Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение проникновения в ткань мозга экзогенного гистона как потенциального белка-носителя лекарственных веществ

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение проникновения в ткань мозга экзогенного гистона как потенциального белка-носителя лекарственных веществ"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРОТВЕНШ УНИВБРСОТЕТ

На правах рукописи

/ЛЬ-СУ СИ ДУРАР

ИЗУЧЕНИЕ ПРОНИКНОВЕНИЯ В ТКАНЬ ШЭГА ЭКЗОГЕННОГО ГИСТОЙА КАК ПОТЕНЦИАЛЬНОГО БЕЛКА-НОСИТЕЛЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ

Специальность 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕ РА Т диссертации ка соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкг-Петербург 1992

Работа выполнена на кафедре биохимии Биолого-почвенного факультета ианкт-Петерйургского государственного университета.

Научные руководители : академик Р/ШЯ . доктор медицинских напрофессор и. П. А1ШРИН кандидат биологических наук 0. А. ГОРНЖНА

Официальные оппоненты : доктор медицинских наук, профессор Я Г. ЩЕРБАК

доктор Апологических наук, старший' научньй сотрудник С, И. ТУМАНОВА

Бедукзе учерождение : Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова РАН

Занята диссертации состояться " 4'!" тоня 1992 г\_ б 16 часов на заседании Специализированного сог-.ета К 053.57.09 по присуждению ученой степени кандидата Отологических наук в Санкт-Петербургской государственном университете по адресу 16Э034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. А. И. Горь-гего Санкт-Петербургского государственного университета

Автореферат разослан мая 1^2 г\_

Ученый секретарь Специализированного совета доцент

А. Г. ПАРКОВ

ОБЩАЯ ХАРШЕРИСТт РАБОТЫ

Актуальность проблема. Е настоящее время зкэогеиниэ гистони 'известны как антимикробные и антивирусные агенты, а также гак факторы, повыиавдке неспецсфическуп резистентность организма, благодаря способности опсонизировать бактерия и стимулировать фагоцитарную и баетерицидиу» акт'/зность макрофагоз ( Лшмаршг ЯП. и др., 1972 ; Горкгаша O.A., Тишюша Т.Е., 198-1 ).

Как потенциальные лечеС-нкэ средства, гистоны привлекает внимание исследователей, благодаря тому, что они обладают низкой токсичностью, незначительной антигекностью, способностью проходить через Отологические мембрана и понимать их проницаемость для других веществ. Возможность использования гистонов в качестве агентов, повышают« проницаемость клеточных мембран для антибиотиков, узта нашла свое подтверждение : в эксперименте обосновано применение гистонов как средства, потевцирукяэго гютивоту-баркулезное действие изониазида (Ашмарш И. IL и др., 1S31).

Особенно перспективным представляется использование гистонов для переноса фармакологических агентов,- слабо вроникиодкх через тканевые барьеры,в такой важный орган, как головной мозг.

Поступление лекарств к яейропептидов в мозг ограничивается гематоэнцефалическим барьером - сарьером меляу нервными клетками и элементами микроциркулярного русла. Капилляры мозга характеризуются избирательной проницаемостью для прохождения определенных молекул, что связано с наличием так называемых плотных контактов, формируемых эндотелиальными клетками в Сольшинстг.е мозговых капилляров, что отличает их от множества других капилляров.

в недавних исследованиях, проведенных на изолированных капиллярах мозга, было показано наличие в них рецепторов для ряда макромолекул - таких пак инсулин, трансфэррин, катионизироваиньй альбумин, катионизированный иммуноглобулин G. Эти соединения опосредуют трансцитов веществ через эндотелий капилляров мозга, т.е. через гемагознцефалический барьер (Pardridga Vi.М., 198В).

Существуют различные способы целенаправленной доставки лекарственных веществ в моаг : инвазивные, фармакологические и Физиологичные. Развитие последних основано иа использовании специфических транспортных систем, в которых петранспортируемнэ через

гематоэнцефалический барьер пептиды - бета-эндорф;ш, интерферон, интерлейюшы, фрагменты антител, ковалентно связываются с транспортируемым белком, например, инсулинок. или трансферриком, и этот комплекс подвергается рецепто, -опосредованному переносу через гематоэнцефалический барьер (Рагс1г1с&е V. М., 1986 ; Раг<3г1с1еэ V. М. еЪ а1. , 19ЭО). ,

В настоящэе время ведется поиск новых веществ, проникающих через гематоэнцеф-ишческий барьер, поскольку не всегда возможно использовать в качестве носителя белки, обладающие эндогенной активность», таете как инсулин и трансферрии, а также белки, которые являются сильными шмуногекаш, например, катионизирован-ный альбумин или катионизированкый ишуноглобулин 3 (ТПеиого 0. еЬ а1., 1989, 1990).

Известно, что лоллкатюнвые белки, такие как протамин, полилизин и его кон'ьюгаты с ферментами, а также гистоны увеличивают проницаемость клеточных меыбран, включая ламгшарныа мембраны эндотелия капилляров мозга, для других веществ (ЗоЬее-Ьегеег Е. Е., 138? ; З^аиэЬаиги Ь. ]., 1967). Зги белки можно рассматривать как потенциальные средства для переноса штранспортируемых обычно агентов через гематоэнцефалический барьер.

Цель работ^.. Цель настоящей работы состояла в оценке возможности пронккнозенш в шаг экзогенного судааркого гистона и последующего использования его в качестве белка-носнтеля при синтезе ковалентньу. квнъюгатов с лекарственными ветестьгдш, сб-ладакзщи.с! низкой способностью проходить через тканевые барьеры.

Задачи исследования. 1. Провести количественную оценку поступления экзогенного суммарного гистона в мозг после введения меченого препарата в русло крши анестезированных крыс.

2. Оценить возможность прошкноздюга суммарного гистона в нервную чкань различных отделов мозга, используя гисторадиоав-тографический подход.

3. Разработать оптимальные условия проведения реакции кова-лентного связывания суммарного гистона с антибиотиком канамиии-ном (которик сам по себе плохо проникает в «саг) через гдутаро-вый альдегид для получения растворимых кониогатов.

4. Исследовать некоторые физико-химические свойства суммарного гистона и его кокъюгатоа с канахмцинои.

Научная иовивна работы, первые в гисторадиоавтографическом исследовании показано, что экзогенный суммарный гистон проникает

через гематоэицефалический барьер в нервную ткань определенных отделов мозга после его введения в сонную артерию анестезированных крыс. Яизико-химическими методами установлены параметры для оценки стабильности препаратов суммарного гистана, в том числе и количеств«- доступных для модификации аминогрупп. Выявлены оптимальные условия проведения реакции ковалентного связывания суммарного гистона с антибиотиком канамицином через глутаровьй альдегид. Впервые получены растворимые коягюгатн суммарного гистона с канашщино;./ и определены их некоторые физико-химические свойства.

Практическое значение работы. Обоснована возможность использования препарата суммарного гистона в качестве потенциального носителя лекарственных веществ. Заложена основа для синтеза кояъюгатов суммарного гистона о лекарственными веществами, слабо проникающими через тканевые барьеры, что расширит арсенал медикаментозных средств для лечения ряда заболеваний.

Апробация работы. Материалы диссертации обсуждены на заседания Отдела бкохтти Санкт-Петербургского государственного университета.

Публикации. Ш теме диссертации опубликована одна работа

Структура и объем работы. Ляссертацкя состоит из введения, обзора литературы, описания методов и результатов исследования, их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы (235 источников). Материал излолва на 154 станицах, содержит il рисунков и 9 таблиц. Протокольное материалы представлены а приложении.

!ШЕ?ИАЛЫ И ЛЕТ0Д1 ИССЛЕДОВАНИЯ

Для получения 14 С-сушарного гистона из ядер печени крыс животным кассой 100-140 Г ' ВНутриСрЮПИНВО вводили Д,1-2-мС~лизин моносолянокислый по 0,05-0,1 мКи или 2- №С-аде?ат натрия по 0,7-0,9 мКи (уд. вя. 35-4? мКи) на 100 г ыассы кивотного. Экстракцию гистона из очиданяых гаггерфазных ядер печени проводили раствором 0,25 а. KCl. содержащий 0,75 Ы NaCI в соотношении 1:10 (вес/объем) (Горюхина О. А., Аяшарин И. П., .1974). Радиоактивность препарата суммарного гистона, меченного 2- "С-ацетатом натрия, составляла (0,2-0,3) 10 шл/(иин-мг), а меченного ДЛ-2-^С-ЛИЗИНОМ - (1,5-4,4) 10 11МП/(ШИ'К(Г).

Суммарный гистон сернокислый из ткани тимуса кет {Реа-хим, Латвия, ifflO "Бислар") и бычий сывороточный альбуютн (Sigira, США) кодировали по стандартному методу, используя Nai!isI3 и хлорамин Т (Остермам X А., 1983). Уделънаэ активность мечень*. препаратов составила 60 ыгеКи на 1 мкг для суммарного гистона и 40 ккКи на 1 мкг для бычьего сывороточного альбумина.

