения этой культуры были объединены в 6 групп, отобрано восемь образцов амаранта с интенсивной окраской листьев, у трех из них выявлено наиболее высокое содержание амарантина: К-9'9, вр. к-

124, к-87. Таким образом, листья овощных форм амаранта вида A. tricolor L. и ряда его разновидностей представляют собой растительное сырье с высоким содержанием пигмента амарантина, которое можно использовать в пищевой промышленности для получения пищевого красно-фиолетового красителя.

3.1.1. Выделение амарантина.

Разработан способ получения амарантина, включающий гомогенизацию свежего материала( листья, соцветия, черешки), экстракцию, центрифугирование, гельфильтрацию на сефадексах G-50 и G-25. Выделены препараты амарантина с соотношением D537/D 280 от 1,9 до 3,9. Лиофильно высушенный ама-рантин хранился при комнатной температуре в целлофановой упаковке в течение 3 лет без потери интенсивности окраски и свойств.

3.1.2. Физико-химические свойства амарантина.

В твердом виде амарантин представляет собой аморфное вещество красно* фиолетового цвета с металлическим блеском. Пигмент хорошо растворим в воде и метаноле, нерастворим в органических растворителях. Характерной особенностью водных и водно-спиртовых растворов амарантина является их устойчивость при действии разных факторов. Интенсивность окраски пигмента не изменялась в широком диапазоне рН (4,5-9,0), а инкубирование амарантина при 80°С в течение 20 мин. вызывало снижение интенсивности окраски только на 15-20 %.

В спектре поглощения водного раствора амарантина имеются максимумы в УФ-области 270 нм и в зеленой 537 нм. Молекула амарантина состоит из аг-ликона и углеводной части, включающей в свой состав молекулу глюкозы и глюкуроновой кислоты. Особенностью строения агликона является наличие двойных сопряженных связей и двух реакционноспособных атомов азота, которые могут обуславливать его биологическую активность.

3.1.3.Влияние амарантина на ростовые и биосинтетические процессы.

Замачивание семян в растворе амарантина или их предварительная 30

мин. обработка амарантином в зависимости от концентрации алкалоида стимулировало или ингибировало ростовые процессы, биосинтез амарантина и пла-

стидных пигментов в проростках овощных культур. Амарантин в концентрации Ю"3 М ингибировал прорастание семян, рост корешка, длину гипокотеля и вес проростков у семян амаранта, капусты, лука, томатов и огурцов в первые сутки прорастания семян, а при концентрациях I О"4-10"8 М стимулировал эти показатели. Однако, для каждой культуры была выявлена определенная стимулирующая концентрация амарантина. Таким образом, представленные данные свидетельствуют, что амарантин, подобно ИУК, стимулировал или ингибировал рост и биосинтез пигментов в проростках овощных культур в зависимости от концентрации пигмента.

3.1.4. Влияние амарантина на электронный транспорт в хлоропластах. Исследовали влияние различных концентраций амарантина на транспорт электронов от Н20 к ФС1 в модельной системе с изолированными хлоропластами амаранта. Сравнивали перенос электронов по нециклическому пути (реакция Хилла), и псевдоциклическому пути (реакция Мелера). Оказалось, что амарантин в узком диапазоне концентраций (5x10"8 М) оказывает стимулирующее действие на оба типа переноса электронов (табл. 1). Более высокие концентрации амарантина (1 Ох"7 М) практически не влияли на скорость электронного

Таблица 1.

Влияние амарантина на электронный транспорт в модельной системе с изолированными хлоропластами

Концентрация амарантина, М Реакция Хилла(выделение Ог), мкмоль О2МГ 4 хлорофилла ч"1 Реакция Мелера (выделение Ог), мкмоль О2 мг"1 хлорофилла г"1

0 47±4 15±2

5x10-8 103±15 29±7

1x10-7 56±10 24±5

5x10-5 11±3 4±1

транспорта, тогда как в концентрации 5x10'5 М и выше амарантин подавлял нециклический и псевдоциклический перенос электронов. Исходя из этих данных, можно считать, что влияние амарантина на интенсивность электронного транспорта в хлоропластах связано с его действием на уровне одного из переносчиков цепи электронного транспорта, возможно, на уровне ФС2.

3.1.5. Влияние амарантина на параметры термолюминвсценции.

О влиянии амарантина на медленную индукцию флуоресценции (МИФ) и термолюминвсценции (ТЛ) при введении пигмента в жилку листа бобов или при выращивании растений на растворе амарантина судили ио изменению кривых ТЛ и величине изменения светосумм полос А и С по сравнению с контролем. Изменения относительной светосуммы полосы А показано на рис 1. При концентрации амарантина 10'5 М относительная свегосумма полосы А уменьшалась в 2 раза по сравнению с контролем. При концентрации раствора амарантина 10"6 М и 10"4 М наблюдалось увеличение относительной светосуммы полосы А на 40%. Ранее было установлено, что увеличение относительной светосуммы полосы А связано со стимуляцией функционирования ФС2 (Юрина с соавт.1992). Амарантин в концентрации 10'5 М снижал эффективность функционирования ФС2, возможно, за счет уменьшения эффективности переходов Б/—»Бз+ водорасщепляющего комплекса.

Ц*. с. Рис. 1. Изменения относительных светосумм 1 -5 полос А и С термолюминесценции листьев

бобов при введении амарантина в жилку 1.0 листа.

0.5

При введении в жилку листа растворов

0,0 амарантина всех концентраций относитель-А

ная светосумма полосы С уменьшилась на 30

10-3 юТ^Т4——/

10-* Контроль, % (рис. 1), что, по нашему мнению, указыва-

Концешрадаяатраитина ет на повышение прочности мембран тила-

коидов под действием амарантина. В работе (Солнцев, 1989) было высказано предположение, что полоса С, по крайней мере, частично, обусловлена окислительными реакциями продуктов деструкции мембран хлоропластов, образующихся при замораживании образцов. По-видимому, амарантин в нашем случае проявил антиоксидантное действие, подобное влиянию антиоксиданта кверце тина на светосумму полосы С ТЛ. Следует подчеркнуть, что эффект уменьше-

ния относительной светосуммы полосы С не зависит от изученной концентрации растворов амарантина.

Таким образом, выявлено в зависимости от концентрации алкалоида, стимулирующее или ингибирующее действие амарантина на транспорт электронов в хлоропластах и ростовые процессы, которое может быть связано с антиокислительным свойством молекулы пигмента.

3.2. Действие света и УФ-А радиации на содержание амарантина в проростках и листьях амаранта.

В литературе представлены неоднозначные данные по действию света на содержание амарантина. Указывается, что некоторые краснолистные виды амаранта, например А. сгиепШз и А. саисЫиз способны синтезировать пигмент в этиолированных проростках.

3.2.1. Содержание амарантина в этиолированных и световых проростках амаранта.

Для получения более полной информации о способности красноокрашен-ных форм различных видов амаранта образовывать амарантин в 7 сут. этиолированных проростках амаранта, изучали содержание амарантина в семядольных листьях и гипокотиле 32 видообразцов амаранта. Изученные образцы амаранта по способности синтезировать амарантин в темноте были разделены на 2 группы: в проростках 14 образцов амаранта не обнаружили амарантин, в то время как проростки 18 образцов амаранта содержали красный пигмент. Количество амарантина в этиолированных проростках этих образцов изменялось в широких пределах от 0,016 мкг до 0,524 мкг на проросток. Наибольшей способностью синтезировать амарантин в этиолированных проростках отличались сорт Валентина и образцы: к-99, к-23, к-185.

Высокой способностью образовывать амарантин на свету выделялись образцы к-99, к-23, к-185 и сорт Валентина. При этом интервал варьирования содержания амарантина был достаточно широк: от 0,3 до 1,2 мкг/проросток.

Исследование действия света на кинетику содержания амарантина в этиолированных листьях после 2 час. освещения светом выявило, что образование

амарантина начиналось спустя 4 час. после освещения и достигаломаксималь-ного значения через 20 час. С увеличением световой экспозиции количество амарантина возрастало. Следовательно, полученные данные позволяют предположить, что у ряда видообразцов существуют темновой и световой пути синтеза амарантина, причем соотношение этих путей по способности синтезировать амарантин различно у этих видообразцов. Видообразцы амаранта, способные синтезировать значительное количество амарантина в темноте, меньше зависят от интенсивности и продолжительности освещения. Именно этим можно объяснить противоречивость данных разных исследователей о неодинаковом действии интенсивности и продолжительности света на содержание амарантина. Более эффективно функционирует световой путь биосинтеза амарантина в проростках тех видов,. которые в темноте способны образовывать большее количество пигмента.

3.2.2. Действие УФ-А света на биосинтез пигментов амаранта.

Особое внимание привлекает проблема биологического действия длинноволнового УФ-излучения - важного экологического фактора на биосинтез пигментов, т.е. тех компонентов клетки, которые участвуют в защитно-приспособительных реакциях растения. Важно понять, как влияет УФ-излучение на прорастание семян, морфо-биологические показатели и содержание пигментов в проростках.

Действие УФ-А света на предпосевную обработку семян. Изучение действия УФ-А света на биометрические показатели, выявило стимуляцию роста корешков до 15% и гипокотеля до 8% в этиолированных проростках по сравнению с растениями, выращенными из необлученных семян, только при 10 и 30 мин. экспозициях облучения семян. При 60 мин. облучении УФ-А светом семян наблюдали увеличение длины корешка и снижение высоты гипокотеля. В этиолированных проростках обнаружили снижение содержания амарантина у сорта Кизлярец, тогда как у образцов к-99 и сорта Дон Педро наблюдали повышение количества амарантина. В световых проростках, выращенных из облученных семян,наблюдали снижение содержания амарантина и пластидных пигментов у

всех изученных образцов. Факт стимуляции биометрических показателей проростков, выращенных из облученных семян, можно объяснить способностью УФ-А света активировать синтез гормонов, например ИУК, стимулирующую ростовые процессы. Снижение содержания амарантина в световых проростках может указывать на разную чувствительность компонентов светового и темно-вого путей биосинтеза пигмента к действию УФ-А света.

Действие ультрафиолета на содержание амарантина в этнолирован-, пых проростках. В листьях 7 сут. этиолированных проростков А. степи« (К-23), освещенных в течение 10 мин,- 6 час УФ-А светом (353 нм), наблюдали возрастание содержания амарантина по сравнению с контролем (табл. 2). Жесткое облучение УФ-С радиацией (254 нм) этиолированных проростков вызывало снижение количества амарантина в семядольных листьях. Одновременное' освещение естественным светом (5 клк) и УФ-С радиацией приводило к возрастанию содержания амарантина только при 10 и 30 мин. экспозиции УФ-С. С увеличением продолжительности освещения естественным светом этиолированных проростков содержание амарантина в них возрастало. Таблица 2

Содержание амарантина в этиолированных проростках, облученных УФ и естественным светом (10"" мол/проросток).

Условия освещения Темновой контроль Экспозиция

10 мин. 30 мин. 1 час. 3 час. бчас.

УФ-А 353 нм 6,71 7,95 8,48 9,19 11,48 12,51

УФ-С 254 нм' 8,83 8,70 7,92 7,78 7,55 -

УФ-С 254 нм на фоне естественного света( 5 клк) 8,83 9,71 10,78 10,25 9,01 8,114

Естественный свет (20 клк) 8,83 10,95 13,07 13,4 14,48 23,9

Представленные данные указывают, что при воздействии УФ-А света на проростки амаранта индуцируется и стимулируется биосинтез амарантина, в то время как УФ-С облучение ингибирует образование амарантина в семядольных листьях этиолированных проростков.

Действие УФ-А радиации, дополнительной к естестпенному свету на

интенсивность процессов ПОЛ мембран и активность ферментов системы защиты от окислительной деструкции в семядольных листьях проростков.

Изучение влияния УФ- А облучения, дополнительного к естественному свету в течение 10 мин. и 4 час. на активность СОД, ГР и содержание пигментов выявило возрастание активности СОД на 48-55%, соответственно, и увеличение содержания амарантина и фотосинтетических пигментов, особенно, после 4 час. освещения (табл.3). За то же время, активность ГР и содержание продуктов перекисного окисления липидов мембран увеличилось незначительно по срав- • нению с контролем. Следует отметить, что активность ГР и содержание малонового диальдегида (МДА) существенно возрастали в контроле с 9 час. утра до 12 час. дня.

Таблица 3.

Влияние дополнительного к естественному свету УФ-А облучения на активность СОД, ГР, содержание МДА, пластидных пигментов и амарантина в семя-

дольных листьях 20 сут. проростках амаранта (Amaranthus tricolor L.)

Время экспозиции 10 мин 4 часа

Биохимические показатели Контроль Опыт Контроль Опыт

% % % %

МДА, нмоль 174 100 203 117 357 100 346 97

СОД, опт.ед 526 100 781 148 645 100 1000 155

ГР, мкмоль/мин 0,.289 100 0,323 118 0,739 100 0,779 105

Хл а, мг/г 1,067 100 1,079 101 1,063 100 1,200 113

Хл в, мг/г 0,759 100 0,767 101 0,758 100 0,820 108

Каротиноиды, мг/г 0,.400 100 0,407 102 0,405 100 0,503 124

Амарантин, мг./г 0,521 100 0,537 103 0,455 100 0,754 166

Повышение активности СОД могло быть стимулировано УФ-А облучением за счет возрастания содержания активных форм кислорода, в частности, супероксид радикала. Увеличение содержания амарантина в этих условиях освещения, позволяет предположить, что действие амарантина может быть подобно СОД, т.е. пигмент способен обезвреживать активные формы кислорода.

Действие дополнительной к естественному све!у УФ-А радиации различной интенсивности освещения на содержание амарантина и пластидных пигментов в растениях амаранта. Снижение интенсивности освещения с 40 до 4 клк и полной УФ-А радиации до 1% приводило к уменьшению

содержания пигментов в 1-ом и 2-ом настоящих листьях: при этом количество хлорофиллов и каротиноидов уменьшилось от 2 до 5 раз, резко снижаясь при 4 клк, тогда как содержание амарантина- в 8 раз. Для выяснения вопроса об эффективности влияния облучении на содержание пигментов при одинаковой интенсивности света и различной УФ радиации, дополнительно облучали растения амаранта УФ-А светом (максимум 353 нм) в течение 3 часов. Содержание амарантина и фотосинтетических пигментов в листьях закончивших рост, изменялось мало, тогда как в растущих листьях содержание амарантина и хлорофилла а существенно увеличилось при дополнительном облучении в ультрафиолетовом диапазоне.

Таким образом, накопление амарантина в листьях АДпсо1ог (к-99) в большей мере зависело от интенсивности освещения, по сравнению с содержанием пластидных пигментов. УФ-А свет эффективнее стимулирует биосинтез амарантина в растущих листьях и особенно при низкой освещенности, чем пластидных пигментов.

Действие УФ-А облучения, дополнительного к естественному свету, на содержание пигментоа в листьях разного возраста амаранта. Исследование действия 5 час УФ-А света на содержание амарантина в листьях и стеблях 45 сут. растений обнаружило возрастание содержания амарантина и фотосинте-зирующих пигментов. В то время, как 7 час. облучение УФ-А светом вызвало снижение амарантина во всех листьях (1-7) и стебле.

На рис. 2 представлены данные по изменению содержания пигментов в листьях амаранта при непрерывном 58 час. ультрафиолетовом облучении на фоне естественного освещения и темноты (ночь).Под действием длительного УФ-А облучения в листьях нижнего и среднего ярусов (старых и закончивших рост листовых пластинах},наряду с нативными пластидными пигментами, были обнаружены прочносвязанные с мембранами формы хлорофиллов и каротиноидов, которые извлекались органическими растворителями только при механическом разрушении, в то время как из молодых расту1цих (6,7,8) листьев амаранта нативные пигменты переходили в раствор ацетона или спирта в течение

10-12 часов. Появление мембраносвязанных форм хлорофиллов и каротиноидов

Хлорофилл & Хлорофилл 6

Рис 2. Содержание пигментов в листьях амаранта разного возраста при естественном (К) и дополнительном к нему УФ-А облучении в течение 58 час. (УФ).По оси ординат указан возраст листьев: 1- стареющий, 2-5 закончивший рост, 6-7 - растущие, 8 - ювенильный, по оси абсцисс указано количество пигмента в мкг/г сырой массы.

в листьях, закончивших рост (1-5), свидетельствует о фото деструкции мембран хлоропластов и, соответственно, в этих листьях наблюдали снижение амаран-тина от 40 до 60%. В молодых листьях, а также в ювенильном, выявлено резкое снижение содержания амарантина, в то время как, количество хлорофиллов в них было на уровне контроля или увеличивалось. Это позволяет предположить, что различная чувствительность к УФ-А свету пластидных пигментов в разных по возрасту листьях обусловлено степенью их защиты амарантином. Несмотря на сильное снижение красного пигмента во всех листьях (40-60 %), количество амарантина в растущих листьях после облучения в 2-3 раза превышало содержание этого пигмента в листьях, закончивших рост (с 1 -5).

