Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микробиологический анализ на основе мономолекулярных пленок антител и сканирующей зондовой микроскопии

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Микробиологический анализ на основе мономолекулярных пленок антител и сканирующей зондовой микроскопии"

ОД

2 7 ОПТ 1Й8

На правах рукописи

БУДАШОВ ИГОРЬ АНАТОЛЬЕВИЧ

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ НА ОСНОВЕ

МОНОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ПЛЕНОК АНТИТЕЛ И СКАНИРУЮЩЕЙ ЗОНДОВОЙ МИКРОСКОПИИ

(03.00.04-биохимия)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1998

Работа выполнена в отделе физико-химической биологии Всероссийского научного центра молекулярной диагностики и лечения (ВНЦМДЛ).

Научный руководитель -

кандидат химических наук И.Н.Курочкин.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор П.Г.Свешников, доктор химических наук А.А.Ярославов

Ведущая организация:

Институт биохимической физики им.Н.М.Эмануэля РАН.

Защита состоится 22 октября 1998 г. в 1430 на заседании Диссертационного Совета при Центре медико-биологических и экологических проблем РАЕН по адресу: 113149, Москва, Симферопольский бульвар, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научного центра молекулярной диагностики и лечения.

Автореферат разослан "_" "_" 1998 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета,

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Антитела (AT) играют важную роль в анализе бактерий, вирусов и других микробиологических объектов, обеспечивая его специфичность. Разработка методов иммобилизации антител, сохраняющих свою функциональную активность, имеет большое практическое значение, в частности при создании биосенсоров. Одним из перспективных направлений является создание биологически активных пленок на основе ленгмюровской технологии с использованием амфифильных полиалекг-ролитов, как защитной матрицы. Такие покрытия обеспечивают хорошую воспроизводимость при серийном изготовлении детектирующих элементов, длительный срок сохранности, ьысокую чувствительность.

Сканирующая зондовая микроскопия (СЗМ) — новый класс методов, основанных на измерении свойств поверхности в нанометровом и субнанометровом диапазоне. Микроскопия осуществляется сверхтонкими зондами, которыми сканируют поверхность образца, используя прецизионные пьезокерамические сканеры. Атомно-силовая микроскопия (АСМ) — одна из разновидностей СЗМ, позволяет получать топографические образы поверхности с атомарным разрешением в различных средах: воздух, любые газы, водные растворы, органические растворители, вакуум. Аналитическое применение АСМ для анализа вирусов, бактерий и отдельных биомакромолекул может быть отнесено к новому поколению биосенсоров. Оно открывает новые возможности на пути увеличения специфичности и чувствительности биосенсорных систем. Современные СЗМ зонды позволяют одновременно получать сигналы в нескольких режимах, создавая многомерный специфический образ отдельной клетки или молекулы. Таким образом, детекторы на основе СЗМ могут обеспечить новый дополнительный уровень селекции специфического сигнала.

Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в исследовании возможностей анализа вирусов, риккетсий и бактерий, модулирующих возбудителей особоопасных инфекций, на основе АСМ и ЛБ-пленок AT с

использованием амфифильных полиэлектролитов (АПЭ). При этом были поставлены следующие задачи:

1) разработать и оптимизировать методику получения ленгмюровскю пленок AT с АПЭ на твердых подложках, пригодных для АСМ;

2) методом АСМ исследовать структурные особенности полученньо пленок;

3) проверить возможность АСМ получать изображения модельные микробиологических объектов;

4) получить АСМ-изображения микробиологических объектов специфически сорбированных на аффинные подложки;

5) осуществить распознавание полученных образов микробиологических объектов на АСМ-изображениях.

Научная новизна исследования. В данной работе предлагается новы( метод формирования ленгмюровских пленок антител на основе амфифиль ных полиэлектролитов. Впервые продемонстрирована возможность исполь зования ЛБ-пленок антител на основе амфифильных полиэлектролитов дш анализа микробиологических объектов методом атомно-силово! микроскопии.

Практическая значимость исследования. Ленгмюровские пленки анти тел на основе амфифильных полиэлекгролитов и анализ микробиологичес ких объектов на их основе методом атомно-силовой микроскопии могу служить основой для создания новых чувствительных биосенсоров.

Апробация работы. Основные реззультаты работы доложены н Втором Съезде Биохимического общества 19-23 мая 1997 г. в Москве, н Всероссийском рабочем совещании "Зондовая микроскопия-98" 2-6 март 1998 г. в Нижнем Новгороде, на 5-ом Всемирном конгрессе по био сенсорам "Biosensors-98" 3-5 июня 1998 г. в Берлине.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ отечественных и зарубежных изданиях.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит и введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результато исследования и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литератур!

(ЯОНназваний). Работа изложена на м страницах машинописного текста и включает 6 таблиц и 33 рисунка.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

На основе анализа литературных данных и работ нашей лаборатории показана перспективность применения ленгмюровских пленок антител (АТ) на основе амфифильных полиэлектролитов (АПЭ) и использование их, как чувствительного элемента биосенсоров. На первом этапе работы были изучены физико-химические свойства полимеров.

Ленгмюровские пленки амфифильных полиэлектролитов (АПЭ).

В работе использовались следующие амфифильные полиэлектролиты (АПЭ): а) сополимер метакриловой кислоты и лаурилметакрилата (мольное соотношение 1:9, степень полимеризации 100-300) (МАК-ЛМА); б) полиэтиленимин линейный, модифицированный в 70% мономерных звеньев лаурилбромидом (ПЭИ-Л70); в) полиэтиленимин разветвленный, модифицированный в 12% мономерных звеньев цетилбромидом и в 88% этилбромидом (ПЭИ-Р12). Все полиэлектролиты были синтезированы на кафедре ВМС химического факультета МГУ им. М.ВЛомоносова по методике (Пшежецкий с соавт., 1975).

Все использойанные полимеры за счет модификации гидрофобными алкильными радикалами нерастворимы в воде. При нанесении небольшой капли раствора полимера в хлороформе на поверхность водной субфазы, он образует на поверхности молекулярный слой (ленгмюровскую пленку). Значения рН буферных растворов были выбраны таким образом, чтобы гидрофильная часть ионизировалась при данных условиях и на полимере возникали отрицательные заряды в случае МАК-ЛМА и положительные в случае ПЭИ, что необходимо для электростатического взаимодействия с АТ. При уменьшении площади поверхности движущимся барьером поверхностное давление повышается, достигая 40-50 мН/м. Зависимости

поверхностного давления я от площади, приходящейся на одно мономерное звено, для трех типов полиэлектролитов (я-А изотермы) имеют характерный для амфифильных соединений вид (рис. 1).

К ,мН/м

во

5оРис. 1. я-А изотермы

амфифильных полимеров.

40

А — площадь, приходя-

30щаяся на одно мономерное

гозвено полимера (А2). 1 —

МАК-ЛМА; 2 - ПЭИ-Л70;

10'

3- ПЭИ-Р12.

о

о 9 10 18 20 25 30 33 40 43 30 33

А, А /мономерное звено

Сформированные на поверхности водной субфазы ленгмюровские пленки переносились методом Ленгмюр-Блоджет на высокоориентированный пиролигический графит. Были получены АСМ-изображения пленок полимеров для разных поверхностных давлений нанесения. Было показано, что пленки на твердых графитовых подложках образуют разрывы.

АСМ-изображения пленки ЛМА-МАК показали, что при давлении 10 мН/м ЛМА-МАК на графите представляет собой тонкую, высотой примерно 1,5-2 нм, пленку с большими округлыми разрывами и занимает около 50% площади. При давлении 20 мН/м площадь покрытия составляет примерно 40% и пленка имеет оегтровковую структуру, но зато высота ее выросла до 5 нм. При поверхностном давлении нанесения 30 мН/м, а также 40 мН/м, ЛМА-МАК полностью покрывает поверхность графита и имеет неровную поверхность. Ее толщина не менее 7 нм. Можно предположить, что пленка, нанесенная при поверхностном давлении до 14 мН/м, переносится на подложку с перестройкой монослоя на границе раздела фаз в бислой на поверхности графита:

К ,мН/м

примерно той же толщины. При давлении 20 мН/м полимер перестраивается на графите либо в бислой, что объясняет достаточно ровную поверхность островков, либо образует хаотичную структуру, сливающуюся при 30 мН/м в сплошной слой.

АСМ-изображения пленки ПЭИ-Л70 имеют вид округлых частиц высотой примерно 2,5 нм, лежащих отдельно для поверхностного давления нанесения 10 мН/м, и занимает около 15% площади. С увеличением поверхностного давления нанесения, частицы агрегируют. Высота агрегатов около 3,5 нм. Площадь покрытия поверхности растет не очень сильно: для 20 мН/м — 25%, для 30 мН/м — 35%, для 40 мН/м — 39%. У пленок ПЭИ-Р12 при увеличении поверхностного давления нанесения значительно возрастает площадь покрытия поверхности графита: для 10 мН/м — 22%, для 20 мН/м — 30%, для 30 мН/м — 37%, для 40 мН/м — 75%.

Пленки ПЭИ состоят из обособленных округлых частиц. Это дает основание считать, что частицы состоят из нескольких плотно упакованных в клубок полимерных молекул.

Таким образом показано, что рассмотренные алкилированные полимеры образуют на поверхности водной субфазы конденсированные слои и, следовательно, пригодны для использования в качестве защитных матриц. С использованием АСМ было показано, что при переносе пленок на твердые графитовые подложки, они меняют свою структуру; степень покрытия поверхйости зависит от степени сжатия исходного ленгмюровского слоя.

Ленгмюровские пленки чистых АТ и АТ с АПЭ.

Амфифильные полимеры МАК-ЛМА, ПЭИ-Л70 и ПЭИ-Р12 были использованы для получения ленгмюровских пленок АТ против НВхА^. Проведена оптимизация их функциональных (иммунохимических) свойств. Для оценки иммунохимической активности антител в ленгмюровских пленках в работе использовали стандартный метод иммуноферментного анализа (ИФА) при постоянной концентрации НВз-антигена (50-500 нг/мл). Для этого на изучаемые пленки сорбировался НВ$Аз, а затем он

метился моноклональными антителами против НВзАв, коньюгированными с пероксидазой хрена. Количество фермента определялось с помощью цветной реакции с о-фенилендиамином. Интенсивность окраски раствора после остановки цветной реакции измеряли спектрофотометрически при длине волны 492 нм. Оптическая плотность (00), как и в обычном ИФА, пропорциональна количеству связавшегося с пластинкой антигена.

Для формирования на поверхности жидкой субфазы полимер-антительной пленки ванну заполняли соответствующим буфером, содержащим АТ. Поверхность ванны очищали подвижным барьером и на поверхность водной субфазы наносили раствор полимера в хлороформе. На этапе инкубации полимерной пленки на поверхности раствора АТ можно наблюдать повышение начального поверхностного давления. Это повышение заканчивается примерно через 10 минут. Через 15 минут инкубации установившееся поверхностное давление системы доводили с помощью подвижного барьера до нужной величины. После этого ленгмюровский слой переносили на графитовые пластинки путем касания свежесколотой поверхностью пластинки поверхности жидкости.

Поверхностное давление системы белок-полиэлектролит несколько отличается от суммы вкладов поверхностных давлений полиэлектролита и антител при изученных степенях сжатия (позиции подвижного барьера) системы. Учитывая полную нерастворимость в водных растворах используемых полимеров, можно сделать предварительный вывод о том, что на поверхности водной субфазы в этом случае образуется достаточно прочный белок-полиэлектролитный комплекс, который тоже нерастворим или плохо растворим в воде.

На примере ПЭИ-Л70 было проведено сравнение иммунохимической активности ленгмюровских пленок АТ на основе АПЭ с ленгмюровскими пленками АТ без полимеров и слоями физически адсорбированных на графит АТ. Результаты, представленны на рис. 2, 3.

Анализ представленных данных показывает большую иммунохими-ческую активность слоев с полимерами по сравнению с другими способами нанесения АТ, по крайней мере в 2-3 раза.

Оптическая плотность

Л'!

Ш

I I

I

Рис. 2. Иммуноактив-ность пленок антител в зависимости от способа нанесения и количества добавленного в ванну полимера. Концентрация НВхАя: 500 нг/мл. О — пленки АТ. К — контрольные пленки без АТ. 1-4 — ленгмюров-ские пленки АТ с полимером ПЭИ-Л70 ( / — 5 мкл ПЭИ-Л70 (1 мг/мл хлороформа) на ванну, начальное поверхностное давление ло=0 мН/м, поверхностное давление при нанесении лн=43 мН/м; 2 - 10 мкл ПЭИ-Л70, яо=0 мН/м, лн=43 мН/м; 3 - 16 мкл ПЭИ-Л70, л0=5 мН/м, л„=43 мН/м; 4 — 20 мкл ПЭИ-Л70; тс0= 11,7 мН/м, тсн=43 мН/м). 5 — ленгмюровские пленки АТ без полимера (лн=22 мН/м). 6 — пленки АТ, полученные прямой сорбцией на графит.

Пленки антител

I-1- К ЕЯЯ - О

Оптическая плотность (00)

Рис. 3. Иммуноактив-ность ленгмюровских пленок АТ в зависимости от полимера и поверхностного давления при нанесении (ян). Концентрация НВзАа: 250 нг/мл. 1-3 - МАК-ЛМА с АТ (1 - тсн= 10 мН/м; 2 — 7сН=20 мН/м; 3 - 7сн=40 мН/м); 4-6 -ПЭИ-Л70 с АТ (4 - я„=20; 5 - 71„=30; 6 - л„=40 мН/м); 7-9 - ПЭИ-Р12 с АТ (7 - лгн=20; 8 -я„=30; 9 — 7гн=40 мН/м); 10 — ленгмюровская пленка АТ без полимера. 11 — контрольные пластинки без АТ (чистый графит).

123 .456 7 В 9

Пленки антител

Исследования функциональном активности пленок при различных концентрациях АТ в объеме водном субфазы при формировании ленгмю-ровских пленок, как было показано на примере МАК-ЛМА (рис. 4). и дли поликлональных и для моноклональных антител наблюдается пологий максимум активности в области концентраций антител 0.003-0,005 мг на мл водной субфазы.

' )|| П1ЧП 1С.14 II 1(> I Н'.х 'I I. ( П|>)

О 123458789 10

Ко1Щ'-|1Т|Ы1И1>1 -4 1 ! 1П ' '.I М I 4.1

Онтнч«'! КИЯ II НГПК11 "П. (()[))

11 I > . ' I

2 4 в 8 10 12

К(>||ЦС'НТ||.1Щ1Н .И1ТПТ1М ЧГ М I

б

Рис. 4. Влияние концентрации моноклональных АТ против НВяАй в ленгмюровской ванне в фосфатном буфере (рН=5,0) на их активность в ленгмюровских пленках на основе МАК-ЛМА. а — моноклональные АТ; б — поликлональные АТ. / — оптическая плотность фона (ОД/,); 2 — оптическая плотность при анализе антигена (ОО1Г).

а

Влияние ионной силы раствора, на поверхности которого формируются мономолекулярные пленки антител с АПЭ, на их иммунохимическую. активность было показано на примере МАК-ЛМА. Иммунохимическая активность увеличивается примерно в 2 раза при уменьшении концентрации ФБР от 100 до 5 мМ. Большая активность антител в пленках, полученных при малых значениях ионной силы раствора, указывает на определяющий вклад электростатического взаимодействия между положительно заряженными молекулами антител (тоэлектрическан точка используемых антител лежит в диапазоне 6.3-7.3)

и отрицательно заряженных цепочек полианиона МАК-ЛМА при формировании белок-полиэлектролитных комплексов в изучаемых пленках.

Зависимости иммунохимической активности пленок от величины рН водной субфазы, на поверхности которой формируются ленгмюровские пленки антител с АПЭ, для МАК-Л МА свидетельствуют, что активность увеличивается примерно в 4 раза с уменьшением рН от 7,4 до 5,0 и слабо изменялась в диапазоне рН цитрат-фосфатного буфера (ЦФБ) от 3 до 6. За рабочее было выбрано значение рН ЦФБ 4,5.

Для поликатионов влияние рН было исследовано на примере ПЭИ-Л70. Иммунохимическая активность АТ слабо изменялась в диапазонах рН от 7,8 до 8,5 с небольшим максимумом в 8,0. За рабочее рН для поликатионов было выбрано значение 8,0.

На следующем этапе работы было исследовано влияние количества слоев ленгмюровских пленок АТ, наносимых на подложку, на ах иммунохимическую активность. Наибольшая иммунохимическая активность ленгмюровских пленок антител с МАК-Л МА наблюдается при использовании подложек с одним монослоем антител.

Было исследовано влияние величины поверхностного давления непосредственно после нанесения на поверхность раствора антител АПЭ — тг0 на иммунохимическую активность антител в получаемых пленках (т.е. влияние степени начального сжатия полимера на функциональную активность). Для амфифильного полианиона МАК-Л МА активность моно- и по-ликлональных антител в диапазоне я0 от 8 до 16 падала, начиная с л0=12 мН/м, т.е. при давлении, превышающем давление фазового перехода (15-20 мН/м). Для ПЭИ-Л70 взаимодействие АТ с поликатионом в отличие от МАК-ЛМА не зависит от его начальной поверхностной плотности (в диапазоне 7t0 от 0 до 11,7 мН/м).

Было исследовано также влияние на качество пленок степени сжатия белок-полимерной пленки. Из результатов, представленных на рис. 3, видно, что в интервале от 20 до 40 мН/м полиэтиленимины дают практически одинаковые по иммунохимической активности пленки АТ. В случае МАК-ЛМА активность меньше в 2 раза при л„=10-20 мН/м, и только при

л,,=40 мН/м активность такая же, как в случае ПЭИ. При этом пленку сжимали до давления, выше соответствующего второму фазовому переходу. Но такая пленка не является монослойной, т.к. на одно мономерное звено приходится около 6 А2. Это подтверждают и данные АСМ (см. ниже).

При выбранных оптимальных условиях, для оценки физико-химических параметров ленгмюровских пленок АТ с АПЭ, были получены изотермы адсорбции (зависимость поверхностной концентрации НВ$А£ на поверхности изучаемой пленки от его концентрации в растворе с использованием метода ИФА). Для сравнения были оценены аналогичные параметры слоев АТ, полученных прямой адсорбцией на поверхность полистирольной плашки методом, используемым для традиционного иммуноферментного анализа. Значения параметров связывания для МАК-ЛМА приведены в табл. 1. Математический анализ изотерм адсорбции (по программе ЕЫ2РПТЕЯ) показывает, что взаимодействие НВз-антигена с ленгмюровскими пленками антител на основе МАК-ЛМА адекватно описывается моделью с одним центром связывания. В то же время процесс взаимодействия НВз-антигена с адсорбированными антителами носит положительно-кооперативный характер. Значения коэффициента Хилла ("да/) приведены в табл. 1.

Такой характер изотерм адсорбции понятным образом задает и существенную разницу в чувствительности иммуноферментного анализа на основе ленгмюровсЮгх пленок и адсорбированных слоев антител. Изотермы адсорбции ИВя-антигена на ленгмюровских пленках поликлональных антител позволяет определять порядка 0,2 нг/мл НВз-антигена, в то время, как номинальная чувствительность иммуноферментного диагностикума НПО "Препарат" 2-3 нг/мл.

Взаимодействие HBsAg с ленгмюровскими пленками АТ на основе ПЭИ во всех случаях происходит согласно модели с одним центром связывания. Значения параметров связывания приведены в таблице 2.

Если у пленок с ПЭИ-Л70 по сравнению с АТ, адсорбированными на плашке, емкость примерно такая же, а константа связывания К^ для ПЭИ-Л70 в 6 раз меньше, то у пленок с ПЭИ-Р12 емкость больше почти в 2

Таблица I

Физико-химические параметры и чувствительность пленок антител, полученных по ленгмюровской технологии с МАК-ЛМА и адсорбированных на поверхность полистирольной плашки.

Пленки антител Тип антител нМ 0, мг/м2 О/Ка "нт Чувствительность, нг/мл

Ленгмюров-

ские пленки поли-АТ 0,09 2,9 3,22 1,6 0,2

антител моно-АТ 0,11 2,5 2,27 1,6 2,4

Антитела, адсорбированные на полистирол поли-АТ моно-АТ другая модель другая модель 1,8 3,0

Таблица 2

Физико-химические параметры гшенок антител с ПЭИ.

Пленки Константа связывания КЛ, нг/мл Емкость иммуносорб-ции HBsAg, нг/м2

Ленгмюровская пленка АТ с ПЭИ-Л70 24 5,2 Ю4

Ленгмюровская пленка АТ с ПЭИ-Р12 260 9,2-Ю4

АТ, адсорбированные на полистирольной плашке 150 5,4 Ю4

раза, а константа связывания в 1,7 раза превосходит таковую слоя AT на полистирольной плашке.

В целях сопоставления структурных и физико-химических характеристик получаемых ленгмюровских пленок на поверхности графита было проведено исследование методом атомно-силовои микроскопии (АСМ). Измерения проводили (совместно с И.В. Яминским и О.И. Киселевой) в режиме прерывистого контакта (tapping mode). На рис. 5-7 представлены АС М-изображения ленгмюровских пленок AT на основе АПЭ.

Рис. 5. АСМ-изображения ленгмюровских пленок АТ с полимером МАК-ЛМА. Размер кадра 1,7x1,7 мкм. При построении изображений использована боковая подсветка. Поверхностное давление при нанесении: а — л,|=20 мН/м; о — Лц=40 мН/м. Примечание: При яи= 10 мН/м изображение практически не отличается от случая л,,=20 мН/м.

Сравнение площадей поверхности пленок полианион-антительных комплексов, незанятых сгустками чистого полимера, полученных для различных степеней сжатия пленки с ах иммунохимической активностью (рис. 3(№1-3)) показало, что наличие сгустков чистого полимера на поверхности пленки препятствует связыванию с ней антигена. При этом

1.1

сгустки, полумаемые при больших поверхностных давлениях, крупнее и занимают меньшую плошадь.

а б в

Рис. 6. АСМ-изображеиия ленгмюровских пленок ДТ с полимером ГГЭИ-Л70. Размер кадров 2.6<2.6 мкм. Поверхностное давление при нанесении: а — к,,=20 мН/м; о — я,,=30 мН/м; и — гс|(=40 мН/м. Высота кластеров пленки лежит в пределах от 5 до 10 нм.

а б в

Рис. 7. ЛСМ-изображения лешмюровекпх пленок /\Т с полимером Г1ЭИ-Р12. Размер кадра 4x4 мкм. Поверхностное давление при нанесении: л — Лц=20 мН/м: о — л„=30 мН/м: в — я„=40 мН/м. Высота пленки лежит в пределах от 5 до 12 нм.

Характерно, что иммуночимическая активность пленок антител на основе полнкатионов. нанесенных при поверхностном давлении 20, 30 н 40

мН/м, практически не измеш1ется (рис. 3(№4-9)). Это подтверждается и тем, что относительная площадь поверхности остается примерно одинаковой.

Таким образом, были оптимизированы условия формирования ленгмюровских пленок AT с амфифильными полиэлектролитами. Показано, что иммунохимические свойства таких пленок превосходят иммунохимические свойства ленгмюровских пленок AT без амфифильных полиэлектролитов и AT, адсорбированных на графит и полистирол. Поликатионные (ПЭИ) пленки превосходят по своим функциональным качествам полианионную (МАК-ЛМА), но покрывают поверхность графита неполностью. Их параметры связывания зависят от природы полимера.

АСМ-аналнз микробиологических объектов.

АСМ-анализ'микробиологических объектов, неспецифически адсорбированных на подложках

Возможность изучения микробиологических объектов была опробована на вирусах и риккетсиях, неспецифически сорбированных на слюду. Были получены АСМ-изображения отдельной клетки и вирусных частиц. Полученные результаты показывают возможность получения АСМ-изображений отдельных клеток и вирусных частиц. Эти изображения позволяют оценить форму и размеры вирусных частиц, детали рельефа клеточной стенки риккетсий, а также жесткость оболочек микробиологических объектов.

АСМ-анализ микробиологических объектов, специфически адсорбированных на подложках.

Были получены пленки AT с АПЭ, которые использовались для сорбции на них бактерий, риккетсий и вирусов.

Эксперименты показали, что иммуносорбированные на ленгмюровские пленки антител риккетсии сорбируются на них специфически: на образцах без антител клеток Coxiella burnetii практически

нет (проводился контроль на электронном сканирующем микроскопе с запылением образцов металлической пленкой).

Примеры АСМ-изображений клеток бактерии Yersinia pestis и риккетсий Coxiella burnetii и Rickettsia prowazekii приведены на рис. 8-10. На получаемых изображениях сравнительно большие клетки бактерий и риккетсий хорошо заметны на фоне полимер-антительной пленки, промытой водой. Отдельные клетки легко различимы на поверхности и могут быть подсчитаны.

Рис. 8. АСМ-изображение клетки Yersinia pestis (штамм ЕВ), специфически адсорбированной на ленгмюров-скую пленку соответствующих поликлональных антител с ПЭИ-Р12. Трехмерная проекция изображения с боковой подсветкой.

Рис. 9. АСМ-изображение клетки риккетсии Coxiella burnetii (штамм "Желтогор-лая Мышь-Jlyra"), специфически адсорбированной на ленгмюровскую пленку соответствующих поликлональных антител с полимером ПЭИ-Л70. Трехмерная проекция изображения с боковой подсветкой.

Рис. 10. АСМ-изображение клетки риккетсии Rickettsia prowazekii (штамм Брейнль"), специфически адсорбированной на ленгмюровскую пленку соответствующих поли-клональных антител с полимером ПЭИ-Р12. Трехмерная проекция изображения с боковой подсветкой.

АСМ, в отличие от других методов, дает точную величину высоты объекта. Это может дать дополнительную информацию о состоянии микроорганизмов. В случае бактерии Yersinia pestis, среди просмотренных клеток встречались три типа, различающихся по высоте: а) 70-120 нм, 6) 155-230 нм, в) 330-390 нм. Первая группа представляет собой пустые клеточные оболочки — "тени" с вытекшей протоплазмой. Две другие группы соответствуют различным жизненным формам. АСМ-сканирование в более мелком масштабе показывает тонкую структуру клеточной стенки, что дает дополнительную информацию о микроорганизме.

Полученный результат показывает возможность специфической идентификации бактерий и риккетсий методом АСМ на аффинных пленках.

При иммуносорбции ротавирусов и вирусов ВЭЛ, имеющих размер 80 нм, на ленгмюровские пленки антител отдельные вирионы неразличимы на поверхности пленок, т.к. они сливаются с неровностями поверхности полимер-антительной пленки. К тому же, в процессе хранения и инкубации вирусы могут частично разрушаться и участвовать в иммунореакции в виде отдельных белков и кусков вирионов. Поскольку сквозь разрывы пленки видна поверхность графита, есть возможность отличить чистую пленку от пленки с севшим на нее антигеном. Для определения иммуносорбции

антигена в таких случаях была разработана программа анализа изображений.

Метод анализа изображений, разработанный совместно с 29-м НИИ МО РФ, функционирует на основе банка машинных эталонов. На первом этапе создается байк эталонных изображений. Для этого по каждому объекту выбираются оптимальные параметры сканирования (размеры фрагмента изображения и шаг сканирования) и наиболее характерные изображения отбираются. На втором этапе анализируемое изображение предъявляется программе, сравнивается с эталонными и относится к одному из них (обладающему наибольшим значением меры сходства с исследуемым изображением).

После анализа структурных свойств объектов следующие аналитические дешифровочные признаки (ДДП) были выбраны (рис. 11): текстурные характеристики объектов представляются размерами элементов, образующих структуру изображений объектов, расстояниями между этими элементами, а также распределениями размеров элементов и расстояний между ними (<1+, (1", ё°), контрастные (г+, г) — положительными и отрицательными перепадами высот на изображениях объектов, а тоновые (2Ср.фр, ^р.п) — средней величиной 2-координаты анализируемого фрагмента и участков изображения с однородной высотой ("полок"). Контрастные и тоновые характеристики масштабируются.

Программа анализа изображений.

Рис. 11. Аналитические дешифровочные признаки (АДП): контрастные — г, г+; текстурные — <1*, <1+, (1°; тоновые — 2^р.фр,

2Ср.т — на схеме х-сечения АСМ-изображе-

х ния.

Текстурные и контрастные характеристики объектов описыва тремя независимыми между собой параметрами. Для выделения параметров используется распределение вида Аддп(Х)=Р(с1,п,Ы), Аддп(Х) — нормализованные по геометрии АДП; с1 — размер де изображения; п — заданная частота встречаемости деталей изображени трассам сканирования; N — количество трасс сканирования для задан размера деталей изображения и заданной частоты их встречаеммости.

Предлагаемая форма представления АДП существенно сни требования к выбору алгоритмов принятия машинного дешифровоч решения. Здесь может быть использован один из непараметриче методов. В этом способе для принятия решения используется cpeJ показатель меры сходства (Мср), вычисляемый по форд

I )

Мср=-(Мфр+Мп+2 М,), где Мфр и Мп — меры сходства тона фрагмеь

7 ы

"полок"; М| — средняя мера сходства по ¡-ой характеристике (текстур контрастной).

1 т 1 "

М(= —где — весовой коэффициент; К; — мера с /и п ^

ства аналогичных элементов гармоники; п — количество элеме сравнения в аналогичных гармониках (поддиапазонах) АДП эталонно дешифруемого изображений; ш — количество гармоник в диапазоне I (характеристике).

Весовой коэффициент может быть найден по формуле: \У,=(2/Ь О — количество элементов сравнения при вычислении ¡-ой харакгерист Ь — количество элементов в 1-ом диапазоне гармоник ¡-ой характеристи

Мера сходства вычисляется по формуле: ^=Аадп/Аэт Аадп(Х)<Аэт(Х) и К;= Аот/Аддп при АадП(Х)>Аэт(Х), где АдцП(Х) и А— амплитуды однотипных элементов гармоники АДП эталонног дешифрируемого изображений.

Применение среднего показателя меры сходства при выраб машинных дешифровочных решений при условии стабильности параме

получения исходного и эталонного изображений практически исключает получение случайного неверного результата и позволяет в случае необходимости производить его расчет раздельно по группам характеристик (текстурным, контрастным, тоновым) или в различном их сочетании.

Для учета анизотропии структуры изображения выделение АДП производится по строкам и столбцам матрицы изображения.

Программа анализа изображений с высокой степенью точности различала пленки с вирусным антигеном как от пленок неинкубированных с антигеном, так и от пленок с антителами другой специфичности, инкубированных с антигеном.

ВЫВОДЫ

1) Разработана базовая технология формирования аффинных покрытий на основе ленгмюровских пленок AT с АПЭ.

2) Методом АСМ исследованы структурные особенности ленгмюровских пленок AT на основе АПЭ.

3) Показана возможность специфической идентификации бактерий и риккетсий методом АСМ на аффинных пленках.

4) Показана возможность анализа вирусов, специфически сорбированных на полимер-антительные пленки, с использованием разработанной программы анализа изображений.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Бабицкая Ю.И., Будашов И.А., Чернов С.Ф., Курочкин И.Н., Дорошенко Н.В., Зубов C.B. - Ленгмюровские пленки антител на основе амфифильного полиэлектролита. - Биол. мембраны, 1996, т. 13, №6, с.634-641.

2. Babitskaya J.I., Budashov 1.А., Chernov S.F., Kurochkin I.N., Doroshenl N.V., Zubov S.V. - Langmuir films from antibodies based on ampliiphil polyelectrolytes. - Membr. and Cell Biol., 1997, v.10 (6), pp.689-697.

3. Будашов И.А., Курочкин И.Н., Денисов A.K., Скрипнюк В.В., Шабаш Г.А. - Использование атомно-силовой микроскопии для анализа мю робиологических объектов. - Второй Съезд Биохимического общесп (19-23 мая 1997 г., Москва). Тезисы стендовых сообщений. Часть II.

1997, с.488.

4. Будашов И.А., Курочкин И.Н., Денисов А.К., Скрипнюк В.В., Шабанс Г.А. - Использование атомно-силовой микроскопии для анализа микр< биологических объектов. - Журн. микробиол., 1997, № 6, с.11-15.

5. Курочкин И.Н., Будашов И.А., Павельев А.Б., Денисов А.К., Скрипнк В.В., Шабанов Г.А. - Биосенсорные системы на основе сканирующе зондовой микроскопии. - Сенсорные системы, 1998, т.12, N° 1, с.122-134

6. Будашов И.А., Курочкин И.Н., Денисов А.К., Скрипнюк В.В., Шабанс Г.А., Киселева О.И., Яминский И.В. - Анализ микробиологическ* объектов на основе сканирующей зондовой микроскопии ленгмюровских пленок антител. - Материалы Всероссийского рабочег совещания "Зондовая микроскопия-98" (2-6 марта 1998 г., Нижни Новгород), с.82-88.

7. Budashov I.A., Kurochkin I.N., Denisov А.К., Skripnuk V.V., Shabanov G./ - Tlie identification of microorganisms based on atomic force microscopy. - Ii Biosensors 98. The Fifth World Congress on Biosensors. Inter-Continenti Hotel, Berlin, Getrnany, 3-5 June 1998. Refered abstracts. Elsevier Scieiic<

1998. P. 415.

8. Будашов И.А., Курочкин И.Н., Цибезов В.В., Кальнов С.Л., Денисо А.К., Киселева О.И., Яминский И.В. - Структурные и функциональны свойства ленгмюровских пленок антител на основе амфифильны полиэлектролитоа. - Биол. мембраны. 1998. В печати.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Будашов, Игорь Анатольевич, Москва



Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения

На правах рукописи УДК 577.3

Будашов Игорь Анатольевич

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ НА ОСНОВЕ МОНОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ПЛЕНОК АНТИТЕЛ И СКАНИРУЮЩЕЙ ЗОНДОВОЙ МИКРОСКОПИИ

(03.00.04 - биохимия)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель - кандидат химических наук И.Н.Курочкин

Москва 1998 ^

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений 5

ВВЕДЕНИЕ 7

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 13

1.1 Атомно-силовая микроскопия (АСМ) 13

1.1.1 АСМ-исследование микробиологических объектов 19

1.1.1.1 Бактерии и клеточные структуры бактерий 19

1.1.1.2 Вирусы 30

1.1.1.3 Другие клетки и клеточные структуры 33

1.1.2 Техника подготовки образцов для АСМ 40

1.1.2.1 Иммобилизация и подготовка объектов для АСМ 41

1.1.2.2 Модификация игл 47

1.1.3 АСМ-исследование различных свойств микробиологических объектов (механических, иммунных, биохимических, меж- и внутримолекулярных сил) 48

1.1.4 Манипулирование микрообъектами с помощью зонда. 55

1.2 Ленгмюровская технология 57 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 66

2.1 Использованные материалы 66

2.2 Методы исследования 70 2.2.1 Формирование и перенесение ленгмюровских пленок 70

2.2.1.1 Формирование и перенесение ленгмюровских пленок амфи-фильных полиэлектролитов (АПЭ) 70

2.2.1.2 Формирование и перенесение ленгмюровских пленок АТ без АПЭ 71

2.2.1.3 Формирование и перенесение ленгмюровских пленок АТ с АПЭ 71

2.2.2 Простая адсорбция АТ 72

2.2.3 Снятие тс-А изотерм 72

2.2.4 Измерение иммунологической активности АТ (ИФА) 73

2.2.5 Изотермы адсорбции 74

2.2.6 Адсорбция микроорганизмов 74

2.2.6.1 Простая 74

2.2.6.2 Иммуноадсорбция 74

2.2.7 Гравиметрический анализ на основе кварцевых пьезоэлектрических резонаторов 75

2.2.8 Атомно-силовая микроскопия (АСМ) 76 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 77

3.1 Ленгмюровские пленки АПЭ 78

3.2 Ленгмюровские пленки чистых АТ и АТ с АПЭ 87

3.3 АСМ-анализ микробиологических объектов 121

3.3.1 АСМ-анализ микробиологических объектов, неспецифически адсорбированных на подложки 122

3.3.2 АСМ-анализ риккетсий и бактерий, специфически адсорбированных на подложки 127

3.3.3 АСМ-анализ вирусов, специфически адсорбированных на подложки, и программа анализа изображений 133 ВЫВОДЫ 139 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 140

Список сокращений.

АГ — антиген

АПЭ — амфифильные полиэлектролиты АСМ — атомно-силовая микроскопия AT — антитела

JIБ-пленки — ленгмюровские пленки (пленки Ленгмюра-Блоджетт) МАК-ЛМА — сополимер метакриловой кислоты и лаурилметакрилата

(мольное соотношение 1:9, степень полимеризации 100-300) o.e. — оптические единицы

ПВП — поли-4-винилпиридиний, алкилированный в 90 % звеньев лаурил-бромидом

ПЭИ-Л70 — полиэтиленимин линейный, модифицированный в 70%

мономерных звеньев лаурилбромидом ПЭИ-Р12 — полиэтиленимин разветвленный, модифицированный в 12%

мономерных звеньев цетилбромидом и в 88% этилбромидом ПЭМ — просвечивающая электронная микроскопия СЗМ — сканирующая зондовая микроскопия СЭМ — сканирующая электронная микроскопия ФБ — фосфатный буфер ЦФБ — цитрат-фосфатный буфер HBsAg — поверхностный антиген вируса гепатита В OD — оптическая плотность

СШф — оптическая плотность фона ОБаг — оптическая плотность антигена

тс0 — поверхностное давление в ленгмюровской ванне сразу после нанесения на поверхность водной субфазы полимера ли — поверхностное давление в ленгмюровской ванне после инкубации (15 мин) раствора антител с нанесенным на поверхность водной субфазы полимером лн — поверхностное давление в ленгмюровской ванне после сжатия барьера (давление нанесения ленгмюровской пленки на подложку)

ВВЕДЕНИЕ

Сканирующая зондовая микроскопия (СЗМ) — новый класс методов, основанных на измерении свойств поверхности в нанометровом и субнанометровом диапазоне. Микроскопия осуществляется сверхтонкими зондами, которыми сканируют поверхность образца, используя прецизионные пьезокерамические сканеры. В зависимости от типа зонда и измеряемых им свойств выделяют такие классы СЗМ [1]: 1) Туннельная микроскопия; 2) Атомно-силовая микроскопия; 3) Микроскопия ион-селективным электродом; 4) Микроскопия термопарой; 5) Оптическая абсорбционная микроскопия; 6) Магнитно-силовая микроскопия; 7) Электростатическая силовая микроскопия; 8) Акустическая микроскопия; 9) Оптическая микроскопия ближнего поля; 10) Криогенная микроскопия. Разработанные первыми сканирующий тунельный микроскоп (СТМ) [2,3] и атомно-силовой микроскоп (АСМ) [4,5] являются в настоящее время основными и наиболее широко применяемыми в науке и технике. Самый универсальный из СЗМ — АСМ позволяет получать топографические образы поверхности с атомарным разрешением на проводящих и непроводящих поверхностях в различных средах: воздух, любые газы, водные растворы, органические растворители, вакуум. Очень привлекательными для биологии являются возможности АСМ исследовать нативные препараты в водных буферах и с помощью химически модифицированных зондов изучать механические, иммунные,

биохимические свойства и даже измерять силы взаимодействия между отдельными молекулами и между частями молекулы.

Аналитическое применение АСМ для анализа вирусов, бактерий и отдельных биомолекул может быть отнесено к новому поколению биосенсоров. Высокочувствительный анализ химических соединений с использованием биосенсоров основан на преобразовании результатов специфического биомолекулярного взаимодействия в изменение физических свойств соответствующего детектора [6,7]. В последние годы было разработано и описано множество биосенсорных систем и устройств, включая моно и мультиферментные электроды и полевые транзисторы, амперометрические датчики на основе лиганд-рецепторных взаимодействий, датчики, использующие изменение свойств проникающей затухающей волны на границе двух оптических сред, термодатчики, клеточные и тканевые электроды, био- и хемолюминесцентные системы, молекулярные детекторы на основе нуклеиновых кислот [6,8,9]. Как правило, детекторы в биосенсорах измеряют экстенсивные свойства системы, связанные с наличием достаточного числа молекул, определяющих величину сигнала детектора. Обычно, для измерения требуется несколько тысяч соответствующих биомолекул (сенсорных элементов). Более того, сигнал используемых детекторов, чаще всего, неспецифичен, т.е. определяется не только специфическими молекулярными свойствами сенсорных биомолекул. Очевидно, что эти факты накладывают определенные ограничения на чувствительность и специфичность анализа с использованием биосенсоров.

Можно выделить два пути увеличения чувствительности и специфичности анализа с применением биосенсоров. Первый путь — это поиск и разработка молекулярных систем усиления результатов специфического биомолекулярного взаимодействия с последующей передачей сигнала на детектор. Кинетические принципы функционирования такого рода систем описаны в обзоре [10]. Наиболее яркими примерами молекулярных систем усиления в области биосенсоров являются: 1) субстратное усиление сигнала, предложенное ЗсИеПег [11], 2) биосенсорные системы на основе жидких кристаллов нуклеиновых кислот, разрабатываемые в лаборатории Ю.М.Евдокимова [12], 3) биосенсоры на основе живых клеток и тканей, использующие каскадные механизмы усиления гормонального сигнала, описанные в работах [7,9,13]. Второй путь — это путь использования систем регистрации сигнала, генерируемого отдельной клеткой или молекулой. Такого рода биосенсоры могут обеспечить исключительно высокую чувствительность [7]. Однако интерпретация сигнала может быть затруднена из-за низкой специфичности отклика. В этом случае осуществляют предварительное фракционирование сложной смеси. Так в работе [7] описано сопряжение высокоэффективного разделения методом капиллярного электрофореза с чувствительной детекцией отдельных составляющих смеси с использованием отдельных клеток. Аналитическим откликом клетки служила интенсивность флуоресценции красителя, пропорциональная концентрации внутриклеточного кальция. В качестве других параметров, измеряемых при том или ином воздействии на единичные клетки, обычно используют величину

трансмембранного тока и величину рН в непосредственной близости от клетки. Но, в любом случае, измеряемый сигнал интегрируется по всей клетке с пространственным разрешением 0,2-0,5 мкм. Собственно такое низкое разрешение и обуславливает низкую специфичность отклика единичных клеток и не позволяет интерпретировать сигнал на уровне изменения свойств отдельных биомакромолекул.

Использование методов сканирующей зондовой микроскопии (СЗМ) открывает новые возможности на пути увеличения специфичности и чувствительности биосенсорных систем. СЗМ и, в частности, сканирующая туннельная микроскопия (СТМ), атомно-силовая микроскопия (АСМ) обеспечивают регистрацию сигналов, связанных со свойствами поверхности исследуемого объекта, с разрешением менее, чем один нанометр. Это позволяет осуществлять измерение не только интегрального отклика от отдельных клеток или молекул, но и его пространственное распределение. Более того, современные СЗМ зонды позволяют одновременно получать сигналы в нескольких режимах: СТМ, АСМ, сил трения, оптический ближнего поля, что создает многомерный образ исследуемого объекта [1416]. Аналитический отклик системы в данном случае представляет собой многомерный образ отдельной клетки или молекулы, сформировавшийся в ответ на воздействие аналита. Специфичность такого отклика задается не только способностью используемых клеток или молекул реагировать на заданный аналит, но и характером собственно многомерного СЗМ образа. Таким образом, детекторы на основе СЗМ могут обеспечить новый дополнительный уровень селекции специфического сигнала.

Специфичность анализа микробиологических объектов в традиционных методах достигается использованием специфических AT. ACM предъявляет особые требования к поверхностям, покрытым AT. Они должны обладать не только высокими функциональными качествами, но и соответствовать критериям пригодности для исследования с помощью ACM: 1) поверхность должна быть достаточно ровной (по сравнению с зондовой иглой); 2) AT должны быть достаточно крепко связаны с поверхностью, так, чтобы зондовая игла не отрывала ни их, ни комплекс АТ-АГ при сканировании; 3) вся конструкция должна быть достаточно жесткой, чтобы получать четкие изображения.

Ранее в нашей лаборатории был исследован ряд амфифильных полиэлектролитов, позволяющих получать ленгмюровские пленки ферментов и фермент-медиаторных комплексов с высокой поверхностной концентрацией и сохранением их функциональных свойств [17-24]. Такие белковые пленки, имеющие твердую и достаточно крепко связанную с поверхностью полимерную матрицу, оказались удобны для исследования с помощью АСМ.

В данной работе была исследована следующая схема анализа с использованием АСМ:

1) Создание пленки, содержащей функциональные специфические антитела (AT), на поверхности, пригодной для АСМ.

2) Иммуносорбция анализируемого микробиологического объекта на специфическую подложку.

3) Получение АСМ-изображений поверхности.

4) Анализ изображений и распознавание образов микробиологических объектов.

Цель работы заключалась в разработке новой технологии формирования ЛБ-пленок AT с использованием амфифильных полиэлектролитов (АПЭ), и, на основе полученных аффинных покрытий, продемонстрировать возможность анализа методами АСМ вирусов, риккетсий и бактерий, модулирующих возбудителей особоопасных инфекций. При этом были поставлены следующие задачи:

1) разработать и оптимизировать методику получения ленгмюровских пленок AT с АПЭ на твердых подложках, пригодных для АСМ;

2) методом АСМ исследовать структурные особенности полученных пленок;

3) проверить возможность АСМ получать изображения модельных микробиологических объектов;

4) получить АСМ-изображения микробиологических объектов, специфически сорбированных на аффинные подложки;

5) осуществить распознавание полученных образов микробиологических объектов на АСМ-изображениях.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Атомно-силовая микроскопия (АСМ).

В АСМ [16,25-27] используется зонд в виде очень острой иглы (обычно из нитрида кремния), который закреплен на мягко-упругом кантилевре, способном реагировать на силы межатомного взаимодействия (отталкивания и притяжения) порядка долей наноньютона. Зонд осуществляет сканирование образца в горизонтальной плоскости в режиме поддержания постоянной силы взаимодействия между зондом и поверхностью. Вертикальные перемещения кантилевра в таком режиме фактически описывают реальную топографию исследуемой поверхности. Сильная экспоненциальная зависимость сил межатомного взаимодействия от расстояния между зондом и поверхностью позволяет получить уникальное разрешение по вертикали: 0,1-1 А, а пьезокерамический сканер обеспечивает разрешение по горизонтали на уровне одного ангстрема.

Кроме режима постоянной прижимающей силы существуют и другие:

1) Режим постоянной высоты. Обратная связь при этом отключается, положение пьезосканера по Z-координате фиксируется, а регистрируемым сигналом становится непосредственно сигнал рассогласования в фотодиоде, который отражает величину отклонения кантилевра. В этом случае сила прижатия кантилевра к поверхности изменяется в процессе сканирования.

2) Режим регистрации ошибки обратной связи.

Ошибка обратной связи, возникающая при сканировании в режиме топографии, содержит дополнительную информацию о топографии. Она

может быть использована для более точного восстановления рельефа. Этот режим можно использовать как промежуточный между режимом постоянной силы и постоянной высоты, если отрегулировать скорость отработки обратной связи так, чтобы она отслеживала пологие изменения рельефа и не успевала отслеживать крутые. Тогда во время пересечения зондом небольших неоднородностей сканирование будет происходить при почти постоянной длине пьезосканера. В результате на изображении будут слабо проявляться медленные изменения рельефа и с высоким контрастом — резкие. Это может быть полезно для отыскания мелких неоднородностей на большом поле на фоне крупных пологих особенностей рельефа. Режим сигнала ошибки хорошо выделяет изменения увеличения сигнала (подобно первой производной сигнала измерения высоты), обеспечивает хорошее изображение деталей поверхности, но не дает количестванной информации о высоте [28].

3) Режим измерения боковых сил.

Во время сканирования в направлении, перпендикулярном оси кантилевра (+х или -х направления), возникает дополнительная крутильная деформация кантилевра. Она обусловлена моментом сил, действнщих на острие иглы. Угол кручения при небольших отклонениях пропорционален боковой силе. При этом регистрируется дополнительное смещение луча лазера в боковом направлении. Для измерения боковых сил АСМ работает в режиме поддержания постоянной силы, как при снятии топографии [29].

При движении по плоской поверхности, на которой присутствуют участки с разными коэффициентами трения, угол кручения будет

изменяться от участка к участку. Это позволяет говорить об измерении локальной силы трения. Если присутствует рельеф,то такая интерпретация невозможна. Тем не менее, этот вид измерений позволяет получать изображения, на которых хорошо видны мелкие особенности рельефа, и облегчать их поиск.

4) Определение упругих свойств.

Количественный анализ упругих и других свойств образца может быть получен на АСМ с помощью силовых кривых, как показано в работах [30-32]. Определение упругих свойств может быть легко выполнено путем снятия силовых кривых во время сканирования образца иглой [33,34]. Этот режим называют силовым картированием (force mapping).

5) Вибрационные и модуляционные методы.

Эти методы используют вибрацию зонда (образца) или модуляцию параметра для получения информации о свойствах поверхности. В числе общих преимуществ можно назвать, во-первых, использование резонансных свойств системы, что позволяет существенно повысить чувствительность по сравнению со статическим измерением, а во-вторых, уменьшение сил взаимодействия, в частности, боковых, между зондом и поверхностью в бесконтактном и полуконтактном режимах. В АСМ вибрация образца и регистрация амплитуды отклика кантилевра дает информацию о локальной жесткости образца. Детектирование амплитуды и/или фазы колебаний кантилевра, возбуждаемого пьезоэлементом, позволяет сканировать в бесконтактном и полуконтактном режиме ввиду того, что они легко деформируются или разрушаются иглой кантилевра.

Эти режимы позволяют также использовать кантилевры с тонкими и очень острыми иглами, которые в контактном режиме сами легко разрушаются.

В работ