Получение пептидных комплексов стресс-протективной направленности из растительного сырья

Рогов, Антон Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение пептидных комплексов стресс-протективной направленности из растительного сырья
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Получение пептидных комплексов стресс-протективной направленности из растительного сырья"

На правахрукописи

Рогов Антон Владимирович

Получение пептидных комплексов стресс-протективной направленности из растительного сырья

03.00.23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва - 2004

На правах рукописи

Рогов Антон Владимирович

Получение пептидных комплексов стресс-иротективной направленности из растительного сырья

03.00.23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва - 2004

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН.

Научный руководитель:

Доктор биологических наук

Минеева Майя Федоровна

Официальные оппоненты:

Доктор химических наук, профессор

Градова Нина Борисовна

Доктор биологических наук,

Никитина Зоя Ким овна

Ведущая организация:

Кафедра биотехнологии Московской государственной академии тонкой химической технологии имени М.В. Ломоносова.

Защита состоится «14» декабря 2004 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 006.070.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН по адресу: 117216 г. Москва, ул. Грина, 7

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЛАР по адресу: 117216 г. Москва, ул. Грина, 7

Автореферат разослан « 09 » ноября 2004 г. Учёный секретарь диссертационного совета Д 006.070.01

к.с -х.н. М. В. Кирцова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Настоящая работа является продолжением исследований, начатых В.А. Быковым и соавторами много лет назад.

Ухудшение экологических условий жизни населения на фоне общей экономической, политической и социальной нестабильности привело к формированию многочисленных стрессогенных факторов и, как следствие, к росту числа заболеваний, прямо или косвенно связанных с расстройством центральной нервной системы. Однако, несмотря на глобальность и серьёзность проблемы стресса и наличие стресс-протективных препаратов, современная медицина на данном этапе своего развития всё еще не располагает требуемым арсеналом эффективных лекарственных средств для профилактики и лечения стресса.

Имеются данные о генетически детерминированной неустойчивости человека к стрессу. Определённые генные нарушения способны оказывать непосредственное влияние на нейромедиаторную регуляцию обменных процессов головного мозга, в том числе на метаболизм дофамина и серотонина, что приводит к дисгармонии психологического состояния человека и к увеличению риска подверженности стрессу. В настоящее время для фармакологической коррекции состояния стресса используют разные группы психотропных препаратов - анксиолитики, ноотропы, антидепрессанты. Однако эти средства не лишены недостатков.

В этой связи актуальным представляется не только поиск и изучение веществ, обладающих стресс-протективными свойствами, но и создание способов их получения, пригодных для промышленного использования. Одним из современных направлений создания средств для профилактики и лечения стресс-состояний является поиск и создание лекарственных препаратов на основе пептидов. Кислоторастворимые пептиды из растений были впервые получены Е.П. Наймытенко, В.А. Быковым и соавторами и изучены фармакологически в ВИЛАРе, где были выявлены их стресс-протективные свойства. Было установлено, что эти пептиды обладают анксиолитическими свойствами, положительно влияют на экстра-поляционное поведение животных и улучшают координацию движений. В отличие от известных анксиолитиков, являющихся продуктом химического синтеза, растительные пептиды, полученные по оригинальной методике, обладают более выраженным стресс-протективным действием, отличительной чертой которого является сохранение когнитивных функций, памяти в условиях кратковременного и длительного стресса, снижение уровня эмоционального напряжения при стрессе. Однако способ получения этих пептидов был сложен для воспроизведения в промышленных условиях.

С помощью биотехнологических методов представляется возможным значительно упростить получение целевого продукта, обладающего искомой биологической активностью.

В данном случае растение, из которого предстоит выделить пептидный комплекс, рассматривается как биообъект, синтезирующий этот комплекс. Для повышения эффективности получения продукта из растения необходимо не только оптимизировать условия его выращивания, но и разработать соответствующую технологию выделения целевого продукта.

Разработка и создание эффективного экономичного способа получения из растительного сырья пептидных комплексов стресс-протективной направленности в рамках перспективы для последующего их внедрения в промышленное фармацевтическое производство представляется актуальным для решения одной из важнейших проблем современной медицины, а именно, проблемы создания высокоэффективных стресс-протективных лекарственных средств. Для сокращения расходов на выявление биологически активных веществ (БАВ) стресс-протективной направленности в процессе выбора сырьевой базы и разработки технологии выделения целесообразно и актуально применение разработанных под руководством В.А. Быкова, М.Ф. Минеевой и В.К. Колхира специфических ферментных биотест-систем т vitro, позволяющих в совокупности выявлять БАВ целевой направленности по их искомой биологической активности среди множества объектов неизвестного химического строения. Цель и задачи исследования. Целью работы являлась разработка эффективного способа получения пептидных комплексов стресс-протективной направленности из доступного растительного сырья.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

1. Осуществить выбор сырья для получения пептидных комплексов, обладающих свойствами, присущими веществам стресс-протективной направленности, применив для этой цели известный способ получения кислоторастворимых пептидов.

2. При помощи специфических ферментных биотест-систем in vitro выбрать и усовершенствовать способ выделения пептидных комплексов из отобранного растительного сырья, основываясь на следующих критериях: уровень целевой активности пептидных комплексов; выход целевого продукта; соответствие технологических параметров процесса возможности внедрения в промышленное производство.

3. Изучить с помощью фармакологических тестов in vivo целевую биологическую активность образцов пептидных комплексов, отобранных в результате первичного биоскрининга in vitro и рекомендовать наиболее активные пептидные комплексы для дальнейшего изучения с целью последующего внедрения в промышленное производство.

4. Охарактеризовать наиболее активные образцы по спектральным и хроматографическим характеристикам.

Научная новизна.

1. Разработан новый более эффективный способ получения пептидных комплексов стресс-протективной направленности из растительного сырья, позволяющий одновременно выделять пептидные комплексы, различающиеся по своим спектральным характеристикам и фармакологическому спектру стресс-протективного действия.

2. Апробирован комплекс из 4-х специфических ферментных биотест-систем (тирозингид-роксилазная, НАДФ-Н-оксидазная, глутатионредуктазная и каталазная) in vitro для выявления БАВ стресс-протективной направленности. При системном введении образцов животным установлено, что, в совокупности, применявшиеся специфические ферментные биотест-системы in vitro позволяют выявлять БАВ со стресс-протективными свойствами. Практическая значимость. Разработан проект технических условий на используемое сырье. Предложенный способ получения комплексов растительных пептидов стресс-протективной направленности отличается доступностью и дешевизной используемого растительного сырья, химических реактивов и вспомогательных материалов, простотой аппаратурного оформления, малостадийностью, отсутствием в технологии критических значений параметров процесса. Перечисленные преимущества данного способа в перспективе позволят разработать промышленную технологию производства пептидных комплексов из недорогого и доступного сырья. Полученные пептидные комплексы являются основой для создания новых эффективных лекарственных препаратов стресс-протективной направленности. Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на II Всероссийской конференции «Химия и технология растительных веществ» (Казань, 2002 г.); на Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов «Пептиды-2003» (Москва, 2003 г.); на VII Международном съезде «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» (Санкт-Петербург-Пушкин, 2003 г.); на V Международном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пущино-Москва, 2003 г.), на III Мижнародна науково-практична конференщя «Наука i сощальш про-блеми сусшльства: медицина, фармащя, биотехнологтя» (Харюв, 2003 г.); на 1-ой Всероссийской научной конференции «Биомедицинские технологии» (Москва, 2003 г.), на 59-й региональной конференции по фармации и фармакологии «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2004 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ. Связь исследований с федеральными научными программами и планами НИР. Диссертационная работа выполнена в соответствии с «Программой фундаментальных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса Российской Федерации

на 2001-2005 гг.», в соответствии с Ф/П развития медицинской промышленности до 2005 г., приоритетным направлением ОМБН РАМН - «Создание современных перспективных лекарственных средств», а также согласно тематическому плану теоретических и прикладных научно-исследовательских работ ВИЛАР.

На защиту выносится: новый эффективный способ получения из растительного сырья пептидных комплексов стресс-протективной направленности.

Объём и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована /о рисунками и 27 таблицами. Общий объем работы составляет 165 страниц машинописного текста. Библиографический указатель вкточастх265 наименований, из которых 101 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты, материалы и методы исследования

В работе использовано воздушно сухое растительное сырье - зерновые культуры и отходы их переработки: пшеничные отруби (ПО) (ГОСТ 7169-66), зерно пшеницы (ЗП) (ГОСТ 9353-90), ячменные ростки (ЯР) и гречишная шелуха (ГШ). Измельчению подвергали только зерна пшеницы.

Для подтверждения пептидной природы выделяемых соединений использовали комплекс качественных реакций. Ультрафиолетовые (УФ)-спектры пептидных комплексов были получены на приборе MPS - 2000 фирмы «Shiraadzu» (Япония). Разработка ВЭЖХ-методики для качественной идентификации пептидных комплексов осуществлена на приборе фирмы «Perkin Elmer» (США) с использованием аналитической колонки фирмы «Phenomenex» (США).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Выбор растительного сырья и температурного режима экстракции

Объектами исследования являлись зерновые культуры: пшеница, гречиха и ячмень. В случае с пшеницей использованы целые зерна и отруби - продукт переработки зерна. В случае с гречихой и ячменем использованы только отходы их переработки. Следует отметить, что отруби обогащены зародышевым материалом, который, как известно, содержит меньшее количество, пищевого белка и большее количество кислоторастворимого.

Критериями при выборе растительного сырья являлись выход пептидного комплекса из сырья и уровень его целевой биологической активности. Перед экстракцией определяли влажность и гранулометрический состав сырья (табл. 1):

Таблица 1

Показатели качества сырья, использованного в работе

Показатели качества Растительное сырье

ПО ЯР ЗП ' ГШ

Влажность, % 9,62 8,54 8,94 7,58

Гранулометрический состав, мм 0,25-3,00 0,25-3,00 0,25-3,00 0,25-5,00

Выделение пептидных комплексов из вышеперечисленных видов сырья осуществляли патентованным способом Наймытенко Е.П. и соавт. (1993), модифицированным с целью установления влияния температурного режима экстракции сырья на уровень биологической активности выделяемой субстанции и на выход продукта. По литературным данным известно, что низкая температура способствует предотвращению ферментативной деструкции извлекаемых пептидов; при повышенной температуре, наоборот, возможно усиление протео-литической активности ферментных систем ПО, что, вероятно, может обеспечивать протекание ограниченного протеолиза извлекаемых пептидов в процессе экстракции. Автопротеолиз нативных пептидов, в свою очередь, может способствовать как увеличению, так и снижению целевой активности пептидных комплексов. При этом доля высокомолекулярных пептидов в выделяемом продукте должна уменьшиться, что приведет к снижению аллергенности пептидных комплексов и, следовательно, их токсичности Применили два температурных режима* I режим - 4±2 °С; II режим - 35±2 °С. Средние выходы пептидных комплексов приведены в таблице 2.

Таблица 2

Средние выходы пептидных комплексов, выделенных из различных видов сырья при двух

температурных режимах

Вид сырья Средний выход, %

I режим II режим

ПО 2,32 2,54

ЯР 1,23 1,81

ЗП 0,50 0,62

ГШ 0,34 0,39

На основании полученных результатов можно однозначно утверждать, что наибольший выход пептидных комплексов достигается при использовании в качестве сырья ПО. Кроме того, при увеличении температуры наблюдается тенденция к небольшому увеличению выхода, которая в наибольшей степени проявилась в опытах с ЯР.

Образцы пептидных комплексов, выделенные в ходе эксперимента из ПО, ЯР, ЗП и ГШ, были протестированы с помощью патентованных специфических ферментных биотест-систем т vitro на наличие искомой биологической активности. Тест-объектами примененных биотест-систем служили тирозингидроксилаза (ТГ), НАДФН-оксидаза, глутатионредуктаза (ГР) и каталаза (КАТ). Влияние изучаемых веществ на скорость тирозингидроксилазной реакции in vitro выявляет наличие сродства к дофаминэргической нейромедиаторной системе. Активирование фермента НАДФ-Н-оксидазы in vitro свидетельствует об иммунотропных свойствах изучаемых веществ. Ингибирование КАТ при активировании (или отсутствии влияния) ГР т vitro свидетельствует о наличии адаптогенной активности. По совокупности результатов тестирования от vitro можно сделать заключение о том, обладают ли исследуемые пептидные комплексы свойствами, присущими веществам стресс-протективной направленности, поскольку стресс-протективная активность включает в себя наличие иммунотроп-ного, адаптогенного эффектов и сродства к дофаминэргической нейромедиаторной системе. Изучение влияния температуры экстракции на целевую активность было проведено на образцах', выделенных при разных температурных режимах из ПО и ЯР, поскольку выход из данных видов сырья выше. Статистическую обработку результатов проводили с использованием критерия Стьюдента. Погрешность определения составляла менее 3 %. Результаты тестирования т vitro представлены на рисунках 1 и 2.

ПО-1 ПО-11 ЯР-1 ЯР-И ЗП ГШ

Рис. 1. Влияние пегггидных комплексов на скорость ТГ-, ГР- и КАТ- реакции

200-г! ..я

| ш!-«ЙЬ—-

гШаяша

ПОИ ГЮ-М ЯЧ Я>-И ЗП ГШ

Рис. 2. Влияние пептидных комплексов на скорость НАДФН-оксидазной реакции

Как видно из рисунков 1 и 2, образцы пептидных комплексов, выделенные из ПО при обоих температурных режимах in vitro, активируют НАДФ-Н-оксидазу и ГР, угнетают ТГ и КАТ. Это свидетельствует о наличии у них иммуностимулирующей и адаптогенной активности, а также сродства к дофаминэргической нейромедиаторной системе. В совокупности эти свойства присуши веществам стресс-протективной направленности.

На основании результатов биоскрининга и данных по выходу продукта можно сделать заключение о том, что наиболее перспективным сырьем для дальнейшего изучения являются П О. При этом температура экстракции незначительно сказывается на уровне активности пептидного комплекса в отношении ТГ и НАДФ-Н-оксидазы.

2. Разработка способа получения пептидных комплексов из пшеничных отрубей

В литературе описано достаточно много способов выделения кислоторастворимых пептидов из различных биообъектов, которые имеют общие черты, связанные с физико-химическими свойствами целевого продукта Основными критериями для выбора способа являлись следующие: высокий выход продукта с высокой целевой активностью, обеспечение требований безопасности при ведении технологического процесса и последующей возможности его масштабирования для реализации в условиях промышленного производства.

В качестве альтернативных способов выделения пептидных комплексов из ПО были предложены следующие методики:

1) модифицированный патентованный способ получения белков, обладающих сродством к опиатным рецепторам. (1) - экстрагент соляная кислота, (1а) - экстрагент серная кислота);

2) модифицированный способ Гинейтиса А.А. и соавторов;

3) предложенный способ получения пептидных комплексов путем химического фракционирования (на основе способов Наймытенко Е.П. и Гинейтиса А.А.);

4) предложенный способ фракционированного выделения пептидных комплексов путем ступенчатого осаждения.

Каждый из перечисленных способов был разработан или модифицирован таким образом, чтобы упростить общую технологическую схему получения пептидных комплексов, а именно, минимизировать количество стадий и избежать сложных Операций, реализация которых в промышленном варианте будет связана с определенными трудностями. Кроме того, каждый из предложенных способов предусматривает получение целевого продукта без каких-либо химических превращений в процессе его получения.

Общая технологическая схема получения кислоторастворимых пептидов состоит из следующих стадий: предварительная экстракция балластных веществ (форэкстракция), экс-

тракция целевого продукта с использованием различных растворителей, осаждение продукта с использованием органических растворителей и сушка готового продукта.

2.1. Оптимизация стадии форэкстракции пшеничных отрубей с использованием методов математического планирования эксперимента

Стадия форэкстракции служит для удаления из растительного сырья балластных веществ, которыми в данном случае являются все компоненты цитоплазмы растительной клетки кроме кислоторастворимых пептидов. Эта стадия является общей для всех известных способов выделения кислоторастворимых пептидов. По этой причине разработку и усовершенствование способа получения пептидных комплексов начали именно со стадии форэкстракции. Для ее оптимизации были применены методы математического планирования эксперимента. Предварительно, в ходе реализации однофакторного эксперимента, осуществлена оценка воспроизводимости.

Для создания математической модели процесса выбраны четыре фактора, которые в наибольшей степени могут влиять на выход экстрактивных веществ в извлечение: продолжительность форэкстракции, температура реакционной массы, природа экстрагента (ионная сила и рН) и количество экстракций. Значение функции отклика ( у ) соответствует выходу экстрактивных веществ в форэкстракт в граммах. Для количественной оценки значимости влияния выбранных факторов реализован полный факторный эксперимент (ПФЭ) с четырьмя факторами, каждый из которых имеет 2 уровня варьирования. Опыты ПФЭ были рандомизированы во времени.

По результатам экспериментов рассчитаны коэффициенты Ь, и составлено уравнение полиноминальной регрессии, которое после удаления из него статистически незначимых коэффициентов приняло следующий вид:

>'=8Д7+Ц125-х1 +0,4025 *2-Ц088-*3 +1^038-*4 - 0,0875-х, хг -0,1588-х, -х} + +0,1675-х1 х, -0,1562 *2 '*} -0,5512-лг3 - 0,0588-*2 хг х4

Максимальный выход экстрактивных веществ в серии опытов ПФЭ в 2 раза превышает результат опытов однофакторного эксперимента. Таким образом, можно полагать, что эксперименты реализованы в оптимальной области и, следовательно, нет необходимости в движении по градиенту.

Анализ полученной математической модели позволяет сделать заключение о том, что наибольшее влияние на процесс форэкстракции, как и ожидалось, оказывают продолжительность экстракции, кратность и природа экстрагента, что также согласуется с литературными данными. Природа экстрагента оказывает значительное влияние на процесс, сопоставимое с продолжительностью форэкстракции. Показано, что в буферной среде по сравнению

с физиологическим раствором извлечение экстрактивных веществ происходит более эффективно. При этом выход экстрактивных веществ увеличивается при понижении рН раствора и увеличении ионной силы экстрагента. Повышение температуры оказывает на процесс положительное влияние, что также не противоречит данным литературы. Однако эффект влияния этого фактора значительно ниже по сравнению с другими факторами. Вероятно, это связано с ограничениями, наложенными на уровень варьирования фактора.

При верхнем значении температурного фактора выход экстрактивных веществ увеличивался незначительно. Таким образом, в целях упрощения ведения процесса выбрана температура 22±2 °С. Оценка целевой активности образцов (с помощью ферментных биотест-систем in vitro), выделенных при температуре форэкстракции 22±2 °С и при температуре 35±2 °С, не выявила значительных различий.

С целью интенсификации процесса форэкстракции были уточнены продолжительность и кратность процесса путем изучения кинетики форэкстракции 0,2 М ацетатным буфе-" ром 0,14 М по хлористому натрию при температуре (22±2)°С. На рисунке 3 представлены кинетические кривые для 4-х кратной форэкстракции.

Выход экстрактивных веществ представляет собой содержание сухого остатка в форэкстракте, измеренное в весообъемных процентах. Анализируя экспериментальные кинетические зависимости можно сделать вывод о том, что наиболее интенсивно процесс протекает в течение первого часа для всех четырех экстракций. При этом вклад 1-ой экстракции в ■ общий выход составляет ~ 50%,2-ой — 34%,3-ей—10%и4-ой — 6 %. Таким образом, -за три экстракции достигается выход экстрактивных веществ более 90 % от возможного выхода при 4-х кратной форэкстракции. Исходя из этих соображений, в качестве оптимального режима выбран 3-х кратный процесс форэкстракции ПО с продолжительностью каждой экстракции 1 час.

На основании анализа уравнения регрессии, данных по изучению кинетики форэкс-тракции, а также с учетом практических соображений для процесса форэкстракции выбраны следующие оптимальные параметры:

экстрагент- 0,2 М ацетатный буфер 0,14 М по хлористому натрию (рН 4,8);

соотношение сырье: экстрагент -1:8;

степень измельчения сырья - 0,25-3,00 мм;

перемешивание - 60-70 об/мин;

температура - (22±2)°С;

продолжительность экстракции -1ч;

количество экстракций - 3.

Применение методов математического моделирования, изучение кинетики процесса на примере стадии форэкстракции позволило нам разработать методические подходы к оптимизации других стадий технологического процесса.

2.2. Выбор активных образцов пептидных комплексов и способа их получения Процесс форэкстракции сырья в каждом опыте в независимости от способа получения осуществлялся в соответствии с выбранными оптимальными параметрами. Наработку субстанций производили из 50 г сырья - 1-ым и 4-ым способами и из 200 г - 2-ым и 3-им способами в двух повторностях для уточнения параметров процесса, в том числе, выхода, и наработки достаточного количества вещества для физико-химических и фармакологических исследований. Выход из сырья рассчитывали с учетом его влажности (9,62 %). Таким образом, было получено 16 образцов. Массы и выходы субстанций приведены в таблице 3.

Как видно из таблицы 3, с наибольшим выходом получены образцы 1, 2, 8,9,11, 12. Следует отметить, что образец 8 (способ 3) является промежуточным продуктом, который в ходе дальнейшей реализации технологического процесса разделяется на составляющие его фракции 1,2 и 3. Поскольку выход каждой отдельно взятой фракции невелик, целесообразно оценить искомую активность исходной суммарной фракции, то есть самого пептидного комплекса 8. С целью выявления наличия свойств, присущих веществам стресс-протективной направленности 13 образцов были подвергнуты биоскринингу с использованием специфических ферментных биотест-систем in vitro.

По результатам биоскрининга наиболее высокую активность проявили пептидные комплексы 1, 5, 6, 8, 9. На рисунке 4 представлено влияние этих образцов на скорость тиро-зингидроксилазной, НАДФН-оксидазной, глутатионредуктазной и каталазной реакций. Из рисунка 4 видно, что образцы 1, 5, 6, 8, 9 оказали выраженное ингибирующее действие по

отношению к ТГ и КАТ, активирующий эффект по отношению к НАДФ-Н-оксидазе и ГР (за исключением образца 6).

Таблица 3

Средние выходы пептидных комплексов при наработке разными способами

Способ полу- № фракции Коды образ- Масса фрак- Выход из Суммарный

чения (в по- (название цов для био- ции, г сырья, % выход из сы-

рядке перечисления) или обозначение) скрининга активности рья всех фракций, %

1 суммарная 1 0,815 1,8 1,8

1а суммарная 2 0,755 1,67 1,67

2 Н1 3 1,113 0,62 1,38

НЗ 4 0,647 0,36

Н2А + Н4 5 0,016 0,01

Н2В 6 0,709 0,39

3 0 7 0,436 0,24 3,27

1+2 + 3 8 2,686 1,49

4 9 2,600 1,44

5 10 0,187 0,1

1 - 0,788 0,44 0,48

2 - 0,065 0,04

3 - 0,016 0,01

4 1 11 0,646 1,43 3,81

2 12 1,004 2,22

3 13 0,070 0,16

g 200Ц-----

i'affltt

16 6 8 9

обрмчы пептидных комплексов

Рис. 4. Влияние пептидных комплексов на скорость ТГ-, НАДФ-Н-оксидазной, ГР- и КАТ-реакций т vitro

Примечание: 1-ые столбцы - ТГ; 2-ые столбцы - НАДФН-оксидаза; 3-й столбцы - ГР; 4-ые столбцы - КАТ.

Результаты эксперимента позволяют заключить, что наиболее выраженный стресс-протекгавный эффект следует ожидать именно у этих образцов. С другой стороны, выход из сырья пептидных комплексов 5 и 6 на порядок ниже такового для пептидных комплексов 1,8 и 9. Поэтому для дальнейших исследований были выбраны комплексы 1,8 и 9.

Таким образом, были отобраны образцы 1, 8 и 9 для изучения их физико-химических свойств и фармакологических исследований in vivo. Вместе с тем выбран 3-ий способ, обеспечивающий выделение сразу 2-х пептидных комплексов (8 и 9) с высоким уровнем ожидаемой активности при достаточно высоком выходе продукта. На схеме 1 представлена принципиальная схема получения пептидных комплексов 8 и 9.

2.3. Изучение технологических параметров стадии экстракции и осаждения готового продукта с целью их оптимизации

Способ 3, позволяющий выделить пептидные комплексы 8 и 9, был предложен нами на основании анализа описанных в литературе методик выделения кислоторастворимых пептидов из растительных и животных тканей, вследствие чего значения параметров процесса выбирались на основании личного экспериментального опыта, данных литературы и по практическим соображениям.

Поскольку именно этот способ представляет интерес как перспективный для последующего внедрения в фармацевтическое производство, он требует уточнения параметров своих отдельных стадий для оптимизации всего процесса в целом. Критериями для оптимизации процесса являлись выход и целевая активность конечного продукта.

Выбранный способ получения пептидных комплексов кроме форэкстракции включает в себя следующие основные стадии: экстракция целевого продукта подкисленным спиртом этиловым; экстракция целевого продукта раствором соляной кислоты; осаждение и фильтрация готовых продуктов; сушка готовых продуктов. Для повышения эффективности нового способа получения пептидных комплексов были уточнены технологические параметры стадии экстракции и осаждения: температура, продолжительность, кратность и соотношение сырье : экстрагент спиртово-кислотной и кислотной экстракций; продолжительность и температура стадии осаждения готового продукта. В таблице 4 приведены уточненные значения технологических параметров выбранного способа получения пептидных комплексов.

По технологии с уточненными параметрами были проведены балансовые загрузки по получению образцов пептидных комплексов из 4-х партий растительного сырья с целью накопления данных для составления проекта лабораторного регламента.

Получение пептидных комплексов 8 и 9 из ПО

Схема 1

Таблица 4

Уточненные технологические параметры процесса выделения пептидных

комплексов из растительного сырья

Наименование процесса Технологические параметры процесса

Темлерату- __0/-» ра, С Кратность Продолжительность, ч Соотношение сырье: экстрагент

Экстракция спиртово-кислотная 22±2 2 1-ая-2 2-ая— 1 1-ая-1:5 2-ая-1:1,5

Экстракция кислотная 22±2 2 1-ая-З 2-ая -1 1-ая-1 :5 2-ая - 1:1,5

Осаждение 4±2 - 4 -

3. Физико-химическое изучение пептидных комплексов с кодами 1,8 и 9, выбранных на основании первичного биоскрининга in vitro Для количественной и качественной характеристики изучаемых веществ были применены методы УФ-спектроскопии и комплекс качественных реакций, а также метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (см. п. 5), которые, в совокупности, позволяют сделать заключение о пептидной природе отобранных образцов и о наличии в их составе основной аминокислоты аргинина и ароматической аминокислоты тирозина.

В качестве растворителя для получения УФ-спектров пептидных комплексов использовали 0,5 М раствор соляной кислоты. Спектры снимали в кювете длиной 1 см в диапазоне длин волн от 190 до 350 им с интервалом в 5 им. УФ-спектры представлены на рисунке 5; спектральные характеристики сведены в таблицу 5. Результаты качественных реакций представлены в таблице 6.

Таблица 5

Характеристики УФ-спектров

Код пептидного комплекса Длины волн максимумов Значение оптической плот-

поглощения, нм ности

№1 Х,=200 1,10

312=280 0,06

Хз=325 0,04

№8 Xi=200 1,05

Л2=270 0,05

№9 Х,=195 0,26

>•2=325 0,08

Из рисунка 5 и по данным таблицы 4 видно, что пептидные комплексы имеют максимум поглощения в области 195-200 нм, что является характерным для веществ, имеющих в своей структуре пептидную связь. Кроме того, образцы 1 и 8 имеют максимум поглощения, а

образец 9 - плато, в области 270-295 нм, что характерно для соединений, содержащих ароматические аминокислоты (максимум поглощения тирозина в чистом виде соответствует длине волны 278 нм). Выявленные особенности позволяют сделать заключение о том, что исследуемые вещества действительно являются комплексами соединений пептидной природы и содержат в своей структуре ароматические аминокислоты.

t<"> 3.Z& ¡so гоо *s.s X, НМ

длина волны, нм

Рис. 5. УФ-спектры пептидных комплексов 1, 8 и 9. На оси X отложена длина волны

X; на оси У отложена оптическая плотность О

Таблица б

Результаты качественных реакций

Качественная Анализируемые образцы

Реакция №1 №8 №9

Реакция Миллона (на тирозин) + + +

Реакция на аргинин + + +

Реакция с нингидрином + + +

Биуретовая реакция + + +

Реакция с ацетоном + + +

Реакция с сернокислой ртутью + + +

Реакция с аммиаком + + +

Ксантопротеиновая реакция + + +

Примечание:«+»- положительная реакция.

Как видно из таблицы 5, все качественные реакции положительны, что подтверждает пептидную природу исследуемых образцов Кроме того, специфические реакции на ки-слоторастворимые пептиды (реакции с аммиаком и сернокислой ртутью) подтверждают тот факт, что выделенные пептидные комплексы действительно представляют собой кислотора-створимые пептиды растительных тканей

4. Фармакологическое изучение пептидных комплексов 1,8 и 9 Фармакологическое изучение проводили для подтверждения наличия стресс-протективных Свойств у пептидных комплексов 1, 8 и 9, а также для сравнительной оценки фармакологических свойст ранее изучаемых пептидов, выделенных по патентованной методике, и пептидных комплексов, полученных способом, разработанным в данном исследовании. Для выявления стресс-протективной активности использовали следующие хорошо известные тесты: тест экстраполяционного избавления Хендерсона в модификации НАБондаренко, тест «открытое поле», тест «приподнятый крестообразный лабиринт, тест «вращающийся горизонтальный стержень. Статистичекую обработку результатов проводили с использованием непараметрического ^критерия. В качестве препаратов сравнения по основным тестам выбраны Милайф -препарат метаболического типа действия стресс-протективной направленности и Гидазепам - анксиолитик, «дневной» транквилизатор, в терапевтических дозах (50 мг/мл и 10 мг/мл соответственно). Результаты экспериментов представлены на рисунках 6-10. При изучении поведения животных в тесте «открытое поле» было установлено, что образцы 1,8 и 9 не оказывают достоверного влияния на поведение животных в этом тесте. Поэтому в автореферате результаты теста «открытое поле» не приводятся.

На рисунке 6а,б приведены результаты изучения влияния пептидных комплексов на поведение крыс в тесте экстраполяционного избавления (тест Хендерсона). На вертикальной оси отмечены латентный период избавления в сек (рис. 6а) и доля животных, решивших задачу, в каждой группе, в процентах от общего числа животных в группе (рис. 66). Из рисунка 66 видно, что доля животных, решивших задачу, в группах, получавших пептидные комплексы, значительно выше, чем в группе контрольных животных. Аналогичный эффект достигается при введении Милайфа в терапевтической дозе 50 мг/кг. Кроме того, образец 8 значительно снижает латентный период избавления (рис. 6а). На основании данных эксперимента можно заключить, что пептидные комплексы при системном введении в микродозах способствуют сохранению когнитивных функций в условиях неожиданно возникшего острого стресса Образцы 8 и 9 в данном тесте проявляют более высокую активность, чем образец 1.

На рисунке 7 а, б приведено влияние пептидных комплексов 1, 8 и 9 в сравнении с Милайфом и Гидазепамом на поведение крыс в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт». На рисунке 7а на вертикальной оси отмечено время в секундах, в течение которого животное находилось на открытой доске. На рисунке 76 на вертикальной оси отмечена доля животных, вышедших на открытую доску.

Рис. 6. Влияние пептидных комплексов и препарата сравнения Милайф на поведение крыс в тесте экстраполяционного избавления (тест Хендерсона)

Как видно из рисунка 7а,б, после системного введения образцов 1, 8 и 9, по сравнению с контрольной группой, возрастает как количество животных, вышедших на открытую доску, так и время, проведенное ими на открытой доске

соответственно), что свидетельствует об анксиолитическом действии образцов 1, 8,9. Эффект этих образцов сравним с эффектом известных препаратов Милайф (р<0,05) и Гида-зепам (ри<0,05), обладающих анксиолитическими свойствами Активность образца 8 в этом тесте сопоставима с активностью Гидазепама.

На рисунке 8аДв представлено влияние образцов 1, 8 и 9 соответственно на поведение мышей в тесте «вращающийся горизонтальный стержень», позволяющем оценить влияние изучаемых веществ на координацию движений.

Из рисунка 8а видно, что образец 1 оказывает положительное влияние на более устойчивых животных, составляющих около 30 % от общего количества животных в группе, время удерживания которых превышает 100 секунд.

№1 N>9 N>9 Милайф Гидамлам

№1' №* те Милайф Гидамлам

(б)

Рис. 7. Влияние пептидных комплексов и препаратов сравнения Милайф и Гидазепам на поведение крыс в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» Образец 8 (рис. 86) и, в большей степени, образец 9 (рис. 8в) вызывают увеличение длительности удерживания животных на стержне, при этом возрастает доля животных, удерживавшихся на стержне более 100 секунд.

Таким образом, образцы 8 и, особенно, 9 оказывают положительное влияние на координацию движений в течение длительного периода наблюдения (2 ч), что является важным элементом стресс-протективного действия.

По результатам фармакологических исследований можно заключить, что пептидные комплексы 1, 8 и 9 обладают стресс-протективными свойствами: проявляют анксио-литическое действие, улучшают когнитивные функции мозга в условиях острого стресса по сравнению с контролем, оказывают положительное влияние на координацию движений в течение длительного периода наблюдения, что сопоставимо с результатами, полученными ранее для пептидных комплексов, выделенных по патентованному способу Наймытен-ко Е.П. При этом образцы 8 и 9 проявляют более выраженный эффект, сопоставимый с эффектом препаратов сравнения (Милайф и Гидазепам). При сравнении результатов исследований пептидных комплексов 8 и 9 видно, что они обладают неодинаково выражен-

(в)

Рис. 8. Влияние пептидного комплекса 1 - а, 8 - б и 9-вна поведение мышей в тесте

«вращающийся горизонтальный стержень» ными фармакологическими свойствами: образец 8 более активен в тестах экстраполяди-онного избавления и «приподнятый крестообразный лабиринт»; образец 9 более активен в тесте «вращающийся стержень». Вместе с тем образцы 8 и 9 являются продуктами, получаемыми на разных стадиях одной технологии почти с одинаковым выходом (см. табл.3), который в сумме превосходит выход образца 1. Исходя из этих соображений, подтверждена целесообразность выбора 3-го способа, который позволяет с достаточно высоким выходом выделить два конечных продукта (схема 1), обладающих выраженными стресс-протективными свойствами. Полученные субстанции можно использовать по-отдельности; однако в дальнейшем представляет интерес фармакологическое изучение их

смеси с целью создания комплексного препарата, который бы сочетал в себе выраженные фармакологические свойства обоих пептидных комплексов.

5. ВЭЖХ-методика для качественной идентификации пептидных комплексов

ВЭЖХ пептидных комплесов 8 и 9 проводили на приборе фирмы «Perkin Elmer» (США) с УФ-детектором «Diode Array Detector 23 5С», насосом градиентного элюирования серии 200 Is и математическим обеспечением «Turbochrom 4» с использованием аналитической колонки фирмы «Phenomenex» (США) с обращенной фазой Luna-ODS-C18 с размерами 250*4,6 мм и размером пор 5 мкм. Пробу растворяли в 0,1 % растворе ортофос-форной кислоты. Концентрация вещества в пробе составляла 3 мг/мл, объем наносимой пробы - 10 мкл, нагрузка по веществу на колонку - 30 мкг. Хроматографирование проводили в системе ацетонитрил-0,1 % раствор фосфорной кислоты в условиях линейного градиентного элюирования: концентрацию ацетонитрила увеличивали от 0 % до 75 % за 70 мин. Хроматограмма образцов пептидных комплексов 8 и 9 представлена на рисунке 9.

№8

»9

i' '' 'Л1'1 'Л1 '"Д......Л '' '.i.1 " 'А" 1 '.Е.'1'г.'.''' 1 ЦТ ' ■ 'Л'' ".W 1' и.1 ' ■ W.....

(а)

(б)

Рис. 9. ВЭЖХ-хроматограммы пептидных комплексов 8 и 9, снятые при длинах волн 220 нм (а) и 280 нм (б). По оси X отложено время в минутах; по оси Y - величина сигнала в милливольтах Сравнительный анализ УФ-спектров каждого пика на хроматограмме образца 8 (рис. 9а) позволил выделить три группы пиков с идентичными УФ-спектрами, которые элюируются в следующие промежутки времени: 22-28 мин, 30-39 мин и 40-48 мин.

Выводы:

1. Разработан новый усовершенствованный способ получения пептидных комплексов стресс-протективной направленности из растительного сырья, позволяющий выделять целевой продукт с достаточно высоким выходом, отличающийся простотой аппаратурного оформления процесса, малым количеством технологических стадий, применением недорогих растворителей и реактивов, отсутствием в технологии критических параметров процесса и возможностью масштабирования процесса С целью внедрения в промышленное производство.

2. В результате сравнительного изучения с помощью специфических ферментных биотест-систем in vitro нескольких видов растительного сырья - зерен пшеницы, пшеничных отрубей, ячменных ростков, гречишной шелухи - в качестве наиболее -перспективного растительного сырья для выделения пептидного комплекса стресс-протективной направленности отобраны пшеничные отруби.