Таким образом, увеличение количества амарантина при непродолжительном действии УФ-А света; или снижение его в листьях амаранта при облучении (7 час. и более), является, по-видимому, одной из защитно-приспособительных

реакций красноокрашенных форм растения амарант как единого организма, регулирующего биосинтетическую активность пигментов и их деградацию в соответствии с возрастом листа, т.е. с активностью метаболических процессов и силы стрессора.

3.3. Антиокислительная активность амарантина и возможные механизмы её действия.

Наше предположение о том, что структура молекулы амарантина и её физико-химические свойства могут обуславливать антиокислительную активность (АОА) пигмента проверяли хемилюминесцентым методом. Антиокси-дантную активность препаратов амарантина разной степени чистоты изучали в системах, инициирующих различные формы свободных радикалов.

3.3.1. Изучение антиокислительной активности амарантина в модельной системе НЬ-НгОг-люминол.

Определение антиокислительной активности амарантина проводили в водной среде на основе НЬ - Н2О2 - люминола, в которой инициировалось образование ряда радикалов: ОН", О2', Я02 и других. Введение амарантина в модельную систему приводило к изменению параметров кинетики ХЛ: понижению интенсивности свечения и увеличению латентного периода (рис. 3).

0.8-1 и^

Рис. 3. Кривые ХЛ системы Не -Н2О2 -люминол при добавлении различных концентраций амарантина. Цифры у кривых- концентрация амарантина в мкМ.

По оси абсцисс - время от момента введения Н2О2 ((показан стрелкой) мин).

По оси ординат интенсивность хе-милюминесценции ((ХЛ) отн. ед.).

о.о ^

§0.4-

10 20 Время, мин

т

30

Из рис. 4 видно, что амарантин пропорционально концентрации увеличивал длительность латентного периода хемилюминограммы и при концентрации 10 мкМ т увеличивалась в ~ 15 раз.

1,20

20 Рис. 4. Влияние амарантина на ин-

5

тенсивность (кривая 1) и латентный период (кривая 2) системы

0,80

о

НЬ-!12Оглюминол и интенсивность флуоресценции люминола (кривая 10 | 3).

0,40

0,00

О 4 8 12 С, мкМ

По оси ординат слева - изменение амплитуды ХЛ и интенсивности флуоресценции люминола (отн. ед.). По оси ординат справа - изменение латентого периода ХЛ (отн.ед.).

Одновременно, подобно СОД и другим белкам, амарантин тушил интенсивность люминолзависимой хемилюминесценции (ЛХЛ) модельной системы. Тушение амарантином ЛХЛ может быть следствием двух причин:

1. перехвата свободных радикалов, образующихся в модельной системе;

2. уменьшения квантового выхода излучательного перехода люминола, который используется в данной модельной системе в качестве активатора свечения.

Как видно из рис. 4, амарантин не влияет на интенсивность фотолюминесценции люминола. Следовательно, можно думать, что все тушение ЛХЛ модельной системы, которое оказывает амарантин во всем интервале использованных концентраций (0-10 мкМ), обусловлено его способностью к перехвату радикалов, образующихся в данной модельной системе.

3.3.2. Изучение антиоксидантных свойств амарантина в системе липосом.

Для изучения АО свойств амарантина использовали Ре2+ индуцированную ХЛ суспензии липосом, сформированных из общей фракции фосфолипи-дов желтка яиц в Трис-НС1 буфере. При введении амарантина в суспензию липосом (рис.5) было обнаружено уменьшение длительности латентного периода и уменьшение интенсивности медленного свечения ХЛ. Известно, что длительность латентного периода хемилюминограммы определяется скоростью убыли "критической" концентрации двухвалентного железа (Владимиров, Аргаков, 1972). Следовательно, амарантин уменьшает длительность латентного периода

1.2-

^0.8 4 1

5 0.4 -0.0-

[ Рс(2+)

Рис.5. Кривые ХЛ суспензии липосом при добавлении различных концентраций ама-рантина. Цифры у кривых - концентрация амарантина в мкМ. По оси абсцисс - время от момента введения Ре2*(показан стрелкой) (мин). По оси ординат - интенсивность ХЛ (отн. ед.).

ю

Время, мин

20

ХЛ, подобно веществам, окисляющим или хелатирующим ионы Ре . Действительно, нами была показана способность амарантина образовывать комплекс с

ионами Ре2\ Результаты титрования суспензии липосом амарантином приведе-

1.2-

8 0 8-3

о 0.4-

0.0-3

Рис. 6. Влияние амарантина на интенсив-г1'2 ность (кривая 1), на латентый период (кривая 2) ХЛ суспензии липосом, накопление ТБКАБ в процессе окисления ли-0.8 посом (кривая 3) и флуоресценцию кума-о рина (кривая 4). По оси абсцисс - кон-$ центрация амарантина (мкМ).По оси ординат слева изменение амплитуды ХЛ, накопления ТБКАП и интенсивности флуоресценции кумарина (отн. ед.). По оси ординат справа — изменение ла-

с-о.о

тентого периода ХЛ (отн.ед.).

100 С. ткМ

■ 200

ны на рис.б. Видно, что наиболее яркий эффект амарантина проявился в изменении т хемилюминограммы. Уже в концентрации 15-20 мкМ длительность латентного периода уменьшилась по отношению к контролю с 1,0 до 0,25, т.е. в 4 раза. Уменьшение интенсивности хемилюминесценции, обнаруженное при титровании липосом амарантином, совпало с динамикой накопления вторичных продуктов перекисного окисления липидов липосом, измеренных в аликвотах, взятых из кюветы хемилюминометра на момент времени достижения амплитуды медленного свечения. Это свидетельствует о том, что амарантин, кроме хе-латирования Ре2+, является перехватчиком пероксильных радикалов, образующихся в липидной фазе мембран липосом.

т АОА

Е2 Конхамрашина

3.3.3. Изучение АОА амарантина в системе, моделирующей образование

белка.

Антиокислительную

___________способность амарантина определяли в системе с использованием глицилтриптофана и фотосенсибилизатора рибофлавина, . преимущественно инициирующего образование супероксид радикала. При изучении антиокислительных свойств экстрактов амарантина было обнаружено, что АОА исходного экстракта составляет 5 ООО. Для того чтобы выяснить вклад амарантина в АОА, измеряли действие отдельных фракций, полученных методом хромотографии на се-фадексе вбО.Как видно из диаграммы, представленной на рис 7, с возрастанием концентрации амарантина антиокислительная активность увеличивалась. Зависимость между концентрацией амарантина и АОА на начальном участке являлась линейной

он-

Нэкерфраодт

Рис. 7. Относительная антиоксидантная активность амарантина и его концентрация в последовательно выделенных фракциях (по логарифмической шкале).

АОА

Концртрация аыарангат, ыМ

Рис. 8. Зависимость антиокскдантной активности от концентрации амарантина.

(рис.8). Полученные данные по антиокислительной активности амарантина свидетельствуют, что одна из возможных функций пигмента в растении может быть связана с фотозащитой компонентов клетки от повреждающего действия

активных форм кислорода и перекисных радикалов, возникающих при облучении УФ-А светом.

Заключение.

Алкалоид амарантин относится к вторичным соединениям, который в большом количестве накапливается в краснолистных видообразцах растений амаранта. Представленные в работе данные свидетельствуют, что амарантин как антиоксидант может выполнять в растении протекторную функцию, защищая компоненты клетки от разрушающего действия высокой интенсивности света, в том числе в УФ-А диапазоне. Развитие фотоиндуцированных реакций, связанных с образованием АФК и CP, в листьях, закончивших рост, приводит к резкому снижению амарантина менее 0,6 мг/r и появлению прочносвязанных с мембраной пластидных пигментов. В то время как в активно растущих листьях снижение амарантина происходило до 0,9 мг/г, при этом содержание пластидных пигментов оставалось на уровне контроля, а в ювенильном их количество возрастало. Это косвенно указывает, что образование АФК и CP в клетке контролируется системой защиты, участником которой является и амарантин, расположенный в клетках эпидермиса, обкладки и мезофилла-Концентрация амарантина 0,9 мг/i} мы предполагаем, является критической, уменьшение которой приводит к неконтролируемому развитию СРР в цитоплазме и фотодеструкции пластидных мембран. На основании представленных данных можно заключить, что ш vivo амарантин способен:

1. поглощать свет в зеленой и УФ-А области спектра, что приводит к ослаблению интенсивности действующего светового излучения;

2. ингибировать образование активных форм кислорода и свободных радикалов, образующихся при облучении УФ-А светом;

3. образовывать комплексы с ионами переменной валентности, в частности железой, медью, цинком, которые катализируют или регулируют свободно-' радикальные реакции.

Количество амарантина,наряду с другими водорастворимыми компонентами защитной системы клетки (например, СОД),возрастает на начальном этапе

развивающегося фотоиндуцированного стресса, что является защитно-

19

приспособительной реакцией, посредством которой антиоксиданты защищают компоненты клетки от губительного действия активных форм кислорода.

