Взаимодействие алкилоксибензолов - ауторегуляторных d1-факторов микроорганизмов с ДНК

Давыдова, Ольга Константиновна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Взаимодействие алкилоксибензолов - ауторегуляторных d1-факторов микроорганизмов с ДНК
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие алкилоксибензолов - ауторегуляторных d1-факторов микроорганизмов с ДНК"

На правах рукописи

Давыдова Ольга Константиновна

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АЛКИЛОКСИБЕНЗОЛОВ-АУТОРЕГУЛЯТОРИЫХ ^-ФАКТОРОВ МИКРООРГАНИЗМОВ С ДНК

03.00.07 - Микробиология 03.00,04 - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов - 2006

Работа выполнена на кафедре микробиологии и

в Центре коллективного пользования Института микро- и нанотехнологий ГОУ ВПО «Оренбургский государственный университет»

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Дерябин Дмитрий Геннадьевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Тихомирова Елена Ивановна

доктор химических наук, профессор Щёголев Сергей Юрьевич

Ведущая организация: Казанский государственный университет

им. В.И. Ульянова-Ленина

Зашита диссертации состоится «20» декабря 2006 года в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 002.146.01 в Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН по адресу: 410049, г. Саратов, пр. Энтузиастов, 13.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН. Электронный вариант автореферата размещён на сайте http://vvww.ibpprn.saratov.ru

Автореферат разослан «18» ноября 2006 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 002:146.01, доктор биологических наук

В.Е.Никитина

Актуальность темы исследования

Ауторегуляторные d г факторы микроорганизмов, по своей химической природе относящиеся к производным алкилоксибензолов (АОБ), в последние десятилетия стали предметом интенсивного изучения (Демкина Е.В., Сонна B.C., Эль-Регистан Г.И., 2000, Мулюкин А.Л. и др., 2005).

Первым из выявленных механизмов влияния АОБ на метаболическую активность и физиологическое состояние бактериальных клеток стало их взаимодействие с мембранными липидамн (Эль-Регистан Г.И. и др., 1979, Reusch R.N., Sadoff H.L., 1983), следствием чего является увеличение микровязкости цито плазматической мембраны, изменение её проницаемости для моновалентных ионов и следующее за этим обезвоживание клетки (Капрельянц A.C. и др., 1985). Эффект взаимодействия АОБ с ферментными белками (Беспалов М.М. и др., 2000) проявляется в изменении скорости катализа с одновременным существенным повышением устойчивости белковых глобул к различным экстремальным воздействиям (Колпаков А.И., 2000). На клеточном уровне результатом взаимодействия АОБ с биополимерами и надмолекулярными структурами является контроль обменных процессов, включая выраженное ингибирование метаболизма и образование цистоподобных покоящихся форм микроорганизмов (Эль-Регистан Г.И. и др., 1979), характеризующихся повышенной резистентностью к различным стрессорным воздействиям (Пронин С.В. и др., 1982, Демкина Е.В. и др., 2000).

В то же время, как формирование анабиотического состояния, так и повышение стрессоустойчивости клеток, предполагают стабилизацию основного носителя генетической информации — ДНК - с приобретением ей устойчивости к повреждающему воздействию широкого спектра абиотических и биотических факторов (Setlow Р., 1995, Azam Т.А. et al„ 1999). При этом АОБ в силу особенностей своего химического строения являются одними из достаточно вероятных кандидатов на эту роль.

Однако, имеющиеся данные как о возможности взаимодействия АОБ с ДНК, так и о результатах подобного контакта до настоящего времени немногочисленны, а иногда и противоречивы. С одной стороны, описан повреждающий эффект АОБ на ДНК, включающий Си(Н)-зависимое расщепление ДНК с ингибированием её репарации (Starck S.R., Deng J.Z., Hecht S.M., 2000), а также мутагенное действие АОБ на клетки про- и эукариот (Маргулис А.Б. и др., 2005). С другой стороны, хорошо документированным является антимутагенное действие АОБ (Gasiorowski К., Brocos В., 2001), а также связываемый с их воздействием эффект компактизации нукпеоида в покоящихся бактериальных клетках (Мулюкин A.JI. и др., 2005), сопровождающийся изменением эластовязкости ДНК.

В пользу актуальности исследования взаимодействия АОБ с ДНК говорят и перспективы применения полученных результатов для совершенствования методов направленного воздействия на метаболические процессы в бактериальных клетках и их генетический аппарат. Кроме того, актуальным представляется и исследование процессов формирования функциональных надмолекулярных структур на основе ДНК и АОБ, потенциально востребованных в таких перспективных областях как биотехнология и биоинженерия.

Цель работы — исследование взаимодействия алкилоксибензолов — химических аналогов ауторегуляторных <1,-факторов микроорганизмов с ДНК, а также оценка последствий подобного взаимодействия.

Задачи исследования:

1. Изучить возможность прямого взаимодействия алк и л оксибе нзол ов -химических аналогов ауторегуляторных с1,-факторов микроорганизмов, различающихся строением и биологической активностью, с ДНК.

2. Визуализировать результат взаимодействия структурно различных АОБ с ДНК.

3. Определить конформационное состояние ДНК в присутствии структурно различающихся АОБ при изменении относительной влажности.

4. Исследовать влияние АОБ на чувствительность ДНК к экстремальным факторам (температура, У Ф-облучение), а также динамику изменения физико-химических свойств ДНК в водных растворах в присутствии АОБ.

Научная новизна

На основании анализа ряда физико-химических характеристик ДНК в присутствии синтетических аналогов ауторегуляторных с5|-факторов микроорганизмов впервые установлен факт прямого взаимодействия между этими молекулами, что расширяет список биополимеров бактериальной клетки, способных устанавливать контакт с АОБ.

Изучение флуоресцентных характеристик структурно различных АОБ в присутствии ДНК, а также поведения флуоресцентного зонда пирека в смесях ДНК-АОБ показали, что взаимодействие между данными молекулами может вести к формированию вокруг ДНК гидрофобного окружения. Впервые показано, что в результате взаимодействия одного из наиболее биологически активных АОБ — гекс ил резорцина - на ДНК формируются устойчивые мииеллоподобные наноструктуры. При этом развивающееся во времени увеличение подобных образований и их слияние в более крупные агрегаты соответствует картине компактизации нуклеоида бактериальной клетки при воздействии АОБ.

Установлено влияние химических аналогов ауторегуляторных с!г факторов микроорганизмов на конформационную подвижность ДНК при уменьшении относительной влажности, результатом которого является замедление В—>■ А-перехода в присутствии метил резорцина и его ускорение в присутствии тирозола и гекс ил резорцина, что может быть одной из причин метаболической инертности ДНК в покоящихся клетках микроорганизмов.

Выявлено повышение температуры плавления ДНК в присутствии АОБ, а также защитное действие последних на линейные и кольцевые молекулы ДНК при УФ-облучении, что является экспериментальным объяснением высокой УФ-и терморезистентности покоящихся форм микроорганизмов, образование которых индуцируется АОБ. Показан факт длительного сохранения вязкостных и электрофоретических свойств полимерных молекул ДНК в водных растворах в присутствии ауторегуляторных (^-факторов, что моделирует процесс консервации генетического материала в цитозоле покоящихся клеток м икроор гаи измов.

Практическая значимость

Полученные результаты, свидетельствующие о формировании вокруг нитей ДНК оболочек из химических аналогов ауторегуляторных с^-факторов микроорганизмов, изолирующих их от водного окружения, потенциально могут быть использованы в нескольких областях современной микробиологии, биохимии и био инженер и и, а именно:

- при разработке методик консервации генетического материала бактериальных клеток, позволяющих сохранять их ДНК в нативных условиях;

- при создании частиц для трансфекции и доставки лекарственных препаратов или плазмидной ДНК в клетки про- и эукариот.

Одной из возможных технологий также является способ получения надмолекулярных композитов из молекул гексилрезорцина и ДНК, характеризующихся их взаимноупорядоченным расположением, на который получено решение о выдаче патента на изобретение по заявке №2005110818/13 от 13.04.2005.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Алкилоксибензолы — химические аналоги ауторегуляторных (1|-факторов микроорганизмов взаимодействуют с ДНК. Это взаимодействие носит различный характер в зависимости от химического строения <1|-факторов, их молярного соотношения с ДНК и времени совместной инкубации. При определённых условиях в присутствии одного из ауторегуляторных с1]-факторов (гексилрезорцина) на нитях ДНК образуются упорядоченные надмолекулярные структуры.

2. Взаимодействие с химическими аналогами ауторегуляторных с1г факторбв влияет на скорость конформационного В—»-А-перехода ДНК при снижении относительной влажности воздуха и оказывает преггективное действие на ДНК, заключающееся в повышении температуры её плавления, защите от УФ-облучения и замедлении гидролитических процессов.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования

Исследования выполнены в рамках ГБ НИР №01200606225 «Влияние ауторегуляторных с1,-факторов бактерий из группы алкилоксибензолов на структуру и функции полимеров», а также при поддержке грантов Минобрнауки РФ №А03-2.12-437 «Влияние органических красителей и ауторегуляторов роста на фоточувствительность бактериальной клетки» и Ха200б-РИ-19.0/001/112 «Создание и исследование наноразмерных структур на поверхности ДНК».

Научные положения диссертации и выводы полностью базируются на результатах собственных исследований автора.

Публикации

Основные результаты изложены в 12 печатных работах, в числе которых 4 статьи в рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК для публикации результатов диссертационных исследований.

Апробация работы

Результаты исследований обсуждались на международной конференции «Молодая наука - XXI веку» (Иваново, 2001); III, VI и VIII международных конференциях «Опто-, наноэлектроника, нанотехнологии и микросистемы» (Ульяновск, 2001, 2004 и 2006), III межрегиональной конференции молодых учёных «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2006), международной конференции «Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» (Москва, 2006).

Структура и объём диссертации

Диссертация состоит из введения, четырёх глав, заключения, списка использованной литературы из 194 источников, включает 127 страниц машинописного текста, в том числе 28 рисунков и 4 таблицы.

Краткая аннотация глав диссертации

Во Введении обосновывается актуальность темы диссертационного исследования, определяются основные задачи и формулируется цель работы, отмечается научная новизна и практическая значимость полученных результатов, приводятся сведения об апробации работы, определяются основные положения диссертации, выносимые на защиту.

В Главе 1 приведен обзор работ, свидетельствующих о существовании у микроорганизмов широкого круга сигнальных молекул (ауторегуляторов), выступающих в качестве факторов межклеточной коммуникации и социального поведения бактериальных популяций. Примером таких веществ являются ауторегуляторные di-факторы микроорганизмов, обладающие функцией индукторов анабиоза. Проведён анализ современных данных, посвященных многообразию, функциям и влиянию ауторегуляторных (^-факторов на субклеточные и молекулярные структуры. Рассмотрен вопрос о механизмах влияния этих сигнальных метаболитов на биохимию и физиологию бактериальных клеток, а также возможность их воздействия на генетический аппарат микроорганизмов.

Во второй части литературного обзора приведены сведения об известных примерах взаимодействия ДНК с низкомолекулярными лигандами, а также проанализированы условия формирования и строение образующихся комплексов макромолекула-лигацд.

На основании представленного обзора сформулирована цель и определен круг задач, решаемых в данной работе.

Материалы и методы

В Главе 2 приведено описание используемых в работе объектов исследования, методик приготовления образцов ДНК+АОБ и методов их исследования.

В первом параграфе представлены структурные формулы используемых химических аналогов ауторегуляторных dj-факторов из группы алкилоксибензолов: метилрезорцина (МР), гексилрезорцина (ГР) и 2-(4-гидроксифенил)этан-1-ала (тирозола - Т).

Использованные образцы ДНК были представлены коммерческим препаратом ДНК фага Д., расщепленной энлонуклеазой Hind III на линейные фрагменты с фиксированной длиной 23130, 9416, 6557, 4361, 2322, 2027, 564 н 125 нуклеотидных пар («Сибэнзим», Россия); препаратом плазмнды pUC19 размером 2686 н.п. («Сибэнзим», Россия), представленной совокупностью кольцевых су перекрученных, кольцевых рел актированных и линеаризованных молекул. При проведении серии экспериментов, требующих большого расхода ДНК, использовали коммерческий препарат высокополимерной линейной ДНК {ICN, США), содержащей пул нерегулярных фрагментов размером от 200 до 25000 н.п.

Во втором параграфе Главы 2 приводятся описание использованных в работе оптических методов: адсорбционной спектрофотометрии (в УФ- и ИК-диапазонах), и флюориметрии. Для измерения спектров поглощения в ультрафиолетовой (УФ) области исследуемых растворов использовался спектрофотометр V-530 («Jasco», Япония), при регистрации спектров люминесценции - спектрофлюориметр FP-750 («Jasco», Япония). При измерении спектров поглощения плёнок ДНК и ДНК с химическими аналогами ауторегуляторных dj-факторов в ИК-диапазоне использовали инфракрасный фурье спектрометр «ИнфраЛЮМ ФТ-02» (НПФ «Люмекс», Россия).

В третьем параграфе описан расчет относительной вязкости для растворов ДНК и ДНК+АОЕ на основании данных, полученных с помощью вискозиметра Уббелоде.

В четвёртом параграфе дано описание метода электрофореза в агарозном геле, который использовался для измерения молекулярной массы комплексов ДНК+АОБ, а также детекции фото повреждений ДНК после УФ-облучения в присутствии ауторегуляторных факторов. Миграцию ДНК оценивали на транс люминаторе (Vi Iber Lourmat, Франция), а полученные цифровые фотографии обрабатывали с использованием программы ImageJ.

В пятом параграфе описаны способы визуализации образующихся структур на ДНК в присутствии АОБ методами атомно-силовой и сканирующей электронной микроскопии. При проведении данного фрагмента работ использован сканирующий зондовый мультимикроскоп СММ-2000, работающий в режиме контактной атомно-силовой микроскопии (АСМ) в воздушной среде. Анализ полученных изображений выполнен с помощью набора инструментов, входящих в состав программного обеспечения микроскопа, представленного программой Scan Master. Изображения микроскопической области топографии поверхности образцов ДНК с АОБ получены в электронном микроскопе J SM-Т20 «Scanning Microscope» (JEOL, Япония) в режиме регистрации тока вторичных электронов.

Результаты и их обсуждение

В Главе 3 приведены результаты исследования взаимодействия АОБ с ДНК оптическими методами (спектрофотометрия в УФ- и ИК-областях и флуоресцентная спектроскопия), а также методами атомно-силовой и электронной микроскопий.

При изучении взаимодействия АОБ с ДНК методом спектрофотометрии в УФ-области возможности разделения полос поглощения растворов ДНК и А ОБ были ограничены расположением их спектральных максимумов (ДНК - 260 нм, МР - 277 нм, ГР - 280 нм и Т - 278 нм) и шириной полос. Спектры поглощения смесей ДНК в присутствии АОБ в основном подчинялись правилу аддитивности спектров поглощения отдельных компонентов непосредственно после смешивания, но проявляли гипохромный эффект после инкубации смесей, возрастающий с увеличением концентрации АОБ (рис. 1). Подобное явление регистрировалось при изучении оптического поглощения смеси ДНК+МР (до 0,10), ДНК+Т (до 0,16) и было наиболее выражено в смесях ДНК+ГР (до 0,31). Гипохромный эффект также нарастал при увеличении концентрации АОБ.

Объяснением наблюдаемых спектральных изменений могут являться эффект экранирования, а также усиление структурированности в поглощающей системе с образованием нековалентных связей между молекулами АОБ и ДНК. При этом вовлеченными в образование таких связей оказываются не только гидроксильные радикалы бензольного кольца АОБ, но и его алкильный радикал, что согласуется с наибольшей выраженностью гипохромного эффекта в присутствии ГР.

Рисунок 1 - Гипохромизм растворов АОБ+ДНК: А — спектры растворов МР+ДНК и ГР+ДНК по сравнению с суммой спектров компонентов, Б -различные концентрации МР, ГР и Т в присутствии ДНК 1(У4: а - 1(Г5М, б-КГ'М, в-/СГ3М.

Изучение физико-химнческих свойств ДНК в присутствии АОБ было продолжено методом флюориметрии, возможность использования которого определялась способностью АОБ к собственной флуоресценции. Длина волны максимума флуоресценции возрастает в ряду метилрезорцин (301 нм) —* тирозол (304 нм) —» гексилрезорцин (312 нм). Указанные различия в длинах волн флюоресценции различных АОБ определяются размерами их ал к ильных радикалов, оказывающих влияние на внутримолекулярное перераспределение электронной плотности.

Зарегистрированные изменения спектральных характеристик АОБ, взаимодействующих с полимерной молекулой ДНК, сводились к

развивающемуся во времени сдвигу максимума флюоресценции ЛОБ в присутствии ДНК в коротковолновую область спектра с одновременным увеличением квантового выхода, что свидетельствует об образовании комплексов ДНК-АОБ. Формирование подобного эффекта оказывалось наиболее выраженным для взаимодействия ДНК с ГР (рис. 2). Следует также отметить, что подобный эффект в наибольшей степени выявлялся при низких и средних значения молярного соотношения ГР:ДНК и нивелировался при высоких концентрациях АОБ, что может объясняться наступающим насыщением сайтов их взаимодействия на ДНК и «перекрытием» спектра комплекса ГР-ДНК спектром флюоресценции избыточного и несвязанного ГР.

Объясняя полученные результаты, следует обратиться к представлениям о том, что спектры испускания многих флуорофоров, особенно содержащих полярные заместители в ароматическом кольце, зависят от свойств микроо кружения. При этом сдвиг максимума флюоресценции в коротковолновую область с увеличением квантового выхода традиционно связывается с уменьшением полярности «ячейки» в которой находится флуорофор. С этих позиций зарегистрированные сдвиги максимума флюоресценции гексилрезорцина в его комплексах с ДНК должны быть интерпретированы как результат частичной дегидратации алкильного радикала АОБ (утрата полярных молекул растворителя — воды) вследствие их взаимодействия с гидрофобными участками ДНК.

Помимо комплексообразования АОБ с участками полимерной молекулы ДНК, представляется вероятным и взаимодействие молекул АОБ между собой с формированием на ДНК надмолекулярных структур. Последнее из высказанных соображений согласуется с присущей молекулам АОБ способностью к м ицеллообраз ован ию.

С целью выяснения деталей взаимодействия ГР с ДНК нами был использован флуоресцентный зонд пирен, спектр испускания которого обладает высокой чувствительностью к гидрофобности микроокружения (рис. За). Полученные с его использованием результаты подтвердили образование мицелл

1200 т

Рисунок 2 - Спектры

флуоресценции ГР ШМ (пунктир) и ГР !ffsM в присутствии ДНК l(f4M на различных сроках инкубации: 1,2,3,4 и 5 - недель соответственно.

ГР в присутствии ДНК при концентрации, меньшей критической концентрации ми ценообразования (ККМ) ГР в водном растворе (рис. 36), что свидетельствует о предпочтительном образовании подобных структур в присутствии ДНК. Обращает на себя внимание и то, что на представленных графиках в отсутствие ДНК в водных растворах ГР не возникает эксимеркого максимума и имеется лишь один участок Б-образного изменения отношения третьей и первой вибронных полос мономерной формы пирена, в то время как в присутствии ДНК таких участков два, что может интерпретироваться как существование двух различных типов комплексов ДНК-ГР.

а б

Рисунок 3 — Спектры флуоресценции пирена в растворах ГР и ГР+ДНК (а), зави сим ость отношения третьей и первой вибронных полос мономерной формы пирена от концентрации ГР в отсутствии и присутствии ДНК (б).

Последующая визуализация процесса комплексообразования ГР с ДНК была проведена с помощью метода АСМ, который позволил установить последовательные этапы формирования мнцеллоподобных надмолекулярных структур на обособленных нитях ДНК.

Контрольные пробы ДНК были представлены линейными фрагментами (рис. 4а), имеющими ширину порядка 30-50 нм, что объясняется эффектом «уширения», зависящим от радиуса кривизны иглы кантилевера. С течением времени (на 2-3 неделе инкубации) в присутствии ГР, на нитях ДНК фиксировалось образование сферических мнцеллоподобных структур диаметром около 200 нм, расположенных по длине данного биополимера на расстоянии от 250 до 500 нм между собой (рис. 46). В то же время ни в контрольных растворах ДНК, ни в растворах ГР образования подобных структур не было выявлено. При дальнейшем увеличении времени инкубации смесей ДНК+ГР до 5-6 недель регистрировалось образование утолщенных разветвлённых структур, как по своей длине, так и по ширине превышающих размеры исходных ДНК-фрагментов, и в точках пересечения объединяющихся описанными выше мицелло подобны ми наноструктурами. При этом последние имели тенденцию к увеличению до 1 мкм в диаметре, а также приобретали отличную от сферической форму, располагаясь вдоль нитей ДНК и на участках их объединения (рис. 4в).

Итогом этого процесса стало формирование в водных растворах ДНК+ГР визуально различимых иглоподобных объектов, изучение которых с помощью сканирующего электронного микроскопа позволило охарактеризовать их как протяженные «кабельные» структуры толщиной 10-100 мкм, состоящие из ряда параллельно ориентированных нитей ДНК, объединенных единым гексилрезорциновым «чехлом». При этом микроскопия концевых участков данных структур выявила картину выхода нитей ДНК из единого надмолекулярного образования.

Наблюдаемая картина взаимодействия ДНК с ГР визуально сходна с явлением компактизации нукпеоида в ни сто подобных покоящихся клетках бактерий, образование которых индуцируется АОБ.

Рисунок 4 — Последовательные этапы формирования мицеллоподобных надмолекулярных структур из ГР на ДНК при различных сроках инкубации: а -интактная ДНК, б — 2-3 недели, в —5-6 недель.

Картину изменений физико-химических свойств ДНК в присутствии АОБ дополняли данные капиллярной вискозиметрии еб растворов. Влияние а кил резорцинов на эту характеристику зафиксировано как умеренное, но достоверное повышение показателя ц, зависещее от химической структуры использованного АОБ, что может рассматриваться как аргумент в пользу образования комплексов между молекулами ДНК и АОБ.

На основании представлений о взаимосвязях в системе «молекулярная масса полимера — вязкость» мы предприняли попытку количественной оценки связывания АОБ с молекулой ДНК с учётом допущения, что изменения вязкостных характеристик ДНК при комплексообразовании с АОБ определяются, в основном, увеличением её молекулярной массы за счет связывания АОБ и не зависят от возможных изменений жесткости данного линейного полимера. Проведенные на этом основании расчеты показали, что средняя молекулярная масса комплексов ДНК-ГР (540б±124 кДа) примерно на 20% превышает молекулярную массу интактного полимера (4465±10б кДа), что соответствует связыванию на фрагменте ДНК длиной 1000 н.п. около полутора тысяч (1492±112) молекул гексилрезорцина.

Сходные результаты получены и при расчете молекулярных масс ДНК и комплексов ДНК-АОБ, основанном на их электрофоретической подвижности в агарозном геле. При этом, начиная с 4-5 недели инкубации было

зарегистрировано выраженное снижение электрофоретической подвижности комплексов ДНК-ГР по сравнению с интактной ДНК, что может быть расценено как возрастание среднего значения их молекулярной массы до 6432±144 кДа против 4217±111 кДа в контроле. В свою очередь основанные на этих различиях расчеты свидетельствовали о том, что на 1000 н.п. в полимерной молекуле ДНК может связываться более полутора тысяч (1670±180) молекул гексилрезоршша. Отметим, что последняя расчетная величина оказалась несколько выше полученной при анализе зависимостей «молекулярная масса полимера — вязкость», что может объясняться ростом количественных показателей связывания гексилрезорцина с ДНК во времени. С другой стороны, в уменьшении электрофоретической подвижности комплексов ДНК-АОБ не может быть исключен и вклад эффекта нейтрализации отрицательного заряда фосфатных групп в молекуле ДНК в результате их экранирования поверхностно связавшимися лигандами, что также может вести к некоторому «завышению» количественных показателей связывания.

С использованием метода ИК~спектроскопии было проанализировано конформациопное состояние ДНК при комплексообразовании с ЛОБ. При этом о конформационном В—»А-переходе ДНК в присутствии АОБ в плёнках при уменьшении относительной влажности (о.в.) воздуха с, 95% до 56% судили по изменению соотношения интенсивностей частот симметричных (1088 см*1) и антисимметричных (1224см'1) колебаний фосфатных групп, а также исчезновению или появлению полос, являющихся маркерами В- или А-формы ДНК.

В случае исследования ИК-спектров интактной ДНК при относительной влажности 95% была зарегистрирована картина, соответствующая В-конформации данной молекулы. В частности, исследуемые образцы характеризовались значением соотношения Ою»>/0]224=1>52, что соответствует нормативному значению этого показателя для В-формы ДНК. В свою очередь, при пошаговом снижении относительной влажности с 95% до 56% в ИК-спектрах наблюдались характерные изменения, заключающиеся в исчезновении маркерных полос В-формы с одновременным (начиная с 75% о.в.) появлением новых полос, являющихся маркерами А-формы ДНК. Одновременно регистрируемые значения соотношения интенсивностей симметричного и антисимметричного колебания фосфатных групп, при значительном сдвиге последнего с 1224 см"1 до 1442 см'1, характеризовались ростом значений до уровня 1,74 (рис. 5), что также свидетельствовало в пользу перехода ДНК в А-форму.

В присутствии МР изменения в ИК-спектрах носили аналогичный характер, но были выражены в меньшей степени. Одним из проявлений этого было сохранение значения соотношения интенсивностей симметричного и антисимметричного колебания фосфатных групп в диапазоне 1,38-1,57, характерном для В-конформации данного биополимера (рис. 5). В пользу сохранения высокой степени гидратированности ДНК дополнительно свидетельствует и значительно меньший сдвиг антисимметричного колебания фосфатной группы (с 1226 до 1233 см"1) против аналогичного сдвига в интактной ДНК с 1224 см"' до 1442 см"1.

Принципиально иные результаты зарегистрированы в ИК-спектрах ДНК в присутствии Т. Снижение значений о.в. вело к быстрому исчезновению маркерных полос В-формы с одновременным появлением полос с максимумами 864 и 1185 см"1, являющихся маркерами А-формы ДНК. Дополнительные изменения в ИК-спектрах ДНК в присутствии Т заключались в существенном сдвиге антисимметричного колебания фосфатной группы с 1229 до 1243 см'1. В свою очередь соотношение интенсив и остей частот симметричного и антисимметричного колебаний фосфатных групп в присутствии Т достоверно превышало таковое у интактной ДНК уже при 95% о.в. (рис. 5), а в дальнейшем прогрессивно увеличивалось, достигая при 66% о.в. значения 1,8, характерного для А-формы.

Рисунок 5 — Изменение соотношения интен сивностей частот симметричных и антисимметричных колебаний фосфатных групп О¡0x^0)224 для плёнок ДНК и ДНК в присутствии АОБ в зависимости от о.в.

558066 70 75 80 6580 Я5ОВ' %

На этом фоне влияние ГР на конформационные переходы в молекуле ДНК были выражены в несколько меньшей степени и в целом соответствовали изменениям, регистрируемым при ступенчатом понижении о.в. для интактной молекулы ДНК. Зарегистрированные же различия свидетельствовали о стимуляции В—<►А перехода в молекулах ДНК в присутствии данного с!|-фактора при о.в. <66% (рис. 5).

В качестве возможных механизмов влияния АОБ на конформационное состояние ДНК при различных значениях о.в. следует указать как замещение молекул воды гидроксильными радикалами (в случае МР и Т), так и изоляцию ДНК от водного окружения (в случае ГР). Биологическое же значение влияния АОБ на интенсивность В-+А перехода хорошо согласуется с представлениями о том, что в вегетативных бактериальных клетках ДНК находится в В-форме, а в покоящихся принимает А-форму.

В Главе 4 представлены результаты исследований некоторых физико-химических свойств комплексов ДНК+АОБ при воздействии повышенной температуры, УФ-облучения, а также при их длительном нахождении в водных растворах, что моделирует состояние генетического материала в покоящихся формах микроорганизмов, а также его устойчивость к воздействию некоторых абиотических факторов среды обитания.

1,8

Изучение процесса термической денатурации ДНК, проводимое на основе измерения значений поглощения растворов данной молекулы при 260 нм, позволило зарегистрировать типичные кривые плавления, возникающие в результате нарушения стекинга оснований между взаимнокомплементарными нитями и переходом «спираль —* клубок» с формированием гиперхромного эффекта. Соответствующий прирост оптической плотности характеризовался величиной (¿Н) — 0,37, а прочими зарегистрированными параметрами являлись температуры начала и окончания плавления (ТНП=41°С, Топ=69°С), ограничивающие диапазон плавления (ДТ) равный 27°С.

На этом фоне наиболее общим результатом, регистрируемым в смесях ДНК+АОБ, стал сдвиг кривых плавления в сторону более высоких температур, наиболее выраженный при использовании максимальных концентраций АОБ и проявляющийся в увеличении значений точки начала плавления (Тщ,) в среднем на 4-5 °С, а точки окончания плавления (Топ) на 1-3°С, с соответствующим уменьшением диапазона плавления. В наибольшей степени подобные изменения были выражены в вариантах комплексообразования ДНК с ГР, затрагивали единичные параметры плавления при использовании Т и были статистически незначимы в случае МР.

Концентрационные зависимости формирования тугоплавкости комплексов АОБ+ДНК продемонстрированы на примере ГР на рис. 6А. При этом каждое увеличение концентрации ГР на порядок вело к росту значений Тщ, на 2-3°С, так что ее величина при соотношении ГР:ДНК (по нуклеотидам) 10:1 составила 4б°С. Дополнительной особенностью выявленных концентрационных зависимостей стало снижение выраженности гиперхромного эффекта при увеличении концентрации ГР, в случае использования его максимальной концентрации составившего около половины от контрольных значений (ДН=0,18). При обсуждении природы указанного явления следует упомянуть описанные выше экранировочные эффекты АОБ в отношении ДНК, а также возможность формирования между ними межмолекулярных взаимодействий, лежащих как в основе гипохромности смесей ДНК+АОБ, так и проявляющихся в снижении гиперхромного эффекта при термической денатурации.

Увеличение срока взаимодействия АОБ-ДНК вело к еще большему росту тугоплавкости подобных комплексов (рис. 6Б), вновь преимущественно проявляющемуся в изменении начальных участков кривых плавления и сопровождающемуся соответствующим уменьшением диапазона плавления. В частности, после 4 недель инкубации смесей ДНК+ГР в соотношении 1:1 значения Т„„ возросли до 67°С, Топ=83<,С, а величина ДТ сократилась до 16°С. Учитывая же, что процесс тепловой денатурации ДНК начинается с участков, богатых АТ-парами, полученные результаты позволяют предположить сайт-специфическое (зависящее от нуклеотидной последовательности) связывание АОБ с полимерной молекулой ДНК. Однако, подобная специфичность имела лишь относительный характер и нивелировалась при увеличении концентрации АОБ или времени контакта ДНК с АОБ.

Таким образом, в присутствии АОБ зарегистрирован зависящий от особенностей их химического строения, используемой концентрации и развивающийся во времени сдвиг кривых плавления ДНК в сторону высоких

температур. При этом, с одной стороны, полученные результаты являются еще одним аргументом в пользу развивающегося во времени формирования устойчивых комплексов данных молекул. С другой стороны факт тугоплавкости комплексов ДНК+АОБ хорошо согласуется с ранее полученными данными о протекторных функциях АОБ, заключающихся в высокой терморезистентности цистоподобных покоящихся форм микроорганизмов, образование которых индуцируется АОБ.

Рисунок 6 — Кривые плавления ДНК в зависимости от концентрации АОБ (А) а—ДНК, при соотношении ГР.ДНК (по нуклеотидам): б — 1:10, в — 1:1, г — 10:1 и от времени прединкубации с АОБ (Б), 1,2,3,4 и $ — недель, соответственно.

Другим абиотическим фактором среды обитания, исследованным при выполнении настоящей работы, явилось ультрафиолетовое (УФ) облучение. При этом значимость устойчивости к подобному воздействию, потенциально важной для длительного сохранения бактериальных клеток в покоящемся состоянии, определяется также и тем, что основной мишенью для УФ-излучения является именно ДНК, интенсивно поглощающая в данном диапазоне длин волн.

При выполнении данного фрагмента исследования было проанализировано воздействие УФ-облу чения на линейные HindlII-рестрикты ДНК фага Л в присутствии ауторегуляторных di-фа кторов микроорганизмов, оцененное по результатам их электрофореза в агарозном геле. При этом интактные образцы ДНК формировали шесть четко обособленных полос, каждая из которых содержала фрагменты с определенной молекулярной массой от 23130 до 564 н.п. В свою очередь УФ-облучение увеличивающейся экспозиции вело к прогрессирующему снижению интенсивности каждой из данных полос, замещающихся единым «треком» из фрагментов вариабельной молекулярной массы с повышенной электрофоретической подвижностью, так что после 3 часов подобного воздействия при электрофорезе выявлялся только «трек» в отсутствие какой-либо из типичных полос (рис. 7). Непосредственной причиной регистрируемого явления являлись УФ-индуцированные двунитевые разрывы ДНК с распадом каждого из фрагментов на две или более нерегулярных по размеру части.

2 3 4 5 6

Рисунок 7 — Электрофоретическая подвижность НтШП-рестриктов ДНК фага X после УФ-облучения.

Слева - результаты электрофореза: 1 — контроль; 2 — после УФ-облучения в течение 3-х часов; 3 - то же в присутствии МР в концентрации 1(Г4М; 4 - то же в присутствии МР в концентрации 10'3М; 5 — то же в присутствии ГР в концентрации Ю4М; б — то же в присутствии ГР в концентрации ! 0~3М. Справа — профили электрофоретической подвижности: по оси абсцисс — расстояние от старта; по оси ординат - интенсивность (!) полос, отн. ед.

Инкубация ДНК с АОБ на ранних сроках (с 1-ой недели контакта) не приводила к изменению ее исходной электрофоретической подвижности, но существенно сказывалась на чувствительности данной макромолекулы к УФ-облучению. При этом регистрируемые эффекты сводились к формированию различных степеней УФ-резистентности комплексов ДНК+АОБ, зависящих как от используемой концентрации последних, так и от особенностей их химического строения. В частности, использование МР в концентрации Ю^М еще не вело к формированию защитного эффекта, тогда как повышение содержания данного вещества в облучаемых пробах до 10'3М на фоне общего «трека» позволяло зафиксировать максимумы с молекулярными массами, типичными для Шп(Ш1-рестриктов ДНК фага X. При этом в присутствии последней концентрации МР после 3-часового УФ-облучения сохранялось до 62,3±3,0% исходных линейных фрагментов ДНК. В свою очередь комплексы ДНК с ГР характеризовались еще более выраженной устойчивостью к УФ-облучению, что проявлялось в формировании заметного уровня защиты при концентрации действующего фактора Ю^М, а использование ГР в концентрации 10°М позволяло сохранять уже до 82,1 ±4,7% исходных фрагментов ДНК (рис.7).

Сходные результаты были получены и при исследовании воздействия УФ-облучения на высокополимерную линейную ДНК. При этом существовала необходимость более продолжительной инкубации смесей ДНК+АОБ, ведущей к

формированию УФ-резистентности, а также к снижению электрофоретической подвижности образующихся комплексов.

Некоторые особенности были зарегистрированы и при изучении воздействия УФ-облучения на плазмиду р11С19, представленную тремя конформанионным и вариантами, отличающимися по своей эле ктрофоретич ее ко й подвижности. Измерение относительной интенсивности данных полос позволило констатировать, что наиболее активно мигрирующая в агарозном геле су перс крученная форма плазмиды (полоса I) составляла до 56% ее абсолютного количества в составе использованного препарата, а наиболее близкая к старту кольцевая релаксированная форма (полоса III) и линеаризованная форма (полоса II) с мол. весом 2686 н.п. (рис. 8), характеризовались значениями 12% и 32% соответственно.

1 2 3 4 5 6

пьМыМ

1УЧ '' а V'. I- «I

п ^ушцУУ

^ 'Лгт^РГ^

I и!' I^-г

Рисунок 8 — Электрофоретическая подвижность плазмиды р11С19 в присутствии АОБ после 3 часов УФ-облучения.

Слева—результаты электрофореза: 1 — контроль; 2 —после 3 часов облучения; 3 — то же в присутствии МР в концентрации ¡ОГ'М; 4 — МР в концентрации¡(X 3М; 5 - то же в присутствии ГР в концентрации 1(Х4М; 6 - то же в присутствии ГР в концентрации Ш3М.

УФ-облучение оказывало на электрофоретические свойства плазмиды рис 19 комплексное влияние, проявляющееся в исчезновении типичных полос или изменении их относительной интенсивности, а также появлении полос с аномальной электрофоретической подвижностью. При этом последовательность происходящих событий была связана с исчезновением типичной полосы 1, что сопровождалось временным усилением интенсивности полосы III и являлось результатом перехода кольцевой су перс крученной формы плазмиды в кольцевую релакенрованную. Второй эффект был связан с нарастающим

Таблица I — Относительное содержание ДНК в

составе полос 1-1V,

Обра 31Ш Содерж ание ДНК.% в том числе в составе полос, %

1 II III IV

I 100 55.7±4,3 31,2±2,7 13,1 ±2.6 0

2 39,9*4,1 0 38,3±2,9 0 1,6*1,1

3 53,7*5,5 0 «,2 ±3.0 1,9 ±0,9 6.6*1,9

4 77,2±4,б 5,4*1.1 «,0*3,0 18,8*1,9 7,0*1,6

1 58,6*5,7 0 45,5±3,4 6,1*1.1 7.0*2,0

6 84,0*6,1 10,0*1,7 47,1 ±3,4 19,9*2.4 7,0*1,9

увеличением интенсивности полосы И, что интерпретируется как результат перехода замкнутых молекул плазмидной ДНК в линеаризованную форму в результате формирования на каждой из них по одному двунитевому разрыву. Третий эффект заключался в появлении новой полосы IV с аномальной (пониженной) электрофоретической подвижностью, что предположительно может быть обусловлено формированием поперечных сшивок между отдельными линейными молекулами ДНК в результате УФ-облучения. Аргументом в пользу последнего предположения является расчетный размер ДНК, формирующей полосу IV, и соответствующий удвоенному значению размера исходной линеаризованной плазмиды pUC19 (около 5400 н.п.). Дальнейшее же увеличение дозы УФ-облучения вновь сопровождалось глубокой деградацией ДНК, что при электрофорезе проявлялось в исчезновении полос I, III и IV с формированием единого «трека» из линейных фрагментов вариабельной молекулярной массы. При этом общее количество электрофоретически выявляемой ДНК после 3-часового УФ-облучения составило 39,9±4,1% от ее исходного содержания в пробе.

Инкубация ппазмиды pUC19 в присутствии АОБ принципиально не изменяла последовательности исчезновения типичных полос или образования полос с аномальной электрофоретической подвижностью при УФ-облучении, но уже с первой недели контакта существенно предупреждала появление подобных эффектов, а также возможность глубокой деградации ДНК (рис. 8). Использование концентраций АОБ Ю^М после 3-часового УФ-воздействия позволяло сохранять преимущественно линеаризованную ДНК, присутствующую в составе полос II и IV, где ее общее содержание оказывалось в 1,38-1,53 раза выше аналогичных величин в УФ-облученных пробах интактной ДНК. На этом фоне повышение действующих концентраций АОБ до 10"3М позволяло сохранить и некоторое количество кольцевых форм ппазмиды pUC19, изначально преобладающих в ее контрольных образцах. В наименьшей степени это было возможно в отношении суперскрученной конформации полосы I, содержание ДНК в которой после 3-часового УФ-облучения составило только 5,4±1,1% от ее исходного количества при использовании МР и Ю,0±1,7% при использовании ГР. С другой стороны, относительное количество релаксированной кольцевой формы ДНК полосы III в присутствии МР было в 1,41, а в присутствии ГР даже в 1,66 раза больше ее содержания в контрольных образцах. Последний факт может быть интерпретирован как предупреждение двухцепочечных разрывов кольцевой ДНК при УФ-облучении, в этих условиях преимущественно перешедшей из суперскрученной в релаксированную форму. В целом же инкубация ДНК плазмиды pUC19 с АОБ в концентрации 10"5М после 3-часового УФ-облучения позволяла сохранять до 77,2±4,6% от исходного содержания ДНК при использовании МР и до 84,0±б,1% при использовании ГР, что в 1,95 и в 2,11 раза превышало аналогичные значения в УФ-облученных пробах интактной ДНК (рис. 8).

Таким образом, в присутствии АОБ различные по происхождению и конформации ДНК характеризуются повышенным уровнем устойчивости к УФ-облучению, что проявляется в предупреждении их глубокой деградации при подобном воздействии. Наиболее общими закономерностями в этом случае

являются дозозависимый характер действия ЛОБ и связь выраженности регистрируемых эффектов с особенностями их химической структуры. В качестве же возможных механизмов протекторного действия АО Б следует назвать возможность «экранирования» молекулы ДНК с поглощением излучения УФ-диапазона, что является общим свойством МР и ГР, а также влияние последнего на интенсивность В—+А перехода в молекуле ДНК (см. выше), что согласуется с представлениями о большей устойчивости А-форм ДНК к УФ-облученню.

На завершающем этапе исследования нами были проанализированы некоторые физико-химические свойства ДНК и комплексов ДНК+АОБ при их длительной инкубации в водных растворах. Происходящие в этих условиях процессы традиционно связываются с возможностью спонтанно протекающего энергонезависимого гидролиза фосфодиэфирных связей в сахарофосфатном остове ДНК. Постепенное накопление однонитевых разрывов, расположенных на расстоянии нескольких нуклеотидных пар друг от друга, ведет к распаду биополимера на короткоцепочечные фрагменты.

Подтверждением этого явились и полученные нами данные о вязкостных свойствах и электрофоретической подвижности линейных фрагментов ДНК при их 8-недельной инкубации в водном растворе при 4*С, В частности, если к началу эксперимента величина относительной вязкости ДНК равнялась 10,13±0,18, что соответствовало средней длине составляющих ее фрагментов порядка 12011±217 н.п., то к его концу эта величина снижалась до 3,1±0,14, что свидетельствовало об уменьшении среднего размера фрагментов до 2017±88 н.п. Параллельно проведенное изучение электрофоретической подвижности ДНК на разных этапах инкубации в водном растворе также позволило подтвердить происходящее при этом уменьшение относительного содержания в образце длинноце почечных фрагментов с одновременным увеличением короткоцепочечных, проявлением чего являлось прогрессирующее повышение их электрофоретической подвижности (и3ф). При этом средняя расчетная длина фрагментов ДНК снижалась с 11370±250 н.п. в начале эксперимента до 9300±211 н.п. к 4-й неделе и до 8123±189 н.п. к 8-й неделе инкубации, что еще раз подтверждает выдвинутое выше предположение о характере деградации данного биополимера с образованием в его молекуле одно- и двунитевых разрывов.

На этом фоне использованные химические аналоги микробных с!р факторов оказывали на ДНК стабилизирующее действие, заключающееся в сохранении исследуемых физико-химических характеристик. При этом выраженность подобного эффекта вновь зависела от дозы и особенностей химического строения алкилоксибензолов, среди которых наибольшую активность демонстрировал ГР. В частности, к 8-й неделе контакта величина относительной вязкости смеси ДНК+ГР равнялась б,81±0,17, что соответствовало средней длине находящихся в ней фрагментов ДНК порядка 6588±1б4 н.п. и более чем в 3 раза превышало указанную выше аналогичную величину, определенную для контрольного раствора ДНК. Более высокая сохранность ДНК в присутствии ГР была подтверждена и электрофоретическим методом: так, если в контрольном растворе доля дпинноцепочечных фрагментов больше 4361 н.п. в процессе инкубации прогрессивно убывала с 57% до 43%, то

в присутствии ГР она достоверно не изменялась, в результате чего в опытных пробах по-прежнему доминировали длинноиепочечные фрагменты.

По результатам вискозиметрии ДНК в комплексах с МР и Т описанный выше эффект был выражен в меньшей степени и проявлялся только при использовании их высоких концентраций, в то время как электрофоретическое исследование не выявило достоверных признаков предупреждения деградации ДНК при использовании названных АОБ.

п и»

Рисунок 9 — Динамика изменения вязкостных (а) и эяектрофоретических (б) свойств ДИК (1), ДНК+МР(2), ДНК+ГР(3), ДНК+Т(4) при молярном соотношении ¡0:1.

Таким образом, полученные результаты позволяют констатировать, что интенсивность выявленного стабилизирующего эффекта АОБ зависит от их химического строения, в частности - длины алкильных радикалов, формирующих гидрофобные полюса этих молекул. Соответственно, оказывается не лишенным оснований и предположение о значении для развития консервирующего эффекта прямого пространственного контакта между молекулами АОБ, ведущего к формированию на данном биополимере мицеллоподобных структур. Обеспечиваемая этим изоляция молекулы ДНК от водного окружения может являться основной причиной, предотвращающей возможность гидролиза сахарофосфатного остова данного биополимера в процессе его длительного хранения в водных растворах.

В целом, полученные данные хорошо согласуются с представлениями об интегральных результатах биологических эффектов АОБ в отношении бактериальных клеток при образовании метаболически инертных, устойчивых к воздействию внешних факторов и длительно сохраняющихся цистоподобных покоящихся форм. При этом длительная консервация ДНК в присутствии АОБ представляется ещё одним из необходимых условий для сохранения бактериальной клетки в покоящемся состоянии.

Основные выявленные нами эффекты, обнаруживаемые при взаимодействии ДНК с АОБ и возможные объяснения их возникновения обобщены в табл. 2.

Регистрируемые эффекты Причины их возникновения

Гипо.хромизм смеси АОБ-ДНК Взаимодействие гидроксильных радикалов АОБ и ДНК с образованием водородных связей; экранирующие эффекты

Сдвиг максимума флюоресценции АОБ в сторону коротких длин волн Переход алкильных радикалов АОБ в гидрофобное окружение

Эксимеризация пире на в растворе ГР+ДНК при концентрациях меньше ККМ Образование мицеллоподобных структур на нитях ДНК

Изменение скорости конформационного В-+А-перехода ДНК Изоляция ДИК от водного окружения

Повышение температуры плавления ДНК в присутствии АОБ Стабилизация нити ДНК при связывании с молекулами АОБ

Зашита ДНК от УФ-облучения Экранирующие эффекты; изменение конформации ДНК под действием АОБ (В->А-переход ДНК)

Длительное сохранение вязкости и элекгрофоретической подвижности комплексов ДНК+АОБ в водных растворах Изоляция ДНК от водного окружения

Выводы:

1. Показано прямое взаимодействие алк илоксибензо лов - химических аналогов ауторегуляторных ^-факторов микроорганизмов с ДНК, результат которого зависит от их химической структуры и используемой концентрации и проявляется в изменении комплекса физико-химических свойств данного биополимера.

2. Установлен факт агрегации молекул гексилрезорцина вокруг нитей ДНК, регистрируемый при концентрациях ниже его критической концентрации мицеллообразования и ведущий к формированию вокруг ДНК гидрофобного окружения.

3. Визуализированы надмолекулярные образования, формирующиеся на нитях ДНК в присутствии гексилрезорцина и исследована динамика их роста, согласующаяся с процессом компактизации нуклеоида в покоящихся клетках микроорганизмов, образование которых инициируется АОБ.

4. Выявлено влияние алкилоксибензолов различной структуры на конформационный В-+А-переход в молекулах ДНК при уменьшении относительной влажности воздуха, выражающееся в его замедлении в присутствии метнлрезорцина и ускорении в присутствии тирозола и гексилрезорцина, что является одним из объяснений биологической инертности ДНК в покоящихся клетках микроорганизмов.

5. Зафиксировано увеличение температуры плавления ДНК в присутствии химических аналогов ауторегуляторных (3 ¡-факторов, что является одним из механизмов формирования высокого уровня терморезистентности покоящихся клеток микроорганизмов

6. Обнаружен эффект защиты линейных и кольцевых молекул ДНК от повреждающего действия УФ-излучения в присутствии химических аналогов ауторегуляторных с1]-факторов микроорганизмов.

7. Показано длительное сохранение физико-химических свойств ДНК в водных растворах в присутствии алкилоксибензолов, моделирующее консервацию генетического материала бактериальных клеток при переходе в покоящееся состояние.

Автор благодарит сотрудников ИНМИ РАН (г. Москва) проф. Эль-Регистам Г.И. и Николаева Ю.А. за предоставление ауторегуляторных dr факторов и обсуждение материалов работы, проректора по научной работе и инновационной деятельности ГОУ ОРУ, проф. Летуту С.Н. и проф. Кецле Г.А. за ценные замечания и внимание к работе; сотрудников ЦКП ИМНТ ГОУ ОГУ Пашкевича С.Н., Лантуха Ю.Д. и Алиджанова Э.К. за возможность использования экспериментального оборудования и участие в обсуждении результатов и, отдельно, Никияна А.Н. за практическую помощь в проведении исследований.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Никиян А.Н., Давыдова O.K. Исследование биомолекул методом атомно-силовой микроскопии // Труды международной конференции «Молодая наука —XXI веку». — Иваново, Ивановский гос. ун-т. -2001, —С. 36.

2. Летута С.Н., Никиян А.Н., Давыдова O.K. Синтез наноструктур на поверхности полианионов // Труды III международной конференции «Оптика, оптоэлектроника и технологии». — Ульяновск, Ульяновский гос. ун-т.— 2001, —С. 106-107.

3. Никиян А.Н., Давыдова O.K. Фотоиндуцированные процессы в водных растворах ДНК // Труды VI международной конференции «Опто-, наноэлеюроника, нанотехнологии и микросистемы», — Ульяновск, Ульяновский гос. ун-т. - 2004. - С. 105.

4. Давыдова O.K., Никиян А.Н. Исследование взаимодействия алкилрезорцинов с ДНК методом атомно-силовой микроскопии П Труды VI международной конференции «Опто-, наноалектроника, нанотехнологии и микросистемы». — Ульяновск, Ульяновский гос. ун-т. — 2004. - С. 168.

5. Давыдова O.K., Никиян А.Н. Исследование наноструктур, сформированных из ДНК в присутствии гексилрезорцина // Труды VIII международной конференции «Опто-, наноэлектроника, нанотехнологии и микросистемы». - Ульяновск, Ульяновский гос. ун-т. - 2006. - С. 242.

6. Давыдова O.K., Никиян А.Н., Дерябин Д.Г. Формирование упорядоченных надмолекулярных структур ДНК в водных растворах в присутствии алкилрезорцинов // Вестник Оренбургского государственного университета. —2005. С. 174-177.

7. Давыдова O.K., Дерябин Д.Г., Никиян А.Н., Эль-Регистан Г.И. О механизмах взаимодействия ДНК с химическими аналогами микробных аутоинду кторов анабиоза//Микробиология. — 2005. — Т.74. — JÉ5. — С. 616-625.

8. Давыдова O.K., Дерябин Д.Г. Взаимодействие ауторе1уляторных dt-факторов микроорганизмов (алкилоксибензолов) с ДНК и его последствия // Материалы международной научной конференции «Физиология

микроорганизмов в природных и экспериментальных системах». - Москва, МГУ. -2006.-С. 52.

9. Давыдова O.K., Дерябин Д.Г. Влияние факторов анабиоза микроорганизмов на физико-химические свойства ДНК // Материалы III межрегиональной научной конференции «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой». - Саратов, ИБФРМ РАН. -2006.-С. 31-32.

Ю.Давыдова O.K., Дерябин Д.Г., Эль-Регистан Г.И. Влияние алкипоксибензолов на чувствительность ДНК к УФ-облучению // Микробиология. - 2006. - Т. 75. - Jfe 5. - С. 654-661.

П.Давыдова O.K., Дерябин Д.Г., Эль-Регистан Г.И. Длительное сохранение ДНК в растворе в присутствии алкилоксибензолов // Микробиология. -2006. -Т. 75. — Jvfe 5.-С. 662-669.

12. Дерябин Д.Г., Давыдова O.K. Способ получения надмолекулярных композитов // Решение о выдаче патента на изобретение по заявке Хг 2005110818/13 от 13.04.2005.

Подписано в печать 9.11.2006. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Гарнитура Times. Объем 1,0 леч.л. Тираж ЮОэкз.

Отпечатано с готового оригинал-макета в И ПК Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования ((Оренбургский государственный университет» 460018 г.Оренбург, ГСП пр. Победы, 13

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Давыдова, Ольга Константиновна

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы. Ауторегуляторные dj-факторы микроорганизмов и возможность их воздействия на генетический аппарат бактериальной клетки.

1.1. Многообразие внеклеточных ауторегуляторных di-факторов микроорганизмов и их влияние на бактериальную клетку.

1.2. Основные закономерности взаимодействия низкомолекулярных лигандов с ДНК.

Глава 2. Материалы и методы исследований.

2.1. Объекты исследования. Приготовление образцов.

2.2. Оптические методы.

2.2.1. Измерение спектров поглощения.

2.2.2. Регистрация спектров люминесценции.

2.2.3. Термическая денатурация ДНК и измерение оптической плотности.

2.3. Капиллярная вискозиметрия.

2.4. Электрофорез в агарозном геле.

2.5. Методы микроскопии.

2.5.1. Атомно-силовая микроскопия.

2.5.2. Сканирующая электронная микроскопия.

2.6. Методы статистической обработки результатов.

Глава 3. Доказательства взаимодействия ауторегуляторных с^-факторов с

3.1. Гипохромный эффект при взаимодействии di-факторов с ДНК

3.2. Определение характера взаимодействия di-факторов с ДНК люминесцентным методом.

3.3. Визуализация комплексов ДНК с di-факторами.

3.4. Количественная оценка связывания молекул di-факторов с ДНК.

3.5. Конформационный В—>А-переход молекул ДНК в присутствии di-факторов при изменении относительной влажности.

Глава 4. Устойчивость ДНК к экстремальным воздействиям в присутствии di-факторов.

4.1. Изменение температуры плавления ДНК в присутствии dr факторов.

4.2. Чувствительность ДНК к УФ-облучению в присутствии dr факторов.

4.2.1. Влияние УФ-облучения на линейные молекулы ДНК в присутствии di4>aKTopoB.

4.2.2. Влияние УФ-облучения на кольцевые молекулы ДНК в присутствии dj.факторов.

4.3 Длительное сохранение физико-химических свойств ДНК в присутствии dj. факторов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Взаимодействие алкилоксибензолов - ауторегуляторных d1-факторов микроорганизмов с ДНК"

Общая характеристика работы

Актуальность темы исследования

Ауторегуляторные di-факторы микроорганизмов, по своей химической природе относящиеся к производным алкилоксибензолов (АОБ), в последние десятилетия стали предметом интенсивного изучения (Демкина Е.В., Соина B.C., Эль-Регистан Г.И., 2000, Мулюкин A.JL и др., 2005).

Первым из выявленных механизмов влияния АОБ на метаболическую активность и физиологическое состояние бактериальных клеток стало их взаимодействие с мембранными липидами (Эль-Регистан Г.И. и др., 1979, Reusch R.N., Sadoff H.L., 1983), следствием чего является увеличение микровязкости цитоплазматической мембраны, изменение её проницаемости для моновалентных ионов и следующее за этим обезвоживание клетки (Капрель-янц А.С. и др., 1985). Эффект взаимодействия АОБ с ферментными белками (Беспалов М.М. и др., 2000) проявляется в изменении скорости катализа с одновременным существенным повышением устойчивости белковых глобул к различным экстремальным воздействиям (Колпаков А.И., 2000). На клеточном уровне результатом взаимодействия АОБ с биополимерами и надмолекулярными структурами является контроль обменных процессов, включая выраженное ингибирование метаболизма и образование цистоподобных покоящихся форм микроорганизмов (Эль-Регистан Г.И. и др., 1979), характеризующихся повышенной резистентностью к различным стрессорным воздействиям (Пронин С.В. и др., 1982, Демкина Е.В. и др., 2000).

В то же время, как формирование анабиотического состояния, так и повышение стрессоустойчивости клеток, предполагают стабилизацию основного носителя генетической информации - ДНК - с приобретением ей устойчивости к повреждающему воздействию широкого спектра абиотических и биотических факторов (Setlow Р., 1995, Azam Т.A. et al., 1999). При этом АОБ в силу особенностей своего химического строения являются одними из достаточно вероятных кандидатов на эту роль.

Однако, имеющиеся данные как о возможности взаимодействия АОБ с ДНК, так и о результатах подобного контакта до настоящего времени немногочисленны, а иногда и противоречивы. С одной стороны, описан повреждающий эффект АОБ на ДНК, включающий Си(П)-зависимое расщепление ДНК с ингибированием её репарации (Starck S.R., Deng J.Z., Hecht S.M., 2000), а также мутагенное действие АОБ на клетки про- и эукариот (Маргулис А.Б. и др., 2005). С другой стороны, хорошо документированным является антимутагенное действие АОБ (Gasiorowski К., Brocos В., 2001), а также связываемый с их воздействием эффект компактизации нуклеоида в покоящихся бактериальных клетках (Мулюкин A.J1. и др., 2005), сопровождающийся изменением эла-стовязкости ДНК.

В пользу актуальности исследования взаимодействия АОБ с ДНК говорят и перспективы применения полученных результатов для совершенствования методов направленного воздействия па метаболические процессы в бактериальных клетках и их генетический аппарат. Кроме того, актуальным представляется и исследование процессов формирования функциональных надмолекулярных структур на основе ДНК и АОБ, потенциально востребованных в таких перспективных областях как биотехнология и биоинженерия.

Цель и задачи исследования

Цель работы - исследование взаимодействия алкилоксибензолов - химических аналогов ауторегуляторных di-факторов микроорганизмов с ДНК, а также оценка последствий подобного взаимодействия.

Для достижения этой цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи:

1. Изучить возможность прямого взаимодействия алкилоксибензолов -химических аналогов ауторегуляторных di-факторов микроорганизмов, различающихся строением и биологической активностью, с ДНК.

2. Визуализировать результат взаимодействия структурно различных АОБ с ДНК.

4. Исследовать влияние АОБ на чувствительность ДНК к экстремальным факторам (температура, УФ-облучение), а также динамику изменения физико-химических свойств ДНК в водных растворах в присутствии АОБ.

Научная новизна

На основании анализа ряда физико-химических характеристик ДНК в присутствии синтетических аналогов ауторегуляторных di-факторов микроорганизмов впервые установлен факт прямого взаимодействия между этими молекулами, что расширяет список биополимеров бактериальной клетки, способных устанавливать контакт с АОБ.

Изучение флуоресцентных характеристик структурно различных АОБ в присутствии ДНК, а также поведения флуоресцентного зонда пирена в смесях ДНК-АОБ показали, что взаимодействие между данными молекулами может вести к формированию вокруг ДНК гидрофобного окружения. Впервые показано, что в результате взаимодействия одного из наиболее биологически активных АОБ - гексилрезорцина - на ДНК формируются устойчивые мицелло-подобные наноструктуры. При этом развивающееся во времени увеличение подобных образований и их слияние в более крупные агрегаты соответствует картине компактизации нуклеоида бактериальной клетки при воздействии АОБ.

Установлено влияние химических аналогов ауторегуляторных dp факторов микроорганизмов на конформационную подвижность ДНК при уменьшении относительной влажности, результатом которого является замедление В—>А-перехода в присутствии метилрезорцина и его ускорение в присутствии тирозола и гексилрезорцина, что может быть одной из причин метаболической инертности ДНК в покоящихся клетках микроорганизмов.

Выявлено повышение температуры плавления ДНК в присутствии АОБ, а также защитное действие последних на линейные и кольцевые молекулы ДНК при УФ-облучении, что является экспериментальным объяснением высокой УФ- и терморезистентности покоящихся форм микроорганизмов, образование которых индуцируется АОБ. Показан факт длительного сохранения вязкостных и электрофоретических свойств полимерных молекул ДНК в водных растворах в присутствии ауторегуляторных di-факторов, что моделирует процесс консервации генетического материала в цитозоле покоящихся клеток микроорганизмов.

Практическая значимость

Полученные результаты, свидетельствующие о формировании вокруг нитей ДНК оболочек из химических аналогов ауторегуляторных di-факторов микроорганизмов, изолирующих их от водного окружения, потенциально могут быть использованы в нескольких областях современной микробиологии, биохимии и биоинженерии, а именно:

Одной из возможных технологий также является способ получения надмолекулярных композитов из молекул гексилрезорцина и ДНК, характеризующихся взаимноупорядоченным расположением, на который получено решение о выдаче патента на изобретение по заявке №2005110818/13 от 13.04.2005.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Алкилоксибензолы - химические аналоги ауторегуляторных dr факторов микроорганизмов взаимодействуют с ДНК. Это взаимодействие носит различный характер в зависимости от химического строения ф-факторов, их молярного соотношения с ДНК и времени совместной инкубации. При определённых условиях в присутствии одного из ауторегуляторных di-факторов (гексилрезорцина) на нитях ДНК образуются упорядоченные надмолекулярные структуры.

2. Взаимодействие с химическими аналогами ауторегуляторных dr факторов влияет на скорость конформационного В—*А-перехода ДНК при снижении относительной влажности воздуха и оказывает протективное действие на ДНК, заключающееся в повышении температуры её плавления, защите от УФ-облучения и замедлении гидролитических процессов.

Публикации

Апробация работы

Структура и объём диссертации

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Давыдова, Ольга Константиновна

Выводы

1. Показано прямое взаимодействие алкилоксибензолов -химических аналогов ауторегуляторных di-факторов микроорганизмов с ДНК, результат которого зависит от их химической структуры и используемой концентрации и проявляется в изменении комплекса физико-химических свойств данного биополимера.

4. Выявлено влияние алкилоксибензолов различной структуры на конформационный В—>А-переход в молекулах ДНК при уменьшении относительной влажности воздуха, выражающееся в его замедлении в присутствии метилрезорцина и ускорении в присутствии тирозола и гексилрезорцина, что является одним из объяснений биологической инертности ДНК в покоящихся клетках микроорганизмов.

5. Зафиксировано увеличение температуры плавления ДНК в присутствии химических аналогов ауторегуляторных di-факторов, что является одним из механизмов формирования высокого уровня терморезистентности покоящихся клеток микроорганизмов.

6. Обнаружен эффект защиты линейных и кольцевых молекул ДНК от повреждающего действия УФ-излучения в присутствии химических аналогов ауторегуляторных di-факторов микроорганизмов.

Заключение

На протяжении двух последних десятилетий интенсивно исследуются процессы образования покоящихся форм микроорганизмов, обеспечивающих их длительное сохранение в среде обитания в неоптимальных условиях. Важным прорывом в данном направлении явилось выявление ведущей роли в этом процессе ауторегуляторных di-факторов, по своей химической природе относящихся к алкилоксибензолам.

Представленный в настоящей работе материал, по нашему мнению, существенно дополняет имеющиеся сведения о природе образования покоящихся форм, а именно объясняет события, происходящие при этом с генетическим аппаратом бактериальных клеток. Разумеется, мы не утверждаем, что полностью изучены все особенности взаимодействия dr факторов с ДНК. Скорее наоборот, полученные результаты создают основу для проведения дальнейших фундаментальных и прикладных исследований, в первую очередь, направленных на разработку методик консервации генетического материала, а также создание частиц для трансфекции и доставки ДНК в клетки про- и эукариот.

Обобщая полученные при проведении данной работы результаты, ещё раз обратим внимание на следующие основные моменты.

Исследование взаимодействия ауторегуляторных di-факторов, представленных АОБ, с ДНК методом спектрофотометрии показало, что спектры поглощения растворов АОБ в присутствии ДНК проявляют гипохром-ный эффект, заключающийся в уменьшении поглощения смеси по сравнению с суммой спектров отдельных компонентов. Подобный гипохромизм нарастал с увеличением времени инкубации растворов, концентрации АОБ, а также зависел от химического строения последних. Объяснением наблюдаемых спектральных изменений может являться усиление структурированности в поглощающей системе, анализ которой должен внести окончательную ясность в характер взаимодействия между молекулами ДНК и di-факторов.

В то же время, определенные акценты в этом вопросе расставило проведенное нами изучение взаимодействия АОБ с ДНК с использованием метода флюориметрии, позволившее зарегистрировать развивающееся во времени смещение максимума флюоресценции АОБ в коротковолновую область с одновременным увеличением интенсивности. При этом подобные изменения, интерпретируемые как уменьшение полярности «ячейки» в которой находится флуорофор, свидетельствуют в пользу взаимодействия ал-кильных радикалов с внутренними гидрофобными областями молекулы ДНК.

Введение в данную систему флуоресцентного зонда пирена, спектральные характеристики которого обладают высокой чувствительностью к гидрофобности микроокружения, позволило получить и дополнительные свидетельства в пользу подобного характера взаимодействия АОБ с ДНК. При этом в присутствии наиболее активного АОБ - гексилрезорцина было зарегистрировано изменение соотношения интенсивностей вибронных компонент спектра пирена, развивающееся при концентрациях ГР существенно уступающих его ККМ. Т.о. общий результат изучения флуоресцентных характеристик АОБ при взаимодействии с ДНК может быть интерпретирован как формирование мицеллоподобных наноструктур из молекул АОБ вокруг нити ДНК, выступающей в этом случае в качестве своеобразного «катализатора» мицеллобразования.

Непосрественная визуализация подобных структур была проведена нами с помощью метода АСМ, позволившего зафиксировать образование на нитях ДНК сферических мицеллоподобных структур из молекул ГР. Дальнейшее же увеличение времени инкубации раствора ДНК+ГР вело к слиянию образуемых ими комплексов в утолщенные разветвлённые образования, объединяемые в точках пересечения описанными выше мицеллоподобными наноструктурами. При этом принципиально важно, что наблюдаемая картина оказывалась визуально сходной с явлением компактизации нуклеоида в покоящихся клетках бактерий, образование которых индуцируется АОБ.

На основании описанных выше результатов гипотетическая модель взаимодействия между макромолекулой биополимера и низкомолекулярными АОБ развивается в три основных этапа. На первом этапе (часы, сутки) происходит комплексообразование ДНК с АОБ, в основном, за счёт взаимодействий алкильных радикалов АОБ с гидрофобными участками макромолекулы. На втором этапе (к 2-3 неделе) в локусах формирования комплексов ДНК-АОБ, происходит локальное повышение концентрации АОБ, превышающую его ККМ, что результируется в образовании на ДНК видимых в АСМ мицеллоподобных наноструктур. В данном случае, однако, речь идет об особенностях этого процесса, происходящего не в растворе при достижении ККМ, а при ее локальном превышении в отдельных участках линейной молекулы ДНК, которые становятся своеобразными «ядрами конденсации» для молекул АОБ. На последнем третьем этапе на поздних сроках инкубации аранжированные низкомолекулярным лигандом (АОБ) молекулы ДНК начинают взаимодействовать друг с другом, что приводит к формированию утолщенных и протяженных структур, состоящих из множества параллельно расположенных нитей ДНК, что визуализируется на микрофотографиях как компактизация ДНК.

Прикладные аспекты полученных результатов определяются возможностью создания упорядоченных надмолекулярных композитов на основе молекул АОБ и ДНК, представляющих собой «кабельные» структуры, в составе которых молекулы ДНК характеризуются взаимно упорядоченным параллельным расположением, будучи объединёнными единым «чехлом» из молекул АОБ (положительное решение о выдаче патента на изобретение на «Способ получения надмолекулярных композитов» по заявке №2005110818/13 от 13.04.2005). При этом потенциальной сферой использования подобных композитов является их применение в ряде биотехнологических и нанотехнологических устройств, а также создание на их основе частиц для трансфекции.

Полученные результаты, свидетельствующие о прямом взаимодействии АОБ с ДНК с формированием надмолекулярных комплексов также явились основанием для постановки вопроса о последствиях подобного взаимодействия для конформационного состояния ДНК, а также её устойчивости к некоторым экстремальным воздействиям.

Изучение конформационных изменений в молекуле ДНК при снижении относительной влажности методом ИК-спектроскопии позволило констатировать различный характер подобных изменений в присутствии АОБ. При этом оценка интенсивности В—>А перехода позволила сделать вывод о его замедленном характере в присутствии MP и более быстром в присутствии Т. На этом фоне особенность эффекта ГР является то, что он оказывал стимулирующее действие на В—» А переход ДНК при низких значениях относительной влажности. Биологическая значимость полученных результатов подтверждается тем, что конформация ДНК определяет биологическую активность данной макромолекулы in vivo. В вегетативных клетках ДНК преимущественно находится в В-форме, при превращении же клеток в споры (один из видов покоящегося состояния) она переходит в свою А-конформацию, характеризующуюся повышенной устойчивостью к ряду внешних факторов. Таким образом, поиск веществ, способных модифицировать интенсивность В—» А перехода представляется одним из подходов к управлению функциональным состоянием бактериальных клеток.

Изучение процесса термической денатурации ДНК в присутствии АОБ позволило зарегистрировать повышение тугоплавкости ДНК, зависящее от химической структуры АОБ, их концентрации и времени совместной инкубации с ДНК. Полученные данные хорошо согласуются с представлениями о высоком уровне терморезистентности покоящихся форм микроорганизмов, переход в которые индуцируется АОБ.

Ещё одним важным абиотическим фактором устойчивость к которому значима для длительного сохранения микроорганизмов является ультрафиолетовое облучение. При этом основной мишенью для ультрафиолета как раз и является ДНК, интенсивно поглощающая в данном диапазоне длин волн. В присутствии АОБ различные по происхождению ДНК характеризовались повышенным уровнем устойчивости к УФ-облучению. В качестве возможных механизмов протекторного действия АОБ следует указать возможность их экранирующего действия, а также меньшую чувствительность А-формы ДНК к УФ, возникающей в присутствии АОБ.

На завершающем этапе исследования были проанализированы некоторые физико-химические свойства ДНК и комплексов ДНК+АОБ при их длительной инкубации в водных растворах, что моделировало нахождение генетического материала в цитозоле покоящихся клеток. Происходящие в этих условиях процессы традиционно связываются с возможностью спонтанного гидролиза фосфодиэфирных связей в сахарофосфатном остове ДНК, ведущее к распаду биополимера на короткоцепочечные фрагменты. Данные о вязкостных свойствах растворов и электрофоретической подвижности ДНК в присутствии АОБ показали их стабилизирующее действие, заключающееся в сохранении исследуемых физико-химических характеристик. Выраженность подобного эффекта вновь зависела от концентрации и особенностей химического строения АОБ. При этом длительная консервация ДНК в присутствии АОБ представляется ещё одним из необходимых условий для сохранения бактериальной клетки в покоящемся состоянии.

Обобщённые представления о выявленных нами эффектах, обнаруживаемых при взаимодействии ДНК с АОБ, а также возможные объяснения их возникновения приведены в табл. 4.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Давыдова, Ольга Константиновна, Саратов

1. Aaronson S. Chemical Communication at the Microbial Level. Florida: CRC Press, Inc. Boca Raton. 1981. V.l. P. 189; V.2. P. 203.

2. Хохлов A.C. Низкомолекулярные микробные ауторегуляторы. M. Наука. 1988, С. 270.

3. Олескин А.В. Надорганизменный уровень взаимодействия в микробных популяциях//Микробиология. 1993. Т.62. № 3. С.389-403.

4. Oleskin A.V. Social behaviour of microbial populations // J. Basic Microbiol.1994. V.34.N6. P.425-439.

5. Смирнов С.Г. Этология бактерий новое направление в исследовании прокариотов // Физико-химические исследования патогенных энтеро-бактерий в процессе культивирования. Иваново. ИвГУ. 1985. С.5-10.

6. Олескин А.В., Ботвинко И.В., Цавкелова Е.А. Колониальная организация и межклеточная коммуникация у микроорганизмов // Микробиология. 2000. Т. 69. № 3. С. 309-327.

7. Shapiro J.A. The significances of bacterial colony patterns // BioEssays.1995. V. 17. N7. P. 597-607.

8. Gray K.M. Intercellular communication and group behavior in bacteria // Trends Microbiol. 1997. V.5. N 5. P.184-188.

9. Олескин А.В. Экологически важные свойства популяций микроорганизмов // Соросовский образовательный журнал. 2001. Т.7. № 8. С. 7-12.

10. Whittaker R. Н., Feeny P. P. Allelochemics: chemical interactions between species // Science. 1971. V. 171. P. 757—770.

11. Law J.H., Regnier F.E. Pheromones // Annu. Rev. Biochem. 1971. V. 40. P. 533-548.

12. Светличный В.А., Эль-Регистан Г.И., Романова А.К., Дуда В.И. Характеристики ауторегуляторного фактора d2, вызывающего автолиз клеток Pseudomonas carboxydoflava и Bacillus cereus // Микробиология. 1983. Т.52. № 1. С.33-38.

13. Бухарин О.В., Гинцбург А.Л., Романова Ю.М., Эль-Регистан Г.И. Механизмы выживания бактерий. М.: Медицина. 2005. С. 367.

14. Запрометов М.Н. Фенольные соединения: распространение, метаболизм и функции в растениях. М.: Наука. 1993. С. 272.

15. Рогинский В.А. Фенольные антиоксиданты: реакционная способность и эффективность. М.: Наука. 1988. С. 247.

16. Kozubek A., Tyman J.H.P. Resorcinolic lipids, the natural non-isoprenoid phenolic amphiphiles and their biological activity // Chem. Rev. 1999. V. 99. №1. P. 1-31.

17. Батраков С.Г., Эль-Регистан Г.И., Придачина H.H., Ненашев В.А., Козлова А.Н., Грязнова М.Н., Золотарёва И.Н. Тирозол ауторегуляторный фактор dj дрожжей Saccharomyces cerevisiae // Микробиология. 1993. Т. 62. №4. С. 633-638.

18. Reusch R.N., Sadoff H.L. 5-n-Alkylresorcinols from encysting Azotobacter vinelandii: isolation and characterization. // J. Bacteriol. 1979. V. 139. P. 448-453.

19. Reusch R.N., Sadoff H.L. Novel lipid components of the Azotobacter vinelandii cyst membrane. //Nature. 1983. V. 302. P.268-270.

20. Su C.-J., Reusch R.N., Sadoff H.L. Isolation and characterization of several unique lipids from Azotobacter vinelandii cyst. // J. Bacterid. 1981. V. 147. P. 80-90.

21. Батраков С.Г., Придашина H.H., Кругляк Е.Б., Новогрудская Е.Д. Фенольные липиды из Azotobacter chroococcum // Хим. прир. соед. 1977. №4. С. 494-499.

22. Осипов Г.А., Эль-Регистан Г.И., Светличный В.А., Козлова А.Н., Дуда

23. B.И., Капрельянц А.С., Помазанов В.В. Химическая природа ауторегу-ляторного фактора dl в Pseudomonas carboxydoflava // Микробиология. 1985. Т. 54. С. 186-190.

24. Tsuge N., Mizokami М., Imai S., Shimazu A., Seto H. Adipostatins A and B, new inhibitors of glycerol-3phospate dehydrogenase // J. Antibiot. 1992. V. 45. P. 886-891.

25. Эль-Регистан Г.И., Акилова Н.А., Хохлова Ю.М., Дужа М.В., Комарова Г.В. Ауторегуляторы начальных стадий развития Rhodotorula gracilis // Реферат научных сообщений 3-й Всес. биохим. съезда. Рига. 1974. Т.2.1. C.16.

26. Эль-Регистан Г.И., Козлова А.Н., Комарова Г.В., Дужа М.В., Конова И.В., Красильников Н.А. Биология лучистых грибков. М.: «Наука». 1975. С.130.

27. Демкина Е.В., Соина B.C., Эль-Регистан Г.И., Звягинцев Д.Г. Репродуктивные покоящиеся формы Arthrobacter globiformis // Микробиология. 2000. Т. 69. №3. С. 377-382.

28. Демкина Е.В., Соина B.C., Эль-Регистан Г.И. Образование покоящихся форм Arthrobacter globiformis в автолизирующихся суспензиях // Микробиология. 2000. Т. 69. №3. С. 383-388.

29. Пронин С.В., Эль-Регистан Г.И., Шевцов В.В., Дуда В.И. Устойчивость покоящихся цистоподобных форм Bacillus cereus к воздействию высокой температуры, ультрафиолетовых лучей и низкомолекулярных спиртов //Микробиология. 1982. Т. 51. №2. С. 314-317.

30. Браун Г., Уолкен Дж. Жидкие кристаллы и биологические структуры. -М.: Мир. 1982. С. 190.

31. Халатур П.Г. Самоорганизация полимеров // Соросовский образовательный журнал. 2001. Т. 7. №4. С. 36-43.

32. Дуда В.И., Королёв Ю.Н., Эль-Регистан Г.И., Дужа М.В., Телегин H.J1. Распределение и пространственная упорядоченность молекул биополимеров в покоящихся бактериальных спорах // Микробиология. 1978. Т. 47. №4. С. 750-755.

33. Бабусенко Е.С., Эль-Регистан Г.И., Градова Н.Б., Козлова А.Н., Осипов Г.А. Исследование мембранотропных ауторегуляторных факторов ме-танокисляющих бактерий // Успехи химии. 1991. Т. 60. №11. С. 23622372.

34. Комолова Г.С., Горская И.А., Каверинская Т.В., Шевелева И.Д. Влияние алкилрезорцина на дыхание, синтез нуклеиновых кислот и белка в изолированных тимоцитах//Биохимия. 1989. Т. 54. №11. С. 1847-1851.

35. Stasiuk М., Kozubek A. Modulation of 5-n-alkylresorcinol hemolytic properties by divalent cations. Dependence of the effect of cations on alkylresorci-nol structure // Cellular & Molecular Biology Letters. 1997. V. 2. P. 77-87.

36. Kozubek A., Gubernator J., Przeworska E., Stasiuk M. Plarosomes, novel efficient phospolipid-amphiphile vesicles for drug delivery // Acta Biochimica Polonica. 2000. V. 47. №3. P. 639-649.

37. Марголис Л.Б., Бергельсон Л.Д. Липосомы и их взаимодействие с клетками. М.: Наука. 1986. С. 240.

38. Kozubek A. Interaction of alkylresorcinols with proteins // Acta Biochim Pol. 1995. V. 42. №2. P. 241-246.

39. Марголис А.Л., Шерстюк С.Ф., Изумрудов В.А. Швядас В.Ю., Зезин А.Б., Кабанов В.А. Фазовые превращения в растворах полиэлектроли-товых комплексов как модель спорообразования // Доклады АН СССР. 1983. Т. 272. № 1.С. 230-233.

40. Степаненко И.Ю. Изучение роли алкилоксибензолов в стрессовом ответе микроорганизмов. Автореф. дис. . канд. биол. наук. М.: ИНМИ РАН, 2005.

41. Kamal-Eldin A., Pouru A., Eliasson C., Aman P. Alkylresorcinols as antioxidants: hydrogen donation and peroxyl radical-scavenging effects // Journal of the Science of Food and Agriculture. 2001. V. 81. №3. P. 353-356.

42. Hladyszowski J., Zubik L., Kozubek A. Quantum Mechanical and Experimental Oxidation Studies of Pentadecylresorcinol, Olivetol, Orcinol and Re-sorcinol // Free Rad. Res. 1998. V. 28. P. 359-368.

43. Gasiorowski K., Szyba K., Brokos В., Kozubek A. Antimutagenic activity of alkylresorcinols from cereal grains. 1996. Cancer Letters. V. 106. P. 109115.

44. Gasiorowski K., Brocos B. DNA repair of hydrogen peroxide-induced damage in human lymphocytes in the presence of four antimutagens. A study with alkaline single cell gel electrophoresis (comet assay) // Cell. Moll. Biol. Lett. 2001. V. 6. P. 897-911.

45. Маргулис А.Б., Ожиганова И.В., Бушманова O.B., Колпаков А.И., Ильинская О.Н. Гексилрезорцин как индуктор хромосомных аберраций в клетках периферической крови мышей // Генетика. 2005. Т. 41. №8. С. 1045-1048.

46. Прозоров А.А. Рекомбинантные перестройки генома бактерий и адаптация к среде обитания // Микробиология. 2001. Т. 70. №5. С. 581-594.

47. Головлёв В.Л. Метастабильность фенотипа у бактерий // Микробиология. 1998. Т. 59. №2. С. 149-155.

48. Милько Е.С., Егоров Н.С. Гетерогенность популяции бактерий и процесс диссоциации. -М.: Изд-во МГУ. 1991. С. 143.

49. Дорошенко Е.В., Лойко И.Г., Ильинская О.И., Колпаков A.M., Горнова И.В., Эль-Регистан Г.И. Характеристика диссоциантов Bacillus cereus, штамм 504 //Микробиология. 2001. Т. 70. №6. С. 811-819.

50. Ильинская О.Н., Колпаков А.И., Шмидт М.А., Дорошенко Е.В., Мулю-кин А.Л., Эль-Регистан Г.И. Роль бактериальных ауторегуляторов роста группы алкилоксибензолов в ответе стафилококков на стрессовые воздействия //Микробиология. 2002. Т. 71. №1. С. 23-29.

51. Ильинская О.Н., Колпаков А.И., Зеленихин П.В., Круглова З.Ф., Чой-даш Б., Дорошенко Е.В., Мулюкин А.Л., Эль-Регистан Г.И. Влияние ау-тоиндукторов анабиоза на геном микробной клетки // Микробиология. 2002. Т. 71. №2. С. 194-199.

52. Hecht S.M. Naturals products that cleave DNA // Pure & Appl. Chem. 1989. V. 61. №3. P. 577-580.

53. Scannell R.T., Barr J.R., Murty V.S., Reddy K.S., Hecht S.M. DNA Strand Scission by Naturally Occurring 5-Alkylresorcinols // J. Am. Chem. Soc. 1988. V. 110. P. 3650-3651.

54. Lytollis W., Scannell R.T., An H., Murty V.S., Reddy K.S., Barr J.R., Hecht S.M. 5-Alkylresorcinols from Hakea trifurcate That Cleave DNA // J. Am. Chem. Soc. 1995. V. 117. P. 12683-12690.

55. Barr J.R., Murty V.S., Yamaguchi K., Singh S., Smith D.H., Hecht S.M. 5-Alkylresorcinols from Hakea amplexicaulis That Cleave DNA // Chem. Res. Toxycol. 1988. V. 1. P. 204-207.

56. Singh U.S., Scannell R.T., An H., Carter B.J., Hecht S.M. DNA Cleavage by Di- and Trihydroxyalkylbenzenes. Characterization of Products and the

57. Roles of 02, Cu(II), and Alkali //J. Am. Chem. Soc. 1995. V. 117. P. 1269112699.

58. Starck S.R., Deng J.Z., Hecht S.M. Naturally occurring alkylresorcinols that mediate DNA damage and inhibit its repair // Biochemistry. 2000. V. 39. №9. P. 2413-2419.

59. Deng J.Z., Starck S.R., Hecht S.M. bis-5-Alkylresorcinols from Panopsis rubescens that inhibit DNA polymerase beta // J. Nat. Prod. 1999. V. 62. №3. P. 477-480.

60. Маргулис А.Б. Низкомолекулярные ауторегуляторные соединения как триггерные молекулы стресса у бактерий. Автореф. дис. . канд. биол. наук. Казань: КГУ, 2005.

61. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия. М.: Высш. шк. 1998. С.479.

62. Фрайфелдер Д. Физическая биохимия. Применение физико-химических методов в биохимии и молекулярной биологии. -М.: Мир. 1980. С. 584.

63. Дерябин Д.Г. Цитология про- и эукариотов. М: Академия. 2005. С. 239.

64. Филиппович Ю.Б. Основы биохимии. М. Высш. шк. 1993. С. 496.

65. Владимиров Ю.А., Рощупкин Д.И., Потапенко А.Я., Деев А.И. Биофизика.-М.: Медицина. 1983. С. 272.

66. Благой Ю.П. Взаимодействие ДНК с биологически активными веществами (ионами металлов, красителями, лекарствами) // Соросовский образовательный журнал. 1998. № 10. С. 18-24.

67. Зенгер В. Принципы структурной организации нуклеиновых кислот. -М.: Мир. 1987. С. 584.

68. Москва В.В. Водородная связь в органической химии // Соросовский образовательный журнал. 1999. № 2. С. 58-64.

69. Сорокин В.А. Взаимодействие ионов двухвалентной меди с природной ДНК и ее мономерами // Биофизика. 1994. Т. 39. Вып. 6. С. 993-1004.

70. Благой Ю.П., Галкин В.Л., Гладченко Г.О. и др. Металлокомплексы нуклеиновых кислот в растворах. Киев: Наукова думка. 1991. С. 225.

71. Карасёв В.Е., Бабий А.П. Комплексы Cu(II) с дегидратированной спиральной ДНК // Электронный журнал «Исследовано в России», 2003, Т.6, С. 1038-1048. http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/1998/003.pdf

72. Шишниашвили Д.М., Лысцов В.Н., Мошковский Ю.Ш. Об изменениях вторичной структуры ДНК под действием ионов палладия. В сб. Кон-формационные изменения биополимеров в растворах. М.: Наука. 1973. С. 207.

73. Поляничко A.M., Чихиржина Е.В., Андрущенко В.В., Виезер Г., Воробьёв В.И. Спектральные исследования структуры комплексов ДНК сл Iионами Мп в УФ- и ИК-диапазонах // Биофизика. 2005. Т. 50. Вып. 5. С. 810-817.

74. Андроникашвили Э.Л. Малигнизация и изменение некоторых физико-химических свойств биомакромолекул и надмолекулярных структур // Биофизика. 1987. Т. 23. С. 782-799.

75. Бурилков В.Н., Крочик Г.М. Биологическое действие лазерного излучения. Институт хим. генетики. Кишенев: Штиинца, 1989. С. 101.

76. Благой Ю.П., Сорокин В.А., Валеев В.А. Спектральное исследование связывания оснований ДНК с ионами магния и кальция // Молекулярная биология. 1980. Т. 14. Вып.З. С. 595-605.

77. Bielawski К., Bielawska A., Bartulewicz D., Rozanski A. Molecular modeling of the interaction of carbocyclic analogues of netropsin and distamycin with d(CGCGAATTCGCG)2 // Acta Biochimica Polonica. 2000. V. 47. № 3. P. 855-866.

78. Kraubauer R., Fischerlander S., Allen S., Gaub H.E. Mechanical fingerprints of DNA drug complexes // Single Mol. 2002. V. 3. P. 97-103.

79. Ouameur A., Tajmir-Riahi H. Interactions with Biogenic Polyamines and Cobalt(III)hexamine Studied by Fourier Transform Infrared and Capillary Electrophoresis // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. № 40. P. 42041-42054.

80. Jary D., Sikorav J.L. Cyclization of globular DNA. Implications for DNA-DNA interactions in vivo // Biochemistry. 1999. V. 38. P. 3223-3227.

81. Lin Z., Wang C., Feng X., Liu M., Li J., Bai C. The observation of the local ordering characteristics of spermidine- condensed DNA: atomic force microscopy and polarizing microscopy studies // Nucl. Acids Res. 1998. V. 26. P. 3228-3234.

82. Стручков B.A., Стражевская Н.Б. Структурные и функциональные аспекты ядерных липидов нормальных и опухолевых клеток // Биохимия. 2000. Т. 65. Вып. 5. С. 620-643.

83. Шабарчина Л.И., Сухоруков Б.И., Шванева Н.В., Коломийцева И.К. // Биофизика. 1975. Т. 20. С. 366-370.

84. Manzoli F.A., Muchmore J.H., Bonora В., Sabioni A., Stefoni S. Interaction between sphingomyelin and DNA // Biochim. Biophys. Acta. 1972. V. 277. P. 251-255.

85. ЮО.Алесенко A.B., Пантаз Э.А., Пушкарёва М.Ю., Русакова С.А., Филиппова Г.Н. //Биохимия. 1993. Т. 58. С. 461-470.

86. Ю1.Шенгелия М.Г., Гачава М.М., Царцидзе М.А., Ламсадзе Б.А. // Биол. науки. 1984. № И. С. 34-36.

87. Жданов Р.И., Дьячков Е.П., Стручков В.А., Стражевская Н.Б., Дьячков П.Н. ДНК-связанные липиды: моделирование взаимодействия ДНК со стеариновой и ненасыщенными жирными кислотами // Известия АН. Серия химическая. 2003. № 9. С. 1794-1800.

88. Стручков В.А., Стражевская Н.Б. ДНК-связанные липиды: состав и возможные функции //Биохимия. 2000. Т. 58. Вып. 8. С. 1154-1175.

89. Сухоруков Б.И., Петров А.И., Казарян P.JL, Кувичкин В.В. Изучение комплексообразования ДНК с катионными амфифильными молекулами методом флуоресцентного зонда // Биофизика. 2000. Т. 45. Вып. 2. С. 245-253.

90. Скуридин С.Г., Дембо А.Т., Ефимов B.C., Евдокимов Ю.М. Жидкокристаллические фазы комплексов ДНК с синтетическими поликатионами // Доклады академии наук. 1999. Т. 365. № 3. С. 400-402.

91. Bloomfield V.A. DNA condensation by multivalent cations // Biopolimers. 1997. V. 44. P. 269-282.

92. Ю8.Тейф В.Б., Ландо Д.Ю. Конденсация ДНК, вызванная адсорбцией ли-гандов. Минск: Технопринт. 2003. С. 116-128.

93. Sikorav J.L., Church G.M. Complementary recognition in condensed DNA: accelerated DNA renaturation//J. Mol. Biol. 1991. V. 222(4). P. 1085-108.

94. Jary D., Sikorav J.L. Cyclization of globular DNA. Implications for DNA-DNA interactions in vivo // Biochemistiy. 1999. V. 38(11). P. 3223-3227.

95. J. Kindt, S. Tzlil, A. Ben-Shaul, and W. M. Gelbart DNA packaging and ejection forces in bacteriophage // Proc. Natl. Acad. USA. 2001. V. 98. P. 13671-13674.

96. Cockell M., Gasser S.M. Nuclear compartments and gene regulation // Curr. Opin. Genet. Develop. 1999. V. 9. P. 199-205.

97. Dobrucki, J., and Darzynkiewicz, Z. Chromatin condensation and sensitivity of DNA in situ to denaturation during cell cycle and apoptosis. A confocal microscopy study // Micron. 2001. V. 32 (7). P. 645-652.

98. Minsky A., Shimoni E., Frenkiel-Krispin D. Stress, order and survival // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2002. V. 3 (1). P. 50-60.

99. S. Levin-Zaidman, J. Englander, E. Shimoni, AK. Sharma, KW. Minton, Minsky A. Ringlike structure of the Deinococcus radiodurans genome: A key to radioresistance? // Science. 2003. V. 299 (5604) P. 254-256.

100. Azam T.A., Iwata A., Nishimura A., Veda S., Ischihama A. Growth phase-dependent variation in protein composition of the Escherichia coli nucleoid // J. Bacteriol. 1999. V. 181. №20. P. 6361-6370.

101. Setlow P. Mechanisms for the prevention of damage to DNA in spores of Bacillus species // Annu. Rev. Microbiol. 1995. V. 49. P. 29-54.

102. Лохман Э.-Р., Михелер А. Связывание органических красителей с нуклеиновыми кислотами и фотодинамический эффект.- В кн.: Физико-химические свойства нуклеиновых кислот. М.: Мир. 1976. С.233-273.

103. Морошкина Е.Б., Сафьянникова М.Г. Взаимодействие ДНК с соединениями феназинового ряда // Биофизика. 1999. Т. 44. № 3. С. 425-429.

104. Li H.J., Crothers D.M. Relaxation studies of proflavine-DNA complex: the kinetics of an intercalation reaction // J. Mol. Biol. 1969. V. 39. P. 461-477.

105. Wakelin L.P.G., Waring M.G. Kinetics of drug-DNA interaction. Dependence of the binding mechanism on structure of the ligand // J. Mol. Biol. 1980. V. 144. P. 183-214.

106. Coury J.E., Anderson J.R., McFail-Isom L., Williams L.D. and Bottomley L.A. Scanning Force Microscopy of Small Ligand-Nucleic Acid Complexes: Tris(o-phenanthroline)ruthenium(II) as a Test for a New Assay // J. Am. Chem. Soc. 1997. 119. P. 3792-3796.

107. Lerman L.S. Structural considerations in the interaction of DNA and acridi-nes // J. Mol. Biol. 1961. V.3.P. 18-30.

108. Gale E.F., Cundliffe F., Reynolds P.E., Richmond M.H., Waring M.J. The molecular Basis of Antibiotic Action. 1972. London: Wiley. P. 102-115.

109. Waring M.J. DNA modification and cancer // Ann. Rev. Biochem. 1981. V. 50. P. 159-92.

110. Berman H.M., Young P.R. The interaction of intercalating drugs with nucleic acids//Annu. Rev. Biophys. Bioeng. 1981. V. 10. P. 87-114.

111. Lee S.L., Debenedetti P.G., Errington J.R., Pethica B.A., Moore D.J. Calo-rimetric and Spectroscopic Study of DNA at Low Hydration // J. Phis. Chem. B. 2004. V. 108. № 9. P. 3098-3106.

112. Сканирующая зондовая микроскопия биополимеров / Под ред. И.В. Яминского. -М.: Научный мир, 1997. С. 87.

113. Reichmann М.Е., Rice S.A., Tomas С.A., Doty P. A further examination of the molecular weight and size of the desoxypentose nucleic acid. // J. Amer. Chem. Soc. 1954. V.76. P. 3047-3053.

114. Молекулярная клиническая диагностика. Методы: Пер. с англ. / Под ред. С. Херрингтона, Дж. Макги. М.: Мир, 1999. С. 558.

115. Falk В.М., Hartman, К.A., Lord, R.C. Hydration of deoxyribonucleic acid. A spectroscopic study of the effect of hydration on the structure of deoxyribonucleic acid // J. Am. Chem. Soc. 1963. V. 85. P. 391-394.

116. Рабек Я. Экспериментальные методы в химии полимеров: в 2-х частях. Ч. 1.-М.: Мир. 1983. С. 384.

117. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот / Под ред. Ю.С. Лазуркина. М.: Наука, 1967. - С. 343.

118. Волькенштейн М.В. Молекулярная биофизика. Т.1 -М.: Наука. 1975. С. 616.

119. Кочетков И.К., Будовский Э.И., Свердлов Е.Д., Симукова Н.А. Турчин-ский М.Ф., Шибаев В.Н. Органическая химия нуклеиновых кислот. 1970. М.: Химия. С. 720.

120. Ашмарин И.П. Молекулярная биология. Избранные разделы. 1974. М.: Медицина. С. 360.

121. Галь Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул: Пер. с англ. -М.: Мир, 1982. С.448.

122. Маниатис Т. и др. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер. с англ. М.: Мир, 1984. С. 480.

123. MO.Engel A., Schoenenberger С.A., Miiller D.J. High resolution imaging of native biological sample surfaces using scanning probe microscopy // Current Opinion in Structural Biology. 1997. №7. P. 279-284.

124. Engel A., Lyubchenko Y. and Miiller D. Atomic force microscopy: a powerful tool to observe biomolecules at work // Trends in Cell Biology. 1999. №9. P. 77-80.

125. You H.X., Lowe C.R. Progress in the application of scanning probe microscopy to biology // Current Opinion in Biotechnology. 1996. №7. P. 78-84.

126. Geisler В., Noll F., Hampp N. Nanodissection And Noncontact Imaging Of Plasmid DNA With An Atomic Force Microscope // Scanning. -2000. V. 22. P. 7-11.

127. Bustamante C., Vesenka J., Tang C., Rees W., Guthold M., Keller R. Circular DNA Molecules imaged in air by scanning force microscopy // Bioochemistry. 1992. -№ 31. - P. 22-26.

128. Галлямов M.O., Яминский И.В. Сканирующая зондовая микроскопия нуклеиновых кислот. М.: Центр перспективных технологий, 1998. - С. 20.

129. Murray M.N., Hansma H.G., Bezanilla М., Sano Т., Ogletree D.F., Kolbe W., Smith C.L., Cantor C.R., Sengler S., Hansma P.K., Salmeron M. Atomic force microscopy of biochemically tagged DNA // Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 1993. №90. P.811-3814.

130. Вудраф Д., Делчар Т. Современные методы исследования поверхности.-М.: Мир. 1989. С. 568.

131. Фелдман JL, Майер Д. Основы анализа поверхности и тонких пленок. -М.: Мир. 1989. С. 342.

132. Основы аналитической электронной микроскопии. / под ред. Дж. Грена. Дж. И. Гольштейна, Д.К. Джоя, А.Д. Ромига. М.: Металлургия, 1990. С. 584.

133. Векшин H.JI. Фотоника биологических структур. Пущино: ОНТИ НЦБИ АН СССР, 1988. С. 164.

134. Tinoco I. // J. Amer. Chem. Soc. 1960. V. 82. № 18. P. 4785-4790.

135. Лакович Дж. Основы флуоресцентной спектроскопии. Пер. с англ. М.: Мир. 1986. С. 496.

136. Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеинов. 1989. М.: Наука. С. 276.

137. Гаврилов В.Б., Конев С.В., Калоша И.И. Люминесцентные свойства пи-ронового красного нового молекулярного зонда для исследования белков // Журнал прикладной спектроскопии. 1999. Т. 66. № 3. С. 369374.

138. Kalyanasundaram К., Thomas J.K. Environmental Effects on Vibronic Band Intensities in Pyrene Monomer Fluorescence and Their Application in Studies of Micellar Systems // Journal of the American Chemical Society. 1977. Vol. 99. № 7. P. 2039-2044.

139. Ильинская О.Н., Колпаков А.И., Зеленихин П.В., Круглова З.Ф., Чойдаш Б., Дорошенко Е.В., Мулюкин А.Л., Эль-Регистан Г.И. Влияние аутоин-дуктооров анабиоза бактерий на геном микробной клетки // Микробиология. 2002. Т. 71. №2. С. 194-199.

140. Нечипуренко Ю.Д., Рябоконь В.Ф., Семёнов С.В., Евдокимов Ю.М. Термодинамические модели, описывающие образование «мостиков» между молекулами нуклеиновых кислот в жидких кристаллах // Биофизика. 2003. Т. 48. Вып. 4. С. 635-643.

141. Евдокимов Ю.М. Жидкокристаллические формы нуклеиновых кислот // Вестник РАН. 2003. Т. 73. № 8. С. 712-721.

142. Жижина Г.П., Олейник Э.Ф. Инфракрасная спектроскопия нуклеиновых кислот// Успехи химии. 1972. Т. 41. № 3. С. 474-511.

143. Mohr S., Sokolov N., Не С., Setlow P. Binding of small acid-soluble spore proteins from Bacillus subtilis chanches the conformation of DNA from В to A // Biochemistry. 1991. Vol. 88. P. 77-81.

144. Иванов В.И., Минченкова JI.E. А-форма ДНК: в поисках биологической роли // Молекулярная биология. 1994. Т.28. С. 1258-1271.

145. Taillander Е., Liquier J. Infrared Spectroscopy of DNA // Methods Enzymol. 1992. V. 211. P. 307-335.

146. Sukhorukov B.I., Montrel M.M. Infrared and X-ray diffraction study of the effect of protonation of DNA on its B-to-A transition // Biophys. Chem. 1990 V. 35(1) P. 47-54.

147. Ghomi M., Letellier R., Liquier J., Taillandier E. Interpretation of DNA vibrational spectra by normal coordinate analysis // Int. J. Biochem. 1990. Vol. 22. № 7. P. 691-699.

148. Поляничко A.M., Чихиржина E.B., Андрущенко B.B., Виезер Г., Воробьёв В.И. Спектральные исследования структуры комплексов ДНК с ионами Мп в УФ- и ИК-диапазонах // Молекулярная биофизика. 2005. Т. 50. Вып. 5. С. 810-817.

149. Ouameur A., Tajmir-Riahi Н. Interactions with Biogenic Polyamines and Cobalt(III)hexamine Studied by Fourier Transform Infrared and Capillary Electrophoresis // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. № 40. P. 42041-42054.169. http://www.sigmaaldrich.com

150. Монтрель M.M., Сухоруков Б.И. Влияние ионов водорода на Б-А переход в ДНК // Мол. биол. 1989. Т. 23. № 3. С. 699-707.

151. Семёнов М.А., Сухоруков Б.И., Малеев В.Я. Гидратируются ли азотистые основания в ДНК при низких влажностях // Биофизика. 1981. Т. 26. Вып. 6. С. 979-984.

152. Шабарчина Л.И., Монтрель М.М., Савинцев И.В., Сухоруков Б.И. Кон-формационное состояние ДНК в мультислойной плёнке с катионным амфифилом // Биофизическая химия. 2003. Т. 77. № 11. С. 2068-2074.

153. Карасёв В.Е., Бабий А.П. Комплексы Cu(II) с дегидратированной спиральной ДНК // Электронный журнал «Исследовано в России», 2003, Т.6, С. 1038-1048. http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/1998/003.pdf

154. Ivanov V.I., Minchenkova L.E., Minyat Е.Е., Frank-Kamenetskii M.D., Schyolkina A.K. The В to A transition of DNA in solution // 1974. J.Mol.Biol. V. 87. P. 817-833.

155. Nelson R.G., Johnson W.C. Jr. Conformation of DNA in ethylene glycol // 1970. Biochem. Biophys. Res. Commun. V. 41. № 1. P. 211-216.

156. Green. G., Mahler H. Conformational changes of deoxyribonucleic acid and polydeoxynucleotides in water and ethylene glycol. 1971. Biochemistry. V. 10. P. 2200-2216.

157. Гагуа A.B., Маленков Г.Г., Тимофеев В.П., Дудич И.В. Полярность окружения как фактор, определяющий конформацию ДНК // 1978. Молекулярная биология. Т. 12. № 3. С. 669-675.

158. Давыдова О.В., Каргов С.И., Влияние диэлектрической проницаемости растворителя и концентрации ДНК на процесс ее термической денатурации в водно-органических растворах // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия. 1999. Т. 40. №3. С. 152-154.

159. Маргулис А.Б., Ильинская О.Н., Колпаков А.И., Эль-Регистан Г.И. Индукция SOS-ответа клетки под действием ауторегуляторных факторов микроорганизмов // Генетика. 2003. Т. 39. №9. С. 1180-1184.

160. Мулюкин А.Л., Луста К.А., Грязнова М.Н., Козлова А.Н., Дужа М.В., Дуда В.И., Эль-Регистан Г.И. Образование покоящихся форм Bacilluscereus и Micrococcus luteus // Микробиология. 1996. Т. 65. № 6. С. 782789.

161. Громов Б.В., Павленко Г.В. Экология бактерий: Учеб. пособие. Л.:Изд-во Ленинградского ун-та, 1989. 248с.

162. Рубин А.Б. Биофизика, в 2-х томах. М.: Высшая школа, 1987.

163. Tyrrell R.M. Induction of pyrimidine dimers in bacterial DNA by 365nm radiation// Photochem. And photobiol. 1973. - Vol. 17. - №1, - P.69-73.

164. Фрайкин Г.Я., Страховская М.Г., Рубин А.Б., Индуцирорванные све-тотм процессы защиты клеток от фотоповреждений // Биохимия. 2000. Т.65. Вып.6. С.865-875.

165. Pospisilova S., Kypr J. UV Light-induced Duplex-to-duplex Crosslinking of DNA Molecules in Aqueous Ethanol Solutions // Photochemistry and Photo-biology. 1998. Vol. 67. №4. P. 386-390.

166. Фрайкин Г.Я. Механизмы УФ-индуцированных деструктивных и фото-модифицирующих реакций у микроорганизмов / Молекулярные механизмы биологического действия оптического излучения. М.: Наука, 1988.-232 с.

167. Vagel A., Roo E. Alkylresorcinols rare chemicals available in bulk // In-nov. Pharm. Tech. 2004. C.94-95.

168. Степаненко И.Ю., Мулюкин A.JI., Козлова А.Н., Николаев Ю.А., Эль-Регистан Г.И. Роль алкилоксибензолов в адаптации Micrococcus luteus к температурному шоку // Микробиология. 2005. Т. 54. № 1. С. 26-33.

169. Мартиросова Е.И., Карпекина Т.А., Эль-Регистан Г.И. Модификация ферментов естественными химическими шаперонами микроорганизмов // Микробиология. 2004. Т. 73. № 5. С. 708-715.

170. Будкер В.Г., Дегтярёв С.Х., Соколов А.В., Расщепление ДНК, адсорбированной на поверхности фосфолипидных мембран, рестриктазами типа II//Биохимия. 1986. Т.51. №9. С. 1496-1498.

Информация о работе

Давыдова, Ольга Константиновна
кандидата биологических наук
Саратов, 2006
ВАК 03.00.07

Диссертация

Взаимодействие алкилоксибензолов - ауторегуляторных d1-факторов микроорганизмов с ДНК - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы