Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сканирующая зондовая микроскопия надмолекулярных белковых комплексов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Киселева, Ольга Игоревна, Москва

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

На правах рукописи

Физический факультет УДК 578.086

КИСЕЛЁВА ОЛЬГА ИГОРЕВНА

СКАНИРУЮЩАЯ ЗОНДОВАЯ МИКРОСКОПИЯ НАДМОЛЕКУЛЯРНЫХ

БЕЛКОВЫХ КОМПЛЕКСОВ

(03.00.02-Биофизика)

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Научные руководители: доктор физико-математических наук профессор Лобышев В.И.

доктор физико-математических наук

Яминский И.В.

МОСКВА 1999

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..........................................................................................................................4

ГЛАВА I ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Принципы функционирования и аппаратура сканирующей зондовой

микроскопии.................................................................................................................5

1.1.1. Сканирующая туннельная микроскопия...........................................................5

1.1.2 Атомно-силовая микроскопия............................................................................8

1.2. Сканирующая зондовая микроскопия белков и белок-мембранных комплексов 15

1.2.1. Атомно-силовая микроскопия.........................................................................15

1.2.1.1 Изолированные белки.................................................................................19

1.2.1.2. Мембранные белки.....................................................................................21

1.2.1.3. Измерение сил межмолекулярного взаимодействия..............................24

1.2.2. Сканирующая туннельная микроскопия.........................................................27

ГЛАВА II. ЭКСПЕРИМЕТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

11.1. Объекты исследования и экспериментальное оборудование................................35

11.2. Характеристика подложек для СЗМ и артефакты, связанные с их структурой .. 36

11.2.1. Слюда................................................................................................................36

11.2.2. Высоко ориентированный пиролитический графит.....................................37

11.2.2.1. Аномальный период..................................................................................37

11.2.2.2. Точечные периодические дефекты.........................................................40

11.2.2.3. Анодизация................................................................................................40

11.2.3. Пленки металлов..............................................................................................44

11.3. Приготовление образцов и связанные с ним артефакты........................................47

11.4. Артефакты, связанные геометрией зонда................................................................50

11.4.1. Уширение..........................................................................................................50

11.4.2. Удвоение...........................................................................................................54

11.4.3. Боковая поверхность.......................................................................................54

ГЛАВА III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

III. 1. Визуализация гем-содержащего мембранного белка методом СТМ и его

электронные свойства..............................................................................................57

III.2. Комплексообразование в биологических системах..............................................66

III.2.1. Цитохром Р450 2В4 и редуктаза NADPH-цитохром Р450.........................66

III.2.2. Гистоновые белки и ДНК..............................................................................77

111.3. Взаимодействие цитохромаР450 see с липидами в составе пленок Ленгмюра-Блоджетт......................................................................................................................82

111.4. Ленгмюровские пленки антител, содержащие амфифильные полиэлектролиты........................................................................................................96

111.5. Протеолипосомы и субмитохондриальные частицы. Кластеризация АТФ-синтетазного комплекса...........................................................................................106

ВЫВОДЫ.........................................................................................................................125

ЛИТЕРАТУРА.................................................................................................................126

Список используемых сокращений

СЗМ - сканирующая зондовая микроскопия

АСМ - атомно-силовая микроскопия, атомно-силовой микроскоп

СТМ - сканирующая туннельная микроскопия, сканирующий туннельный микроскоп

АСС - атомно-силовая спектроскопия

САБ - сывороточный альбумин быка

ЛБ пленка - пленка Ленгмюра-Блоджетт

Графит - высоко ориентированный пиролитический графит

ИФА - иммуно-ферментный анализ

AT - антитела на вирус гепатита В

HBsAg - вирус гепатита В

ПЭИ-Р12 - полиэтиленимин разветвленный

ПЭИ-Л70 - полиэтиленимин линейный

МАК-ЛМАК - сополимер метакриоловой кислоты и лаурил-метакрилата

2В4 - цитохром Р450 2В4

Fp - редуктаза NADPH-цитохром Р450

СМЧ - субмитохондриальные частицы

ВВЕДЕНИЕ

После получения первых надежных изображений биологических макромолекул (дезоксирибонуклеиновой кислоты) в 1991 году возник широкий интерес к применению сканирующей зондовой микроскопии (СЗМ) [1, 2] в биологии. СЗМ является уникальным и перспективным направлением неразрушающих исследований биологических молекул и надмолекулярных комплексов в условиях, максимально приближенных к естественным [3, 4].

В данной работе основное внимание уделяется применению СЗМ для изучения мембранных белков и белок-мембранных комплексов, играющих ключевую роль в функционировании биологических систем. В частности, методом атомно-силовой микроскопии (АСМ) исследуются процессы образования комплексов между молекулами белков, а также белков с липидами и нуклеиновыми кислотами. Молекулярная организация мембранного белка цитохрома Р450 see в составе бислойной липидной мембраны изучается на примере модельной системы -ленгмюровских пленок фосфолипидов, содержащих исследуемый белок, а АТФ-синтетазного белкового комплекса - на примере протеолипосом, содержащих встроенный белок, при их частичной дегидратации и последующем формировании из них квазикристаллических структур различного типа. Анализ размеров и формы липосом и протеолипосом, а также процесса их агрегации помимо фундаментального имеет прикладное значение для фармакологии. Проводятся исследование структуры и количественный анализ изображений ленгмюровских пленок, содержащих антитела против вируса гепатита В. Полученные данные о структуре и свойствах ленмюровских пленок белков и белков с липидами и амфифильными полиэлектролитами имеют важное практическое значение для создания чувствительных элементов имунносенсоров. Сканирующая туннельная микроскопия (СТМ) позволяет исследовать на уровне отдельных молекул электронные свойства мембранных белков, участвующих в электронном транспорте. На примере белка цитохрома Р450 2В4, встроенного в липосомы, впервые зарегистрирована зависимость проводимости отдельной белковой молекулы в составе мембраны от полярности напряжения на туннельном переходе.

ГЛАВА I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Принципы функционирования и аппаратура сканирующей

зондовой микроскопии

1.1.1. Сканирующая туннельная микроскопия

Принцип функционирования сканирующего туннельного микроскопа (СТМ) [1] основан на измерении туннельного тока между исследуемой проводящей поверхностью и острием туннельной иглы (зондом). Для наглядности рассмотрим случай металлического образца, для которого разработана удовлетворительная теория. Металлическое острие закрепляют в позиционер и подводят к образцу на расстояние порядка единиц-десятков ангстрем. Электроны туннелируют через потенциальный барьер между образцом и иглой. Через некоторое время установится равновесие, и уровни Ферми обоих металлов уравняются. Если приложить к игле напряжение смещения V относительно образца, между электродами (образцом и иглой) будет поддерживаться туннельный ток. Энергетическая диаграмма туннельного перехода изображена на рис. 1 .а. Высота и форма потенциального барьера определяется работами выхода Ф| и Ф2 и разностью потенциалов между электродами. Упрощенную

формулу для плотности туннельного тока можно получить для металлических электродов в приближении еУ«Ф:

1«(к0/47г28)Уехр(-2к08) (1),

1 /2

где 8 эффективная величина туннельного зазора в Е, ко=(2тФ) /Ъ , Ф - эффективная высота барьера, Ъ. - постоянная Планка, Ф«(Ф^+Ф2)/2.

При рассмотрении образцов с неоднородной электронной структурой необходимо внести поправку в приближенную формулу (1) с учетом того, что величина туннельного тока определяется не только вышеуказанными параметрами, но и локальной плотностью электронных состояний вблизи уровня Ферми.

Для органических и биологических молекул, адсорбированных на проводящей подложке, ситуация оказывается значительно сложнее (см. п. 1.2.2 "Туннельная микроскопия"). Для визуализации их, как правило, адсорбируют на проводящей подложке. Анализ изображений показывает, что в таких случаях в туннельный ток

Рис. 1.а Энергетическая диаграмма туннельного перехода в одномерном случае. Ф1? Ф2 - работы выхода материалов образца и иглы, 8 - величина туннельного зазора, V - приложенное напряжение смещения, Ер - уровень Ферми.

манипулятор обратная связь

Рис. 1.6. Схема визуализации биологического объекта с помощью СТМ.

Реальная траектория (а) движения острия дает заниженное значение высоты

биологического объекта.

Если бы биологический объект и подложка обладали одинаковыми электронными свойствами, то движение острия описывалось бы траеторией б.

вносят вклад состояния, образованные сложением электронных состояний адсорбированных молекул и состояний образца, расположенных вблизи уровня Ферми материала подложки [5].

В режиме постоянного туннельного тока в процессе сканирования иглы в плоскости образца постоянное значение тока поддерживается за счет применения обратной связи. Рабочие значения туннельного тока могут составлять единицы -десятые доли наноампер. В последние годы были сконструированы СТМ, работающие в низкотоковом режиме при рабочих значениях туннельного тока равных десятым долям пикоампер [6]. В процессе сканирования игла туннельного микроскопа перемещается над исследуемой поверхностью с помощью пьезокерамического манипулятора. При движении иглы над поверхностью образца (в плоскости ХУ) цепь обратной связи компенсирует изменения в сигнале туннельного тока (1^ вариацией Ъ-координаты иглы. Фиксируя величину сигнала обратной связи и отображая зависимость ¿-координаты иглы от ее Х- и У- координат, получают информацию о реальной топографии исследуемой поверхности. При постоянной величине работы выхода это соответствует постоянному значению расстояния Б, и контур, описываемый острием, повторяет контур топографии исследуемой поверхности. На рис. 1.6 показана схема работы СТМ. Контур (а) следования острия описывает поверхность постоянного тока для биологического объекта, адсорбированного на проводящей подложке. Описываемая поверхность несколько отличается от реальной топографии (траектория б), которую повторяло бы острие, если бы адсорбированный объект был деталью рельефа подложки. Высота адсорбированного объекта занижена из за большей работы выхода и меньшей локальной плотности электронных состояний.

Благодаря экспоненциальной зависимости I от Б разрешающая способность метода по нормали к образцу достигает сотых долей ангстрема. Разрешающая способность в плоскости образца определяется геометрией острия и может достигать

1 А.

Возможен также режим работы с отключенной обратной связью. Игла при этом движется над образцом на постоянной высоте, в каждой точке регистрируя значение туннельного тока 1(х,у).

Если при сканировании регистрировать с1(1п1)/с18, можно найти распределение (Ф(х,у))ш и по совокупности данных восстановить топографию поверхности. Кроме

1 /9

того режим (Ф(х,у)) важен для изучения взаимодействия между адсорбированными молекулами и подложкой и понимания механизма возникновения контраста

изображений органических и биологических молекулярных систем [7]. С помощью манипулятора игла движется в перпендикулярном образцу направлении синусоидально с амплитудой 0,2-0,3 А и частотой 5-7 кГц. Переменная составляющая тока на частоте модуляции пропорциональна dl/ds. Средняя величина туннельного зазора остается постоянной, как и в топографическом режиме z(x,y).

Если помимо напряжения смещения V на иглу подавать синусоидальное напряжение Умод =V0sincot, амплитудой обычно несколько десятков милливольт, можно измерять распределение dI/dV(x,y), пропорциональное, локальной плотности электронных состояний вблизи уровня Ферми.

Иглы для СТМ изготавливают из вольфрама, а также платины, иридия и их сплавов. Для этого можно использовать электрохимическое травление. Технически более простым способом получения игл является срезание проволоки ножницами под углом 45-60°. При этом процесс формирования острия становится случайным, но, как показывает практика, такие иглы часто не уступают изготовленным по более сложным технологиям.

1.1.2 Атомно-силовая микроскопия

В основе работы атомно-силового микроскопа (АСМ) лежит измерение силы взаимодействия между точечным острием и исследуемой поверхностью [2]. Кристаллическое острие (зонд) прикрепляют к кремниевой пластинке (кантилеверу, или просто леверу). Связь между отклонением пластины Az в плоскости, перпендикулярной образцу, и силой взаимодействия между зондом и образцом F приближенно описывается законом Гука Кн;гтки* Д/, где кн - константа жесткости кантилевера, характеризующая изгиб в плоскости, перпендикулярной образцу. Для измерения величины отклонения Az первоначально применялся туннельный датчик [2]. В настоящее время в коммерческих АСМ используется более надежное оптическое детектирование [8]. На конец кантилевера, покрытого отражающим материалом, например пленкой золота, направляют луч лазера, который после отражения попадает на фотодетектор, регистрирующий смещение луча (рис. 2) и состоящий из четырех сегментов. Он позволяет измерять не только вертикальное отклонение кантилевера (А-В), пропорциональное нормальной составляющей силы взаимодействия, но и горизонтальное (C-D), пропорциональное тангенциальной составляющей.

Сегменты фотодетектора

ACM

Кантилевер

Рис. 2. Регистрация сигналов в различных режимах работы АСМ. А - суммарный сигнал двух верхних сегментов, В - суммарный сигнал двух нижних сегментов, С - суммарный сигнал двух левых сегментов, D - суммарный сигнал двух правых сегментов.

Вертикальное отклонение кантилевера пропорционально нормальной составляющей силы FH, действующей на кантилевер, т.е. FH ~ А-В,

Горизонтальное отклонение кантилевера пропорционально тангенциальной составляющей силы FTp., действующей на кантилевер, т.е. Fip. ~C-D. Измерения можно проводить в режиме топографии и отклонения атомно-силовой микроскопии (АСМ) и режиме измерения сил трения в фрикционно-силовой микроскопии (ФСМ).

АСМ - атомно-силовая микроскопия (режим топографии, отклонения). ФСМ - фрикционная силовая микроскопия (фрикционный режим).

Основными требованиями к зонду являются острота (идеальным было бы острие, имеющее на конце один единственный атом), прочность, химическая инертность, низкая адгезия к исследуемым материалам. Одними из используемых материалов являются кремний и нитрид кремния Si3N4.

Когда острие приближается к поверхности, между ними возникает взаимодействие, и кантилевер отклоняется, что регистрируется фотодетектором. Сила взаимодействия зонд/образец зависит от свойств поверхности образца и расстояния зонд/образец. Пьезокерамическая трубка осуществляет сканирование образца в двух взаимно перпендикулярных направлениях в плоскости образца с заданным шагом и перемещение образца по третьей координате. При этом в каждой точке производится измерение отклонения кантилевера.

В зависимости от того, является ли контакт между зондом и образцом постоянным или прерывистым, различают режим постоянного контакта и прерывистого контакта, или "тэппинг" моду (tapping mode).

В контактном режиме зонд находится в постоянном контакте с образцом, повторяя при движении рельеф исследуемой поверхности. В зависимости от того, какой сигнал регистрируется при сканировании образца, различают режим отклонения ("deflection"), режим постоянной силы и фрикционный режим.

В режиме отклонения регистрируется величина вертикального отклонения кантилевера. Этот режим позволяет четко видеть контуры и различать мелкие детали, так как их не отслеживает обратная связь. Однако он не дает четкого представления о реальной высоте объектов. Наибольшую информацию дает сопоставление изображений, полученных в режиме постоянной силы и отклонения.

В режиме постоянной силы система обратной связи поддерживает постоянным вертикальное отклонение кантилевера (разностный сигнал А-В), а значит и сила взаимодействия зонд/образец остается постоянной. Таким образом, при сканировании острие описывает контуры исследуемой поверхности, а по данным сигнала обратной связи компьютер восстанавливает исходную топографию.

Если направление строчной развертки перпендикулярно продольной оси кантилевера, то при сканировании можно вместо вертикального отклонения регистрировать его торсионное (крутильное) смещение (разностный сигнал C-D на рис. 2), пропорциональное силе трения между зондом и исследуемой поверхностью F ч = к х * а, где к т - константа торсионной жесткости, а а - угол поворота кантилеверс

относительно собственной ос