Универсальность действия амарантина с учетом того, что в листьях он содержится в значительном количестве, позволяет считать амарантин реальным ингибитором свободнорадикальных реакций in vivo. При этом пигмент выполняет защитную функцию уже на первых этапах образования активных форм кислорода в гидрофильной среде, тогда как известные растительные пигменты -антиоксиданты - каротиноиды защищают мембранносвязанные компоненты в гидрофобной среде.

Таким образом, образование амарантина имеет приспособительный характер к световому освещению и одной из его функций является защита компонентов клетки от активных форм кислорода, в частности, супероксид радикалов, образующихся в ней при действии УФ-А - радиации и высокой интенсивности света.

Выводы.

1. Эффективность биосинтеза амарантина при различной интенсивности освещения и УФ-А света является объектом регуляции со стороны целого растения и представляет собой защитно-приспособительную реакцию организма к световым условиям среды. Обнаружено увеличение содержания амарантина в листьях разного возраста и стебле при кратковременном облучении УФ-А светом (до 5 час.) и снижение количества амарантина при длительном (до 58 час.) УФ-А облучении.

2. Впервые обнаружено новое свойство амарантина - антиоксидантное и выявлены возможные механизмы его протекторного действия. Показана способность амарантина:

а) перехватывать активные формы кислорода в модельной системе

НЬ-НгОг-люминол;

б) ингибировать образование свободных радикалов в модельной системе липосом;

в) образовывать комплексы с ионами переменной валентности;

г) ингибировать образование Оггв модельной реакции окисления глицил-триптофана в присутствии сенсибилизатора- рибофлавина;

3. Показано, что амарантин является биологически активным веществом:

а) амарантин стимулирует ростовые процессы проростков и биосинтез пигментов в концентрации 1СГ4 М- 10"8 М в зависимости от вида и сорта растения и ингибирует при меньших концентрациях алкалоида;

б)в модельной системе с изолированными хлоропластаМи обнаружено ингибирующее (5х10"5 М) и стимулирующее (5х10"8 М) действие амарантина на электронный транспорт по нециклическому и псевдоциклическому пути;

г) оказывает неоднозначное действие на параметры термолюмин. сцен-ции, уменьшая относительную светосумму полосы А при концентрации 10"5 М в 2 раза, тогда как при концентрации 10'6 и 10"4 наблюдали увеличение этого показателя на 40 %; светосумма полосы С уменьшилась на 30 % при всех исследованных концентрациях, что свидетельствует о влиянии амарантина на активность ФС 2 и прочность мембраны .

4. Установлено, что этиолированные проростки 14 образцов амаранта,из изученных 32,не синтезируют амарантин в семядольных листьях, в то время как проростки 18 образцов в темноте образуют амарантин в количестве от 0,016 мкг до 0,524 мкг/проросток. Наибольшей способностью синтезировать амарантин в этиолированных проростках и на свету отличались образцы к-99, к-23, к-185, к-103, сорт Валентина в пределах от 0,7 до 1,2 мкг/проросток.

5. Выявлены образцы амаранта с высоким содержанием амарантина и разработан способ выделения амарантина и получения пищевой добавки - ан-тиоксиданта «Амфикра» из листьев амаранта.

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Екобена А.П., Гинс М.С., Солнцев М.К., Кукушкин А.К. Изменениелю-минесцентных параметров листьев амаранта в онтогенезе // Материалы I международного симпозиума «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования». Пущино. 1995. С.23-25.

2. Гинс В.К., Кононков П.Ф., Гипс М.С. Перспективы получения красителей на базе беталаиновых пигментов // Научные труды ВНИИС-СОК.1995. С.288-300.

3. Кононков П.Ф., Пивоваров В.Ф., Гиренко М.М., Струкова Л.В., Гинс М.С. Изучение овощных форм амаранта по содержанию пигментов в листьях //Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук . 1995. N5.C. 20-21.

4. Гинс М.С., Савельев 11.И. Действие УФ-А излучения на биосинтез амарантина в семядольных листьях амаранта //Тезисы докл. I Всероссийской конференции фотобиологов. Пущино. 1996.С.66.

5. Екобена А.П., Солнцев М.К., Гинс М.С. Особенности УФ-воздействия на некоторые С4-растения //Тезисы докл. I Всероссийской конференции фотобиологов. Пущино. 1996. С. 69.

6. Gins M.S., Charlamova S.I., Kononkov P.F. Savelev I.I., Effect of UV-radiation on amaranthion biosynthesis // Abstracts 12-Intemational Congress on Photobiology. Vienna. Austria. 1996. P. 237.

7. Gins V.K., Ecobena F., Solntsev M.K., Gins M.S. Slow fluorescence induction during ontogenesis in C4-plants // Abstracts 12-th International congress on Photobiology. Vienna. Austria. 1996. P. 296.

8. Gins V.K., Gins M.S. UV-blue light control of amaranthin sinthesis in in-solated Amaranthus cotyledons // UY-blue light: perception and responses in plants and microorganisms. Marburg. 1996. P. 89.

9. Гинс B.K., Кононков П.Ф., Гинс М.С. Амарант - перспективная культура XXI века // М:ПХУ " Отечество ". 1997.160 с.

Ю.Лысенко Г.Г., Гинс В.К., Гинс М.С. Изучение псевдоциклического транспорта электронов у зелено- и краснолистных видов амаранта // Материалы II Международного симпозиума «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования». Пущино. 1997. С. 4850.

11 .Гинс В.К.,Балахнина Т.Н.,Кононков П.Ф., Гинс М.С. Влияние УФ-А

радиации на интенсивность процессов перекисного окисления мем-

22

бран и систему защиты от окислительной деструкции в семядольных листьях Amaranthus tricolor L.// Материалы II Международного симпозиума «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования». Пущино 1997.С.65-68.

12.Гинс М.С. Возможный механизм воздействия УФ-А света на биосинтез амарантина в семядольных листьях амаранта. // Материалы II Международного симпозиума «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования»Пущино. 1997.С.63-64.

13.Гинс М.С., Кононков П.Ф., Гинс В.К., Клебанов Г.И., Пивоваров В.Ф. Антиоксидантная активность растительного красителя "Амфикра" из листьев Amaranthus cruentus L. // Материалы II Всероссийского съезда фотобиологов Пущино. 1998. С. 322-324.'

14.Кононков П.Ф., Гинс М.С. Амарант - перспективная культура XXI века. //М: Изд. РУДН.1998.312 с.

15.Пивоваров В.Ф., Гинс М.С. Изучение механизма антиоксидантной активности амарантина из листьев амаранта // Тезисы международной научно-практической конференции МАИ, М. 1998. С. 113-118.

16.ГинсМ. С., Кононков П.Ф., Лысенко Г.Т., Дэсалень Т.Л., Гинс В.К. Физико-химические свойства и биологическая активность амарантина из растений Amaranthus cruentus L. // Прикладная биохимия и микробиология. 1998. Т.34. № 4. С. 460-464.

17. Гинс В.К., Кононков П.Ф., Гинс М.С., Кононков Ф.П. «Способ получения натурального красно-фиолетового пищевого красителя». 1998. Патент №2118971.

18. Кононков П.Ф., Пивоваров В.Ф., Гинс В.К., Мельник Л.С., Гинс М.С. Биология развития овощных форм амаранта// Материалы VI Международной научно-практической конференции «Рынок и управление», М. 1999. С. 76-89.

19.Гинс М.С., Лозовская Е.Л. Возможная роль амарантина в защитно-приспособительных реакциях амаранта // Материалы III Международ-

ного симпозиума «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования »Пущино. 1999. С.48-51.

20.Гинс М.С., Гинс В.К., Коненков П.Ф., Васильева О.В., Любицкий О.Б., Пивоваров В.Ф., Клебанов Г.И. Возможные механизмы антиоксидант-ной активности растительного красителя «Амфикра» из листьев Аша-ranthus cruentus L // Материалы III Международного симпозиума «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования», Пущино. 1999. С. 16-19.

21.Пивоваров В.Ф., Гинс М.С. Формирование антиоксидантного пула в листьях амаранта при действии длинноволнового ультрафиолета // Сб. науч. тр. «Рынок и управление» отделение информатизации АПК Международной академии информатизации. М. 1999. С. 73-76.

22.Гинс В.К., Кононков П.Ф. Пивоваров В.Ф., Гинс М.С., Кононков П.Ф. Антиоксидант.1999. Патент № 2140432.

¿($0 (902,-ем* / и.,*--I

7 J-c-Co&gci, <уУ 3. Tt/tf. ¿//7£ /"/jC/S.