В серии опытов по изучении :к>личественного распределения меченого суммарного гистона в различных отделах мозга использовали Ъ-гкстоа. Hps парат 'уС-гистона (4-8 кг) растворяли в 1 мл рас.твора Рига-ера и вводили в левьй кедудочек сердца белка крысам массой 175-200 г, которьм предварительно внутрибршшно вводили гексе-нал к через 2-10 мин осуществляли перфузию сосудистого русла через восходящую часть аорты 100 миллилитрами раствора, состоящего из 2/3 сыворотки крупного рогатого скота и 1/3 раствора Рингера. Скорость протекания жидкости составляла 3 мл/мин, отток жидкости осуществляли через вскрытое правое предсердие. Раствор для пэр-фузии содержал "гепарин в дозе 50 ед. в 1 мл. После окончания перйузии мозг извлекали," ткань из различных отделов мозга (равные навески) помешали в виалы для счета радиоактивности и солас-билизировали в 1 И раствора Hyanine hydroxide в метаноле Г Koch-Light ltd, Англия). Радиоактивность измеряли через 1-2 суток.

В опытах по гг.сторадиоавтографичаской оценке проницаемости суммарного гистона в различные структуоы мозга использовали мзченые препараты, которые вводили в правую обцуи сонную артерию анестезированных крыс по 1 мл раствора, содержащего 3-12 кот белка, что составляло 0,5 нКи на одно животное. Промывку .сосудистого русла осуществляли чера'з 10-12 мин от начала введения препарата, геж описано выше. После окончания перфузии мозг извлекали и фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина.

Для гисторадгоавтографическогэ исследования образцы шторной коры, готпокаша, гипоталамуса, юзмэчка и обонятельных луковиц фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина в течение 12-'4 ч, падле чего их заключали в парафин стандартном способом. На стекла со срезами (7 мкм) наносили эмульсии Ilforld-L4 и экспонировали в контейнерах при 4 °С в течение 4 недель. Шсле проявления образцов иетолоЕМн проявителем срезы окрашивали геыа-токсилин-эозинов а исследовали распределение "треков" радиоактивности на микроскопе Opton.

Аналитический электрофорез препаратов гистонов проводили в двух системах 16%-ного полиакриламвдного геля с 2,5 M мочевиной: в вертикальных трубочках по методу 0. Панима и Р.Чалкли (Fanium S., Chalkley R., 1969) и вертикальных пластинках по методу С.Спайкера. (Spiker S., 1980), а также в 18%.-ком полиакрюшвдном геле с ö.lS-ным додецилсулъфатом натрия по методу Дж. Томаса и Р. Коркберга (Thomas J., Kornberg- S, 1975). Определение величины молекулярной массы конъюгатов гистонов с антибиотиком канамици-ном проводили методом электрофореза в присутствии додецилсульфа-та натрия (Weber К. Oeborn М., 1969). Содержание свободных аминогрупп в препаратах суммарного гистона и антибиотика канамицина определяли в реакции с 2,4,6-тринитроСенэилсульфокксяотой по методу Б. Сарантокис и др. (Sarantonis Е. et. al., 1S86).

Конъгагаты суммарного гистона с антибиотиком канамицином получали с помощь» бифункционального сшивающего агента глутарсвого альдегида (Данилова P.A. и др., 1980; Кузнецова H.IL , Самсонов Г. В. , 1S86).

Огатистическ"» достоверность полученных результатов оценивали по критерию Стыодента-Фииера (УрбахВ., 1S53).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВШШ И П ОЕСУВДЕНИЕ

К. Лучение поступления экзогенного гистона . •

из русла крови в.различике отделы мозга

Нами поедена количественная оценка поступления '''с-гистона из русла крови в различные отделы козга крыс после введения меченого препарата в левый желудочек сердца анестезированных животных В опытах использовали ^С-гистон, меченный как^С-лизином, гак и й-^-ацетатоы натрия.

Необходимо отметить, что при получении меченого препарата суммарного гистона из ядер печени после введения животным 2- г"С-ацетата натрия в составе суммарного гистона ацетилировании подвергаются аргининбогатие фракции. Напротив, при использовании Ь-лизина болев 502 радиоактивности обнаруживается во фракции гистона НГ.

В табл. I.представлены данные опытов по распределению радиоактивности (Кр-коэффициент распределена) в четырех отделах

- б -

шага крыс (лобная доля коры, теменная доля коры, четверохолмие, дозжэчок) через 2-10 мин после введения меченого препарата гистока в левый желудочек сердца анестезированных животных.

Таблица 1

Распределение экзогенного ^С-гй'сюна в различных отделах мозга" через 2-10 мин после внутрисердечного введения препарата анестезированным крысам.

Г"-------------------- | Отдел ...... ■ 1 1 Опыты 1 I " "i Досювер-1

[шэга -1-,-,-1—] 14 ± т| Кр pOCTi« от-1

1 *| **¡ л*| **-( | личия от !

1 | 1 12 ¡3 |5 | 1 i ,f,i ..i.., ,;' i контроля, i p 1

1 1 i i Имп/ыич на 250 мг Г | •Г i

1 t сырого г-лса ткан*/ | | i i

i |ДОбЯ<Л i t i i i i 2*Ч|208|130|136| 7SU61Í31I 8,6*1,3 < 0,02 i

¡■.ОЛЯ коры 1 1 1 1 . (П-5) |

| Теменная 12111651345!220 i i 091132±43111,8+3,0 < 0,05 |

¡доля лора 1 1 1 1 1 (n-5) |

|Четверохол- 193| 951171 i 1101 - |142¿24| 6,7+4,5 < 0,02 |

¡мие 1 1 1 1 1 (n«4)|

'Козхочок 68|103|116|133| e~UC2+12| 6,6+1,0 < 0,02 1

1 i 1 1 1 1 1 (n-5)| 1 1 1 f , 1 1

1 [Ткаяь мозга 1 1 I I 1 1 45¡-68| - | | 50| 54+7 | 1

Iконтролького 1 1 ! 1 1 (n-3)|

|.КИ2ОТН0Г0 1 1 1 1 1 ! 1 i i i i ■ ■ i ......1

Л-гис.он, печенный О.Ь^С-лкзином, 1400 шп/(иин-мг); гЛ-гистон, ке«°нный 2-лС-ацетатом натрия, 225 кмл/(иин-ит);

Кр - коэффициент распределения радиоактивности, Z: иш/мин на 250 кг сырого веса тканк

-------100

имп/'мин в объеме введенного раствора гистона Видно, что активность обнаруживается во всех исследованных отделах ыогга. Зяа<; те Крсоэтааля&т 6,6tl,0 - 11,8±3 X (достоверность отличия от контроля Р< 0,02-Q, 05). Наблюдается тендеиаиа к преобладанию радиоактивности; в теменной и лобной долях коры по

сравнению с радиоактивностью, обнаруженной в ткани ¡.гасдачгл и четверохолмия (Р<0,1). Отмечено, что при увеличении срока зкспо-згаш до 10 мин (время от начача введения до начала перфузии) прироста радиоактивности в исследуемых отделах мозга не наблюдалось Это свидетельствует о том, что уравновешивание процессов поступления и выхода гиотонов ив мозга присходит уже в первые минуты после его введения.

Необходимо отметить/ что при введении животным суммарного гистона, меченного 2-^С-ацетатом натрия, радиоактивность, определяемая в образцах ткани мозга, существенно не отличалась от соответствующих значений при использовании препарата суммарного гистона, меченного -лизином, имеющего более высокую удельную активность.

Можно предположить, что связывание различных фракций гисто-поз, входяеих в состав су1,¡маркого гистона, с поверхностью эндотелия капилляров мозга различно и , по-видимому, предпочтительнее связываются аргининбогатые гистоны.

ТаюШ образом следует заключить, что поступление экзогенного суммарного гистона в мозг происходит ухз в первые 2-1С мот после введения меченого препарата в левый желудочек сердца анестезированных животных. Радиоактивность регистриуется во всех исследованных отделах мозга: в лобной доле коры, в теменной доле коры, четверохолмии и мозжечке. Количество меченого гистона. связанного с капиллярами ткани лобной доли коры, теменной доли коры было вниз, чем с кагаиляраш ткани юзяэчка и четверохол-М!я. Эти результаты в общем не противоречат данным по изучению проницаемости гематознцефалического барьера . для лизиябогатого гистона (РапЗПйёб У. М. еЪ а1., 1983). Автора!® показано, что максимальное количество ,,г5 1-лизииоогатого гистона определяется в ткани мозга через 10 мин после введения меченого препарата в сонную артерию анестезированных крыс. Поликатионные белки после введения в сонную артерию животным особенно интенсивно поступают в мозг: 19% катионизированного иммуноглобулина б и 12% катиони-зированного альбумина (Тп^иего а е1 а1., 1590). Сопоставление значений, полученных для лизинбогагого гистона, катионизированного иммуноглобулина 3 и кагюнизяроваююго альбумина, показывает, что количество лизинбогатого гистона, поступающего из капилляров в иятерстициальную жидкость юзга, ню® и составляет в?.. По мнению Падридеа В.11 и др. (Рагйпйде У. Ы 91 а1. ,1089), это

может указывать на то, что часть молекул лиаинбогатого гистока вступает ео взаимодействие с клеточными структурами, такими как ядра клеток эндотелия, при прохождении через гематознцефали-ческий барьер.

Полученные нами данные о поступлении экзогенных гистонов вз руслз крови в различные отделы мозга явились основанием для проведения исследований несколько другого типа - с учетом более тонкой морфологической локализации этого белка

íL Изучение проницаемости гематоэнцейзлического барьера • щя экзогенного гистона.

Исследование прохождения вещества через гемзтознцефали-ческий барьер на модели in vivo позволяет дифференцировать действительный транспорт веществ через гематоэнцефалический барьер в нервную т:сань мозга от их депонирования или связывания с капиллярами мозга. Суекку поступления U51-гистона в различные ' структуры мозга мы проводили гксто^здкоавтографическим методом. Применяли полуколичеетвевный визуальный способ оценки включения меченог- препарата в различные структуры мозга. Б качестве контрольного теста использовали 1451-альбумин, который, как изестно, не проходит через геыгтознцефалический барьер .

Для идентификации относительного количества радиоактивности, поступающей в юзг, была также проведена гисторадиоадаографи-ческая оценка захвата меченого препарата тканью печени. Показано интенсивное включение гиотоно. в ткзнь печени, при этом "метка" здесь располагалась равномерно над паренхимой и максимальный захват гистонов отмечался в синусах купферовскдаи клетками. В ткани мозга, напротив, наблюдали неравномерное распределение UsI-гистона в исследованных структурах. Его наибольшее коли-ч1ество было зарегистрировано в нервной ткани гиппокашта и гипоталамуса. Яри Эмм интенсивность поступления гистона в зоны гипоталамуса и гиппокампа была практически одинаковой. В гипота^а-иической области распределение "метки" было не ¡одномерным - во внеклеточных зонах гипоталамической области, т. е. в иейропиле, отмечали большее количество "мотки", чем в участках скопления клеточных ядер Постуадедав меченого гистона в нервную ткань гиппокампа в СА/ САд-, СА3 CAv-венах было также неравномерным. Однако в целом "метка" била сосредоточена в участках

скопления клеточных тел нейронов, а. в участках кейропиля ее было значительно меньше. Проникновение меченого гистона в область сенсошторной коры было ню®, чем в другие названные выше отделы мозга Поступление 5I-гистона в мозжечок было незначительным и наблюдалось во всех cuotx (зернистой, гангдиоэнеЛ и молекулярной). Незначительное проникновение гистона отмечено и в ткань обонятельных л'^тавщ.

Кроме того, наблюдали интенсивное насыщение мечеиыы гиотоном сосудистого сплетения Ш-го желудочка мозга, при этом "метка" была локализовала вдоль поверхности зндотелиальной выстилки, "треки" наблюдали как в зоне плазматической мембраны, так и в зоне базальной мембраны. Использованный в качестве контроля *1э1-альбушш не проникал в соответствующие отделы мозга. Частота встречаемости "треков" над нервной тканью мозга достоверно не отличалась от фэковой вне гистологической ткани.

Таким образом, гисторадиоавтогр'гфическое исследований выявило Факт поступления экзогенного гистона из плазмы крови в нервную ткань мозга. Южно предположить, что меченый гистон превде всего связывается с анионными участками фенестрированных ' капилляров мозга, такими как сосудистое сплетение, и проникает в жэ-Дудочки мозга> из которых в дальнейшем поступает в паренхиму различных отделов мозга. В ряде работ приводятся данные гистора- , диоавтографяческога анализа перехода катионизированных белков через геыатознцефалический барьер в паренхиму мпзга после их введения в сонную артерию анестезированных животных (Kuragai А. К. et.al., 1987; Triguero D. et al. , 1939). Авторы выссазывадат предположение о том, что транспорт модифицированных белков в эндотелий капилляров моага, по-вадиии.у, опосредован адссрбционньм трансцитозом.

Наряду с этим транспорт таких поликзтиошшх полимеров, как протамин-сульфат и поли-1.-£иаяя, через гематоэнцефалический барьер имеет, свои особенности. Это связано с тем, что они оказывают прямое действие на биологические мембраны. Виеокие дозы протамик-сульфата и поди-L-лизина при введении в сонную артерию неанестезированныы животным открывают гематоэнцефалический барьер для альбумина к икулика, которые в норме не проходит через него (Strausbaugh US., 1987). Необходимо отметит», что увеличение проницаемости геиатознцефаяичэского барьера для'Н-альбуьина показано и при внутртаргериалыюм введении 1-дкзинСогетого

гистона (Pardridge V. М. et al. , 1929). Иными слогами, ьаутриар-териалыгое введение поликатконнкх белков, таких как гистон илк протамин-суль^ат, а<мет приводить к увеличению проницаемости капилляров мозга, тогда' как виутриартериальное введение модифицированных поликатиоаных белков (иммуноглобулин S и альбумин), по видимому, не вызывает подобных изменений.

В настоящей работе показано, что суммарный гистон, подобно дизинбсгатоыу гистону, инсулину, транс&'ррину, катионизированно-му альбумину и катмонизированному иммуноглобулину G проходит через гематоэкцефалячгский баргер in vivo в паренхиму мозга

3. Характеристика использованных в работе препаратов суммарного гистона

В настоящей работе использовали лиофильно высушенные препараты суммарного гистона из ткани тимуса телят, изготовленные ШО "Бколар" (Реахим, Латвия). Харайгеристику препаратов суммарного гистона и оценку их стабильности при длительном хранении проводили по ряду показателей, включающих: злектрофоретический аксйшз В полийфиламадноы геле (ПААГ) при рН 2,4, спектрофотометри-ческий анализ водного раствора гистона (рН 6,0) в ультрафиолетовой области спектра и определение количества доступных для модификации аминогрупп.

В работе использовали те препараты суммарного гистона, которые соответствовали всем показателям, выбранным для их анализа. С этой целью анализируемые препараты гистонов сравнивали с рабочим стандартным образцом (контроль), в качестве которого исполь-эоЕали свежеприготовленные коммерческие и лабораторные образцы. Так,' .для стандартного рабочего образца суммарного гистона была измерена подвижность (RT) в ПААГ для фракции Ш (медленно "идущая") и Н4 (быстро "идущая") по отношению к фракциям НЗ, Н2В, В2А, которые при электрофорезе в ПААГ расположены меаду этими двумя фракциям и имеют близкие величины Rf. Установлено, что для рабочего стандартного образца отношения Rf(H2B) Rf(H4) .

—■— и - составляют 1,285 ± 0,017 и 1.138 10,031

Rf(Hl) RTCH2B) соответственно, причем первое всегда выше второго. Наш было принято, что соответствие этому показателю кавдого анализируемо-

- Xi -

го при электрофорезе з ПААГ препарата, как в момент его изготовления, так и на различных сроках храг.енич, служит критерием стабильности (кативиости) и пригодности препарата для использования.

Установлено, что лиофияьно высушенные препараты суммарного гистона при определенных условиях хранения (над S i 11 agol в сухом, защищенном от света месте, при температуре не кика +4°С и не вызе +10 °С) стабильны в течение двух и более лет.

Постольку спектрофотомегркческий ачализ препаратов оумиарно-го гистона в ближней ультрафиолетовой области можт служить одним из методов оценки их подлинности - низкого содержания в их составе ароматических аминокислот - нами был определен коэффициент зкетинкща 0,1%-кого водного раствора суммарного гистона при 275 нм (Аfjf). te рабочего стандартного образца (контроль) этот коэффициент составлял 0,ü33 ± 0,018, что в два раза люке значения, Используемого для бычьего сывороточного альбумина (А^" -0,63) и в три раза нилэ значения, принятого для "усредненного" белка (А-1,0),

Для определения в препарате суммарного гистона количества аминогрупп, доступных для модификации, пользовались реакцией их взаимодействуй с тринитробензолсульфокислотой (ТНБС). Мзлярное содержание аминогрупп в анализируемых препаратах суммарного гистона рассчитызаля по величинам оптической плотности раствора гистона {h (j% о) при проведении реакции с ТЯБС и с поиоцыо предварительно установленного коэффициента молярного поглощения аминогрупп глицина в реакции с ТНБО, Установлено, что содержание аминогрупп в препарате стандартного рабочего образца суммарного гистона составляло. (8,3 ± 0,1) ■ lû" моль/г. Если принять (условно) , что молекулярная масса гистона равна 20 • 1С3 . то тогда молярная концентрация аминогрупп на X мода» гистона будет равна 16,6 моль аминогрупп. Эта величина сдуздла в качестве ориентира •при характеристике кавдой партии препарата еумшрного гистона на содержание доступных аминогрупп для - взаимодействия с биологически активными (лекарственными) веществами,

- 12 -

конгюгатов сухарного гистона с антибиотиком каиашцинои путем ковалентгой модификации 'белка-носителя.

Коныогаты суммарного гистона с антибиотгеим получали с помощью глутарового альдегида, который широко используется как с;и вамций агент аа счет высокой эффективности взаимодействия с аминогруппами белков и пептидов. При этом реакциэ связывания и состояние целевого продукта находятся в зависимости от концентрации глутарового альдегида в среде инкубации, временя инкубации, температуры, также от количества агеота иа единицу массы белка-носителя.

Дня решения поставленной задачи было необходимо подобрать условия проведения реакции ковалентного связывания, при которых продукт остается в растворе и вместе с тем содержит максимальное количество связанного активного антибиотика С этой целью в настоящей работе определяли: 1) количество доступных аминогрупп в препарате суммарного гистона (белок-носитель) для взаимодействия с антибиотиком (канашшком); 2) соотношение концентраций суммарного гистона и глутарового альдегида, при котором продукт реакции (активированный белок-носитель) остается в растворе, но все доступные аминогруппы белка-носителя модифицированы; 3) влияние рН инкубационной среды и времени инкубации на ход реакции связывания канамишна с гистоном через глютаровый альдегид; 4) молекулярную массу коньюгата гистон-канашцин.

Синтез конгюгатов суммарного гистона с канамицкном проводили в две стадии: первая стадия - конденсация аминогрупп белка с альдегидной группой глутарового альдегида; вторая - связывание активированного белка-носителя с антибиотиком канамицином. Проведение реакции в две стадии позволяет избежать образования наряду с целевым продуктом олнгомеров белка и антибиотика.

Показано, что концентрация глутарового альдегида находится в эквимолярном соотношении с количеством доступных для модификации аминогрупп в препарате суммарного гист.на, определенных в реаздии с ТНБС. При изучении влияния рН среды на ход реакции связывания антибиотика канамицина с препаратом гистона после его кондг :сацш с глутаровым альдегидом, выявлено, что связывание необходимо проводить при рН 7,8 - в атом случае происходит 100%-пая модификация аминогрупп гистона и продукты реакции находятся в растворе. В табл. 2 представлены результаты исследования

влияния времени инкубации на колич лш связанного ("пришитого") канамицина с белком-носителем.

Таблица 2

Влияние времени активации и инкубации на связывание канамицина с суммарным гистоном после его конденсации с глутароьым альдегидом при рН 7. 8

I 1 1 я ! * Время Врем1' 1 | Кол-во канамицина, I

I опыта | активации, инкубации, |связанного с гистоном

мин мин | . • |

1 1 | мг/мг | 1 | моль/моль |

1.....г ! 1 1 15 60 1 1 ! 0,51 | 16,4 1

! 2 | 15 120 1 0,51 | 16,4 |

I 3 | 5 60 I 0,55 | 17,6 |

1 4 | 1 , 1 5 го \ 0,21 I . 1....... 1 в, Г !

Обнаружено, что при 30 мин инкубации количество связанного канамицина существенно меньше, чем при инкубации в течение 60 мкн. Однако, увеличение времени инкубации до двух часов не приводило к увеличению количества связанного канамицина При этом отмечено, что количество связанного антибиотика пропорционально, количеству доступных для модификации аминогрупп в препарате суммарного гистона

Для установления молекулярной массы растворимых кончлогатов суммарного гистона с канамицином проводил!) их элактрофорети-ческий анализ в 18Х-ном ПААГ в присутствии 0.1%-ного доде-цилсульфата натрия. Согласно такой оценке, она расположена в диапазоне 34000 ± 500 Ш. однако в составе" конъюгага имеется и определенная доля комплексов с молекулярной массой, превышающей эту величину.

Таким образом, в настоящей работе подобраны условия проведения реакции ковалентного связывания препарата суммарного гистона с канамицином, при которых продукт остается в растворе. При это« в его составе присутствуют в основном димеры фракций гистонов.

Обсугагя возможность использования препаратов гистона в качестве белка-носителя лекарственных веществ, шкно сказать, что гиетоны как и катионизированньй альбумин образуют конхюгаты с лекарственными веществами за о«ет высокого содержания в их моле-

куле доступных для Связывания . аминогрупп, в качестве которых выступают свободные аминогруппы лизина.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итак, проведенные в данной работе исследования по изучению проникновения гистонов через гематозкцефалкческий барьер подт-верадеют и дополняют сведения о способности экзогенных гистонов проникать через биологические мембраны, включая мембрану эндотелия капилляров мозга..

Известно, что одним из ведущих звеньев в механизме антибактериального и антивирусного действия гистонов и других катионных белков и подипептидов является их влияние на мембранную систему клеток животных.- Это свойство гистонов имеет практическое значение в плане совместного их использования с антибактериальными и антивирусными агентами, которые характеризуются недостаточной способностью проникать через клеточные и тканевые мембраны. Кроме того, тестоны, благодаря способности оказывать архивирующее влияние на фагоцитирующие клетки и опсонизировать бактерии, могут принимать участие в реализации защитно-приспособительных функций неспецифического и специфического (иммунологического) характера.

Исходя из современных представлений о рецепции фагоцитами функциональных рдуляторав, можно ожидать, что активирующее действие гистонов на фагоцитарную функцию макрофагов опосредуется через определенные рецепторы. Возможность реализации активирующего действия гистонов через специфические рецепторы плазматических мембран существенно отличает их от синтетических основных подипептидов, таких как полилизин. Однако сложные механизмы действия основных белков на мембраны еще далеко не раскрыты и требуют дальнейших исследований.

Как экзогенные, так и эндогенные г ¡¡стоны хроматина при естественной гибели клеток в норме или при мгосовом их разрушении в очагах шспаления могут подвергаться протеолитическому расщеплению с образованием биологически активных пептидов, способных принимать участие в поддержании гомеостаэа. Имеющиеся сведения о повышенном уровне аргинина во-фракции альбумина плазмы крови больных с различном злокачественными новообразованиями указывают на то, что циркулирующие в организме гистоиы и (или)

/

продукты их (¡эрагмзитации могут образовывать стабильные комплексы с полимерами и некоторыми лекарственными веществами, что мокет проявляться в потенцировании действия последних.

Исходя из виааизлоденкого, представляется перспективным использование экзогенных гистонов как потенциальных белков-носителей лекарственных веществ, слабо проникавших через тканевые барьеры и в ингэдсулироЕанные очаги воспаления. В дайной работе впервые проведен синтез коваленткых контагатов суммарного гистона с антибиотиком каяамицином через глутаровый альдегид. Определены некоторые физико-химические параметры полученных конъюгатов и оценена их стабильность при хранении. Биологические эффекты полученных конъюгатов, включая и их возможность прохождения через гематоэнцефалический барьер, еще предстоит научить.

Автор выражает благодарность канд. биол, наук, ст. науч. сотр. - Ю. а Бобрышеву (Лаборатория молекулярной нейробиологии Института мозга человека РАН) за приведение гисторадиоаг ографи-ческого анализа; канд. Сиод. наук, ст. науч. сотр. Г. Е Демьяненко (НИИ физиологии им. А. А. Ухтомского при Санкт-Петербургском государственном университете) га теоретическую помо1ць и методические советы при проведении исследований по прохождению веществ через тканевнг барьеры; канд. хим. наук ст. науч. сотр. & Е Немцовой (Есесовзнь.'й -научно-исследовательский технологический институт антибиотиков и фермзнтов медицинского назначения) за методические консультации при получении кон-ногатов биополимеров с лекарственными веществами.

ВЫВОДЫ

1. Поступление экзогенного суммарного гистона в мозг происходит уже в первые 2-10 гаин после введения меченого препарата в левый желудочек сердца анестезированных крыс. При этом радиоактивность регистрируется во всех исследованных отделах мозга : в лобной доле коры, теменной доле коры, четверохолмии и моа-мечке.

2. ПронжновеякЛ-сукмарного гистона в нервную ткань различных отделов мезга после введения препарата в сонную артерии анестезированных крьв по данным гисторадиоавтографяческой оценки, неравномерно. Нещбольшеч количество меченого гистона регист-

рируется в нервной ткани гиппокампа и гипоталамуса, в то время как в сенсомоторной коре и мозжечке количество поступившего ме-. ченого гистона сутйсгвенно кике; незначительно проникновение гистона и в ткань обонятельных луковиц. Показано интенсивное насыщение меченым гистонои сосудистого сплетения II 1-го желудочка мозга Использованный в качестве контроля i2s ¡-альбумин не протекал в соответствующе отделы мозга.

3. Для оценки стабильности препаратов- суммарного гистона определены физико-химические параметры рабочего стандартного образца, в том числе и количество доступных для модификации аминогрупп, составляющая 8,3 • 10"* моль/г. Выявлено, что лиофшно высушенные препараты суммарного гистона стабильны при хранении в течение двух и более дет.

4. Посредством коваленткого связывания через глутаровый альдегид получены растворимые конъюгаты суммарного гистона ( белок-носитель) с какамициком (антибиотик). Определены" оптимальные условия проведения реакции связк^ния : рН инкубационной среды, время инкубации, с отношение концентраций белка-носитселя к свивающего агента. Показано, что для модификации всех доступных аминогрупп в препарате суммарного гистона с антибиотиком канами-цаном реакцию связывания необходимо проводить в две стадии.

Ьйлекулярная масса конъюгагов гистона с канамицином составляет 34000 ± 500 Да. Гистоиы в составе конъюгата сохраняют свою основность.

5. Препараты суммарного гистона перспективны в качестсе носителя лекарственных веществ, слабо проникающих через тканевые барьеры.

Работа, опубликованная по теме диссертации

Дурар Аль-Суфи, О, А. Горюхина, Г. П. Демьяненко, Ю, а Бобрышев Иэуч ние поступления экзогенного гистона из русла крови в различные отделы мозга //Вестник ЛГУ. - 1991. - Сер. 3, вып. 3, N 17. - С. 123-132.