3. Пептидные комплексы 8 и 9, полученные по способу, разработанному в данном исследовании, а также комплекс 1, по результатам тестирования с применением тиро-зингидроксилазной, НАДФ'Н-оксидазной, глутатионредуктазной и каталазной биотест-систем т vitro, проявляют свойства, присущие веществам стресс-протективной '' направленности, а именно, иммуноактивирующие и адаптогенные, а также сродство к дофаминэргической нейромедиаторной системе.

4. При системном введении пептидные комплексы 1, 8 и 9 проявили анксиолитиче-скую активность, положительное влияние на экстраполяционное поведение и на координацию движений, что свойственно веществам стресс-протективной направленности. При этом пептидный комплекс 8, полученный по новому способу превосходит комплексы 1 и 9 по положительному влиянию на экстраполяционное поведение животных.

5. В качестве одного из подходов к стандартизации пептидных комплексов разработана ВЭЖХ-методика для качественной идентификации пептидных комплексов 8 и 9.

Основное содержание диссертации изложено в следующих научных работах:

1. Рогов А. В. Обоснование поиска стресс-протективных веществ среди объектов растительного происхождения//Химия и технология растительных веществ: Материалы II Всероссийской конференции - Казань, 2002. - С. 123-124.

2. Рогов А.В., Минеева М.Ф., Колхир В.К. и др. Белково-пептидные комплексы из растений как новый класс веществ со стресс-протективной активностью//Новые и нетрадиционные

растения и перспективы их использования: Материалы V Международного симпозиума - Т. 1.-М., 2003.-С. 319-321.

3. Рогов А.В., Можайский AM., Минеева М.Ф., Сокольская ТА. Определение состава и стандартизация нового препарата на основе растительных белков//Наука i сощальш пробле-ми сусшльства: медицина, фармащя, бютехнолот: Материалы III Международной научно-практической конференции - Ч. 1. - Харьков, 2003. - С. 249.

4. Рогов А.В., Минеева М.Ф., Дубинская В.А., Сокольская Т.А. Выявление присущих адаптогенам свойств у пептидных комплексов, выделенных из различных сырьевых источников, с помощью ферментных тестов in vitro/IАктуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения: Материалы VII Международного Съезда Фитофарм 2003. - Санкт-Петербур-Пушкин, 2003. - С. 85-88.

5. Быков В.А., Минеева М.Ф., Колхир В.К. и др. Применение специфических ферментных биотест-систем in \itro для скрининга пептидов на биологическую активность//Пептиды-2003: Материалы Российского симпозиума по химии и биологии пептидов. - М., 2003. - С. 63.

6. Рогов А.В., Минеева М.Ф., Сокольская Т.А. Растительные пептиды как новый класс стресс-протективных веществ//Химия, технология, медицина: Труды ВНИИ лекарственных и ароматических растений под общ. ред. ВА. Быкова-Т. XVI. - М., 2003. - С. 3-10.

7. Рогов А.В., Минеева М.Ф., Колхир В.К. и др. Пептидные комплексы из растений как основа для создания высокоэффективных и безопасных лекарственных средств нового поколе-ния//Материалы I Всероссийской конференции «Биомедицинские технологии». - Вып. 20. -М.,2003.-С. 81-85.

8. Рогов А.В., Минеева М.Ф., Колхир В.К. и др. Растительные пептиды - перспективный источник создания лекарственных средств//Фармация. - 2003. - № 6. - С. 41-43.

9. Рогов А.В., Минеева М.Ф., Сокольская Т.А., Быков В.А. Способы выделения кислоторас-творимых полипептидов//Фармация. - 2004. - № 2. - С. 46-48.

10. Рогов А.В., Можайский А.М., Минеева М.Ф. и др. Разработка ВЭЖХ-методики для стандартизации пептидных комплексов, выделенных из растительного сырья/УРазработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: Труды 59 региональной конференции по фармации и фармакологии. - Пятигорск, 2004. - С. 209-210.

*22 5в&

подписано к печати 4.11.2004 Г. Ф. А5 Бум. офс. Печ. ризогр Тираж 100 экз.

Научно-исследовательский и учебно-методический Центр БМТ ВИЛАР, 123056, Москва, ул. Красина, 2.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Рогов, Антон Владимирович

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Стресс как одна из важнейших проблем современной медицины и общества.

1.2. Характеристика структуры кислоторастворимых пептидов и их иейромедиаторные свойства.

1.2.1. Психотропные свойства кислоторастворимых пептидов.

1.2.2. Гистопы как основные представители кислоторастворимых пептидов, их структура и функции в клетке, биологические свойства.

1.3. Способы выделения и очистки кислоторастворимых пептидов из биологических тканей.

1.3.1. Способы выделения и очистки кислоторастворимых пептидов 33 из животных тканей.

1.3.2. Способы выделения и очистки кислоторастворимых пептидов из растительных тканей.

1.3.3. Стерилизация и хранение препаратов кислоторастворимых пептидов.

1.4. Методы определения состава и разделения кислоторастворимых пептидов.

1.4.1. Метод диск-электрофореза в ПААГ.

1.4.2. Аналитическая и препаративная ВЭЖХ пептидов.

1.4.3. ВЭЖХ-вариант гель-проникающей хроматографии пептидов.

1.5. Подходы к стандартизации пептидных лекарственных препаратов. 54 Экспериментальная часть

Глава 2. Материалы п методы исследования.

2.1. Материалы исследования.

2.2. Методы исследования.

Глава 3. Результаты исследований и нх обсуждение.

3.1. Выбор растительного сырья и температурного режима экстракции пептидных комплексов стресс-протективной направленности с использованием специфических ферментных биотест систем in vitro.

3.2. Разработка способа получения пептидных комплексов из пшеничных отрубей.

3.2.1. Оптимизация стадии форэкстракции пшеничных отрубей с использованием методов математического планирования эксперимента.

3.2.2. Выбор активных образцов пептидных комплексов и способа их получения с использованием специфических ферментных биотест-систем in vitro.

3.2.3. Изучение технологических параметров стадии экстракции и осаждения готового продукта с целью их оптимизации.

3.3. Физико-химическое изучение пептидных комплексов 1, 8, 9, выбранных на основании первичного биоскрининга in vitro.

3.4. Фармакологическое изучение пептидных комплексов 1, 8, 9.

3.5. ВЭЖХ-методика для качественной идентификации пептидных комплексов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение пептидных комплексов стресс-протективной направленности из растительного сырья"

Актуальность проблемы

Настоящая работа является продолжением исследований, начатых В.А. Быковым и соавторами много лет назад.

Ухудшение экологических условий жизни населения на фоне общей экономической, политической и социальной нестабильности привело к формированию многочисленных стрессогенных факторов и, как следствие, к росту числа заболеваний, прямо или косвенно связанных с расстройством центральной нервной системы (ЦНС) [147]. Однако, несмотря на глобальность и серьёзность проблемы стресса и наличие стресс-протективных препаратов [99], современная медицина всё ещё не располагает требуемым арсеналом эффективных лекарственных средств для профилактики и лечения стресса.

В этой связи актуальным представляется не только поиск и изучение веществ, обладающих стресс-протективными свойствами, но и создание способов их получения, пригодных для промышленного использования. Одним из современных направлений создания средств для профилактики и лечения стресс-состояний является поиск и создание лекарственных препаратов на основе пептидов. Кислоторастворимые пептиды из растений были впервые получены Е.П. Наймытенко, В.А. Быковым и соавторами и изучены фармакологически в ВИЛАРе, где были выявлены их стресс-протективные свойства [37]. Было установлено, что эти пептиды обладают анксиолитическими свойствами, положительно влияют на экстраполяционное поведение животных и улучшают координацию движений. В отличие от известных анксиоли-тиков, являющихся продуктом химического синтеза, растительные пептиды, полученные по оригинальной методике, обладают более выраженным стресс-протективным действием, отличительной чертой которого является сохранение когнитивных функций, памяти в условиях кратковременного и длительного стресса, снижение уровня эмоционального напряжения при стрессе. Однако способ получения этих пептидов был сложен для воспроизведения в промышленных условиях [108].

С помощью биотехнологических методов представляется возможным значительно упростить получение целевого продукта, обладающего искомой биологической активностью. В данном случае растение, из которого предстоит выделить пептидный комплекс, рассматривается как биообъект, синтезирующий этот комплекс. Для повышения эффективности получения продукта из растения необходимо не только оптимизировать условия его выращивания, но и разработать соответствующую технологию выделения целевого продукта.

35, 36], позволяющих в совокупности выявлять БАВ целевой направленности по их искомой биологической активности среди множества объектов неизвестного химического строения.

Цель и задачи исследования

Целью работы являлась разработка эффективного способа получения пептидных комплексов стресс-протективной направленности из доступного растительного сырья.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

4. Охарактеризовать наиболее активные образцы по спектральным и хроматографическим характеристикам.

Научная новизна

2. Апробирован комплекс из 4-х специфических ферментных биотест-систем (тирозингидроксилазная, НАДФ-Н-оксидазная, глутатионредук-тазная и каталазная) in vitro для выявления БАВ стресс-протективной направленности. При системном введении образцов животным установлено, что, в совокупности, применявшиеся специфические ферментные биотест-системы in vitro позволяют выявлять БАВ со стресс-протективными свойствами.

Практическая значимость

Разработан проект технических условий на используемое сырье. Предложенный способ получения комплексов растительных пептидов стресс-протективной направленности отличается доступностью и дешевизной используемого растительного сырья, химических реактивов и вспомогательных материалов, простотой аппаратурного оформления, малостадийно-стью, отсутствием в технологии критических значений параметров процесса. Перечисленные преимущества данного способа в перспективе позволят разработать промышленную технологию производства пептидных комплексов из недорогого и доступного сырья. Полученные пептидные комплексы являются основой для создания новых эффективных лекарственных препаратов стресс-протективной направленности.

Объём и структура диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 16-ю рисунками и 27-ю таблицами. Общий объем работы составляет 165 страниц машинописного текста. Библиографический указатель включает 264 наименований, из которых 101 на иностранных языках.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Рогов, Антон Владимирович

140 ВЫВОДЫ

1. Разработан новый усовершенствованный способ получения пептидных комплексов стресс-протективной направленности из растительного сырья, позволяющий выделять целевой продукт с достаточно высоким выходом, отличающийся простотой аппаратурного оформления процесса, малым количеством технологических стадий, применением недорогих растворителей и реактивов, отсутствием в технологии критических параметров процесса и возможностью масштабирования процесса с целью внедрения в промышленное производство.

2. В результате сравнительного изучения с помощью специфических ферментных биотест-систем in vitro нескольких видов растительного сырья -зерен пшеницы, пшеничных отрубей, ячменных ростков, гречишной шелухи - в качестве наиболее перспективного растительного сырья для выделения пептидного комплекса стресс-протективной направленности отобраны пшеничные отруби.

3. Пептидные комплексы 8 и 9, полученные по способу, разработанному в данном исследовании, а также комплекс 1, по результатам тестирования с применением тирозингидроксилазной, НАДФ'Н-оксидазной, глутатион-редуктазной и каталазной биотест-систем in vitro, проявляют свойства, присущие веществам стресс-протективной направленности, а именно, им-муноактивирующие и адаптогенные, а также сродство к дофаминэргиче-ской нейромедиаторной системе.

4. При системном введении пептидные комплексы 1, 8 и 9 проявили анксио-литическую активность, положительное влияние на экстраполяционное поведение и на координацию движений, что свойственно веществам стресс-протективной направленности. При этом пептидный комплекс 8, полученный по новому способу, превосходит комплексы 1 и 9 по положительному влиянию на экстраполяционное поведение животных.

141

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследование было посвящено разработке нового пригодного для последующего внедрения в промышленное производство способа получения из растительного сырья кислоторастворимых пептидных комплексов, обладающих стресс-протективными свойствами. Предпосылкой исследования явилась работа Е.П. Наймытенко, В.А. Быкова и соавторов [108], в которой впервые был разработан способ получения из растений (в том числе, из продуктов переработки зерновых культур) кислоторастворимых пептидных комплексов с выраженными стресс-протективными свойствами [37].

Для повышения эффективности работы при выборе сырья, а также при разработке способа получения пептидных комплексов с целевой активностью были применены специфические ферментные биотест-системы in vitro, позволяющие быстро и с большой точностью выявлять иммуностимулирующую, адаптогенную активность, а также сродство к дофаминэргической нейромедиаторной системе - эффекты, в совокупности, присущие веществам стресс-протективной направленности. Наличие стресс-протективных свойств, выявленных in vitro, было подтверждено в фармакологических экспериментах с использованием лабораторных животных.

В процессе разработки нового способа получения пептидных комплексов из пшеничных отрубей были применены методы математического планирования эксперимента, изучены кинетические параметры процессов отдельных стадий. Основными критериями при оптимизации и интенсификации нового способа являлись выход и уровень целевой активности готового продукта.

В результате проведенного исследования был разработан новый способ получения из пшеничных отрубей кислоторастворимых пептидных комплексов со стресс-протективными свойствами. Разработанный способ включает в себя следующие стадии: форэкстракция сырья буферным раствором для удаления балластных веществ, экстракция пептидного комплекса 8 подкисленным этиловым спиртом, экстракция пептидного комплекса 9 раствором соляной кислоты, осаждение пептидных комплексов с использованием органического растворителя и сушка осадка пептидных комплексов. Предложенный способ позволяет одновременно выделять два пептидных комплекса, обладающих неодинаково выраженными стресс-протективными свойствами, с достаточно высоким выходом. В отличие от способа получения растительных пептидов, разработанного Е.П. Наймытенко, В.А. Быковым и соавторами [108], с помощью которого получают один пептидный комплекс, новый способ позволяет сократить продолжительность процесса форэкстракции в 12 раз, экстракции - в 7 раз и осаждения готового продукта - в 4,5 раза; обеспечивает получение 2-х пептидных комплексов, обладающих целевой активностью, с суммарным выходом, более чем в 2 раза превышающим выход пептидов, выделяемых по способу [108]. Кроме того, в разработанном способе отсутствует необходимость обработки сырья в процессе форэкстракции и экстракций ультразвуковым излучением.

Таким образом, в результате проведенного исследования разработан новый способ получения стресс-протективных пептидных комплексов из растительного сырья. Способ, предложенный Е.П. Наймытенко, В.А. Быковым и соавторами [108], позволивший впервые получить стресс-протективные пептидные комплексы из растений, представлял собой лабораторную методику, которую необходимо было усовершенствовать и адаптировать для возможности последующего внедрения в промышленное производство. Новый способ, разработанный в данном исследовании, обеспечивает получение готового продукта с целевой активностью при меньших трудовых и временных затратах. Кроме того, разработанный способ позволяет выделять два готовых продукта - пептидные комплексы, обладающие неодинаковой выраженностью фармакологических свойств, которая проявляется в преобладании анксиолитического действия и положительного влияния на экстраполяционное поведение у одного комплекса и преобладании актопротекторных свойств у другого комплекса.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рогов, Антон Владимирович, Москва

1. Авенирова Е.Л. Токсичность гистонов и их влияние на синтез РНК в ткани мозга//Автореф. дис. канд. биол. наук.-Л., 1972.-С. 16-21.

2. Андреева Е.В., Костылева Е.И., Пинаев Г.П., Тартаковский А.Д. Инактивация протеаз в процессе получения гистона как способ изменения его гетерогенности//Матер. науч. конф. ин-та цитологии АН СССР. Л., 1970.-С. 6.

3. Андреева И.Б., Вишневская Т.О., Газарян К.Г. Роль гистона, богатого серином (Н5) в инактивации генома эритроцитов птиц//Молек. биол. -1978.-Т. 12.-Вып. 1.-С. 123-134.

4. Антигипоксанты и актопротекторы. Итоги и перспективы//Матер. конф. -СПб, 1994. Вып. 3.

5. Асадуллаев Т.А., Букринская А.Г. Действие гистонов и 6-азауридина на репродукцию миксовирусов//Труды Азерб. науч.-исслед. ин-та вирусологии, микробиологии и гигиены за 1966 год. 1970. - Т. 18. - С. 247-250.

6. Ахназарова С.Л., Кафаров В.В. Оптимизация экспериментов в химии и химической технологии. М.: ВШ, 1978. - С. 28-39.

7. Ашмарин И.П. и др. Аддитивное действие Актиномицина Д и гистонов на синтез клеточной РНК//Вопр. мед. химии. — 1967. Т. 13. — Вып. 4. — С. 355-359.

8. Ашмарин И.П., Авенирова Е.Л. Влияние гистонов и актиномицина Д на синтез РНК мозга: действие in vivo в мозгу белых мышей//Вопр. мед. химии. 1970. - Т. 16. - Вып. 2. - С. 137-139.

9. Ашмарин И.П., Авенирова Е.Л. Влияние гистонов, протамина и актиномицина Д на синтез РНК мозга//Вопр. мед. химии. — 1969. Т. 15. - Вып. 5. -С. 532-535.

10. П.Ашмарин И.П., Ждан-Пушкина С.М., Кокряков В.И. Антибактериальные и антивирусные функции основных белков клетки и перспективы практического их использования//Известия АН СССР, сер. Биол. 1972. -№4.-С. 502-508.

11. Ашмарин И.П., Каменская М.А. Нейропептиды в синаптической передаче//Итоги науки и техники, серия «Физиология человека и животных». Т. 34. - М., ВИНИТИ, 1988.

12. П.Ашмарин И.П., Ралчев К.Х. Взаимоотношения гормонов и гистонов. Подавление действия гормона роста некоторыми фракциями гистонов//Докл. АН СССР. Сер. Биология. 1973. - Т. 258. - № 2. - С. 451453.

13. Н.Ашмарин И.П., Суродеева Е.К. Специфичность и обратимость стабилизации сперматозоидов некоторыми гистонами//Биохимия. 1969. — Т. 34. — Вып. 3. — С. 655-658.

14. Бадыштов В.А., Лосев С.А., Сытник С.И. и др. Исследование механизма защитного действия ацефена//Эксп. клин, фармакол. — 1995. Т. 58. - № 5. -С. 68-71.

15. Баландин И.Г., Козлова И.А., Мельникова JI.A., Петерсон О.П. Влияние гистона на адсорбцию и депротеинизацию вируса осповакцины: Ингибиторы вирусной активности. Рига: Зинатне, 1967. - С. 32-33.

16. Баландин И.Г., Кольцов В.Д. Влияние гистонов и актиномицина Д на репродукцию РНК-содержащих вирусов//Химиотерапия инфекций и лекарственная устойчивость патогенных микроорганизмов: Тез. докл. Всесоюз. конф.-М., 1973. С. 159-161.

17. Баландин И.Г., Лозовская Л.С., Добрецов Г.Е. Гемагглютинирующая активность гистонов//Вопр. мед. химии. 1969. - Т. 15. - Вып. 2. - С. 132138.

18. Балынина Е.С., Березовская И.В. Сравнительная оценка методов определения ориентировочной реакции крыс в токсикологическом эксперименте//Фармакология и токсикология. № 5. - 1976. - С. 635638.

19. Барабай В.А. Механизмы стресса и перекисного окисления липидов//Усп. совр. биол. 1991. - Т. 111. - Вып. 6. - С. 923-931.

20. Барабай В.А., Брехман И.И., Голотин В.Г., Кудряшов Ю.Б. Перекисное окисление и стресс. — СПб, 1992. 149с.

21. Белки. Биохимия белковых веществ, т. 3.//под ред. Г. Нейрата и К. Бейли. М.: Изд-во ин. лит., 1958. - С. 88-96.

22. Бердышев Г.Д. Ядерные белки и их роль в регуляции генома//Молек. генет. и биофизика. Киев, 1986. - Вып. 11. - С. 99-105.

23. Биохимия растительного сырья (под ред. В.Г. Щербакова). М.: Колос, 1999. - С. 137-162.

24. Блюм Я.Б. и др. II. Ацетилирование, метилирование гистонов и белок А24// Молекулярная биология (АН УССР. Ин-т молекуляр. Биологии и генетики). Киев, 1982. - Вып. 32. - С. 66-77.

25. Бойг X., Бириштиль М., Коттен М., Вагнер Э. Способ переноса нуклеиновой кислоты в клетки животных. Патент РФ №2098487, приоритет от 10.12.1997.

26. Бондаренко Н.А. Избирательное влияние нейролептиков на дофамин-зависимое нарушение поведения крыс в тесте экстраполяционного избавления//Бюлл. эксп. биол. мед. 1990. - Т. 11. - № 11. - С. 506-509.

27. Босток К., Самнер Э. Хромосома эукариотической клетки (под ред. А.Ф. Захарова). -М., 1981.-С. 184-186.

28. Бреслер В.М., Воробьёва В.И. Торможение роста перевивной опухоли нефракционированными препаратами гистонов нормальных тканей млекопитающих/УЦитология. 1963. - Т. 5. -№ 1. — С. 69-72.

29. Букринская А.Г., Гительман А.К., Бурдучева О., Жень Куй-Фан. Действие гистонов на репродукцию миксовирусов//Вопр. вирусологии. 1965. - № 6. - С. 720-726.

30. Булычёв А.Г., Новиков И.П., Браун А.Д. Влияние циклических нуклеотидов и некоторых фракций гистонов на дыхательную и фосфорилирующую активность митохондрий/УЦитология. — 1978. Т. 20. - № 8. - С. 938-941.

31. Буш Г. Гистоны и другие ядерные белки (пер. с англ. В.Д. Аксельрода, под ред. и с предисл. д.б.н. Баева). -М.: Мир, 1967. С. 80-100.

32. Быков В.А., Дубинская В.А., Минеева М.Ф., Ребров Л.Б., Колхир В.К. Способ выявления веществ, обладающих антиоксидантными свойствами, in vitro. Патент РФ № 2181892, приоритет от 06.06.2001.

33. Быков В.А., Минеева М.Ф., Дубинская В.А. и др. Способ выявления веществ, обладающих адаптогенными свойствами, in vitro. — Патент РФ № 2181890, приоритет от 06.06.2001.

34. Быков В.А., Минеева М.Ф., Наймытенко Е.П., Колхир В.К. Стресспротек-тивные мнемотропные пептиды из растений//Химия, технология, медицина: Сб. науч. тр. Всерос. НИИ лек. и ароматич. раст. М., 2000. -С. 192-199.

35. Вальдман А.В. Пептиды как модуляторы моноаминэргических процессов//Фармакология нейропептидов. М.: ИФ, 1982. - С. 9-30.

36. Вальдман А.В., Козловская М.М. Фармакологическая регуляция эмоционального стресса. М.:Медиздат,1979. - 360с.

37. Веретенникова Н.И. Биологически активные пептиды фрагменты иммуноглобулинов//В кн.: Структурные основы действия пептидных и белковых иммунорегуляторов (под ред. Г.И. Чипенса). - Рига: Зинатне, 1990.-С. 101-103.

38. Веретенникова Н.И. Биологически активные пептиды — фрагменты иммуноглобулинов//В кн.: Структурные основы действия пептидных и белковых иммунорегуляторов (под ред. Г.И. Чипенса). — Рига: Зинатне, 1990.-С. 240-242.

39. Вознесенский А.Т. Влияние новых производных ГАМК на память и обучение//Дисс. на соиск. уч. степ, к.м.н. — 14.00.25 — Волгоград, 1989. -245с.

40. Воронина Т.А., Середенин С.Б. Ноотропные препараты, достижения и новые проблемы//Эксп. клин, фармакол. 1998. - Т. 61. - № 4. - С. 3-9.

41. ВФС 42-2147-92 Миелопептид. Введена с 09.06.1992. - 11 с.

42. ВФС 42-3065-98 Пептид дельта-сна. Введена с 01.07.1998. - 7с.

43. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии//под ред. Хеншен А. и др. М.: Мир, 1988. - С. 201-249.

44. Ганелина JI.II1. Кортикостероидные гормоны и гистоны//Цитология. -1975.-Т. 17.-№ 1.-С. 514.

45. Георгиев Г.П. К цитохимии ядрышек и остаточных хромосом//Цитология.- 1960.-Т. 2.-С. 186-189.

46. Георгиев Г.П. Цитохимическое исследование нуклеопротеидных фракций клеточных ядер//Биохимия. 1958. - Т. 23. - С. 700-708.

47. Георгиев Г.П., Бакаев В.В. Три уровня структурной организации хромосом эукариот//Молек. биология. — 1978. № 6. - С. 1205-1230.

48. Георгиев Г.П., Ченцов Ю.С. О труктуре клеточного ядра//Докл. АН СССР.- 1960.-Т. 132.-С. 199-201.

49. Гинейтис А.А. Белки хроматина//Могография//АН Лит. ССР. Ин-т биохимии. Вильнюс: Мокслас, 1988. - С. 67-68.

50. Гинейтис А.А. Изучение фракционного состава гистонов методом электрофореза на крахмальном геле//Матер. 1-й науч. конф. молод, специалистов ин-та цитологии АН СССР. — M.-JL, 1966. — 12с.

51. Гинейтис А.А., Ясинскас A.JI. Метод препаративного выделения гомогенных фракций гистоиов/ТМетоды в биохимии: Матер. 2-го съезда биохимиков Литовской ССР. Вильнюс, 1975. - С. 29-33.

52. Голосова Т.В., Фром А.А., Рудницкая М.З. и др. Стерилизация белковых препаратов комбинированным воздействием у-облучения и тепла//Матер. Междунар. Симп. По дезинфекции и стерилизации. М., 1972. - С. 84.

53. Гомазков О.А. Системы нейрохимической регуляции при патологии мозга//Биомед. хим. 2004. - Т. 50. - Вып. 4 - С. 321-343.

54. Горюхина О.А., Гончарова В.П., Степанова И.С., Резцова В.В. Протеиназная активность ядер различных тканей в отношении эндогенных гистонов//Биохимия. 1979. - Т. 44. - Вып. 3. - С. 504-513.

55. Горюхина О.А., Леонтьева Г.Ф., Кашкин А.П. некоторые антигенные свойства препаратов гистона тимуса телёнка//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. 1978. - № 7. - С. 91-96.

56. Государственная Фармакопея СССР: Вып.1. Общие методы анализа/МЗ СССР. 11-е изд., доп. - М.: Медицина, 1987. - 336 с.

57. Государственная Фармакопея СССР: Вып.2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье/МЗ СССР. 11-е изд., доп. — М.: Медицина, 1989. - 400 с.

58. Гублер Е.В., Генкин А.А. Применение непараметрических критериев статистики в медико-биологических исследованиях. Л., 1973. - 198с.

59. Данчев Н.Д., Рожанец В.В., Вальдман А.В. Влияние хронического психогенного стресса на ряд поведенческих и нейрохимических характеристик крыс//Бюлл. эксп. биол. и мед. 1986. - Т. 101. - № 1. - С. 57-59.

60. Дебабов В.Г., Ребентиш Б.А. Фракционирование гистонов электрофорезом в ПААГ//Биохимия. 1966. - Т. 31. - Вып. 5. - С. 943-947.

61. Дебов С.С. Количественное содержание белковых фракций в клеточных ядрах нормальных тканей и злокачественных опухолей//Биохимия. 1951. -Т. 16.-Вып. 4.-С. 314-319.

62. Дубровина Т.Я., Ашмарин И.П., Поляк Р.Я. Действие гистонов на репродукцию вирусов различной величины и сложности строения//Грипп и острые респираторные заболевания, ч.2. Науч. тр. Всесоюз. НИИ гриппа. Л., 1967. - С. 206-208.

63. Дубровина Т.Я., Мещерякова И.Е., Поляк Р.Я., Ашмарин И.П. Влияние гистонов нормальных и заражённых клеток на репродукцию некоторых ДНК- и РНК-содержащих вирусов//Общ. вирусология. М.,1968. - Т. 8. -№ 18.-С. 28-29.

64. Дурар Аль-Суфи, Горюхина О.А., Демьяненко Г.П., Бобрышев Ю.В. Изучение поступления экзогенного гистона из русла крови в различные отделы головного мозга//Вестн. ЛГУ. Сер. 3. Биология. 1991. - Вып. 3. -№ 17.-С. 129-132.

65. Дурар Аль-Суфи. Изучение проникновения в ткань мозга экзогенного гистона как потенциального белка-носителя лекарственных веществ//Автореф. дисс. канд. биол. наук. СПб., 1992. - С. 16.

66. Дюйсалиева Р.Г., Кольцов В.Д., Марченко В.И., Баландин И.Г. Усиление антивирусной активности в клетках под влиянием гистона и интерфе-рона//Общ. вирусология. М.,1968. - Т. 8. - № 18. - С. 59-60.

67. Елинов Н. П. Основы биотехнологии. СПб.: Наука, 1995. — 104с.

68. Ершова-Павлова А.А. Влияние гистонов на адаптирование к росту in vitro клеточной линии опухолей человека различного генеза//Адаптационные механизмы и методы их регуляции. Гродно, 1980. — С. 106-107.

69. Ждан-Пушкина С.М., Ашмарин И.П., Комкова А.И. Действие гистонов на микроорганизмы. Сообщ. II. Изучение процесса взаимодействия гистонов и Acetobacter suboxudans//)KypH. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1968. - № 5. - С. 38-41.

70. Калинина Е.В., Новичкова М.Д., Комисарова И.А. Метаболитный препарат МР-33 — индуктор внутриклеточного уровня глутатиона и глутатионзависимых ферментов//Бюлл. эксп. биол. и мед. — 1999. Т. 128. -Вып. 7.-С. 56-58.

71. Каменский А.А., Сарычева Н.Ю., Батурина Е.Ю., Ашмарин И.П. Интраназалыюе введение регуляторных пептидов//Вестн. АМН СССР. — 1988.-№ 10.-С. 43.

72. Каплан А.Я., Кошелев В.Б., Незавибатько В.И., Ашмарин И.П. Повышение устойчивости организма к гипоксии с помощью нейропептидного лекарственного препарата Семакс//Физиология человека- 1992.-Т. 18. -№ 5. С. 104-107.

73. Карпова Л.Д., Минеева М.Ф., Карпов Д.А. Тирозингидроксилаза клеток крови как показатель функционального состояния человека// Биомедицинские технологии. М., 2002. - Вып. 19. — С. 12-17.

74. Каррер П. Курс органической химии (под ред. М.Н. Колосова). Л.: ГНТИХЛ, 1960.-С. 397.

75. Клименко В.Г. Выделение и очистка белка из растительного материала//Укр. 6ioxiM. журн. 1952. - Т. 24. - № 4. - С. 499-503.

76. Клуша В.Е. Пептиды регуляторы функций мозга//Монография. — Рига: Зинатне, 1984.-С. 141-142.

77. Клуша В.Е., Муцениеце Р.К., Лиепа И.Р. Изыскание стресспротективных пептидов среди белковых фрагментов//Принципы и механизмы деятельности мозга человека: Тез. докл. 2-й Всесоюз. конф. — Л., 1989. — С. 260-261.

78. Ковалева С.В., Исаева И.В., Евтушенко Н.С. Пептидные лекарственные средства и их стандартизация// Ведомости научного центра экспертизы и государственного контроля лекарственных средств. — 2002. № 2(10). — С. 83-94.

79. Колпакова В.В. Научные основы технологии получения и применения белковых продуктов из пшеничных отрубей. Автореферат докт. дисс. — М., 1997.-С. 4-23.

80. Корнева Е.А., Григорьев В.А., Клименко В.А., Столяров И.Д. Электрофизиологические феномены головного мозга при иммунных реакциях. Л.: Наука, 1990. - 148 с.

81. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики. -М: Мир, 1979.-279с.

82. Король Б. Действие у-радиации на гистоны: Автореф. дис. докт. биол. наук. Пущино, 1970. - С. 24-26.

83. Королюк М.А., Иванова М.И., Майорова И.Г., Токарев В.Е. Метод определения активности каталазы // Лаб. дело. М.: Медицина. -1988. -№ 1.-С. 1-8.

84. Кравченко Л.С., Воробьёв В.И. Очистка и фракционирование ДНП-комплекса хроматографией на геле фосфата кальция//Матер. науч. конф. ин-та цитологии Ан СССР. Л., 1967. - С. 56-57.

85. Кривчик А.А., Дадьков И.Г., Берлов Г.А. и др. Экспериментальное исследование противопухолевого действия эмбриональных

86. Крыжановскнй Г.Н., Луценко В.К. Значение нейротрофических факторов для патологии нервной системы//Усп. совр. биол. 1995. - Т. 115. — № 1. -С. 31-49.

87. Кушнер В.П., Гершун В.А., Горячева А.А. О выделении негистоновых белков из хроматина клеток животных//Цитология. — 1984. Т. 26. - № 10.-С. 1196-1199.

88. Ляпина Л.А. Влияние гистонов на неферментативный фибринолиз плазмы//Вопр. мед. хим. 1989.-Т. 35. - № 1.-С. 37-41.

89. Максимов В.Н. Многофакторный эксперимент в биологии. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1980. - С. 6-95.

90. Маслов Л.Н., Крылатов А.В., Лишманов Ю.Б. Об участии эндогенных агонистов ц- и 5- опиатных рецепторов в механизмах антиаритмического эффекта адаптации//Бюл. экспер. биол. и мед. 1996. — Т. 121. - № 1. - С. 24-25.

91. Меерсон Ф.З., Пшенникова М.Г. Адаптация к стрессорным ситуациям и физическим нагрузкам. М., 1988. - 253с.

92. Миль Е.М., Бинюков Е.М. Локальная гомология аминокислотных последовательностей гистонов НЗ, Н4 и белка репрессора Я.-Сго. Возможная конформация гомологичных участков гистонов в ДНШБиохимия. 1988. - Т. 53. - № 12. - С. 1980-1986.

93. ЮЗ.Минеева М.Ф. Механизм действия нейролептиков//Итого науки и техники. Серия Фармакология. Химиотерапевтические средства. — М.: ВИНИТИ, 1989. Т. 15. - С. 192-224.

94. Минеева М.Ф. Физиологические основы регуляции тирозингидроксилазы//Нейрохимические основы психотропного эффекта. М., 1982. - С. 53-63.

95. Минеева М.Ф., Маркосян К.А., Курганов Б.И. Влияние гептапептида, производного тафтсина, на тирозингидроксилазу синаптосом//Нейрохимия. 2002. - Т. 19. -№ 2. - С. 98-101.

96. Юб.Минеева-Вялых М.Ф. Прямой спектрофотометрический метод измерения скорости тирозингидроксилазной реакции// Вопр.мед.химии. 1976. - Т. 22. - С. 274-279.

97. Мироненко А.В., Иванцов JI.B., Романовская С.Г. Способ получения гистона из растительного сырья//Авторское свидетельство № 1139437 от 15.02.85.

98. Наймытенко Е.П., Быков В.А., Крашенинников О.А., Наймытенко К.Е. Способ получения белков, обладающих сродством к опиатным рецепторам. Патент № 21000061 от 07.09.93.

99. Никифорович Г.В., Галактионов С.Г., Чипенс Г.И. Конформация пептидных биорегуляторов. -М.: Медицина, 1983.-С. 167-172.

100. Ю.Николайчик В.В., Дальнов И.Г. Действие гистонов на рост и развитие экспериментальных опухолей: Тез. докл. Минский мед. ин-т. Отчёта, науч. конф. Минск,1969. - С. 337-338.

101. Ш.Новиков С.Н.//В кн.: Феромоны и размножение млекопитающих. Физиологические аспекты. JI.,1982. - С. 169.

102. Носач Л.Н. Влияние экзогенного гистона на репродукцию аденовирусов//Молекулярная генетика, микробиология, вирусология.-1983.-№3.-С. 34-39.

103. Пб.Патент № 2181891. Способ выявления веществ, обладающих противомикробными и противовирусными свойствами, in vitroll Быков В.А., Минеева М.Ф., Дубинская В.А., Ребров Л.Б., Колхир В.К. 2002.

104. Патент № 218892. Способ выявления веществ с потенциальной иммуномодулирующей активностью in vitro с применением НАДФ-Н-оксидазной тест-системы//Быков В.А., Минеева М.Ф., Попова Н.Б. — 2002.

105. Петерсон О.П., Мельникова Л.А., Козлова И.А. и др. Влияние гистона на развитие вируса осповакцины в клетках культуры ткани: Вирус и клетка. — Рига: Зинатне, 1966. — С. 219-225.

106. Поддубная Е.В., Чихунова С.Д., Трусле Э.А.// Патология органов грудной полости. — Рига, 1983.-С. 159-162.

107. Практикум по биохимии (под ред. Л.Г. Смирновой). — М.: Медгиз, 1957.-С. 37.

108. Практикум по биохимии (под ред. Л.Г. Смирновой). — М.: Медгиз, 1957.-С. 48.

109. Протас А.Ф. Биология гистонов//Структура и генетическое значение белков хроматина: Сб. науч. тр. — Киев, 1985. — С. 16-24.

110. Рахманкулова И.Х., Гарибова Т.Л., Воронин К.Э. и др. Эффекты пирацетама при длительном применении в эксперименте //Фармакол.токсикол., 1985. Т. 48. - № 4. - С. 42-46.

111. Рисин С.А. Влияние гистонов на активность цитохромоксидазы митохондрий печени мышей//Вопр. мед. хим. 1981. - Т. 27. - № 11.— С. 56-59.

