Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности формирования иммунных оболочек на поверхности клеток и перспективы их использования в микробиологических исследованиях

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Особенности формирования иммунных оболочек на поверхности клеток и перспективы их использования в микробиологических исследованиях"

РГ6 ОД

2 з ЦЩ т7

На правах рукописи

АДАМОВ Олег Алексеевич

"ОСОБЕННОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ ИММУННЫХ ОБОЛОЧЕК ИЛ ПОВЕРХНОСТИ КЛЕТОК И ПЕРСПЕКТИВ!! ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ"

03.00.07. - микробиология

диссертации на соискание

ученой степени доктора медицинских наук

г

Саратов, 1Э97

- г -

Работа выполнена в Российском научно-исследовательском противо- ' чумном институте "Микроб" и Саратовском научно-исследовательским институте сельской гигиены.

Научный консультант - доктор- медицинских наук.

профессор С. А.Коровкин

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук.

профессор В.С.Рыбкин;

действительный член'МАЕНЭБ, доктор биологических наук, профессор П.А.Чиров:

доктор медицинских наук Ю. ». Елисеев.

Ведущая организация: Ростовский на Дону государственный научно-исследовательский противочумный институт. .

Защита диссертации состоится "19 " июня 1997 г. в 13.00 часов на заседании Диссертационного Совета Д.074.32.01 при Российской научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" Министерства здравоохранения РФ (410005, г.Саратов. , Университетская. 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке . института "Микроб".

Автореферат разослан" tsCt&JL-1997 г.

Ученый Секретарь Диссертационного Совета, доктор биологических наук, профессор

Корнеев Г. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ ВВЕДЕНИЕ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. ■ Реакция антиген-антитело занимает центральное место в иммунологии. Исследование ее закономерностей ведется свыше 120 лет. Открыты коллсидно-хишческие свойства антител, изучены особенности образования комплексов анти-тело-антнгэн при разных соотношениях концентраций антител и антигенов, исследованы регуляторные функции иммунных антител в межклеточных и мезкмолекулярных взаимодействиях (Великанов И. И. . с соавт..1937, Зильбер Л.А.,1958; Бсйд У.,1969; Незлин Р. С. ,1972; Кульберг А.П., 1975, 1985; Петров Н. В. ,1976. 1983, 1987; Покровский В.И. '.с соавт., 1979; Ломов П.М., 1991. Наумов A.B. с соавт., 1992; Svejgard А.» 1995 и др.).

Показано, что в комплексах антитело-антиген, образовавшихся при избытке антител, последние несколькими слоями окружают каждую молекулу антигена. Подобные же многослойные покрытия из ' антител образуются при шаимодеЯствии их с патогенными микроорганизмами. При обработке микробных клеток антителами, меченными флюоресцеином, на них образуатся плотные слои люминесци-рувдх антител, четко обнаруживаемые в люминесцентном микроскопе. -

Вместе с тем никто из исследователей не ставил как проблему изучение свойств иммунных оболочек на поверхности молекул антигенов и клеточных антигенных мембран в плане возможности дальнейшего совершенствования методов их 'применения в микробиологической диагностике. За последние .30 лет не опубликовано

ни одной обзорной статьи о проницаемости иммунных оболочек, и ни в одной монографии по микробиологии и иммунологии нет раздела, рассматривающего свойства оболочек, образуемых иммунными антителами, ни в теоретическом, ни в практическом аспектах.

В связи со сказанным выше,. потребовалось собрать и обобщить разрозненные сведения об условиях образования антительных пленок или слрев, их свойствах и значении в иммунных механизмах и диагностических реакциях. Эти данные были, получены из научных публикаций, в которых образуемые антителами слои на поверхности антигенов изучались для выяснения механизмов реакций преципитации. агглютинации, связывания комплемента, опсонизации, а также реакций с антителами, меченными изоцианатом флзоресцеикэ или электронноплотными веществами и некоторых других.

Исследование закономерностей образования иммунных оболочек на поверхности молекул антигенов и клеток, содержащих поверхностно расположенные антигены, необходимы для более глубокогс понимания серологических реакций и поиска новых- возможностей при разработке эффективных методов микробиологической диагностики и новых лечебно-профилактических препаратов.

ЦЕЛЬ К ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЙ. Цель работу закидалась е изучен:«: особенностей формирования иммунных оболочек кз антите; на поверхности антигенов для совершенствования микробиологических и. серологических диагностических методов.

Для достижения атой цели были поставлены следующие оснсс-нм, задачн:

исследовать условия образования из антител :: иммунпы: комплекс?-; оболочек на эритроцитах:

2. разработать новый метод определения циркулирующих иммунных комплексов, основанный на изменении седиментации эритроцитов под влиянием иммунных оболочек, формируемых на них этими комплексами;

3. изучить проницаемость оболочек, образующихся из антител на поверхности микробных клеток, для низкомолекулярных веществ и биополимеров, обладающих антимикробной активностью;

4. исследовать влияние • некоторых условий на образовавние иммунных оболочек;

5. разработать новый метод определения титров специфических антител в сьшоротках. основанный на свойстве иммунных антител образовывать иммукомембраны с различной проницаемостью;

6. разработать методику оценки популяций вирулентных и ази-рулектных холерных вибрионов по плотности поверхностных антигенов, участвующих в Формировании антительной иммунной оболочки.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ:

- впервые проведен анализ и обобщение опубликованных'данных о формировании антителами иммунных оболочек на поверхности антигенов, а также обоснована актуальность изучения иммунных оболочек, формируемых антителами ка поверхности антигенов, их структуры и роли в защитных механизмах и реакциях;

■ - впервые проведены исследования проницаемости оболочек, образуемых иммунными антителами на поверхности клеток животных (эритроцитах) и бактерий, к низкомолекулярным веществам и биополимерам, обладающим лнтической или антимикробной активностью:

- изучены с помощью люминесцентного и электронного микроскопов. а также аппарата для проточной цитофлюориметрии накоти-

- & - -

рые закономерности формирования иммунных оболочек на поверх- 1 ности микробных клеток;

- в экспериментах с эритроцитами получены новые данные о роли различных концентраций антител и растворимых имму;,лых ¡-.-.'Мплексов антитело-антиген • в образовании иммунных оболочек;

- на основании проведенных исследований разработан метод

гистрированный в качестве изобретения;

- установлено, что при высоких концентрациях поликлональкых или моноклональиых антител на поверхности клеток, , содержащих гомологичные антигены, образуются из антител иммунные оболочки. обладавшие свойством полупроницаемых мембран; при низких концентрациях антител из них формируются крупнопористые оболочки. проницаемые как для низкомолекулярных, так и для высокомолекулярных веществ;

- изобретен новый способ определения титров антител, основанный на их свойстве образовывать, в зависимости от'концентрации, полупроницаемые или проницаемые иммунные оболочки;

- установлены существенные различия в образовании иммунных оболочек у вирулентных и авирулентных холерных вибрионов.

Полученные экспериментальные данные о свойствах иммунных оболочек будут способствовать дальнейшему развитию теории ви- . рулентности микроорганизмов, совершенствованию методов диагностики и идентификации патогенных микроорганизмов.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ ?АВ0ТЫ. Показана практическая целесообразность разработки новых методов микробиологической и серологической диагностики на основе Феномена образования полупро-

ицает-ш иммунных оболочек из антител, гомологичных антигенам, ¡окализованным на поверхности клеток или других биологических : синтетических структурах.

Разработан ноенй диагностический тест "Способ определения [иркулируодих иммунных комплексов в крови" (A.C. N1698784, 991 г.).

Изобретено: "Устройство для оценки аллергических кожных ¡роб" рекомендованное также для определения размеров кожной реакции при титровании аллергенов и холерного экзотоксина" патент N 1790396, 1992 г.).

Предложен "Способ определения титра антител в противохолерных иммунных сыворотках, препятствующих вибриоцидному действию фотаминсульфата". (А. С. СССР N 1837232. 1992 г.).

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ й ВНЕДРЕНИЕ. Материалы работы доложены и ¡осуждены:

- На внутрппнстптутских конференциях СарНКИСГ и РНИПЧИ 'Микроб", 19S9-1995 гг.

- На Первом Всессдазнпч иммунологическом съезде (Сочи .15-17 юября 1989 г.).

- На заседании Всероссийского иммунологического общества '.Саратов 1990 г.

- На .15 конгрессе Европейской Академии Аллергологии и ¡{лирической иммунологии. Пари:х - Франция, май 10-15 1992 г.

- На Всесоюзной научной конференции "Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфекций". 21-23 сентября 1993 г. . ' •

Изобретение:- "способ определения содержания иммунных комп-

лексов в крови" внедрено в работу Саратовского НИИ сельской гигиены и кафедры кожных и венерологических болезней Саратовского Государственного медицинского университета.

Изобретение: "Способ определения титра антител в противохолерных иммунных сыворотках, препятствующих вибриоцидному действию протаминсульфата" используется в научно-исследовательской _работе_ЕшШИПЩ1_:1айкр&&^^-------~~

На патент: "Устройство для оценки аллергологических кожных проб" получены положительные заключения из клиники койных болезней Саратовского Государственного медицинского института (1987), зам.министра МЗ РСФСР (1990), Саратовского отделения Всесоюзного общества иммунологов (1990),, Всесоюзного научно-исследовательского противочумного института "Микроб" (1991). Ростовского противочумного института (1991).

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ. ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ,

1. Формирование иммунными антителами.на поверхности антигенов оболочек, обладающих свойствами полупроницаемых или проницаемых мембран. ' '

2. Эффективность методики "определения циркулирующих шмун-ных комплексов посредством модифицированной реакрти СОЭ. .

3. Способ определения титров антител к патогенным -микроорганизмам основанный на принципе'регистрации проницаемости образуемых ими иммунных оболочек для биополимеров, обладающих антимикробной активностью/

4. Принцип дифференцирования популяций вирулентных и ави-рулгктнкх холерных вибрионов по плотности Формируемых на них С'-актате.памл иммунных оболочек.

ПУБЛИКАЦИИ. Основное содержание диссертации отражено в 16 опубликованных работах.

ОБЪЕМ Н СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит-из введения. 1 главы литературного обзора. 7 глав собственных исследований. заключения, выводов й библиографии. Работа содержит 245 страницы машинописи, иллюстрирована 14 рисунками и 40 таблицами. Указатель литературы вклвчает 124 отечественных и 267 иностранных источников.

ГЛАВА 1. УСЛОВИЯ ФОРМИРОВАНИЯ ОБОЛОЧЕК ИЗ ИММУННЫХ АНТИТЕЛ НА КЛЕТКАХ. СОДЕРЖАЩИХ АНТИГЕНЫ.

В первой главе обобщены литературные данные о взаимодействии антител с антигенами, локализованными на поверхности клеток животных и микроорганизмов.

Подвергнуты анализу опубликованные материалы о свойствах оболочек, образуемых иммунными антителами на поверхностях, несущих антигены, а также об особенностях межмолекулярных взаимодействий различных классов иммуноглобулинов.

По литературным данным обоснована перспективность углубленного изучения свойств иммунных оболочек с целью совершенствования микробиологических и серологических диагностических методов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

_2.1. МАТЕРИАЛЫ_

При выполнении исследований применялась следующие отечественные 'и импортные реактивы, а такке коммерческие и приготовленные нами нммунопрепараты. антиген»« и другие биопрепарата.

2.1.1. Хшицческне решотаеи. Кислоты, соли фосфорной кислоты, хлорид натрия, стрептомицин, ксантиноксидаза и некоторы; другие вещества получали от химических предприятий СНГ. У зарубежных Фирм были преобретены: _ гликокол, ксантин и трилси; фирмы "Ршнал"; протаминсульфат и гистон Фирмы ''Serva": с-ос фоглкжомутаза фирмы "CaiMochera".

2. ¡. 2 Штунные реагент. Применялись лооадаяыз диагноста ческие холерные агглютинирующие О-сыворсткя: видовые, серо??, роспецифические йнаба, Огава; иммуноглобулины диагностически люминесцируэде холерные и чу!.'.ные; сыворотка днагностическа агглютинирующая против штамма EV (37®С) производства ?осси,?;с кого НМПЧИ "Микроб"; ослиная лютшесцкрущая сыворотка проти кроличьих иммуноглобулинов и овечья преципиткрувщзя еыБорот;-: против человеческого IgG, приготовленная ИЗ!: им. Н.Ф. Гамалеи гемолитическая сыворотка против бараньих эритроцитов, выпу;зя ная Пермским НИИ вакцин и сывороток.

Кроличьи О-холерные агглютинирующие сыворотки б^ли аояучс-ь. нами путем 3-х кратной с 3-х дневным интервалом подкожной

- И -

внутривенной иммунизации кроликов О-антигеном. приготовленным из штамма холерных вибриоьэв 569 В серовара Инаба по методике И.И.Щуркиной (1931).

Кроличью чумную сыворотку получали от кроликов, иммунизированных культурой чумного микроба бескапсульного штамма ЕУ-2, выращенной при 28° С. Животных иммунизировали тремя циклами. Каждый цикл включал 3- внутривенные инъекции культуры в дозах от 5 млрд. до 3 млрд. с 3-х дневными интервалами. Между циклами выдерживали интервал в 7 дней.

Нонокяоиальные холерные видовые О-антитела мышиной гибрндо-мы Гв12 били любезно предоставлены нам доктором медицинских наук Л.П.Алексеевой, заведующей лабораторией гибридом Ростовского противочумного института.

Комплемент использовался сухой, производства Уфимского НПО "Иммунопрепарат".

2.1.3. Пнгазпельные среды. Питательные среды, на которых культивировали холерные вибрионы, штамм ЕУ живой чумной вакцины и другие виды бактерий готовили в отделе питательных сред Российского НИПЧИ "Микроб" по стандартным технологиям.

2.1.4. Биологические объекты. В экспериментах использовали штаммы микроорганизмов, полученные из филиала Центрального Российского музея патогенных микроорганизмов при Российском НИПЧИ "Микроб", и свежевыделенные на вспышке холеры в 1994 г. в Республике Дагестан. Всего при выполнении работы было использовано 123 штамма бактерий, в том числе зльтор вибрионов серовара Огаеа - 85 штаммов, серовара Инаба - 33 штамма. 1 штамм 569 В классического биовара серовара Инаба, 1 цта.ч.ч вой чумкой вакцины Е\г. 1 штамм палочек дизентерии Зонне, 1

шта»м сальмонеллы таФимуриум. 1 шташ ¡ашечкой палочки

Лля получения шмушшх сывороток использовались кролики породы шиншилла.

эритроциты получали от баранов-доноров.

-2.2;—КЕГОДЫ'

2.2.1. эшврадеик с адиадшот. При исследовании влияния оболочек, образующихся из при взаимодействии с эритроцитарнымк антигенами, на лизис эритроцитов комплементом опыты ставили в трех вариантах. В экспериментах №ш ге-«слит„ЧеСкуа сыворотку ^ эритроЩ5Тов сарана 1.3000 и сухой комплемент. При постановке опытов по I варианту методики к 0.5 «л гемолитической сыворотки против бараньих ритмов, разведенной от 1:25 до 1:200. добавляли по 0.25

« 1.2 л отмытых эритроцитов барана и после 1 часа инкубирования ди 37 С В№ в шх по о>25 . комплемеята_

ГГ ВВДеРМ 4'ЧЗСа 8 ТерШСТаТе * ^Рату-

ре 37 с и 24 ч при температуре 25°С. Результуть учитывали витально: интенсивность гемолиза отмечали плюсам

В опытах с применением второго варианта методики к 0 5 мл

ГГТ08с" ра~ 1:25-

- ■ • ^ 3' с- ^атьм в них ВНОСИЛИ ПО 0.25 МЛ 1 2

* СУС'3еН5!!1! ' После перемешивания компон«!

Т°ЙСХЙ?И » Учитывали результаты как и в ксп „

вш^ннш па : варианту методики '

^ лесииоако с^ов с использованием 3-го варианта «его-

дики в ряд пробирок разливали по 0.25 мл кокплеме.чгг, разведенного 1:2,5 физиологическим раствором, и вносили гю 0/25 нл 1,2 % суспензи и эритроцитов барана. После инкубированз течение 1 часа при 37°с в смеси вносили по 0.5 кл гемолитической сыворотки. За: гм смеси инкубировали и учитывали результат как и по 1 варианту методики.

Эксперименты с трипсином ставили в объеме 0,25 (члч 0.5 мл) с разными разведениями антизритроцитэркнх (гемолитических) сывороток в 0,85 % растворе хлорида натрия рН 7.0-7,2. к какдому разведения сыворотки добавлял:-! по 0,25 (или 0,5) тЛ-х-2 % суспензии эритроцитов. инкубировал« 1 (или 2) ч при 37° с для образования антнтельной оболочки на поверхности эритроцитов, затем вносили в них по 0,5 (или 1) мл 0,-5 % раствора трипсина Комплемент не добавлялся. После перемеглвания компонентов пробирки выдерживали при 37°С з течение 24 ч. Второе перемешивание производили после учета результатов через 3 ч инкубирования с трипсином. Кснтролями слукили смеси, приготовленные как и опытные, но иг которых исключали один или два компонента и вместо них добавляли 0,85 % растовр хлорида натрия рН 7,2.

При исследовании влияния на лизис трипсином эритроцитов пленки, образующейся на поверхности из иммунных комплексов, смеси готовили в следующем порядке: к 0.25 мл разных разведений овечьей сыворотки против человека добавляли по 0,25 мл 2% суспензии эритроцитов человека и по 0,5 к., дефибриякрован-ной плазмы человека, разведенной 1:10 в 0,85% растворе хлорида натрия. Смесь инкубировали 2 ч при 37°С для образования клмплексов: антиген (ив дефибриккрованкой плазмы человека) + овечьи анти-1ч«?С (против человека) антитела: затем а скеси

добавляли по 1 мл 0,5% раствора трипсина. После перемешивания, их инкубировали при 37°С в течение 18-24 ч. Результаты учитывали по гемолизу. Контролями служили смеси, в которых один из компонентов заменяли 0,85 % раствором хлорида натрия.

При разработке методики определения циркулирующих комплексов опыты проводили по следующей методике. __Крысы -опытной - группы подвергались затравке аэрозолем антигена в концентрации 4-6 мг/м3. Затем животных умерщвляли декапитацней. Кровь (1 мл) собирали в пробирку с 0,25 мл 5% трехзамещенного раствора цитрата натрия. Затем с помощью 0.85% раствора NaCl (физиологический раствор) получали разведения' крови сенсибилизированных животных в соотношениях 1:2. 1:4. 1:8. 1:16. Пробирки помещали в термостат при 37° С на 30 мин. После инкубации все пробы доводили до разведения 1:16 теплым (37°С) физиологическим раствором и через 1. 2. 3 и 4 часа во всех, образцах определяли СОЭ по Панченкову. Одновременно у всех «ивотных методом ПЭГ'-преци-питации определяли содержание ЦИК в сыворотке крови по методике D.A.Гриневич с соавт. (1981).

г. 2. г. Методы исследования проницаемости, антшльшх

оболочек, образующихся ш лшкробныг клетках, для вецееяв, обладающих атимихробной активностью.

Для исследования проницаемости антительных оболочек, образующихся ча поверхности микробных клеток, содержащих гомологичные им антитела, нами был применен принципиально новый методический подход, заключающийся в использовании низкомолекулярных и высокомолекулярных веществ! обладающих антимикробной активностью.

Проявление антибактериальной активности свидетельствует о проникновении вещества через оболочку из антител, покрывающую микробнуп клетку после взаимодействия ее с иммунной сывороткой. отсутствие антибактериального эффекта при соответствующих контролях свидетельствует о непроницаемости антительной оболочки для этих веществ.

Опыты проводили в различных вариантах, изменяя последовательность добавляемых компонентов - сывороток, кислот, солей, стрептомицина, протамин-сульфата, гистона, фосфоглюкомутазы. ксантиноксидазы; их концентраций и некоторых других условий.

Количество живых микроорганизмов определяли путем высева проб из экспериментальных смесей на чашки с питательным агаром. Посевы инкубировали в течение 18 часов при 37°С.' По числу выросших колоний рассчитывали концентрацию живых микробных клеток в 1 ил смесей. Концентрацию микроорганизмов немедленно после приготовления экспериментальных смесей контролировали высевом на чашки из рабочих микробных суспензий. В экспериментах использовались кроличьи холерные сыворотки с титрами агглютининов 1:3200. 1:6400 и нормальная кроличья сыворотка, инактивированная прогреванием при 56°С в течение 30 мин.

2.2.3. ИсслеЭобания условии образования шсшпельных оболочек на тювсрхносго ляифобнъсс клеток с тю«ощмо аппарат для про почкой -циаоф/жрильетрии. лтиинесцетного и электронного /агхроскопов.

Для исследования плотности оболочек на поверхности вибрионов. образуемых антителами ь разных разведениях сывороток, применялся непрямой метод скрааивания микробных мазкое (обра-

ботанкых кроличьими антисызоротками) люминесцирущими антителами против кроличьих иммуноглобулинов. Препараты исследовали с помощью люминесцентного микроскопа 11Л-2. Интенсивность свечения оболочек микробов отмечали плюса,1ли.

Для более глубокого изучения плотности антительных оболочек, образующихся из иммунных антител на поверхности микробных клетск. проводили эксперимекта_^^со^^— пульсном проточном цитоФлюоркметре . 1СР-22-РОТЕ (Германия). Опыты ставил;: с суспензиями холерных вибрионов, содержавшими 1 млн. клеток в 1 мл. полученных путей разведения 1 млрд. суспензий вибрионов. приготовленных из суточных агаровых культур холерных вибрионов, убитых формалином (из расчета 0,02 мл коммерческого формалина на 100 млрд. клеток) и трижды отмытых 0.85 % растворс хлорида натрия. Суспензию каждого штамма вибрионов разливали по 1 мл в 6 пробирок, затем центрифугировала ' 30 мин при "ООО об\мин. Надосадсчную жидкость отсасывали. К осадку вибрионов в перзой пробирке добавляли 1 мл цельной холерной кроличьей иммунной сыворотки, во 2-ю пробирку - 1 мл сыворотки, разведенной 1:20. в з-ю - 1 кл скзоротки. разведенкой 1:100, в 4-ю - 1 мл сыворотки» 'разведенной 1:400. в 5-ю -1 мл еыьоротки. разведенной 1:800 и в 6-ю - 1 мл сыворотки, разведенной 1: '1600. После перемешивания пробирки инкубировали 30 мин при 37° с. затем микробные'клетки трижды отмывали 0,85-% растворах хлорида натрия. К осадкам добавляли по 0.5 мл лвми-пеаарущвгэ ькти-'.оогн-'ьего иммуноглобулина в рабочем раьведе-н::н. имеси инкубировали СО мин при 37°с, отмывали 1 раз 0,85 X рзгтиором хлорида натрия к к осадку клеток добавляли по 1 мл 0.0125 .4 глиг:,жоловог'.> буфера рК 7. 3.

Суспензии исследовали в условиях оптимального возбуждения флюоресцеин изотиоцианата спектром ртутной лампы при светофильтре Lp 4LJ\KP49Q Фирмы "Leltz" ("ЛеЛтц" ФРГ). Результаты анализа каадой смеси представляли в виде гистограммы распределения клеток по интенсивности иммунофлаоресценции. Учитывали сигналы от 30000 бактериальных клеток.

Обобщение распределения интенсивности свечения клеток производили в следующем порядке: слабые фонсвые сигналы - каналы с номерами от С до 50; сигналы от умеренно светящихся клеток -каналы с номерам! от 51 до ICO; сигналы от средне люминесциру-ю'дих клеток - каналы с номерами от 101 до 150 и сигналы от интенсивно светящихся клеток - каналы с номерами от 151 до 500. Интенсивность свечения клеток выражали для каж, й группы каналов в % к Фоновым.

Для электронно-микроскопических исследований использовались кроличьи сыворотки, полученные путем иммунизации животных суспензией убитых формалином холерных вибрионов классического биовара. штамма 569 В серсвара Инаба. В сыворотках содержались антитела к 0- и Н-антигенам. Опыты ставили с клетками вибрионов. убитых Формалином и трижды отмытых 0.85 % раствором хлорида натрия. Суспенгип вибрионов, содержавшую 20 млрд. вибрионов в-1 мл, вносили в равно,ч объеме в пробирки с разными разведениями иммунной сыворотки: 1:2,5; 1:25; 1:50; 1:100. После перемешивания смеси инкубировали при 37°С в течение 1 часа. Затеи, после однократного отмываки" 0,85 % раствором хлорида натрия, из них готовил! препараты для обнаружения кроличьих антител на поверхности клеток с помощью электронной микроскопии. Центрифугировали при 12000 об/мин в течение 5 мин. Осадок

фиксировали 2.558 раствором глютаральдегида при +4° С в течение 1 18 часов. Дважда отмывали охлажденным (+4°С) буфером -0.1 М раствором кркодилата натрия рН 7.4. Затем фиксировали в течение 3 часов при +4°С 1 % раствором окиси осмил (Ме11оп^ в.. 1962;. После отмывания от фиксатора тем же буфером, материал обезвоживали в этаноле при возрастающей концентрации (50°, 70°. 96°. 100ч-)-и-пропилбНоксиде.—Затем-пропитывали и заливали в смолу. Полимеризацию проводили при 56°С 18 часов. Ультратонкие срезы готовили на ультратомах ЫШ 4801 и 8800. помещали на медно-палладиевые сеточки" с парлодиевой подложкой, окрашивали насыщенным раствором уранилацетата 5 мин -при 56° С и раствором соли свинца.

Препараты исследовали в электронных микроскопах Ш.1-7А и ОТ-12А.

Для исследования влияния антител первого и второго порядка на формирование антительных оболочек готовились адсорбенты антител Ат1 (антител первого порядка) и антител Ат2 ( антител второго порядка).

Для исследования плотности оболочек, образуются на поверхности с участием антител Ат2 и без них, на мазки, которые готовили из суточных культур холерных вибрионов, выраженных -.а агаре из настоя сердечной мшшы, рН-7.6; иди 24 часовых культур вакцинного штамма ЕУ чумного микроба, выраженных ка агаре Хоттингера при 37°С. рН-7.2, после высушивания на воздухе и фиксирования в течение 20 мин в этиловом спирте наносили по 0,05 мл исходных или адсорбированных разными икиунссорЛжтм люминесципуащих иммуноглобулинов. Препараты кикускрэд^ти 20 мин при температуре 22°С во влажной камере. По истечение этого

времени капли сыворотки удаляли, мазки отмывали в течение 10-15 мин в трех меняющихся порциях ФРХН, затеи ополаскивали дистиллированной водой и высушивали на воздухе. Исследование иммунооболочек. образующихся на поверхности клеток после обработки их ^юнинесцируюдами иммуноглобулинами, производили в люминесцентном микроскопе МЛ-2.

2.2.4. МеиоЗихи отатсшияескоп обработки данных.

Результаты экспериментов обрабатывали посредством статистических параметрических методов по И. И. Ашмарину и А.А.Воробьеву (1987) и по Е.В. Монцевичате-Эрингене (1964) и непараметрического метода по точному методу Фишера (1973).

ГЛАВА 3. ОСОБЕННОСТИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЭРИТРОЦИТОВ С АНТИТЕЛАМИ И ИММУННЫМИ КОМПЛЕКСАМИ

3.1. влияние антюритроштарж антител и шмуншх "■комплексов на лизис эритроцитов' комплементом или, трипсином.

В реакции иммунных антител с антигенами наименее изучены особенности образования оболочек из антител на поверхности антигенов или клеток, несущих антигены, и их свойства. Также слабо исследованы возможности использования свойства иммунных антител формировать икмунотуники в диагностических реакциях и для конструирования профилактических препаратов.

В начале наших исследований было проЕедчкс изучение влияния различной плотности пленки, образующейся из ангивритрсцитар-вд

антител на поверхности эритроцитов, на лизис их комплементом и трипсином.

Экспериментальные данные, полученные при исследовании зависимости устойчивости к лизису комплементом эритроцитов, от плотности покрытия их антителами показали, что при высокой концентрации антител, если комплемент вводили после взаимодействия их с эритроцитами, последние не лизировапись. Только при значительном снижении концентрации антител (в сыворотках, разведенных 1:200) происходило активирование комплемента и лизис эритроцитов. В разведении 1:50-1:200 антитела гемолитической сыворотки образуют оболочку на поверхности эритроцитов. ■ препятствующую (при последующем добавлегат комплемента) молекулам комплемента взаимодействовать с мембраной зрггрощтв. В смеси с сывороткой, разведенной 1:400, на эритроците формггру-егся пленка антител проницаемая для комплемента и антитела в • этой пленке активируют комплемент, который вызывает гемолиз.

При взаимодействии с эритроцитами антител б присутствии комплемента или при добавлении к эритроцитам комплемента, а затем гемолитической сыворотки (антител) не образуется шгги-тельной оболочки. • препятствующей действию комплемента. Б этих -условиях происходит образование комплексов антитело-кокпдеизит • во ьремя присоединения антител к антигену, что обеспечивает взаимодействие комплемента с мембраной эритроцита.

Даикие. полученные б экспериментах с.кроличьей антаэритро- '"г цитарней ц-РмслитическоЛ сывороткой и трипсином) показали, что в уаз-Ьедс-нгл", до 1: '.£0 актлоритрсадтарнан сыворотка иагибирует : ■ и»йС эритроцитов триясуньм.' В то же время нормальная кроличья с2®оротка не ккгк&ц>сзд№ дазиса ■эрулроштов трипсинам.

Результаты экспериментов с сыворотками, против человеческих 1£А и 1еЫ выявили, что кроличьи антитела против человеческих 1&А и 1яМ тормозят лизис человеческих эритроцитов трипсином,

.Результаты исследований влияния иммунных комплексов ан-ти-1еС-1§С человека показали, что комплексы анти-да-1яС достоверно тормозят лизис эритроцитов, если они формируются в смеси, содержащей сыворотку анти-1вй в разведении 1:40, дефиб-ринированную человеческую плазму 1:40 и 0,25 % эритроцитов человека. В этих смесях, но с сыворотками, разведенными 1:20, : 1:80 и 1:160 (в первые 20 часов инкубирования), лизис эритроцитов происходит медленнее, чем в контроле б^з сывороток и. примерно, с одинаковой скоростью при сравнении ю смесями, содержащими сыворотку антя-да, в которые не вводили дефибрини-рованную плазму человека. Следовательно, в разведении 'сыворотки 1:40 проявляется тормозящее действие иммунных комплексов на лизис эритроцитов трипсином.

В экспериментах с холерной лошадиной сывороткой было установлено, что комплексы антитело-холерный 0-антиген не ингиби-руют лизис эритроцитов человека трипсином.

Приведенные выше-данные свидетельствуют о существенном влиянии антител, связывающихс . с поверхностными антигенами клеток. на взаимодействие их с окружающими молек"лами и. в частности. с ферментами: комплементом и трипсином.

з. 2. влияние циркулирующих иммунных комплексов на соэ.

Результаты экспериментов с иммунными комплексами, приведен-

ные в разделе 3.1., показали, что иммунные циклы образуют на поверхности эритроцитов слой, который блокирует доступ к мембранам эритрг-дитов молекул трипсина. В соответствии с этими данными можно было предположить, что слой иммунных комплексов препятствует соприкосновен :!? с мембранами эритроцитов и других белков плазмы, которые поддерживают нормальную скорость оседания эритроцитов в капиллярах. В крови животных, содержащей циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК), следует ожидать более высокие показатели СОЭ.

Для проверки этого предположения были проведены опыты на 30 беспородных белых крысах-самцах массой 180-300 г (20 животных - опытная группа; ю - контрольная). Крысы опытной группы ежедневно в течение 9 месяцев подвергались затравке антигенами комбикормовой пыли в концентрации 4-6 мг/к3.

Эксперименты показали, что содержание ЦИК у животных опытной группы достоверно (р<0,001) вьше, чем в контроле (соответственно 312.7+39.8 и 22.5±4,2 единиц оптической плотности). Динамика СОЭ представлена на рисунке 1.

В контроле не отмечено различий величин СОЭ в пробах с предварительным разведением крови. В опытной группе СОЭ значительно (РС0.01) изменялось в зависимости от разведения, в котором инкубировались образцы. .Наибольшие и наименьшие отличия в СОЭ отмечены в разведениях 1:4 и 1:16 черз 4 ч с момента постановки реакции СОЭ.

Полученные в экспериментах, на животных результаты свидетельствуют о возможности определения ЦИК в крови по реакции СОЭ.

С целью проверки разработанной нами методики было обследо-

а я з

Рисукск 1. Динамика СОЭ ( в мм) у животных с нормальным (а) и повышенным (б) содержанием ЦИК в крови. Обозначения: 1 - цельная кровь; 2 - разведенная-1:2; 3 - 1:4; 4 - 1:8; 5 - 1:16.

вано 15 пациентов дерматологической клиники (5 случаев с ограниченной и системной склеродермией. 7 - с дискоидной и 3 - с диссеминированной красной волчанкой), у которых методом ПЭГ -преципитации было выявлено повышенное содержание ЦИК в сыворотке крови, и 17 практически здоровых лиц того же возраста с нормальным содержанием ЦКК. Кровь из пальца Я мл) стабилизировали цитратом натрия (соотношение "кровь: цитрат" составляло 4:1), готовили разведение крови физиологическим раствором 1:4, 1:8 и 1:16. Результаты учитывали черз 4 ч. Остальные этапы полностью соответствовали описанной выше схеме эксперимента.

Изменения СОЭ в крови ладей имели ту же закономерность, что и в эксперименте у животных.

Расчет доверительного интервала средней арифметической Д СОЭ в образцах крови, инкубированных в разведениях 1:4 и 1:16, у больных коллагенозами показал, что не менее 95 % всех значений Д СОЭ попадают в интервал от 5,5 до 17.2 км. в то время как у практически здоровых людей доверителььый интервал составил 0,3-4.5 мм. (Рис. 1). •

Таким ооразом, если после инкубации образцов крови в разведениях 1:4 и 1:16 СОЭ в одном" из капилляров через 4 ч после помещения в аппарат Панченкова будет выше, чем в другом, на 5 мм и более, то с вероятностью не менее 95 % можно говорить о повыценнок содержании ЦКК в крови данного пациента.

.-КоаФФициент корреляции между величиной Д СОЭ и уровнем ЦИК. определенный методом Г2Г - преципитации, рассчитанный по способу наименьших кг-есратоь. составил 0,89 (гКО, 05).

Разработанный ногнй скрининг-тест для определения повышенного сссергаш'я цирпулкрушда иммунних комплексов ШИК» в кро-

ви пригоден для использования в лечебно-профилактических учреждениях всех уровней и в экспедиционных условиях.

При обследовании больных в . клинических условиях (с целью отбора страдающих аллергическими реакциг -л) для последующего определения v них ЦИК нами было предложено устройство для оценки аллергических кожных проб, позволяющее точно и быстро измерять элементы кожных реакций. Устройство зарегистрировано в Комитете по делам изобретений и открытий в качестве изобретения (патент If 1790396).

ГЛАВА 4. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОНИЦАЕМОСТИ АНТКТЕЛЬНЫХ Ш.'МУНШХ ОБОЛОЧЕК В ЭКСПЕРИМЕНТАХ С НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫМИ ВЕЩЕСТВАМИ

С целью более глубокого изучения свойств иммунных оболочек дальнейшие исследования проводили на микробных клетках. Для определения проницаемости оболочек, образующихся при взаимодействии антител с антигенами, расположенными на микробных клетках, использовались низкомолекулярные вещества: соляная кислота, молочная кислота, гликокол. гипертонический раствор хлорида натрия, стрептомицин, обладающие антимикробной активностью. Использование подобных веществ дает возможность определить проницаемость иммуномембран по изменению ими антимикробной активности этих веществ.

Опыты ставили на музейных штаммах: V.cholerae class 569 В серовара Инаба, Bact.dys.Sonnel; S. typhimurlum и Escherlchla coll.

-

Результаты исследования влияния соляной кислоты на холерные вибрионы с разной плотностью иммуномембран, формировавшихся 1фи разных концентрациях иммунных антител, показали, 1-го в экспериментальных смесях иммунная сыворотка ингибировала размножение холерных вибрионов в течение 3 ч инкубирования в среде с рН<7,О по сравнению с действием этой сыворотки при рН

7,85-7,95 или рН 1,2.____

При введении в экспериментальные смеси иммунной холерной сыворотки, из которой антитела были адсорбированы, или нормальной кроличьей сыворЪтки, подвергнутой адсорбции таким ке количеством убитых клеток вибрионов как и- иммунная сыворотка', размножение вибрионов з них происходило с одинаковой интенсивностью. В экспериментах с кишечной палочкой в смесях с холерной иммунной сывороткой и нормальной кроличьей сывороткой существенных различий в размножении бактерий не отмечалось.

При исследовании проницаемости антительных иммуномембран. образованных иолшигснальныма и моноклональиьви антителами для соляной и молочной кислот было установлено, что мембраны, образованные на поверхности холерных вибрионов этими антителами, усиливают янгибирование размножения вибрионов кислотами.

Мммуномембранн. образованные гомологичными антителами бактерий дизентерии зонне и сальмонелл тифимуриум. также усиливали бактерицидное и бактериостатическое действие молочной кислоты.

Результаты исследования влияния иммунной холерной сыворотки на ингибирование размножения холерных вибрионов гипертоническим" растворами хлорида натрия показали, что гипертонические 1,5% и 2% растворы хлорида натрия ингибирувт размножение хо-

лерных вибрионов при сравнении с экспериментальной смесью, содержавшей 0,85& раствора хлорида натрия (Табл.1.). Нормальная сыворотка, убавленная в экспериментальные смеси, уменьшает ингибирующее действие гипертонических растворов хлорида натрия. Введение в экспериментальные смеси иммунной сыворотки также снижает ингибирующее действие гипертонических растворов хлорида натрия на размножение холерных вибрионов по сравнению с их действием в смесях, не содержащих сывороток, но при сравнении с влиянием нормальной сыворотки обнаруживается усиление иммунной сывороткой ингибирующего действия гипертонических растворов NaCl на размножение вибрионов.

Также достоверно усиление иммунными сыворо';ками ингибирова-ния гипертоническими растворами хлорида натрия размножения холерных вибрионов по сравнению с влиянием этой сыворотки на размножение вибрионов в 0,35% растворе хлорида натрия.-

В опытах с Escherichia coll существенных различий в размножении этих бактерий в смесях с иммунной холерной сывороткой и нормальной кроличьей сывороткой, не выявлялось. Зти сыворотки снижали антивибрионную активность гипертонических растворов.

При исследовании влияния холерной иммунной сыворотки на ин-гибирование рагмнолзэния холерных вибрионом гликоколом (амино-уксусной кислотой) в повышенной концентрации установлено, что гликокол в концентрации 3,7 мг/мл действовал вибриоцидно при рН 4,4 и слабо ингибировал размножение вибрионов при рН 7,8. В смесях с нормальной сывороткой при пН 4,4 гликокол действовал вибриоцидно; при рН 7.75-7,8 ингибирующее действие гликокола на размножение холерных вибрионов не проявлялось: компоненты сыворотки стимулировали размножение вибрионов по сравнению с

Таблица 1.

Усиление холерной иммунной сывороткой антивибрионного действия гипертонических растворов хлорида натрия

К пп Состав смесей Ере мя ин- ку- би- ро- Средняя концентрация швых • вибрионов в 1 мл смесей после инкубирования Контроль без сывороток

организмы хлорид натрия сыворотки

Конечные разведения сывороток в CM^fTí

(мг/ мл) ва-ння (Ч)

1:20 1:100 1:400 1:800 1:1600

I II III IV V VI •VII VIII IX X XI

1 2 3 4 .5 6 7 8 9 10 И 12 13 14 15 16 104 клеток в 1 мл смесей Vibrio Chole-rae 104 клеток в 1 мл смесей E.coli 15,0 _ И _ _ и _ 20.0 „ 1' _ _ И _ - 8,5 _ И _ _ И _ _ ÍI _ 20.0 _ м _ _ и _ ХКС — " НКС _ К _ ХКС —11 — НКС ХКС НКС __ II _ ХКС _ II _ НКС _ и _ 3 24 3 24' 3 24 3 24 3 24 3 24 3 24 3 24 8, OxlO4 8.4Х105 1, 5х105 2. 9x10a 1. 8x104 4.1Х106 1.5X105 2. OxlO8 2, 6Х105 6.1Х107 6.6x105 1,3x10е 104 7.1x10'' 7. OxlO3 6.6X107 ГО O) СО -0 HOCO-JWOHOJOÜl'sJ^MCO XX XXXX>íXXXXXXXN^Í кн-*»—*»—»•»—^ »-». i—i—^ oo oooooooooooooo «4 W 6, 6X103 3.3X106 1.8X104 1,1X108 3.7X103 1.8X105 9.3X103 3.5X107 3,1X104 5.1X10S 1.9X105 2.7X107 2.6X103 1,8x107 2.0X103 9.8X106 4.6X103 1. 8xl0s 1. OXlO4 2.3X107 3. зхю3 í.ixio6 8. OxlO3 2. ЗХ101 i,6xio4 7,6x10® 4. 5xl05 2, 5xl07 5. OxlO3 6,9x10е 1,8x103 5, OxlO6 4, ЗХ103 1.6X106 5.3X103 2, 0X107 3.8X103 7, OxlO5 3, ЗХ103 4, 3X107 8. 5X103 7.-8X106 2.2X104 2,4xl07 1,5x103 7, lXlO5 2. 0X103 1.7X106 1,2X103 9.6xl О5 8,3x102 7.0x10е 3,1Х103 3.9X104 4.5Х103 1.3x104 8.1X103 1.1X107 2.6X103 4. OxlO6 2.4Х103 2.1Х103 2.1Х103 6,8x103

Примечание: последовательность смешивания компонентов: 0,5 мл разных разве

;ений сывороток + 0,5 мл суспензии Vibrio choleras или Escherlhla col .OxlO4 d 1 мл + инкубирование 30 мин + 1 мл 3%. 4% или 0,85% раствора хлори а натрия рН 7,2.. Условные обозначения - ХКС - холерная иммунная кроличья сы оротка; ИКС - нормальная кроличья.

размножением их в смесях, не содержащих сывороток.

Не отмечалось существенных различий в размножении Escherichia coll в экспериментальных смесях, содержащих сыворотки: иммунную холерную или нормальную.

Исследования влияния иммунных антител на вибриоцидное действие стрептомицина показали, что стрептомицин в концентрации 50 мкг/мл действует вибриоцидно и в смесях с иммунной холерной и нормальной сыворотками полностью убивает холерных вибрионов после 3х часов инкубирования. При концентрации 0.5 мкг/мл виб-риоцидность стрептомицина усиливалась в смесях, содержащих иммунную холерную сыворотку, по сравнению со смесями, содержащими нормальную сыворотку (Табл.2.).

Иммунная холерная сыворотка, из которой антитела были полностью адсорбированы, не влияла на вибриоцидную активность стрептомицина.

Активирование хслерной иммунной сывороткой вибриоцидного действия стрептомицина строго специфично - бактерицидное действие стрептомицина на Escherichia coll иммунная холерная сыворотка не усиливала. Размножение Escherichia coli е смесях, содержащих стрептомицин и иммунную холерную или нормальную сыворотки происходило с равной интенсивностью.

ГЛАЗА 5. ПРОНИЦАЕМОСТЬ ДНТИТЕЛЫИХ ЖМУНЬЪК ОБОЛОЧЕК ДЛЯ БИОПОЛИМЕРОВ.

Опыты.проводили с биополимерами: протаииноуль^атом. потоком. Оосфпглкжомутазсй л ксантиксксндазой.

Таблица 2.

Влияние иммунных холерных антител на бактерицидную активность стрептомицина в отношении ч.о\о!егае .

N пп Состав смесей Ко-ли-чес тво опы тсв Время инку биро ва-кия Средняя концентрация живых бактерий в 1 мл смесей после инкубирования

организмы стреп томи-цин (мкг/ сыворотки

1:20 1:100 1:400 1:800 1:1600

МЛ) (ч)

I II III IV V VI VII VIII IX X XI

1 Vib- 50.0 ХКС 1 3 0 0 0 0 0

2 rio _ tl_ 1 24 0 0 0 0 0

3 cho- _ 11 _ НКС 1 3 0 0 0 0 0

4 lerae 1 24. 0 0 0 0 0

5 104кл 0.5 ХКС ' 3 3 3, 2x104 2. ОхЮ4 3.0XÍ03 1.8Х1С3 1.6XÍ03

6 в 1мл 3 24 4.6ХЮ6 1,5X104 2.0 6,0 8,0

7 сме- _ м_ НКС 3 3 2. ОхЮ5 6.2x104 2.SX104 3.8x103 5.3Х103

8 сей _ II _ _ II _ 3 24 9,2x10® 2,9x105 5. ОХЮ3 50,0 63,0

9 - ХКС 3 3 2.2x105 5,6Х104 1.8X104 2,1X104 2. 0x104

10 - -"- 3 24 5.5x107 2.1Х107 8.0x10® 4,6X106 2.8x10®

И - НКС . 3 3 6,6х105 1.7X105 1.9X105 4.5Х104 2.2x104

12 - • _ »1 3 24 1.3x10е 6.8Х107 2.7ХЮ7 2.5X107 2,4x10'

13 0,5 ХКС-А 3 . 3 1¿ 9х106 1.4Х106 9. ОхЮ5 3. ОХЮ5 1.8x105

14 — м — 3 .24 1.3х108 2.3Х107 6.0Х105 1,3x10® 1, ÍX102

15 —"— НКС-А 3 3 2.3X106 2.8Х106 3.6x10® 2.5x10® 1.6Х105

16 _ и— — м— - 0 24 2.3x10е 1.8Х107 2,2x10® 5.5Х103 4, ЗхЮ3

Примечание: Последовательность смешивания компонентов: 0,5 мл' оазных раз:-эдений сывороток .+ 0.5 мл суспензий Vibrio cholerae 4.0x101 клеток в 1 мл i- инкубирование 30 мин + 1 мл раствора стрептомицина 1 мкг/кл в гликоколовом 0.025 м буфере рН 7.8; в смеси (строки 9-12) вместо стрептомицина добавляли гликок'оловый 0.025 И буфер; ' рН в смесях 7.75-7,8.

компонент не добавлялся или опыт не стазился; ü - жизке бактемш. не обнаруживались. Условные обозначения - ХКС - холерная иммунная кроличья сыворотка; НКС - нормальная кроличья; ХКС-А - холорная иммунная сыворотка. Из которой антитела удалены адсорбцией на убитых клетках вибрионов; IsKC-A - нормальная кроличья сывооотка, адсорбироЕ&нная такье как холерная сыворотка.

Результаты исследования проницаемости • антительных иммуно-мембран для протаминсульфата показали, что при рН 6.85-6,9 в смесях с иммунной сывороткой, разведенной 1:20. и протамин-сульфатом холерные вибрионы размножались несколько более интенсивно, чем в смесях, содержавших нормальную кроличью сыворотку, разведенную 1:20, и протаминсульфат. Отсутствие бакте-риостатического-действия .протаминсульфата в иммунной и нормальной сыворотках. • разведенных 1:20, объясняется избытком белка, нейтрализующего активность протаминсульфата. В разведении сыворотки 1:100 четко проявлялась защита вибрионов оболочками. образовавшимися из иммунных антител на их поверхности, от бактерицидного действия протаминсульфата.

В разведениях холерной сыворотки 1:4-00-1:80f антитела в им-муномембранах активировали бактёриос'татическое действие протаминсульфата в течение первых 3-х часов инкубирования. Через 24 часа различия в размножении вибрионов в этих смесях не выявлялись.

Свойство иммунной сызоротки усиливать ингибирующее действие протаминсульфата на размножение вибрионов устранялось после адсорбции из нее специфических антител. В смесях, содержащих иммунную холерную сыворотку, из которой антитела были адсорбированы убитыми клетками вибрионов, и протаминсульфат. холерные вибрионы размножались с такой же скоростью как и а смесях нормальной сыворотки с протаминсульфатом.

Размножение Escherichia coll в смесях, содержащих иммунную холерную или нормальную сыворотку и протаминсульфат. происходило с равной интенсивностью (на таблице не показано).

В экспериментах с иммунной холерной сывороткой и гистоном в

смесях, содержавших в разведении 1:10 холерную сыворотку, на клетках вибрионов из антител образуются ишуномембргшы, не пропускающие молекулы гистока. что прояваляется -в блокаде бак-териостатического действия гистона; в смесях с холерной сывороткой, разведенной 1:100 1,: 800. на вибрионах образуются имму-номембраны. пропускающие молекулы гистона и усиливающие его бактериостатическое действие.

Эксперименты с фосфоглюкомутазой и ксантиноксидазой показали, . Что при добавлении в опытные смеси холерной сыворотки в разведении до 1:50 антитела образуют пленку на поверхности вибрионов, препятствующую вкбриостатическоыу действию этих ферментов. В разведении 1:800 иммунная сыворотка усиливает вибриостатическое действие фосфоглвкомутазы и ксантиноксидазы.

При исследовании интенсивности образования антительных им-мунотуник на поверхности вибрионов.с помощью люминесцентных антител, установлено, что четко видикая в люминесцентном микроскопе оболочка образовывалась на поверхности клеток- холерных вибрионов только в смесях с холерной иммунной сывороткой, разведенной 1:20. . В смесях с сывороткой, разведенной 1:100 и более. антительная пленка не выявлялась. В то же время, в экспериментальных смесях, содержащих иммунную сыворотку. ; положительная реакция агглютинации отмечалась в разведениях 1:20 -1:1600. .

Полученные данные позволяют считать, что непроницаемые для биополимеров иммуномембраны образуются при относительно высоких концентрациях антител: в сыворотках, разведенных до 1:100.

ГЛАВА 6. ОСОБЕННОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ ИММУННЫХ ОБОЛОЧЕК НА ПОВЕРХНОСТИ КЛЕТОК. НЕСУЩИХ АНТИГЕНЫ.

Взаимодействию антител с антигенами посвящено огромное число исследований и публикаций, однако, особенности формирования на поверхности клеток оболочек или мембран из антител иммунных сывороток недостаточно изучены.

Применение антител, конъюгированиых с электронно-плотными молекулами, и методов, основанных на использовании меченных ляминофораки антител, позволили увидеть оболочки из антител на поверхности микробных клеток. _ но условия, способствующие их образования, а тагам противоречия в расчетных и действительных размерах антительных оболочек не подвергались глубокому изучению в экспериментах.

Нами было исследовало влияние различных буферных смесей на образование антителькых оболочек в кислой или щелочной среде и длительность их сохранения, а тзкяе значение идиотипических антител второго порядка. некоЕальнтных Fc-Fc взаимодействий Ig молекул, в образовании иммунных оболочек я вариабельность структуры кммунккх оболочек в популяции холерных вибрионов.

При исследований образования антитэльннх оболочек на поверхности вибрионов з среде с рН 7,5 и последующем инкубировании их в среде с р.Н 5.8-6,0 обнаружено, что пГ/разсваежеся при рК 7.5 оболочки из антител на иозерхнссти вибрионов после внесения их в буферные смеси с pîi 5.8-6,0 изменяются Через 3 часа они истончается (интенсивность жминесцеишп: снижается да ++). но пзлнссть» оболочки не разрушаются и через 24 часа ич-кубирсданин при 37° С.

Результаты исследований влияния идиотипических антител на образование иммунных оболочек показали, что после извлечения из холерного лошадиного люминесвдрувдего иммуноглобулина идио-. тигшческих антител Ат2 (антител 2-го порядка) он утрачивает свойство специфически окрашивать клетки холерных вибрионов.

Идаотипический иммукосорбент чумных антител 2-го порядка (Атг) и сорбент чумных антител 1-го порядка (ATt) против чумных антигенов не влияют на активность холерного лошадиного лю-минесцирующего иммуноглобулина.

Аналогичные результаты в экспериментах с чумным микробом показали, что адсорбция из люыинесвдрующего чумного иммуноглобулина идиотипических антител снижает активность иммуноглобулина и он утрачивает свойства образовывать видимый лвминесци-' рующий слой на поверхности клеток чумного микроба. . Адсорбции чумного лошадиного лвминесцирующего ; иммуноглобулина холерным идиотипическим икмунооорбентом или, убитыми клетками вибрионов не снижала его активности.' ■

Принимая во внимание данкие' K.S.Greenspan and C.L.Cooper (1992) о существовании взаимодействия между самими молекулами антител, были проведены иследования значения этого взаимодействия в образовании антительных иммунных оболочек. В экспериментах использовались лошадиные люминесцируащие йммуноглобули-ни против холерного видового О-антигенов производства институ'-« та "Микроб"; холерная лошадиная сыворотка к силовому О-антиге-ну н другим О-антигенам холерных виОриснсз; нормальная лошадиная сыеоротка. л.

Из 1 миллиардных суспензий каждого атамма холерных вибрко-кой готокуш 3 хазка на предметных стеклах. После высуаивания

на воздухе их фиксировали в 96° этиловом спирте. Затем на'первый мазок каждого штамма накосили по 0,1 мл холерной лошадиной сыворотки к °-антигенам холерных вибрионов: на второй - о, i мл нормальной лошадиной сыворотки: на тр ий мазок - 0.1 мл холерного лошадьного лшинесцирующего полиглобулина. Лопадиные холерная иммунная и нормальная сыворотки применялись в разведении 1:2:. люишесцирующий холерный полиглобулин в разведении до рабочего титра - 1:4. Препараты с нанесенными на них сызо-ротками инкубировали 20 мин при 25°С во влажной камере. Дальнейшую обработку мазков проводили по методике Coons- А.H. and Kaplan M. H. (1954). После высушивания мазков на первый и второй мазки наносили по 0.1 мл холерного лошадгного люкинесциру-ющего полиглобулина. Последующую обработку маг"ов проводили по методике Weller Т.Н. and Coons A.H. (1954). Приготовление препаратов исследовали в люминесцентном микроскопе МЛ-2. '

В препаратах, обработанных холерным лоаадиньи полнглобули-ном. содержащим лкшнесцирувщие антитела к О-антигену холерных вибрионов, видна клетки, покрытые люминесцирувщей оболочкой.

В препаратах, последовательно обработанных некеченной Флюо-рохрсмом О-агглитг.нируюгдей сыворотксй и холерным л'-оминесцирую-щим полиглобулином, агглютинирующая сыворотка не препятствовала образованию на холерных вибрионах люмнкзсцлрукпих сболочек. ке отличающихся по яркости люминесценции от оболочек в препаратах. обработанных только холерным лэмпкепцируючнм полиглобулином и слукасдаи контролем.

В контрольных мазках, последовательно обработанных нормальней лошадиной сывороткой и холерным лкмше-ецкрув-зим полргглобу-лином, на поверхности также образовывалась лю;.яяесц;:ру;-сщая

оболочка из антител.

Полученные результаты позволяют предположить, в соответствии с данными M.S.Greenspan and C.L.Cooper (1992), что при образовании иммунной оболочки, люминесцирукщяе антитела взаимодействуют посредством Fi>Fc нековалентных связей с неыечен-ными антителами, которые иммунной связью соедилены с молекула-К' о-антигена! содержащимися на поверхности холерных вибрионов. Однако, в этих экспериментах нельзя было исключить и влияния идиотипических антител меченых флюорохромом. которые как показали ранее проведенные эксперименты, также участвуют в Формировании люминесцирующих оболочек. •

Плотность оболочек, образующихся из иммунных антител ка поверхности вибрионов, исследовали также с помощью люминесцирующих антикроличьих иммуноглобулинов, люминесцентного микроскопа и импульсного проточного цитофлюориметра ICP-22-PHYWE.

При обработке вибрионов люминесцирующими антителами по непрямому методу плотная оболочка обнаруживается на поверхности клеток, взаимодействующих с холерной сывороткой, разведенной 1:20-1:100; при обработке сывороткой, разведенной свыше 1:100, видимой под микроскопом пленки не образуется.

Результаты исследований экспериментальных смесей убитых клеток вибрионов с разными разведениями иммунной холерной сыворотки (отмытых и обработанных антиглобулииовой люминесцирую-щей сывороткой) в приборе для импульсной проточной цитофлюоро-метрии записывались в виде гистограмм распределения клеток по интенсивности свечения. На гистограммах четко регистрировалось, что в смесях с холерной сывороткой, разведенной 1:20-1:400. преобладают клетки со средней и высокой интенсив-

костью свечения, в смесях с холерной сывороткой, разведенной 1:803-1:1600 т клетки с низкой интенсивностью свечения.

При исследовании в электронном микроскопе обнаруживаются четкие различия в плотности оболочек, Лорнирующихся из антител в разных разведениях иммунной сыворотки. ■

Ка клетках, ' обработанных разведенной 1:100 иммунной сывороткой оболочки из антител не выявляются: клетки вибрионов по толщине оболочек не отличаются от клеток в контроле. В тоже время на клетках, обработанных иммунной сывороткой, разведенной 1:2,5. клеточная оболочка значительно утолщена вследствие образования дополнительного слоя из антител.

ГЛАВА 7. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ФЕНОМЕНА ОБРАЗОВАНИЯ ИММУННЫХ

ОБОЛОЧЕК ЛЛЯ УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ

В обзоре литературных данных отмечалось, что на свойстве антител образовывать иммунные оболочки на поверхностях, несущих антигены, гомологичные антителам, основаны диагностические методы, в которых используются антитела, меченные флюорохрома-ми или электронно-плотными веществами. На поверхности клеток меченые флюорохромами антитела образуют ярко светящуюся оболочку, четко видимую в люминесцентном микроскопе. На поверхности клеток, обработанных электронно-плотными антителами, последние образуют электронноплотную оболочку, видимую ь электронном микроскопе.

Большинство исследователей добивались получения люминееда-

рующих антител, образующих хорошо видимую в люмдаесцентн микроскопе оболочку вокруг клеток микроорганизмов, содержащ на поверхности гомологачные антигены. Изобретение метода пр точной цитофляориметрия посредством прибора 1СР-22 открыло н вые возможности для количественной, хотя и косвенной, оцен плотности иммунных оболочек, образующихся на поверхности кл

ляций культур микроорганизмов в доступной литературе нами : найдено.

Сообщения об использовании показателей проницаемости имму них оболочек, образующихся из антител, в качестве принципа р гистрации иммунной реакции в доступной литературе наш не на) д&но.

На основана, списанных выше экспериментов мы предпркня, разработку новых серологических реакций на принципах регистр; ции проницаемости.иммунных оболочек и изменений их структуры

7.1. йеиоЭ серологической диагностики.

Обнаруженное нами свойство иммунных оболочек препятствова' бактерицидному и бактериостатическому действию биополимера] послухило основанием для разработки новой методики серолол ческой диагностики по титрам антител, при которых образуют! иммунные оболочки, препятствующие действию антимикробных би< полимеров.

Эксперименты проводили на кроликах. Животных иммунизкрова. по разным схемам. В качестве биополимер* с антимикробна сз^аегсамл •.'"п.-льооьалп протаииксульЮТ. В экспериментах, ю стк^чепо вш*. при добэьленш: протамвноулыгта пос.

смешивания суспензий вибрионов с разными разведениями иммунных сывороток он в первых разведениях сывороток не проявляет бак-терностатического действия, т. е. образующаяся из антител оболочка, Функционируя как полупроницаемая мембрана, защищает микробные клетки.

Для изучения условий, способствующих образованию непроницаемых для биополимеров иммунных мембран, проводились опыты с различными концентрациями протаминсульфата. вариантами смешивания компонентов, разными концентрациями вибрионов и другими видами микроорганизмов.

Данные, полученные при исследовании специфичности реакции образования антителами полупроницаемой облочки, препятствующей антимикробному действию протаминсульфата. свидетельствуют о ее строгой специфичности. С помощью этой реакции обнаруживаются только холерные антитела, которые образуют оболочки со свойствами полупроницаемой мембраны, препятствующие антивибрионному действию протаминсульфата. Холерная сыворотка не образует на клетках \Л с1ю1егае не 01 группы иммунных;оболочек, защищающих их от антибактериального действия протаминсульфата.

Для оценки иммунологической информативности методики определения иммуномембранных (оболочкообразуэдих) титров антител, при которых образуются из них полупроницаемые. оболочки, проводились сравнительные исследования сывороток кроликов (иммунизированных различными способами и различными антигеннными препаратами холерных вибрионов) посредством этой методики и реакции агглютинации (Табл.3).

Как видно на таблице 3. иммуномембранные титры антител и титры антител б реакции агглютинации не. совпадают. Следова-

Таблица 3.

Динамика титров антител, препятствующих вибриоцидяому действию протаминсульфата, агглютининов я вибркоцндиЕов у кроликов, иммунизированных холерной вакциной "холероген-анатоксин+О-анткгек"

Дни после введе няя животным

Средние тигры антител*

Препятствующих вибриоцидному действию протаминсульфата

М

Ртмф

Агглютининов

РТмф

Вибриоциднкх

я .

Рткф

до им муни-зации 7

14 21 28 36"

14,0 213,3 400,0 400,0 333,3 60,0

<0,025 <0.025 <0,025 <0.025 >0,025

20.6 93.3 1066,6 693.3 373.3 346.6

<0.025 <0.025 <0.025 <0.025 <0.025

102' 5. 3x103

1, 8x106

2, 0x101 5.2x103 7,0X10^

<0.025 <0.025 <0,025 <0.025 >0.025

Примечание: * - средние данные по 6 животным: " - по з ви-вотным: татры антител приведены в величинах, обратных разведениям; "-" - рассчеты не производились. Пои статистической обработке значения титров на 7. 14, 21. £8 и 36-е сутки сравнивали с величинами титров до иммунизации!

телыю, иммуномембрзнкые татры отражают еще неизвестные механизмы иммунологической перестройки организма. По-видимому, определение иммуномембранных титров антител позволит улучшить серологическую диагностику и глубже изучить эффективность защитных механизмов животных и человека.

Пригодность метода определения иммуномембранных титров антител для серологической диагностики инфекционных заболеваний и для исследования перестройки организма изучали в модельных экспериментах на кроликах, которым подкожно вводили 1 человеческую дозу холерной вакцины "холероген-анатоксин + 0-анти-ген\ Результата опытов показали, что накопление оболочкообра-зуюэдх антител, защищающих от вибриоцидного действия протамин-сульфата.' начинается' после однократного введения вакцины в первые дни. такяе как агглютининов и вибриоцидных антител. На 7 день титры этих антител достоверно превышали титры агглютининов. но были нияе титров вибрноцидинов. В последующие две недели титры агглютининов и вибриоцидинов превышали оболочко-образующие титры антител, снижаясь к 36 дню от начала иммунизации. Максимальных значений "тгры антител. при которых образуются оболочки со свойством полупроницаемых мембран, достигали на 14 сутки от начала иммунизации, но они были в 2. 3 раза нихе титров агглютининов и достоверно не отличались от титров оболочкообразующих антител, зарегистрированных на 7 сутки, Им-муномембранные титры антител на 7 сутки колебались от О до 320; в последующие 3 недели - 80-640. Следовательно, к 14 дню Нарастание иммуномембранных титрсв антител, хотя и наблюдалась. но оно не было достоверным, то есть, по-суцеству. дос-1игнув определенных величин к 7 суткам, иммунокембранныо титры

антител в последующее время до 28 суток не изменялись и достоверно снижался только на 36 сутки.

Полученные данные показывают, что определение оболочкообра-зующих титров антител открывает возможности для более глубокого изучения свойств сывороток больных и вакцинированных людей. Методика определения иымуномэмбранных (оболочкообразуюцих) титрсз антител может быть использована для серологической диагностики холеры.

Реакции образования иммунотуник, препятствующих антимикробному действию биополимеров, по-видимому, могут быть использованы при серологической диагностике инфекционных заболеваний.

7.2. Популяционная вариабельность е образовании амднныг оболочек.

При исследовании мазков микробных культур, обработанных лю-мннесцирующимк антителами, в люминесцентном микроскопе обнаруживаются клетки с разной интенсивностью свечения оболочек, образованных антителами. Неоднородность клеточной популяции по интенсивности свечения антительных оболочек отражает особенности поверхностной структуры клеточных стенок бактерий и.их антигенного состава. Е связи с этим представлялось целесообразным исследовать гетерогенность популяции .культур по строению наружных мембран клэточных стенок, выявляемому люкинесцк-ру'хш;антителами (по особенностям Формирования на них различных размеров к плотности оболочек), с цель» определения возможности применения показателей этой гетерогенности для ха-

рЗлТгрИСТННИ стамноа.

При изучении б культурах холерных вибрионов гетерогенности клеточных популяций по размерам и плотности оболочек, образуемых на них лсш'есщфуэвдш антителами ноу.и бич причоноя метол проточно;! ппгофлгоорнметрйи в аппарате ХСР-32 В экспериментах использовались 78 этекмоз холерных эльтор еибриопов со-росара гаделеинкх от больных холерой и' косктел-:« на

всякжо холерн в 1334 г. в Республике Дагестан, а так»; за «у-зейках стакмсв. и ток числе 13. выделенных от больных холерой на Укрйкье и Ставропольском крае и 15 атаммов на обьохтоз внешней среды. Кроме того,' использовались 10 му:;ейних ашков холерных вибрионов классического бкопара ссрозарсв 01ава и Инаба.

Опыты проводил;! по слвяую!гз»; методике. Из 18-чассзых культу) холерных вибрионов готовили по сптичс-сксму стандарту 1 клод пзз^си в оЪък'.ъ 2 мл. К казедоа взвеси лоОзеляди рячч-й объем 1'Л раствора Формалина. Затем их о'л.«валк .{«заело гическим раствором и суспендировали в 2 мл цизиологичеексго раствора. По 0.1 мл суспензии каждого втамз'а смешивали с 0, 1 «л разведенной Л"у::аесц;<.рда-?й зпдоесй холерной о-сыЕсротки (содеряа-с;ей два диагностических татра). См-зси иякуЗйссбэлп 20 «йк при температура 37°С. Затем к 0,2 мл шсубирсяакной смеси добавляли 4.й мл :-;гол-.г;г:Оскпго раствора (рН 7,5). Суспензии. оС-ра-бстанные холерной лвмннесцирусаб;: сьъ-ороткой. исследовали а аппарате 1СР-22 РЯУЯь.

Исследований показали, что неоднородность клеточных популяций птакмсс достаточно велика. На таблице 4 приведены данные опытор только о эльтор вибрионами серовара Огава. По интенсивности ЛйМ'/.кеоценшя'. клеток (в каналах 151-500) в. популяциях

Таблица 4..

Распределание клеток, обработанных люминесцирующими антителами, в популяциях разных штаммов холерных эльтор вибрионов серовара Огава по интенсивности люминесценции.

Пр эисхож-

дение

штаммов

Свежевы-деленные штаммы от больных (Дагестан, 1994)

Вирулентность

вирулентные '

Музейные штаммы

Всего

вирулентные и слабовирулентные

авирулен-тные

вирулентные

авирутен-тные

Коли-

чес.

ТВ!

шта ммов

О- но

67

10

73

Группа по «н-тенсив-сти

свечения в

у

каналах 151-500

I

II

III 1+Ш

Кол-во штаммов

абс

22 30 15 67

28.2 38.4 19.3 85,9

60.0

40.0

Распределение клеток в популяции по интенсивности -люминесценции-

1-50

36.2

41.3 46.6 40.8

36.9

46,3

40.3

46,3

51100

27.6 29.1 29.4 28,6

32,9

23,3

29.3

23.

101150

18,8

17.6

16.7

17.8

18,1

18.4

17,3

18.4

151500

17.4 12.0 7.3 12.8

12.1

12.0

12.2

12,0

исследованных штаммов холерных вибрионов последние могут быть объединены в три группы: первая группа штаммов с высоким процентом интенсивно светящихся клеток - 17,4 35: вторая группа -со средним процентом - 12,0 Я; третья - снизким процентом -7, з %. В. то г;е время в этих группах проценты умеренно светящихся клеток, регистрируемых в каналах 51-100, колеблются в узких пределах от 27,6 (первая группа) до 29,4 (третья группа). Также относительно в небольших пределах колеблются проценты клеток, регистрируемых" в каналах 101-150.

Суспензии культур свежевыделенных и музейных вирулентных штаммов, обработанных люмшеецирующими антителами, достоверно отличаются по соотношению в популяциях умеренно люминесцирую-щих клеток (каналы 51-100) от авирулентных штаммов. ■ У вирулентных штаммов они в среднем составляли 29,3%. у авирулентных -23,3% (различие достоверно).

Ввиду небольшого количества авирулентных штаммов холерных вибрионов анализ особенностей популяций клеток, обработанных люминесцирующими антителами, у вирулентных и авирулентных клеток следует рассматривать лишь как предварительно-ориентировочный.

Приведенные результаты исследований свидетельствуют о перспективности дальнейшего совершенствования метода проточной ци-гофлюорометрии для идентификации вирулентности штаммов эльтор зибрионов., В этом плане целесообразно изучить условия культи-зирования вибрионов, от которых зависит накопление антигенов в их клетках. По-видимому, в агаровых асинхронных-культурах происходит и равномернее накопление антигенов в клетках эльтор вибрионов. Поскольку клетки в культурах находятся на разных

стадиях размножения, то. вероятно, у только что разделявшихся клзток видового О-антигена А будет меньше, чек в клетках, на- ■ холящихся в последней фазе перед делением.

Реально., такте к влияние соотношения различных антигенов на наружной «екбраке клеточной стена; на гря^^ка —.аоишсс-— тзфуодих антител к формирование из них иммунной оболочки. В усяс-слях преобладания синтеза одного из них возможно экранирование другого аатпгела н соответствующего изменения структуры иммунной оболочки.

В произЕодствекных условиях кетод лэжнесцирукщих антител с применением прибора 1СР-22 для проточной цитофлз&орокетрии. мо-хзт Сыть использован для контроля качества культур по популя-цнонному распределению б них антигенов и их стандартизации.

ГЛАВА 8. ОБСУЖДЕНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ МАТЕРИАЛОВ

В Главе 8 обсуждены результаты, полученные при выполнении диссертации, и сопоставленные с литературными данными. Сформулировала предполагаемые механизмы взаимодействия компонентов ц'-гмуннык сывороток при образовании оболочек на поверхности клеток.

Предложена гипотеза о зависимости серологических реакций 'от структурных особенностей иммунных оболочек, образующихся на г зерхности микробных клеток, содержащих антигены, гомологич-ш? антителам.

ВЫВОДЫ

1. .Иммунные антитела при высокой их концентрации образуют на поверхности клеток. содержащих гомологичные им антигены. многослойную оболочку, обладавшую свойствами полупроницаемой мембраны, пропускающую только низкомолеку-лярнда вещества; при низкой концентрации - оболочку сетчатой структуры, проницаемую для низкомолекулярных веществ и биополимеров;

2. На поверхности эритроцитов антитела образуют оболочки, ускорявшие оседание эритроцитов и блокирующие действие на эритроцита комплемента.

3. Разработана новая методика определения циркулирующих иммунных комплексов в крови животных и ладей, основанная на ускорении оседания эритроцитов вследствие образования из комплексов на их поверхности иммунных оболочек.

4. Иммуномембрана, образующаяся на поверхности холерных вибрионов в избытке антител, проницаема для назкомолеку-

' лярнкх веществ и усиливает вибриостатическое действие некоторых их та. но блокирует вибриоцидное действие биополимеров протаминсульфата. гистона, ксантиноксидазы. фосфоглюкомутазы, комплемента.

5. Антитела оболочки, формирующейся на поверхности вибрионов в разбавленных растворах иммунной сыворотки и проницаемые для низкомолекулярных и высокомолекулярных веществ, обладают свойствами усиливать антиЕибрионную ак-

тивность неорганических кислот, гликокола, стрептомицина , и биополимеров: протаминсульфата. гистона, фосфоглвкому-тазы и ксантиноксидазы. .

6. В формировании оболочки из антител на поверхности микробных клеток в иммунной сыворотке участвуют, кроме ан-тктел -1-го "порядкаГ^дйотапйческие антитела и компоненты

комплемента. •

7. •Образование многослойной иммунной оболочки обусловлено •силами иммунного взаимодействии антител 1-го • порядка с антигенами, идиотапических антител с антителами 1-го порядка, нековалентными силами мещолекулярного взаимодействия компонентов комплемента, а такке, вероятно, силами межмолекулярного взаимодействия Гс-Гс регионов молекул антител.

8. Показана возможность быстрого определения с помощью прибора для проточной цитофлюорометрии полноценности культур в производстве бактерийных препаратов по отношению в их популяциях клеток, на которых образуются интенсивно светящиеся оболочки из люминесцирующих антител и слабо светящиеся оболочки.

9. Предложена новая серологическая реакция определения титров антител, образующих иммунные оболочки со свойствами полупроницаемой мембраны, для исследования специфической перестройки организма под влиянием антигенов и диагностики инфекционных заболеваний.

Список опубликованных работ по теме диссертации.

1. Особенности изучения СОЭ у больных с повышенным содержанием ЦКК в крови после ее инкубации в различных разведениях // Первый Всесоюзный иммунологический съезд (Сочи. 15-17 ноября 1989 г.). Тез. докл. - И.. 1989. - С. 190-190. {Утц С. Р.)

2. Особенности взаимодействия антител, ферментов, молекулярных регуляторов л метаболитов с антигенными структурами // ВКИПЧИ "Микроб". Саратов. 1990. - 19 С. - Деп. в ВИНИТИ Н 6023-В90 (Адамов А.К.).

3. Влияние иммунных антител на антквибриоануга активность протамлнсульОата // ВНШЧИ "Микроб". Саратов, 1950. - 11 С. -Деп. в ЕКНИТИ N 3779-В50 (Адамов А.К., Павлова Ю.П.. Домнина И. К.).

4. способ определения титра антител в противохолерных иммунных сыворотках, препятствующих Еибриоцидному действию про-таккнсульфата // Авторское свидетельство П 1837232, 02.07.1990 (Адамов А. К., Павлова Ю. П.).

5. Способ определения иммунных комплексов з крови // Авторское свидетельство :! 1698784, 15.08.1991. (Утц С. Р.).

6. Устройство для оценки аллергических кожных проб // Патент И 5''90396. 24.09.1992 г. ПЫсник Б .Г., Махонько fi.IL).

7. Елилкие иммунных антител, реагирующих с поверхностными знтиген-зми клетки, на антимикробное действие некоторых биополимеров и кнгкоколекудярних веществ // Тез. докл. I съезд иммунологе- России (23-25 июня 1392 г.) - Новосибирск. 1992. -С. 10-Ю. (Ад2м.оз А.К.. Павлова Ю. Л.).

8. Влияние антител и иммунных комплексов на лизис эритроцитов комплементом и трипсином //. Иммунология • и спецнфическа: профилактика особо опасных инфекций. - Саратов, 1993. - С. 127-127. {Щуркина И.И.)'. ''

9. Определение иммунных комплексов в крови по скорости' осё--дания -эритроцитов // Клиническая лабораторная диагностик -

1992. - N 3-4. - С. 23-25. (Утц С.Р., Махонько Н.Н.. Баиаровг Т.В., Утц И.А.).

10. Исследование особенностей формирования пленки из антите.! на поверхности микробных клеток при обработке их люминесцирую-щими иммуноглобулинами //. РосНИПЧИ "Микроб", Саратов. 1993. -16 С. - Леп.:в ВИНИТИ N 966-В93 (Щуркина И.И.).

11. Образование антителами полупроницаемой мембраны на поверхности холерных вибрионов // РосНИПЧИ "Микроб", Саратов,

1993.' - 35 С. - Деп. в ВИНИТИ N 4146-11Б (Щуркина И.И.. Кравцов А. Л.).

12. Функциональные свойства иммунных оболочек,' расположений на поверности клеточных, антигенов // Иммунология и специфическая иммунопрофилактика особо опасных инфекций. Материалы Российской научной конференции.' - Саратов. 1993. - с. 126-123.

13. Антителогенез при иммунизации животных убитыми вибрионами. покрытыми пленкой, из антител к гетерологичвкм антигенам /у Актуальные вопросы профилактики чумы и других инфекционных за,-болеваний. - Ставрополь. 1994. - С. 152-153. ([¿уохнка И II.).

14. Роль идиотипических антител в формировании иммунных оболочек-на поверхности чуиного микроба // Матер. мег:госуд, конф. "Профилакт. и меры борьбы с чумой ", посвящ. ЮО-л-зтиа открытия возбудителя чумы (г. Алма-Ата 6-7 сект. 1Э34 г.). - Ал-

1-Ата. 1994. -С. 56-56. (Щуркина И. И.)'.

15. Новая методика определения титра антител в сыворотках ¡нотных, основанная на феномене экранирования или вибриоцид-1го действия протаминсульфата // Актуальные проблемы профи-«тики одобо опасных и природно-очаговых инфекционных болез-¡й. - Иркутск, 1994. - С. 8-8. (Павлова Ю. П.).

16. Популяционные различия в культурах разных штаммов холер-к Эль-Тор вибрионов, выявленные с помощью ламинесцирующих [тител в аппарате для проточной цитофлюорометрии // Холера. -ютов-на-Дону. 1995. - С. 152-155. .

¿ГШ г.,го