112. Романов В.А., Федорович Э.И. Лиофильная сушка белковых препаратов в лабораторных условиях: Сб. науч. тр. Белорус, науч.-исслед. кожновенерологич. ин-та. Минск, 1972. - Вып. 18.-С. 99-101.

113. Самедов А.Ш., Подольский В.И., Камышинцев М.В. и др. Влияние длительного введения гистонов на периферическую кровь и некоторые другие показатели состояния экспериментальных животных//Антибиотики. 1974. - Т. 19. - № 17. - С. 587-593.

114. Селье Г. Очерки об адаптационном синдроме. М., 1960. - 254с.

115. Селье Г. Стресс без дистресса. -М., 1979. 123с.

116. Семина О.В., Семенец Т.П., Цеппецауэр М., Цебецауэр А., Поверенный A.M. Воздействие гистона на кроветворные клетки-предшественники (КОЕс) нормального и облученного организма//Радиационная биология. Радиоэкология. 1994. - Т. 34. - № 4-5. - С. 544-549.

117. Сидорова Е.В. Изучение действия гистонов на синтез антител и других клеточных белков: Тез. докл. Конф. по общ. иммунологии. М.,1965. — С .4-5.

118. Сидорова Е.В. Строение и биологическая функция гистонов//Успехи биологической химии. М.: Наука,1967. — Т. 8. — С. 117-137.

119. Суходольская А.И., Рыбакова Л.П., Тяготин Ю.В. Влияние гистонов на лимфоциты человека in vitroll Актуальные вопросы иммуногематологии. -Л., 1977. С. 105-111.

120. Сытник С.И., Нагорнев С.Н. Методические аспекты фармакологической регуляции эмоционального стресса у лиц опасных профессий//Вест. РАМН. 1996. - № 12. - С. 60-63.

121. Тиктонуло Е.И., Одинцова Т.И., Ермохина Т.М. и др. Кооперативность компактной структуры гистонов HI и Н5//Доклады АН СССР. 1982. -Т. 263. -№ 1.-С. 208-211.

122. Тихомиров В.Г. Технология пивоварения и безалкогольного производства.-М.: Колос, 1999.-С. 132-133.13 7. Тихомиров В.Г. Технология пивоварения и безалкогольного производства. -М.: Колос, 1999. С. 180.

123. Тишкина Т.Е., Горюхина О.А., Вишневский Б.И. Влияние ограниченного протеолиза гистонов на их биологическую активность//Вестн. Ленингр. ун-та, сер. Биол. 1983. - Т. 15. - Вып. 3. - С. 66-73.

124. Тонгур B.C., Лейкина Е.М., Куликова Л.Г. Фракционирование ДНП, выделенного из печени//Бюлл. экспер. биол. мед. 1959. - Т. 47. - № 4. — С. 66-69.

125. НО.Урысон С.О. Изучение ядерных фракций некоторых тканей животного и растительного происхождения//Биохимия. 1956. - Т. 21. - Вып. 2. — С. 262-267.

126. Фармакологическая коррекция состояний дезадаптации. -М., 1986.

127. ФС 42-3014-94 Даларгин. Введена с 11.04.1994. - 7с.

128. ФС 42-3918-00 Семакс. Введена с 02.05.2000. - 7с.

129. ФС № 42-1256-79 Протамин сульфат. Введена с 19.06.1979. - 7с.

130. Нб.Фурдуй Ф.Н. Физиологические механизмы стресса и адаптации приостром воздействии стресс-факторов. Кишинев, Штиинца, 1986. — 239с.

131. Харченко Е.П., Багров А .Я., Соколова Т.В. Фармакологическое влияние экзогенных гистонов на мышцы//Бюл. экспер. биол. и медиц. — 1987. — Т. 103.-№4.-С. 418-420.

132. Хашимова З.С., Калонтаров А.И., Махмудова А.А. и др. Взаимодействие гистона HI с нуклеосомными гистонами//Докл. АН УзССР. 1981. — № 9.-С. 52-53.

133. Храпунов С.И., Сиволоб А.В., Бердышев Г.Д. Модель пространственной укладки полипептидных цепей гистонов НЗ и Н4//Биофизика. 1981. -Т. 26. - Вып. 2. - С. 242-246.

134. Храпунов С.И., Сиволоб А.В., Бердышев Г.Д. Теоретическое предсказание третичной и четвертичной структуры гистонов//Молекулярная биология (АН УССР. Ин-т молекуляр. Биологии и генетики). Киев, 1982. - Вып. 30. - С. 73-82.

135. Храпунов С.И., Сиволоб А.В., Бердышев Г.Д. Теоретическое предсказание пространственной укладки полипептидных цепей гистонов Н2А и Н2В//Биофизика. — 1981. Т. 26.-Вып. 1.-С. 37-41.

136. Храпунов С.И., Сиволоб А.В., Бердышев Г.Д. Теоретическое предсказание третичной структуры гистона HI//Биофизика. 1981. — Т. 26.-Вып. 4.-С. 587-589.

137. Храпунов С.Н., Протас А.Ф., Бердышев Г.Д. Гетерогенность структуры димеров гистонов (Н2А-Н2В)//Биофизика. 1982. - Т. 27. - Вып. 5 - С. 791-794.

138. Храпунов С.Н., Протас А.Ф., Драган А.Н., Бердышев Г.Д. Влияние ионной силы среды на структуру и агрегацию гистона HI из тимуса телёнка//Биофизика. 1984. - Т. 29. - Вып. 5. - С. 590-594.

139. Храпунов С.Н., Протас А.Ф., Драган А.Н., Бердышев Г.Д. Две структурные формы октамера гистонов//Биофизика. 1985. - Т. 30. -Вып. 5.-С. 791-796.

140. Цитология ферментов/под ред. Покровского А.А. М.: Мир, 1971. - С. 55-57.

141. Черная Ж.А. Биологическое действие гистонов при экспериментальном лейкозе//Автореф. дисс. канд. биол. наук. Киев, 1979. — С. 20.

142. Чипенс Г.И. Дизайн иммунорегуляторов на базе пептидно-белковых веществ//В кн.: Химия и биология иммунорегуляторов. Рига: Зинатне, 1985.-С. 6.

143. Шарпатый В.А., Закатова Н.В. О природе и превращениях радикалов в у-облучённом растворе гистона//Радиобиология. — 1981. — Т. 21. — Вып. 1. — С. 45-50.

144. Шляховенко В.А., Негрей Г.З., Бароновский М.А., Бутенко З.А. Гистоны, как возможные факторы антиканцерогенеза//Факторы антиканцерогенеза. Киев, 1974.- С. 86-87.

145. Элпидина Е.И., Одинцова Т.И., Горожанин П.П., Крашенинников И.А. Выделение гистонов из ядер простейшего Astasia longa/УБиохимия. -1980. Т. 45. - Вып. 3. - С. 507-516.

146. Яременко К.В. Адаптогены как средства профилактической медицины. — Томск: Изд. Томск, ун-та, 1990. -96с.

147. Aebi Н. Methods in enzymatic Analysis ed H. V. Bergmeyer S. P. -1974. -V. 2. -P. 673-678.

148. Ajiro K., Borun T.W., Shulman S.D. et al. Comparison of the structures of human histones 1A and IB and their intramolecular phosphorilation sites during the HeLa S-3 cell cycle//Biochemistry. 1981. - Vol. 20. - P. 14541464.

149. Allfrey V. G. Post-synthetic modification of histone structure/Лп: Chromatin and Chromosome Structure (H.J. Li, R. Eckhardt, eds.). New York, Academic Press, 1977.-P. 167-191.

150. Allfrey V., Mirsky A., Osawa S. Protein synthesis in isolated cell nuclei//J. gen. physiol. 1957. - Vol. 40. - P. 451-471.

151. Allis С., Sullivan D., Kevin F. Marqueur moleculaire pour mitose. Патент Франции WO 01/92339, приоритет от 06.12.2001.

152. Bae I., Kim D., Yim H. et al. Composition contenant des histones et utile dans le traitement de l'arthrite rheumatoid. Патент Франции WO 99/37318, приоритет от 29.07.1999.

153. Bang I. Studies on histones// Z. physiol. Chem. 1899. - Vol. 27. - P. 463486.

154. Beuter E., Red cell metabolism. Ed. E. Beuter, Churchill, Livingsone. 1986. -P. 69-71.

155. Biserte G., Sautiere P. Groupes a-amines terminaux des histones du thymus de vean et de tumeurs experimentales du rat//Compt. Rend. Acad. Sci. 1958. -Vol. 246.-P. 1764-1766.

156. Bishop C.A., Meyer L.J., Harding D.R. et al. The preparative separation of synthetic peptides on reversed-phase silica-packed in radially compressed flexible-walled columns//J. Liqu. Chromatogr. 1981. - Vol. 4 - P. 661-680.

157. Black M.M., Speer M.D. Maurice M. Antigen-inducted changes in lymph node Metallophilia//Arch. of pathology. 1958. - Vol. 66. - P. 754.

158. Bohm F.L., Strickland W.M., Strickland M. et al. Purification of the five main calf thymus histones fractions by gel exclusion chromatography//Febs lett. -1973.-Vol. 34.- P. 217-237.

159. Bradshaw R., Timothy P. A user's guide: introduction to peptide and protein HPLC, vol. 1. Copyright Phenomenex, 1998. - P. 10-25.

160. Carter.D.B., Efird P.H., Chi-Bom Chac. Chromatin bound proteases and their ingibitors. In: Methods in cell biology. - New York; San Francisco; London, 1978.-Vol. 19.-Ch. 18.-P. 175-190.

161. Certa U., von Ehrenstein G. Reversed phase high performance liquid chromatography of histones//Anal. Biochem. 1981. — Vol. 118. - P. 147154.

162. Class R., Zeppezauer M. Compositions antimicrobiennes comprenant l'histone HI, trousses, et modes d'employ des dites compositions. Патент Франции WO 01/10901, приоритет от 15.02.2001.

163. D'Anna I.A., Thayer M.M., Tobey R.A., Gurley L.R. G,- and S-phase synthesis of histones HI and HI0 in mitotically selected CHO cells: utilization of HPLC//Biochemistry. 1985. - Vol. 24. - P. 2005-2010.

164. Daniels R.H., Elmore M.A., Hill M.E., Shimuzu Y. et al. // Immunology.-1994.-№ 4.-P. 465-472.

165. Datta S., Kaliyaperumal A. Localization of major peptide autoepitopes for nucleosome specific T-cells of systemic lupus erythematosus. Патент США № 6468537, приоритет от 22.10.2002.

166. De Wied D. The neuropeptide concept//Progr. In Brain Res. 1987. - V. 72. -P. 93-108.

167. Delange R.J., Smith E.L. Histones: structure and function//Ann. Rev. Biochem.- 1971.-Vol. 40.-P. 10410-10416.

168. Devlin A., Robert H. Transgenic fish. Патент Великобритании GB 2291646, приоритет от 31.01.1996.

169. Duncan N.M., Mija D.B. A note on a simple apparatus for detecting of neurological deficit in rats and mice. J. Amer. Pharm. Assoc. - 1957. - V. 46.-P. 208-229.

170. European Pharmacopeia, 3 ed. Strasbourg, 2001. - Suppl.

171. Fahmy O.G., Fahmy M.J. Mutagenic activity of cellular macromolecules in Drosophila me!anogaster//Nature. 1962. - Vol. 196. - P. 873-876.

172. Fallon A., Lewis R.W., Gibson K.D. Separation of the major species of interstitial collagen by reverse-phase HPLC//Anal. Biochem. 1981. — Vol. 110.-P. 318-322.

173. Foe V.E., Wilkinson L.E., Laird C.D. Comparative organization of active transcription in Oncopeltus fasciatus//Cell. — 1976. — Vol. 9. P. 131-146.

174. Forman H.Y., Liu R.-M., Shi M.M. Biothiols in health and disease// N. J. -1995.-P. 189-212.

175. Garel A., Zolan M., Axel R. Genes transcribed at diverse rates have a similar conformation in chromatin//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. - Vol. 74. -P. 4867-4871.

176. Grego В., Hearn M.T.W. Role of the organic solvent modifier in the revers-phase HPLC of polipeptides//Chromatographia. 1981. - Vol. 14. - № 10 -P. 589-592.

177. Gurley L.R., D'Anna I.A., Blumenfeld M. Preparation of histon variants and HMG-proteins by reversed phase HPLC//J. Chromatogr. 1984. - Vol. 297. -P. 147-165.

178. Hammarsten E. Zur Kenntnis der biologischen Bedoutung des Nuclein saureverbindungen//Biochem. Z. 1924. - Vol. 144. - P. 383-466.

179. Hearn M.T.W., Grego В., Bishop C.A. The semi-preparative separation of peptides on reversed-phase silica-packed into radially compressed flexible-walled columns //J. Liqu. Chromatogr. 1981. - Vol. 4 - P. 1725-1744.

180. Heukeshoven J., Dernick R., Hashimoto T. Reversed-phase high performance liquid chromatography of virus proteins and other large hydrophobic proteins in formic acid containing solvents//J.Chromatogr. 1982. - Vol. 252. - P. 241-254.

181. Hiroe Nakazava, Chokoh Genka, Minako Fujishima. Pathological aspects of active oxygen/Free Radicals//Japanese J. Physiol. 1996. - Vol. 46. - P. 1532.

182. HniIica L., Hupka St. Zleps eny sposob pripravy histonu z tel'acieho tymu//BioIogia (Bratislava). 1959. - Т. 11. - P. 821-826.

183. Hnilica L.S., Bess L.G. The heterogeneity of arginie-rich histones //Analyt. Biochem. 1965. -Vol. 12.-P. 421-436.

184. Huether G. et al. Psychische Betalstung und neuronale Plastizitat//In: Kropiuning U., Stacher A. (Hrsg.) Ganzheits medizin und psychoneuroimmunologie. Wien: Vierter Wiener Dialog, Facultas, 1997.

185. Insoo В., Kim D., Yim H. et al. Method of treating rheumatoid arthritis with composition containing histone. Патент США № 6204242, приоритет от 20.03.2001.

186. Isenberg I. Histones//Annu. Rev. Biochem. 1979. - Vol. 48. - P. 159-191.

187. Johns E.W. Studies on histones. 7. Preparative methods for histone fractions from calf thymus//Biochem. J. 1964. - Vol. 92. - P. 55-59.

188. Johns E.W., Butler J.A.W. Studies on histones: 4. The histones of wheat germ//Biochem. J. 1962. - Vol. 84. - P. 436-439.

189. Johns E.W., Phillips D.M.P., Simpson P., Butler I.A.V. Improved fractionations of Arginine-rich histones from calf thymus//Biochem. J. — 1960.-Vol. 77.-P. 631-635.

190. Johns E.W., Phillips D.M.P., Simson P., Butler I.A.V. The electrophoresis of histones and histone fractions on starch gel//Biochem. J. 1961. - Vol. 80. -P. 189-192.

191. Kalinina E.V., Nechaev V.N., Saprin A.N. Antitoxic properties of a preparation of glutathione S-transferase//Biomed. sci. — 1991. — Vol. 2. — P. 415-416.

192. Konnopinska D., Nawrocka E., Siemion Z. et al. Partial sequences of histones with tuftsin activity//J. Peptid Protein Res. 1977. - Vol. 9. - № 1. - P. 71-77.

193. Kornberg R.D., Klug A. The nucleosome//Sci. Am. 1981. - Vol. 244. - № 2. - P. 52-64.

194. Korneyer A.Y. The role of the hypothalamic-pituitary adrenocortical axis in memory-related effects of anxiolytics//Neurobiol. J. Mem. 1997. - V. 67. -№ l.-P. 1-13.

195. Kossel A. Ueber einen peptonartigen Bestandthail des Zellkerns//Z. physiol. Chem.- 1884.-Vol. 8.-P. 511-515.

196. Lewis R.W., Falljn A., Stein S. et al. Supports for reversed-phase HPLC of large proteins//Anal. Biochem. 1980. - Vol. 104. - P. 153-159.

197. Lilienfeld L. Zur chemie der leukocyten//Z. physiol. Chem. 1893. - Vol. 18. -P. 472-486.

198. Lowry O., Rosenbrough N., Farr A., Randall R. Protein measurement phenol reagents //J. Biol. Chem. 1951. - Vol. 193. - № 1. - P. 265-275.

199. Mahoney W.C. Isolation of denatured protein and peptides by high performance liquid chromatography//Biochim. Biophys. Acta. 1982. - Vol. 704. - P. 284-289.

200. Mathis D., Oudet P., Chambon P. Structure of transcribing chromatin//Prog. Nuclei Acid Res. Mol. Biol. 1980. - Vol. 24. - P. 1-55.

201. McGhee J. D., Felsenfeld G. Nucleosome structure//Annu. Rev. Biochem. — 1980.-Vol. 49.-P. 1115-1156.

202. Mcllwain H. Chemical exploration of the brain. New York, 1963. - P. 2732.

203. Miller O.L. The nucleolus, chromosomes, and visualization of genetic activity// J. Cell Biol. 1981. - Vol. 91. - P. 15-27.

204. Mirsky A., Pollister A. Chromosin, a desoxyribose nucleoprotein complex of the cell nucleus//! gen. physiol. 1946. - Vol. 30. - P. 117-126.

205. Mirsky A., Pollister A. The nucleoprotamine of trout sperm//J. gen. physiol. — 1946.-Vol. 30.-P. 101-115.

206. Miyazaki A., Toshiyuki Т., Motoi K. et al. Lipolytic enzyme inhibitors. -Патент Великобритании GB 2239455, приоритет от 03.07.1991.

207. Mohberg I., Rusch H.P. Isolation of the nuclear histones from Myxomycete Phusarum polycepalumlIArch, of biochem. and biophys. 1969. - Vol. 134. -P. 577-589.

208. Morii Т., Mitsuyoshi A. Novel function peptide. Патент Японии JP 06192298, приоритет от 12.07.1994.

209. Nadean P., Pallotta D. and Lafontaine J.-G. Electrophoretic Study of Plant Histones: Comparison with vertebrate histones//Arch. Biochem. a. Biophys. — 1974.-Vol. 161.-P. 171-177.

210. Najjar V.A. Biochemical aspects of tuftsin deficiency syndrom//Med. Biol. — 1981.-Vol. 59. № 3. - P. 134-138.

211. Neelin I.M., Butler G.C. The fractionation of the histones of calf thymus and chicken erythrocytes by cation-exchange chromatography with sodium salts//Canad. J. Biochem. Physiol. 1959. - Vol. 37. - P. 843-859.

212. Pabst M., Hedegaard H., Johnston R. Cultured human monocytes require exposure to bacterial products to maintain an optimal oxygen radical response.//J. Immunol.-1982,-Vol. 128.№ l.-P. 123128.

213. Panyum S., Chalkley R. High resolution acrylamide gel electroforesis of histones//Arch. Biochem. a. Biophys. 1969. - Vol. 130. - № 1-2 - P. 337346.

214. Park J.-W. // Biochemical and Biophisical Research Communications.-1996.-Vol. 229.-P. 758-765.

215. Pearson J.D., Mahoney W.C., Hermodson M.A., Regnier F.E. Re versed-phase supports for the resolution of large denatured protein fragments//J. Chromatogr. 1981. - Vol. 207. - P. 325-332.

216. Pelletier M., Delaunay A. Influence exercee par des histones sur la phagocytose de bacteries vivantes on tuces par des macrophage de cobaye//C.R. Acad. Sci. Paris, 1972. - Vol. 247D. - P. 492-495.

217. Pestronk A. Autoantibodies and their targets in the diagnosis of peripheral neuropathies. Патент CUIA № 6121004, приоритет от 19.09.2000.

218. Porsolt R.D., Anton G., Blavet N., Jalfre V. Behavior despair in rats: a new model sensitive to antidepressant treatment//Eur. J. Pharmacol. — 1978. V. 47.-P. 379-391.

219. Rasmussen P.S., Murrey K., Luck I.M. On the complexity of calf thymus histone//Biochemistry. 1962. - Vol. 1. - P. 79-89.

220. Rathinavelu A., Malave A. Simple non-radioactive assay for estimating protein kinase and protein-phosphatase-1. Патент CLLIA № 6280965, приоритет от 28.08.2001.

221. Regnier F.E., Gooding K.M. High performance liquid chromatography of proteins//Anal. Biochem. 1980. - Vol. 103. - P. 1-25.

222. Rivier J.E. Use of trialkyl ammonium phosphate (TAAP) buffers in reverse phase HPLC for high resolution and high recovery of peptides and proteins//J. Liqu. Chromatogr. 1978. - Vol. 1 - P. 343-366.

223. Rizzo P.J. Basic chromosomal proteins in lower eucaryotes: relevance to evolution and function of histones//J. Mol. Biol. 1976. - Vol. 8. - P. 79-94.

224. Rokushika S., Ohrava Т., Hatano H.J. High speed aqueous gel permeation chromatography of proteins//J. Chromatogr. 1979. - Vol. 176. - P. 456-461.

225. Rubinstein M. Preparative high performance liquid partition chromatography of proteins//Anal. Biochem. 1979. - Vol. 98. - P. 1-7.

226. Rubinstein M., Cheng-Kiang S., Stein S., Udenfriend S. Characterization of proteins and peptides by high performance liquid chromatography and fluorescence monitoring of their tryptic digests// Anal. Biochem. 1979. -Vol. 95.-P. 117-121.

227. Setterfield G., Neelin J.M., Neelin E.M. and Bayley S.T. Studies on basic proteins from ribosomes of buds of pea seedlings//J. Mol. Biol. 1960. - Vol. 2.-P. 416-424.

228. Shuichi H., Masatoshi К., Masanori К. Serodiagnostic method and the kit used therefor. Патент Великобритании GB 2241782, приоритет от 11.09.1991.

229. Simpson R. Т. Structure of the chromatosome, a chromatin particle containing 160 base pairs of DNA and all the histones//Biochemistry. 1978. - Vol. 17.- P. 5524-5531.

230. Staneck D., Matisova E. Усиление активности интерферона гистоном/VActa virol. 1968. - Т. 12. - № 4. - P. 309-315.

231. Stern K.G., Goldstein G., Albaum H.G. Adenosinetriphosphatase activity of desoxyribose nucleoprotein from thymus//J. biol. chem. 1951. - Vol. 188. — P. 273-284.

232. Stem L., Chermat R., Millet D. et al. Comparative study in mise of ten 1,4-benzodiazepines and clobasam: anticonvulsant, anxiolytic, sedative and myorelaxant effects//Epilepsia. 1986. - V. 27. - Suppl.l. - P. 14-17.

233. Tahira K., Mishicawa S., Wada A. et al. Functional molecule transporter. -Патент Японии JP 08301791, приоритет от 19.11.1996.

234. The United States Pharmacopeia. Philadelphia, (USP 24), 2001. - Suppl. 3.

235. Thoma F., Koller Т., Klug A. Involvement of histone HI in the organization of the nucleosome and of the salt-dependent superstructures of chromatin//.!. Cell Biol. 1979. - Vol. 83. - P. 403-427.

236. Ui N. Rapid estimation of the molecular weights of protein polypeptide chains using high performance liquid chromatography in 6 M guanidine hydrochloride//Anal. Biochem. 1979. - Vol. 97. - P. 65-71.

237. Van der Rest M., Bennett H.P.J., Solomon S., Glorieux F.H. Separation of collagen cyanogens bromide-derived peptides by reversed-phase high performance liquid chromatography//Biochem. J. 1980. - Vol. 191. - P. 253-259.

238. Wehr C.T., Correia L., Abbott S.R. Evaluation of stationary and mobile phases for reversed phase HPLS of peptides // J. Chromatogr. Sci. - 1982.- Vol.20.-№3 -P. 114-119.

239. Weintraub H., Groudine M. Chromosomal subunits in active genes have an altered conformation//Science. 1976. - Vol. 193. - P. 847-856.

240. Weisbroad S. Active chromatin//Nature. 1982. - Vol. 297. - P. 289-295.

241. Zachau H.G., Igo-Kemenes T. Face to phase with nucleosomes//Cell. 1981. -Vol. 24.-P. 597-598.

242. Zbarsky I.B., Georgiev G.P. Cytological characteristics of protein and nucleoprotein fractions of cell nuclei//Biochim. et Biophys. Acta. 1959. - T. 32. -C. 301-305.

243. Zeppezauer M., Schonberger A., Cebecauer L. Peptides for the production of preparations for the diagnosis and therapy of systemic lupus. Патент США № 6369203, приоритет от 09.04.2002.

244. Zubay G., Wilkins M.H.F. An X-ray diffraction study of histone and protamine in isolated and combination with DNA//J. Mol. Biol. — 1962. -Vol. 4. P. 444-450.

Информация о работе

Рогов, Антон Владимирович
кандидата биологических наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.23

Диссертация

Получение пептидных комплексов стресс-протективной направленности из растительного сырья - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы