Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение роли алкилоксибензолов в стабилизации и модуляции активности ферментных белков

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Изучение роли алкилоксибензолов в стабилизации и модуляции активности ферментных белков"

На правах рукописи

МАРТИРОСОВА Елена Игоревна

ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ АЛКИЛОКСИБЕНЗОЛОВ В СТАБИЛИЗАЦИИ И МОДУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТНЫХ БЕЛКОВ

03.00.23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2007

003066263

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Российского химико-технологического университета им Д И Менделеева совместно с Институтом микробиологии им СН Виноградского РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Эль-Регистан Галина Ивановна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Капрельянц Арсений Сумбатович

кандидат технических наук Пичугина Татьяна Викторовна

Ведущая организация: НТЦ «Лекбиотех»

Защита состоится «»£2007 г в /¿?ЗР, часов на заседании диссертационного совета ДМ 212 204 13 в Российском химико-технологическом университете им Д И Менделеева по адресу 125047, Москва, Миусская пл, 9 в ауд 443

С диссертацией можно ознакомиться в информационно-библиотечном центре РХТУ им Д И Менделеева

Автореферат разослан «13» 2007 ]

Ученый секретарь диссертационного совета ДМ 212 204 13 У/ y/Zz&aA^-- Шакир И В

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Ферментные белки являются одними из наиболее эффективных участников технологий в пищевой промышленности, в производстве премиксов, фармацевтических препаратов, в кожевенной, текстильной и других отраслях промышленности Однако, невысокая стабильность белковых макромолекул, ограничивает область их практического применения, что диктует необходимость стабилизации ферментов Другой фундаментальной проблемой современной биотехнологии, решения которой востребованы практикой, является целенаправленное изменение функциональной активности ферментных белков в сторону, как повышения, так и понижения их активности

В последние годы большое внимание уделяется стабилизации белковых молекул с помощью химических шаперонов (ХШ), представленных низкомолекулярными соединениями, выполняющими такую же функцию, что и молекулярные шапероны [Welch, Brown, 1996, Tatzelt et al, 1996] В отличие от молекулярных, химические шапероны стабилизируют белки неспецифически к структуре макромолекул в их совместных комплексах, образующихся за счет слабых взаимодействий (гидрофобных, ван-дер-ваальсовых, водородных связей) К наиболее изученным химическим шаперонам относятся глицерин, некоторые аминокислоты, сахара (трегалоза), многоатомные спирты Химическими шаперонами являются и алкилированные оксибензолы (АОБ), что было обнаружено при изучении механизмов действия микробных ауторегуляторных факторов di (ф<1[) - аутоиндукторов анабиоза, представленных у ряда бактерий и дрожжей алкилоксибензолами [Беспалов с соавт, 2000, Колпаков с соавт, 2000], и участвующих в развитии стрессового ответа клетки [Ильинская с соавт, 2000] и образовании покоящихся форм [Мулюкин с соавт , 1996] Важным свойством АОБ является показанная для одного из гомологов - С12-АОБ, способность повышать устойчивость модельных ферментов к pH-, UF-, Т-воздействиям [Колпаков с соавт, 2000] Однако, как правило, стабилизация белка сопровождается ингибированием его каталитической активности [Goller, Gahnski, 1999] Поэтому, разработка приемов и выяснение молекулярных механизмов модификации ферментных белков, приводящей к их функциональной стабилизации одновременно с направленным изменением каталитической активности (стимуляция -ингибирование), представляет фундаментальный интерес и имеет важное практическое значение

Цель работы — изучить роль алкилоксибензолов - химических аналогов микробных ауторегуляторных факторов db в процессах стабилизации и модуляции

активности ферментных белков и разработать приемы модификации ферментов в промышленных препаратах

Задачи исследований

1 Изучить эффекты взаимодействия индивидуальных модельных ферментов с гомологами и изомерами алкилокеибеязолов (С7-АОБ, С]2-АОБ и тирозолом) как химическими шаперонами

2 Разработать приемы модификации алкилоксибензолами ферментных белков в промышленных препаратах с целью их стабилизации и направленной регуляции активности

3 Изучить механизмы действия АОБ в процессах модификации структуры белков

Научная новизна

1 В опытах in vitro впервые показана способность химических аналогов фс1] (С7-АОБ, Ci2-AOB и тирозола) направленно модифицировать структуру ферментных белков, что приводит к повышению их функциональной стабильности и изменению каталитической активности в сторону, как активации, так и ингибирования Установлено, что вектор изменения каталитической активности модифицированных АОБ ферментных белков зависит от структуры и концентрации АОБ как модификатора

2 Показано эффективное модифицирующее действие АОБ на концентрированные (жидкие) промышленные ферментные препараты, обеспечивающее повышение их устойчивости к тепловой денатурации и стимуляцию каталитической активности в широком диапазоне рН и температур

3 Обнаружено, что структурно различающиеся гомологи АОБ по-разному влияют на характер изменений каталитической активности белков и их физико-химические свойства, такие как вязкость, набухание, взаимодействие с водным окружением Выявлена корреляция между изменением степени гидрофобности модифицированных алкилоксибензолами ферментных белков и модуляцией их активности

4 На основании данных динамики и внутримолекулярной реорганизации белков (лизоцима), модифицированных АОБ, предложены гипотезы, объясняющие изменение активности и стабилизацию ферментов в их комплексах с АОБ

Практическая ценность работы

1 Разработан способ стабилизации и направленной модуляции каталитической активности ферментов для сухих и жидких промышленных препаратов, основанный на

использовании алкилоксибензолов в качестве структурных модификаторов белков Способ позволяет увеличить скорость катализа и глубину превращения промышленных полимерных субстратов (крахмала, углеводных полимеров солода, казеина), а также повысить каталитическую активность в широком диапазоне рН и температур Предложен прием эффективной модификации концентрированных ферментных препаратов алкилоксибензолами за счет дробного внесения АОБ

2 На основе использования С12-АОБ предложен способ ингибирования ферментативной активности для производств, включающих стадии консервации, в частности, таких как прекращение брожения при производстве пива, кумыса, кваса и ДР

3 Полученные в работе результаты могут быть использованы для оптимизации технологий получения высокоактивных и стабильных препаратов ферментов, повышения эффективности производств, основанных на ферментативных процессах, разработки эффективных способов защиты материалов от микробных биоповреждений, а также для консервации

Апробация работы и публикации Результаты работы были представлены на 3-ей Международной конференции по стабилизации белка «Biocatalyst stability» (Тулуза, Франция, 2002), 1-ом и 2-ом Международных конгрессах «Биотехнология — состояние и перспективы развития» (Москва, 2002, 2003), Всероссийской научно-технической конференции-выставке «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации» (Москва, 2003), 2-ой Международной конференции «Микробное разнообразие состояние, стратегия сохранения, биологический потенциал» (Пермь-Казань-Пермь, 2005), Всероссийской Молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2005) По материалам диссертации опубликовано 10 работ, из них 4 статьи и 6 тезисов

Структура диссертации. Диссертация изложена на 150 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы, включающего 186 работ отечественных и зарубежных авторов Диссертация иллюстрирована 5 таблицами и 43 рисунками

ЭКСПЕРИМЕНТ АЛЬВГЫЯ ЧАСТЬ Глава 1. Объекты и методы исследования

Объекты исследования Целлюлазы ФП «Целловиридин ГЗх» продуцент Trichoderma viride (АО «Восток»), концентрированные ФП глюкоамилазы, продуцент Aspergillus avamori и а-амилазы, продуцент Bacillus subtilis (АО «Биосинтезе», Литва),

высокоочищенные ß-амилаза из ячменя («Fluka») и трипсин из свиной поджелудочной железы («Sigma»), лизодим яичный (НПО «Биолар»)

Биохимические методы анализа. Выделение микробных алкилоксибензолов проводили, как описано ранее [Светличный с соавт, 1986] Концентрацию АОБ в образцах определяли колориметрически с диазониевым производным 3,3'-диметоксибензидина (Fast Blue В Salt diazotized — FBB, «Sigma») [Tluscik et al, 1981] В качестве химических аналогов Факторов di использовали алкилоксибензолы С7-АОБ, С!2-АОБ, и 2-(4-парагидроксифенил)-этан-1-ол (тирозол), синтезированные в МИТХТ им MB Ломоносова со степенью чистоты 99,9% АОБ вносили в реакционные среды в виде водно-спиртовых растворов или водорастворимых калиевых солей Количество белка определяли по методу Лоури [Lowry et al, 1951] и колориметрически с Кумаси синим («Fluka») [Bradford, 1976] Количество редуцирующих веществ определяли колориметрически с 3,5-дишпросалициловой кислотой («Fluka») [Miller, 1959] Активность целлюлаз определяли по количеству образующихся при гидролизе субстрата (Na-соль карбоксиметилцеллюлозы) редуцирующих веществ [Рухлядева, Полыгалина, 1981] Активность амилаз определяли по количеству образующихся при гидролизе крахмала редуцирующих веществ [Грачева с соавт, 1982] Активность трипсина определяли при гидролизе казеина модифицированным методом Ансона [Грачева с соавт, 1982] Активность лизоцима определяли по снижению оптической плотности суспензии клеток Micrococcus luteus фазы экспоненциального роста [Gönn et al, 1971] Значения Km и Vmax ß-амилазы были определены из зависимостей Лайнуивера-Бэрка

Физико-химические методы анализа. Вязкость растворов белков определяли вискозиметрическим методом [Алейникова, Рубцова, 1988] Степень набухания белка определяли по модифицированной методике [Зимон, Лещенко, 2001] Гель-фильтрацию растворов белков проводили на колонке (35,0x2,5 см), заполненной сефадексом G-75 («Chemapol») Показатель гидрофобности белка (ПГ) определяли по модифицированной методике [Серебрякова с соавт, 2002], где в качестве липофильной фазы использовали хлороформ Рэлеевское рассеивание Мессбауэровского излучения белковых систем (РРМИ) регистрировали на установке ИХФ им НН Семёнова РАН при энергетическом разрешении As«10~9 эв Молекулярно-динамическое компьютерное моделирование (МДКМ) проводили методами молекулярной динамики и компьютерной графики в программе MoDyp 1 13 build la

Статистический анализ проводили стандартными математическими методами (t-тест Стьюдента) в программе Microsoft Excel 2003 Критерий вероятности Р < 0,05 принимали достаточным для достоверной разницы между опытной и контрольной группами данных

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Глава 2 Модификация алкилоксибензолами ферментов в промышленных препаратах

В наших исследованиях в качестве структурных модификаторов ферментов были использованы индивидуальные соединения - С12-АОБ, С7-АОБ, аналоги ф<1, бактерий [Осипов с соавт, 1986], и 2-(4-парагидроксифенил)-этан-1-ол (тирозол), фс1, дрожжей [Батраков с соавт, 1993], различающиеся числом и положением заместителей (гидроксильных групп) в ароматическом кольце и длиной алкильного радикала, что определяет степень гидрофобности их молекул и влияет на характер взаимодействия с молекулами биополимеров Учитывая, что для модификации структуры макромолекул может требоваться определенное время [Березин, 1985, Беспалов с соавт, 2000], опыты проводили двумя способами (1) одновременно смешивая растворы фермента, модифицирующего фактора и субстрата -беспрединкубационный способ, (2) предварительно стабилизируя фермент модификатором в течение 40 минут - прединкубационный способ О модифицирующем действии добавок судили по изменению каталитической активности ферментов [Березин, 1985]

Модификация а-амилазы Сц-АОБ. Было установлено, что взаимодействие Сп-АОБ с а-амилазой (0,1 ед/мл) имело концентрационную зависимость в низких концентрациях (0,1-0,93 мМ) обуславливало стимуляцию каталитической активности а-амилазы до 130% (от контроля) (рис 1), при более высоких (выше 1,2 мМ) -вызывало ингибирование, при этом способ внесения АОБ не влиял на характер изменения активности Отметим, что стимулирующий эффект длинноцепочечных АОБ в низких концентрациях показан впервые

Другой эффект модификации ферментов Сп-АОБ заключался в повышении их операционной стабильности, о чем судили по сохранению ими функциональных свойств в условиях, отличных от «стандартных» Так, стабилизированная (Си-АОБ) ct-амилаза имела существенно более широкие температурный и рН-диапазоны катализа (рис 2, табл 1) Для других ферментов показаны аналогичные закономерности

0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 2 С и-АОБ, мМ

20 30 40 50 60о 70 80 Температура, С

Рис 1 Концентрационная зависимость действия Сп-АОБ на изменение активности ФП а-амилазы в вариантах 1 - прединкубации, 2 - без прединкубации, 3 - максимальная активность в контроле (100%)

Модификация ферментов СгАОБ. Модификация структуры ферментов другим гомологом - С7-АОБ, отличающимся от С12-АОБ меньшим размером алкильного радикала, и вследствие этого, меньшей гидрофобностью, во всем диапазоне применяемых концентраций (0,8-12,9 мМ) обуславливала повышение каталитической активности всех изучаемых ферментов Для всех ферментов а-амилазы (0,017 ед/мл), глюкоамилазы (0,03 ед/мл), |3-амилазы (0,04 мг/мл), цеялюлаз (0,6 мг/мл), трипсина (1,2мкг/мл) в обоих вариантах опытов, без- и прединкубационном, изменения активности имели осциллаторный характер и зависели от концентрации вносимого С7-АОБ (рис 3) Максимальный прирост ферментативной активности при внесении Су-АОБ был зафиксирован для целлюлаз на 100% (9,7 мМ), трипсина на 45% (4,8 мМ), глюкоамилазы на 60% (9,7 мМ), а-амилазы на 55% (1,6 мМ), Р-амилазы на 70% (4,8 мМ) (рис 3) При этом для всех исследованных гидролаз в вариантах беспрединкубационной обработки были отмечены два максимума активности Появление второго можно объяснить вероятной модификацией полимерного субстрата избытком молекул АОБ Это предположение было подтверждено в опытах с раздельной прединкубацией с С7-АОБ обоих реакционных партнеров - фермента и субстрата

Рис 2 Действие С12-АОБ на изменение активности ФП а-амилазы при различных значениях температуры 1 - контроль (без АОБ), 2 - 0,2 мМ, 3 - максимальная активность в контрольном варианте

В опытах с предварительной модификацией крахмала было получено такое же увеличение эффективности гидролиза, как и при модификации а-амилазы (на 50%), но концентрации требуемого для этого Ст-АОБ были различны в первом случае 11,29мМ, а во втором - на порядок меньше 1,61 мМ Для целлюлаз на изменение активности катализируемой реакции в большей степени влияла модификация субстрата (ТЧа-КМЦ), а не фермента (рис 4) Так, при концентрации С7-АОБ 8,06 мМ эта разница составила 70 %

7,5 10 С7-АОБ, мм

5 7,5 10 С7-АОБ, мМ

Рис 3 Концентрационная зависимость действия С7-АОБ на изменение активности ФП глюкоамилазы в вариантах 1 - прединкубации, 2 - без прединкубации

Рис 4 Влияние на целлюлолитическую активность ФП "Целловиридин ГЗх" раздельной прединкубации с С7-АОБ 1 - фермента, 2 - субстрата, 3 - фермента и субстрата

Вероятно, при модификации субстрата, происходит его частичная реорганизация и увеличение числа доступных сайтов, а возможные изменения степени гидратированности молекул приводят к возрастанию фермент-субстратного узнавания и реакционной способности В наибольшей степени модификация субстрата С7-АОБ была результативна в реакциях гидролиза целлюлозы, эффективность которого, как было показано ранее, определяется способностью фермента «адсорбироваться» на субстрате [Рабинович, Мельник, 2000] По-видимому, модификация целлюлозы с помощью АОБ увеличивает эту способность, что повышает скорость и глубину гидролиза (рис 4)

Операционная стабилизация ферментов в результате модификации их структуры С7-АОБ проявляется в значительном расширении диапазона рабочих значений температуры и рН с сохранением оптимумов катализа (табл 1) Неизменность рН-оптимумов катализа указывает на то, что структурные модификации

производными оксибензолов не затрагивают ионогенные группы, участвующие в формировании активного центра ферментов [Березин, 1985]

Модификация глюкоамилазы тирозолом Эффекты модификации структуры ферментов в комплексах с другим аналогом микробных фс^ - тирозолом, отличающимся от представленных выше АОБ расположением гидроксильных групп и отсутствием гидрофобного алкильного радикала и, поэтому большей полярностью молекулы [Schultz, 1987], продемонстрированы в опытах с ФП глюкоамилазы Изменение активности модифицированного тирозолом фермента зависело нелинейно от концентрации добавки и способа ее внесения Максимум увеличения активности наблюдался при дозе модификатора 16,3 мМ и составил 130% (рис 5)

Протекторные свойства тирозола выражались в развитии операционной стабилизации модифицируемого фермента так же, как в случае с другими АОБ Беспрединкубационная обработка глюкоамилазы данным модификатором позволила достигауть лучших результатов в рН-протекции фермента (рис 6), чем в его термопротекции (табл 1)

Продемонстрированная неспецифичность воздействия АОБ на различные ферменты, не противоречит показанному действию химических шаперонов иной структуры, например, осмопротекторов глицин-бетаина, эггоина [Plaza del Pino, Sanchez-Ruiz, 1995, Лойко с соавт, 2002]

Тирозол, мМ

Рис 5 Концентрационная зависимость действия тирозола на изменение активности ФП глюкоамилазы в вариантах 1 - прединкубации, 2 - без прединкубации

Рис 6 Действие тирозола на изменение активности ФП глюкоамилазы при различных значениях рН 1 - контроль (без АОБ), 2 - 0,2 мМ, 3 - максимальная активность в контрольном варианте

При объяснении полученных результатов следует учесть, что взаимодействие

белков с ХШ, в нашем случае, с короткоцепочечными С7-АОБ и тирозолом и

длинноцепочечным С^-АОБ в низких концентрациях, может способствовать

реорганизации белковых цепей в области или вне активного центра фермента,

изменению поверхностного заряда белковой глобулы, изменению сольватных

оболочек белков Конформационная реорганизация белковых цепей (вне активного

центра) косвенно подтверждается изменением спектра флуоресценции рибонуклеазы,

модифицированной С^-АОБ [Колпаков с соавт, 2000] Так же, как будет показано

ниже, имеют место изменения сольватных оболочек белков, функциональные свойства

воды в которых отличаются от свойств воды в объемной фазе, что показано для других

ХШ [Schein, 1990, Tiwari, Bhat, 2006] Совокупно это приводит к увеличению

молекулярной динамики белка и, вследствие этого, повышению его каталитической

активности Доказательства такого объяснения рассмотрены в 4 главе

Таблица 1 Действие АОБ на изменение ферментативной активности при различных значениях температуры и pH гидролиза

Модифицированный фермент Изменение границ температурного диапазона катализа Изменение границ pH-диапазона катализа

Концентрация АОБ, мМ Диапазон температур, °с* Концентрация АОБ, мМ Диапазон pH, ед pH*

с7-аоб

Целлюлазы 1,61 10-65 (50)** 1,61 2,6-7,3 (4,5)**

а - амилаза 2,67 38 - 75 (60) 2,67 4,5 - 6,8 (6,0)

Глюкоамилаза 2,18 47 - 69 (60) 2,18 2,3 - 5,5 (4,0)

с12-аоб

а - амилаза 0,21 40-65 (60) 0,72 3,9-6,7(6,0)

Тирозол

Глюкоамилаза 18,1 54-65 (60) 16,3 2,5 - 5,2 (4,0)

*В указанных диапазонах активность модифицированного фермента > активности

фермента в контроле (при оптимальных значениях температуры и рН)

**В скобках указано оптимальное значение температуры/рН для данного фермента

Поскольку длинноцепочечный Ci2-AOB обладает свойствами ПАВ, то при повышенных концентрациях он образует оболочку мицеллярной структуры вокруг молекулы полимера, что обуславливает снижение конформационной подвижности модифицированного белка [Arakawa et al, 1990, Kaushik, Bhat, 1998] Вследствие этого увеличивается стабильность глобулы одновременно с ингибированием каталитической активности белка, подобно описанным в работах [Zheng, Ornstem, 1996, Rariy,

Kiibanov, 1997, Пожарский, Зенченко, 1998, Baskakov, Bolen, 1998, Варфоломеев, Гуревич, 1999]

В заключение сделаем вывод о том, что для максимальной эффективности катализируемых реакций необходим индивидуальный подход к модификации каждого конкретного фермента, учитывающий выбор низкомолекулярного модификатора (добавки), его концентрацию и способ обработки фермента

Глава 3. Биотехнологические аспекты применения алкилоксибензолов

Модификация ферментов Cf-АОБ в концентрированных ферментных растворах. Для биотехнологических исследований был выбран Ст-АОБ, показавший наилучшие результаты по активации и стабилизации ферментов Модифицировали концентрированные растворы жидких промышленных ФП а- и глюкоамилаз (способ прединкубации), затем разводили до стандартного значения (по единицам активности) фермента и использовали в реакциях гидролиза

Как видно из данных, приведенных в табл 2, при одной и той же норме расхода С7-АОБ (0,16 М на стадии прединкубации) 22-26%-ный прирост активности в сочетании с оптимальной кратностью разведения ФП (активность фермента на стадии прединкубации Ащ,етнк = 2,5 и 12,5 ед/мл) был получен на препаратах глюкоамилазы в 25 и 125 раз более концентрированных, чем в стандартных реакциях (Апрединк= 0Л ед/мл) Максимальная стимуляция (66% прироста активности) была получена для препарата в 12,5 раз более концентрированного (Апрединк = 1,25 ед/мл)

Таблица 2 Зависимость повышения активности глюкоамилазы от соотношения числа моль Су-АОБ к единице ферментативной активности (А) (активность фермента без АОБ принимается за 100%)

Активность, % Расходные нормы

Концентрированные растворы Стандартные растворы*

Прединкубация Гидролиз Прединкубация Гидролиз

Фер- СгАОБ, СгАОБ, Фер- СгАОБ, С,-

мент, А мМ мент, А АОБ,**

ед/мл (моль/ед)хЮ"3 ед/мл (моль/ед)х10"3 мМ

122 12,5 0,013 0,4 0,1 0,096 3,2

126 2,5 0,064 2,5 од 0,105 3,5

166 1,25 0,130 4,0 0,1 0,327 10,9

* Активность ферментного белка в реакционной смеси 0,03 ед/мл, ""Концентрация С7-АОБ рассчитана из рис 3, как соответствующая активности в столбце 1

Таким образом, нами впервые продемонстрирована возможность стабилизации и модуляции активности ферментов алкилоксибензолами в растворах с высоким

содержанием белка, что равно применимо как для жидких концентрированных, так и сухих ферментных препаратов В перспективе промышленного применения разработанный способ стабилизации ферментов обеспечивает снижение как нормы расхода АОБ на единицу фермента, так и объема жидкого ферментного препарата

Возможные способы модификации ферментов с помощью С-гАОБ С целью снижения расхода АОБ при стабилизации промышленно применяемых ферментных белков а- и глкжоамияазы наряду с одноразовым внесением АОБ (0,02-0,16 М) в ферментный раствор был применен дробный способ его подачи на стадии прединкубации Раствор АОБ с концентрацией 0,32 М вносили через каждые 20 мин в ферментный раствор (1 объем) порциями по 1/14 - 1/8 объема, так чтобы его конечная концентрация соответствовала заданному значению (рис 7) Если в области низких концентраций АОБ (до 60 мМ) изменение активности у обоих ферментов не зависело от способа внесения модификатора, то при концентрациях выше 60 мМ способ добавки влиял на результативность реакций гидролиза Равная стимуляция амилолитической активности (до 140%) наблюдалась при меньших концентрациях дробно вносимого АОБ (0,08 М), чем при его разовом внесении (0,12 М) Таким образом, постепенное наращивание концентрации С7-АОБ на стадии прединкубации фермента приводит к уменьшению расхода модифицирующей добавки на единицу фермента

Стабилизация ферментов алкилоксибензолами в концентрированных ферментных растворах рассматривалась в нашей работе с позиций сохранения их функциональных свойств

• Функциональная стабильность сохранения каталитической активности в условиях, способствующих денатурации белка. Для определения термо-/рН-стабильности модифицированной глюкоамилазы после прединкубации фермента (Апрединк= 2,5 ед/мл) с С7-АОБ (0,16 М) их раствор экспонировали (0-60 мин) при температуре 70°С/рН 2 или 9,5, затем охлаждали/нейтрализовали и определяли остаточную ферментативную активность в реакции гидролиза при стандартном значении температуры/рН

Активность модифицированного С7-АОБ фермента в условиях термо- и рН-денатурации была выше, чем в контроле на протяжении всего времени экспонирования (рис 8) Если 60 минутное прогревание нативного фермента привело к потере активности до 57%, то модифицированный фермент сохранил свою активность на 73% (по отношению к контролю до прогревания) (рис 8а) В условиях как кислой,

так и щелочной рН-де пату рал ии активность стабилизированного фермента через 30 мин сохранялась на начальном уровне, в то время как активность нативного фермента непрерывно снижалась (рис. 86). Подобный эффект увеличения устойчивости биополимера к денатурирующим воздействиям 1 фи одновременном повышении каталитической активности уже отмечался в литературе для а-химотриненна, солю бил изированного диизооктилсульфосукшнатом натрия а октане [Ьерезин, 1985]. однако лля водных раствор он ферментов такой эффект показан впервые.

СтЛОБ и предннкубацнонной смеси, М

Дшггслыюсть прогревания при 70"С, чин

О 30 60

Длительность вылерживания

при рН <Щ, мин

Рис. 7. Концентрационная зависимо« гь действия С7-АОЬ на изменение активности а-амилазы в концентрированных растворах Мп^л.нк = 1 Сл/мл) при различных способах внесения ЛОБ' разовом (1) и Дробном (2)

Следует отметить биотехмологичесхую перспективность полученных результатов, в частности, для производства мо-ющих средств, где термостабилькые и щелочеустойчнаые амилазы (п роте азы, липазы) мщуг быть эффективной биологической добавкой для снятия органических загрязнений [Грачева. Кривова, 2000|.

Рис, 8, Стабильность ФП глгокоамилазы в концентрированном растворе

(А-прсш-™ = 2,5 ед/м.т) в условиях терм о- (а) и рН-денатурации (б): I - без С7-ЛОЬ (контроль) я 2 - с С7-ЛОЙ (0,16 М)

• Операционная стабильность как проявление каталитической активности ферментов в условиях, отличных от «стандартных», была продемонстрирована для стабилизированных АОБ ферментов, при их функционировании в широком температурном и рН-диапазонах катализа (табл 2) Использование Ст-АОБ для модификации ферментов в сгущенных препаратах позволяет, также как и в случае с разбавленными растворами ферментов, значительно расширить диапазон рабочих значений температуры и рН

Повышение эффективности функционирования ферментов, модифицированных АОБ, важно для применения ферментов при несоответствии их рН и температурного оптимумов условиям катализа, например в пивоварении при подкислении молочной кислотой затора, в котором происходит амилолитический гидролиз крахмала зерна [Ермолаева, 2000], или в силосовании при применении целлюлаз в условиях низких температур и закисления среды [Грачева, Кривова, 2000]

• Стабильность ферментов при их хранении. Для биотехнологических целей помимо показанных эффектов важно, чтобы модифицированный с помощью АОБ фермент длительное время сохранял свои новые свойства Полученные зависимости (рис 9) свидетельствуют о том, что у ферментов, стабилизированных С7-АОБ, уровень активности был выше, чем в контроле в течение всего времени опыта (35-50 суток)

2

о. я

я &

0,4 0,3 -§0,2 0,1 0

X

\

Рис 9 Активность концентрированных растворов ФП глюкоамилазы

(АПредИЖ= 2,5 ед/мл) 1 - без С7-АОБ (контроль) и 2 -стабилизированного С7-АОБ (0,16 М) в процессе хранения

0

—I—

10

20

30

40

Длительность хранения, сут

50

Установлено следующее операционная стабильность модифицированных С7-АОБ ферментов в водных растворах варьируется для разных ферментов менее выражена для а-амилазы, характерна для глюкоамилазы и возрастает при хранении целлюлаз Стабильность фермента при хранении может быть обусловлена не только изначальной модификацией его структуры при взаимодействии с С7-АОБ, но и ее поддержанием за счет вторичных взаимодействий с окисленными молекулами АОБ

Следует отметить, что алкилоксибензолы обладают выраженной антиоксидантной активностью [Revina et al, 2002] и образующиеся при доступе кислорода продукты их окисления имеют большую биологическую активность, чем нативные молекулы Так, в параллельно проводимых исследованиях было выявлено, что продукты окисления Ст-АОБ повышали активность [3-амилазы (180-200%), при этом эффективные концентрации окисленного АОБ были меньше (8,0 мМ), чем неокисленного (12,9 мМ)

Таким образом, АОБ можно использовать в качестве стабилизатора при хранении ферментных препаратов в условиях доступа кислорода

Применение алкилоксибензолов для интенсификации процессов переработки промышленных субстратов Изучение динамики гидролиза промышленных субстратов модифицированными С7-АОБ (4,8 мМ) ферментами показало, что (1) время полного гидролиза казеина трипсином сократилось в 2 раза, а выход продуктов гидролиза увеличился в 3,4 раза по сравнению с контролем, (2) общее количество продуктов гидролиза крахмала ¡З-амилазой возросло в 1,6 раза при сокращении времени гидролиза в 4-5 раз, (3) время гидролиза крахмала солода сократилось в 10 раз, а количество Сахаров увеличилось в 1,5 раза

Отметим, что в биотехнологической промышленности востребованы приемы не только интенсификации, но и ингибирования ферментативных процессов на стадиях консервации конечных продуктов Этим целям отвечает гомолог Си-АОБ (концентрация > 5 1 (У4 М)

Глава 4 Изменение физико-химических свойств белков, модифицированных алкилоксибензолами

Изменения основных свойств ферментов (активности и стабильности) в их комплексах с различными по гидрофобности АОБ должны быть обусловлены изменениями физико-химических характеристик биополимеров, отражающих, в той или иной степени, конформационные модификации белков и влияющих на кинетические параметры

Физико-химические свойства модифицированных белков. Установлены существенные изменения параметров вязкости (рис 10) и набухания (рис 11) растворов желатина, модифицированного С?- и С12-АОБ, которые в области рН < 6 в обоих случаях могут быть обусловлены образованием межмолекулярных водородных связей между протонированными молекулами белка и АОБ, что коррелирует с повышением биологической активности АОБ при рН < 7 [Эль-Решстан с соавт, 2000, Бухарин с соавт, 2005] В области рН > 7, когда образование водородных связей

ингибировано условиями среды, на изменение учитываемых свойств белка влиял только Сц-АОБ, способный к гидрофобным взаимодействиям за счет алкильного радикала (в отличие от С7-АОБ) (рис 10,11) Таким образом, взаимодействия белка с водой изменяются и отражаются на его гидрофобности

Рис 10 Влияние АОБ на изменение вязкости желатина при различных значениях рН 1 - контроль, 2 - С7-АОБ (8 мМ), 3 - С12-АОБ (0,05 мМ) По оси ординат отложена вязкость в пуазах, (Пз)

т-

0,1 0,2 0,3 0,4 С7-АОБ, мм

Рис 11 Влияние АОБ на изменение степени набухания желатина при различных значениях рН 1 - контроль, 2 - С7-АОБ (8 мМ) 3 - С12-АОБ (0,05 мМ) По оси ординат отложена степень набухания, (%)

т 0,12

0,04 5

в

0,02 <

0,4 0,6 118 1 С,2-АО£, мМ

Рис 12 Концентрационная зависимость действия С7-АОБ на изменение показателя гидрофобности (ПГ) яизоцима и его каталитическую активность (А) Время прединкубации белка с АОБ 10 мин

Рис 13 Концентрационная зависимость действия С и-АОБ на изменение показателя гидрофобности (ПГ) лизоцнма и его каталитическую активность (А) Время прединкубации белка с АОБ 60 мин

Это было показано при исследовании комплексов лизоцима с разными гомологами АОБ методом их перераспределения в бифазной системе «вода - органический растворитель (хлороформ)»

Установлено, что в широком диапазоне концентраций С7-АОБ обуславливал повышение активности при снижении гидрофобности белка (рис 12), С12-АОБ, напротив, вызывал ингибирование активности при повышении гидрофобности лизоцима (рис 13) Эти результаты согласуются со способностью ХШ изменять гидратацию молекул белка plaza del Pino, Sanchez-Ruiz, 1995]

Изменения физико-химических свойств модифицированных АОБ ферментов (Р-амилазы) влияли на изменения основных кинетических параметров Кш и Vmax, которые изменялись различным образом при использовании С7-АОБ (4,8 мМ) или С12-АОБ (0,64 мМ) как шаперонов (табл 3) и позволяют интерпретировать взаимодействия фермент-АОБ как неконкурентную активацию (С7-АОБ) и неконкурентный тип ингибирования (С12-АОБ)

Молекулярные механизмы действия алкилоксибензолов на белки* Для понимания молекулярных событий, приводящих к одновременному повышению функциональной стабильности и активности ферментов, были исследованы молекулярные механизмы взаимодействия лизоцима (модельный объект в динамике белков) с АОБ методом Рэлеевского рассеяния Мессбауэровского излучения (РРМИ) и молекулярно-динамического компьютерного моделирования (МДКМ) Данные РРМИ (рис 14) и параллельно проводимого диффузионного рассеяния рентгеновских лучей (ДРРЛ) показали, что в области малых концентраций С7-АОБ и С^-АОБ, при которых возрастает активность лизоцима, существенно возрастает конформационная подвижность, особенно в присутствии С7-АОБ, ослабевают внутримолекулярные водородные связи, возрастает междоменная подвижность Макромолекула становится более рыхлой, приобретает свойства «жидкой» структуры (fp < 0,3) при гидратации h > 0,25, в отличие от нативного лизоцима (fp > 0,3) в контроле, что объясняет стимуляцию активности фермента (рис 14) Однако разрыхление не имеет характера денатурации, что фиксируется методом ДРРЛ и объясняет наличие функциональной стабильности

^Исследования проведены совместно с проф Ю Ф Крупянским и сотрудниками лаборатории динамики белков ИХФ им Н Н Семенова РАН, за что автор выражает им глубокую благодарность

Таблица 3 Влияние АОБ на изменение кинетических

параметров (3-амилазы

АОБ кш, (мкМ) V * тах? (ммоль/ (мг х мин))

контроль 6,7±0,3 0,03+0,0003

С7-АОБ 6,8±0,2 0,06+0,0008

Сц-АОБ 7,1±0,4 0,014+0,0001

-+---1 1

0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 11

Рис 14 Зависимости доли упругого рассеяния (1р) от степени гидратации (Ъ) для чистого лизоцима (1) и модифицированного С7-АОБ (2) и С^-АОБ (3)

Моделирование системы (МДКМ) лизоцим-вода-ХШ предполагает, что для больших концентраций АОБ имеет место эффект «предпочтительной гидратации» белка [Оекко, ЪтавЪеГГ, 1981], когда молекулы АОБ располагаются во 2-ом - 3-ем гидратных слоях, соответственно «сжимая» белок, в результате чего уменьшаются равновесные флуктуации доменов и стабилизируется молекула Вытесненные из непосредственного контакта с белком молекулы С7-АОБ формируют «стэкинг-образования» типа стопок тарелок, что не мешает функционированию фермента, тогда как гидрофобные молекулы С^-АОБ образуют мицеллоподобные оболочки вокруг белка, что приводит к инактивации гидролиза

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты исследования роли алкилоксибензолов в стабилизации и модуляции активности ферментных белков демонстрируют их способность направленно модифицировать структуру белковых макромолекул с образованием комплексов, обладающих повышенной устойчивостью к денатурирующим воздействиям Повышение стабильности ферментных бежов сопровождалось изменением их каталитической активности в сторону как ингибирования, так и активации, что зависело от структуры АОБ и его концентрации Подобные изменения функциональных свойств белков в их комплексах с различными АОБ коррелировали с изменением физико-химических свойств биополимеров и внутримолекулярных динамических характеристик

Выявленные механизмы воздействия АОБ на функциональную активность и стабильность ферментных белков, позволяют целенаправленно модифицировать структуру белков в промышленных ферментных препаратах различной формы выпуска (жидкие и сухие) с целью повышения их устойчивости к термо- и рН-денатурации и повышения исходной каталитической активности в широком диапазоне температур и рН

ВЫВОДЫ

1 Обнаружена способность химических аналогов ми1фобных ауторегуляторов -С7-АОБ, С12-АОБ и тирозола, изменять конформацию ферментов, обуславливая сопряженные изменения каталитической активности и стабильности белков, что выражается в повышении их термо- и рН-устойчивости и расширении температурного и рН диапазонов катализа

2 Вектор изменения каталитической активности (стимуляция - ингибирование) модифицированных АОБ ферментов зависит от структуры и концентрации АОБ как модификатора

3 Алкилоксибензолы влияют на изменение физико-химических свойств белка в их совместных комплексах Установлена корреляция между изменениями физико-химических свойств белков, модифицированных АОБ (вязкостью, степенью гидрофобности, набуханием, изменения молекулярной массы и четвертичной структуры белка) и структурой АОБ

4 Применение С7-АОБ при гидролизе промышленных субстратов (крахмала, углеводных полимеров солода, казеина) позволяет повысить общую скорость ведения процесса в широком диапазоне рН и температур и увеличить выход конечных продуктов реакции

5 Показано, что эффект модификации структуры ферментов С7-АОБ зависит от способа его внесения (разовое или дробное)

6 Методами физической химии и молекулярно-динамического компьютерного моделирования установлены изменения внутримолекулярной динамики модифицированных АОБ ферментов (на примере лизоцима)

7 На основании структурно-динамических данных предложена предварительная модель взаимодействия молекул алкилоксибензолов с ферментами и сформулированы гипотезы, объясняющие одновременное увеличение стабильности и изменение активности фермента (стимуляция - ингибирование) при различных концентрациях алкилоксибензолов, различающихся гидрофобностью

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Карпекина Т А, Степаненко И Ю , Крылова Е И, Козлова А Н, Грачева И М, Эль-Регистан Г И Участие микробных алкилоксибензолов в регуляции автолитической деструкции дрожжевых клеток // Микробиология 2002 Т 71 № 5 С 611-618

2 Мартиросова Е И, Карпекина Т А, Эль-Регистан Г И Модификация ферментов естественными химическими шаперонами микроорганизмов // Микробиология 2004 Т 73 № 5 С 708-715

3 El-Registan GI, Mulyukm A L , Nikolaev Yu А, Stepanenko I Yu , Kozlova A N, Martirosova EI, Shanenko E F , Strakhovskaya M G , Revma A A The role of microbial low-molecular-weight autoregulatory factors (alkylhydroxybenzenes) in resistance of microorganisms to radiation and heat shock //Advances m Space Research 2005 V 36 P 1718-1728

4 Мартиросова E И, Николаев Ю A, Шаненко E Ф, Крупянский Ю Ф , Лойко Н Г, Эль-Регистан Г И Использование алкилоксибензолов для повышения активности и стабильности ферментов// Химическая технология 2007 № 6 С 250-256

5 Karpekma Т А, Stepanenko I Yu , Krylova Е I, Revma A A , Boudrant J , El- Registan GI Stabilization of enzymes by alkylhydroxybenzenes// 3rd International Conference of Protein Stabilization "Biocatalyst Stability different levels of observation" Toulouse 2002 P 67

6 Эль-Регистан Г И , Карпекина Т А , Степаненко И Ю , Крылова Е И, Шаненко Е Ф, Крылов И А, Красноштанова А А, Баурина М М, Будран Ж Стабилизация индивидуальных ферментов и ферментных систем алкилоксибензояами// 1-ый Международный Конгресс «Биотехнология состояние и перспективы развития» Москва 2002 С 195-196

7 Крылова ЕИ, Эль-Регистан Г И Стабилизация и модуляция активности жидких ферментных препаратов// 2-ой Международный Конгресс «Биотехнология состояние и перспективы развития» Москва 2003 С 296-297

8 Степаненко И Ю , Шишкина М Л, Мартиросова Е И , Шаненко Е Ф , Витол И С , Николаев Ю А, Эль-Регистан Г И Механизм действия алкилоксибензолов на физико-химические свойства белков// Всероссийская научно-техническая конференция-выставка «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации» Москва 2003 С 195-199

9 Эль-Регистан Г И, Николаев Ю А , Степаненко И Ю , Мулюкин А Л, Мартиросова ЕИ, Шаненко ЕФ Роль алкилоксибензолов в стрессоустойчивости клеток микроорганизмов и механизмы их протекторного действия// 2-ая Международная конференция «Микробное разнообразие состояние, стратегия сохранения, биологический потенциал» Пермь-Казань-Пермь 2005 С 108-109

10 Мартиросова Е И, Николаев Ю А, Эль-Регистан Г И Использование алкилоксибензолов в процессах повышения активности и стабильности ферментов// Всероссийская Молодежная школа-конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии» Москва 2005 С 96-97

Подписано в печать 12 09 2007 г Исполнено 12 09 2007 г Печать трафаретная

Заказ № 704 Тираж 100 экз

Типография «U-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш , 36 (495) 975-78-56 www autoreferat ru

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение роли алкилоксибензолов в стабилизации и модуляции активности ферментных белков"

Актуальность проблемы

Ферментные белки являются одними из наиболее эффективных участников технологий в пищевой промышленности, в производстве премиксов, фармацевтических препаратов, в кожевенной, текстильной и других отраслях промышленности. Однако, невысокая стабильность белковых макромолекул, ограничивает область их практического применения, что диктует необходимость стабилизации ферментов. Другой фундаментальной проблемой современной биотехнологии, решения которой востребованы практикой, является целенаправленное изменение функциональной активности ферментных белков в сторону, как повышения, так и понижения их активности.

В последние годы большое внимание уделяется стабилизации белковых молекул с помощью химических шаперонов (ХШ), представленных низкомолекулярными соединениями, выполняющими такую же функцию, что и молекулярные шапероны [Welch, Brown, 1996; Tatzelt et al., 1996]. В отличие от молекулярных, химические шапероны стабилизируют белки неспецифически к структуре макромолекул в их совместных комплексах, образующихся за счет слабых взаимодействий (гидрофобных, ван-дер-ваальсовых, водородных связей). К наиболее изученным химическим шаперонам относятся глицерин, некоторые аминокислоты, сахара (трегалоза), многоатомные спирты. Химическими шаперонами являются и алкилированные оксибензолы (АОБ), что было обнаружено при изучении механизмов действия микробных ауторегуляторных факторов dj (фф) -аутоиндукторов анабиоза, представленных у ряда бактерий и дрожжей алкилоксибензолами [Беспалов с соавт., 2000; Колпаков с соавт., 2000], и участвующих в развитии стрессового ответа клетки [Ильинская с соавт., 2000] и образовании покоящихся форм [Мулюкин с соавт., 1996]. Важным свойством АОБ является показанная для одного из гомологов - С12-АОБ, способность повышать устойчивость модельных ферментов к рН-, UF-, Т-воздействиям [Колпаков с соавт., 2000]. Однако, как правило, стабилизация белка сопровождается ингибированием его каталитической активности [Goller, Galinski, 1999]. Поэтому, разработка приемов и выяснение молекулярных механизмов модификации ферментных белков, приводящей к их функциональной стабилизации одновременно с направленным изменением каталитической активности (стимуляция - ингибирование), представляет фундаментальный интерес и имеет важное практическое значение.

Цель работы — изучить роль алкилоксибензолов — химических аналогов микробных ауторегуляторных факторов di, в процессах стабилизации и модуляции активности ферментных белков и разработать приемы модификации ферментов в промышленных препаратах.

Задачи исследований

1. Изучить эффекты взаимодействия индивидуальных модельных ферментов с гомологами и изомерами алкилоксибензолов (С7-АОБ, С12-АОБ и тирозолом) как химическими шаперонами.

2. Разработать приемы модификации алкилоксибензолами ферментных белков в промышленных препаратах с целью их стабилизации и направленной регуляции активности.

3. Изучить механизмы действия АОБ в процессах модификации структуры белков.

Научная новизна

1. В опытах in vitro впервые показана способность химических аналогов фс^ (С7-АОБ, С12-АОБ и тирозола) направленно модифицировать структуру ферментных белков, что приводит к повышению их функциональной стабильности и изменению каталитической активности в сторону, как активации, так и ингибирования. Установлено, что вектор изменения каталитической активности модифицированных АОБ ферментных белков зависит от структуры и концентрации АОБ как модификатора.

2. Показано эффективное модифицирующее действие АОБ на концентрированные (жидкие) промышленные ферментные препараты, обеспечивающее повышение их устойчивости к тепловой денатурации и стимуляцию каталитической активности в широком диапазоне рН и температур.

3. Обнаружено, что структурно различающиеся гомологи АОБ по-разному влияют на характер изменений каталитической активности белков и их физико-химические свойства такие, как вязкость, набухание, взаимодействие с водным окружением. Выявлена корреляция между изменением степени гидрофобности модифицированных алкилоксибензолами ферментных препаратов белков и модуляцией их активности.

4. На основании данных динамики и внутримолекулярной реорганизации белков (лизоцима), модифицированных АОБ, предложены гипотезы, объясняющие изменение активности и стабилизацию ферментов в их комплексах с АОБ.

Практическая ценность работы

1. Разработан способ стабилизации и направленной модуляции каталитической активности ферментов для сухих и жидких промышленных препаратов, основанный на использовании алкилоксибензолов в качестве структурных модификаторов белков. Способ позволяет увеличить скорость катализа и глубину превращения промышленных полимерных субстратов (крахмала, углеводных полимеров солода, казеина), а также повысить каталитическую активность в широком диапазоне рН и температур. Предложен прием эффективной модификации концентрированных ферментных препаратов алкилоксибензолами за счет дробного внесения АОБ.

2. На основе использования С12-АОБ предложен способ ингибирования ферментативной активности для производств, включающих стадии консервации, в частности, таких как прекращение брожения при производстве пива, кумыса, кваса и др.

3. Полученные в работе результаты могут быть использованы для: оптимизации технологий получения высокоактивных и стабильных препаратов ферментов; повышения эффективности производств, основанных на ферментативных процессах; разработки эффективных способов защиты материалов от микробных биоповреждений, а также для консервации.

Апробация работы

Результаты работы были представлены на 3-ей Международной конференции по стабилизации белка «Biocatalyst stability» (Тулуза, Франция, 2002); 1-ом и 2-ом Международных конгрессах «Биотехнология — состояние и перспективы развития» (Москва, 2002, 2003); Всероссийской научно-технической конференции-выставке «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации» (Москва, 2003); 2-ой Международной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биологический потенциал» (Пермь-Казань-Пермь, 2005); Всероссийской Молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2005).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 10 работ, из них 4 статьи и 6 тезисов.

Структура диссертации

Диссертация изложена на 150 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы, включающего 186 работ отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 5 таблицами и 43 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Мартиросова, Елена Игоревна

выводы

1. Обнаружена способность химических аналогов микробных ауторегуляторов - С7-АОБ, С|2-АОБ и тирозола, изменять конформацию ферментов, обуславливая сопряженные изменения каталитической активности и стабильности белков, что выражается в повышении их термо- и рН-устойчивости и расширении температурного и рН диапазонов катализа.

2. Вектор изменения каталитической активности (стимуляция -ингибирование) модифицированных АОБ ферментов зависит от структуры и концентрации АОБ как модификатора.

3. Алкилоксибензолы влияют на изменение физико-химических свойств белка в их совместных комплексах. Установлена корреляция между изменениями физико-химических свойств белков, модифицированных АОБ (вязкостью, степенью гидрофобности, набуханием, изменения молекулярной массы и четвертичной структуры белка) и структурой АОБ.

4. Применение СуАОБ при гидролизе промышленных субстратов (крахмала, углеводных полимеров солода, казеина) позволяет повысить общую скорость ведения процесса в широком диапазоне рН и температур и увеличить выход конечных продуктов реакции.

5. Показано, что эффект модификации структуры ферментов С7-АОБ зависит от способа его внесения (разовое или дробное).

6. Методами физической химии и молекулярно-динамического компьютерного моделирования установлены изменения внутримолекулярной динамики модифицированных АОБ ферментов (на примере лизоцима).

7. На основании структурно-динамических данных предложена предварительная модель взаимодействия молекул алкилоксибензолов с ферментами и сформулированы гипотезы, объясняющие одновременное увеличение стабильности и изменение активности фермента (стимуляция -ингибирование) при различных концентрациях алкилоксибензолов, различающихся гидрофобностью.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мартиросова, Елена Игоревна, Москва

1. Алейникова Т.Д., Рубцова Г.В. Руководство к практическим занятиям по биологической химии // Под. ред. Николаева А .Я. М.: Высшая школа. 1988.239 с.

2. Андронати С.А., Мазуров A.A. Синтез пептидов в присутствии краун-эфиров // Биоорг. химия. 1984. Т. 10. № 11. С. 1445-1447.

3. Батраков С.Г., Эль-Регистан Г.И., Придачина H.H., Ненашева В.А., Козлова А.Н., Грязнова М.Н., Золотарева H.H. Тирозол — ауторегуляторный фактор di Saccharomyces cerevisiae II Микробиология. 1993. T. 62. №. 4. С. 633-638.

4. Березин И. В., Мартинек К. Основы физической химии ферментативного катализа. М.: Высшая школа. 1977. 280 с.

5. Березин И.В. Действие ферментов в обращенных мицеллах. 39-е Баховское чтение. М.: Наука. 1985. 40 с.

6. Бухарин О.В., Гинцбург А.Л., Романова Ю.М., Эль-Регистан Г.И. Механизмы выживания бактерий // М.: Медицина. 2005. 367 с.

7. Гернет М.В. Культивирование продуцентов целлюлаз и глюкоамилаз. Стабилизация ферментов в растворах // Биотехнология. 1985. № 3. С. 36-42.

8. Гладилин А.К., Левашов A.B. Стабильность ферментов в системах с органическими растворителями // Биохимия. 1998. Т.63. Вып. 3. С. 408-421.

9. Грачева И.М., Грачев Ю.П., Мосичев М.С., Борисенко Е.Г., Богатков C.B., Гернет М.В. Лабораторный практикум по технологии ферментных препаратов. М.: Легкая и пищевая промышленность. 1982. С. 3657, 186-198.

10. Грачева И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов. М.: Элевар. 2000.512 с.

11. Давыдова O.K., Дерябин Д.Г., Никиян А.И., Эль-Регистан Г.И. О механизмах действия ДНК с химическими аналогами микробных аутоиндукторов анабиоза//Микробиология. 2005. Т. 74. № 5. С. 616-625.

12. Давыдова O.K., Дерябин Д.Г., Эль-Регистан Г.И. Длительное сохранение ДНК в водных растворах в присутствии химических аналогов микробных ауторегуляторов // Микробиология. 2006. Т. 75. № 5. С. 662-669.

13. Ермолаева Г. А., Колчева P.A. Технология и оборудование производства пива и безалкогольных напитков. М.: ИРПО/ Академия. 2000. 416 с.

14. Зимон А.Д., Лещенко Н.Ф. Коллоидная химия. М.: АГАР. 2001. 320 с.

15. Капрельянц Л.В. Ферменты в пищевых технологиях: вчера, сегодня, завтра // Пищевые ингредиенты. 2006. № 2.

16. Ленинджер А. Основы биохимии. Пер. с англ. Т. 1. М., 1985. С. 176-179.

17. Лихтенштейн Г.И. Метод спиновых меток в молекулярной биологии // М.: Наука. 1974. С. 256.

18. Лойко Н.Г., Козлова А.Н., Осипов Г. А., Эль-Регистан Г.И. Низкомолекулярные ауторегуляторы развития бактерий Thioalkalivibrioversutus и Thioalkalimicrobium aerophilum II Микробиология. 2002. Т. 71. № 3. С. 308-315.

19. Мартинек К., Левашов А.В., Хмельницкий Ю.Л., Клячко Н.Л. Мицеллярная энзимология // Физико-химические проблемы ферментативного катализа. Под ред. Торчинского Ю.М. М.: Наука. 1981. С. 18-28.

20. Митин Ю.В., Шелленбергер Ф., Якубке Г.-Д. Синтез пептидов, катализируемый папаином, в органических растворителях с минимальным содержанием воды//Биоорг. химия. 1988. Т. 14. №1. С. 5-9.

21. Мулюкин А.Л., Козлова А.Н., Капрельянц А.С., Эль-Регистан Г.И. Обнаружение и изучение динамики накопления ауторегуляторного фактора d) в культуральной жидкости и клетках Micrococcus luteus II Микробиология. 1996а. Т. 65. № 1.С. 20-25.

22. Мулюкин А.Л., Луста К.А., Грязнова М.Н., Козлова А.Н., Дужа М.В., Дуда В.И., Эль-Регистан Г.И. Образование покоящихся форм Bacillus cereus и Micrococcus luteus II Микробиология. 1996b. Т. 65. № 6. С. 782-789.

23. Осипов Г.А., Эль-Регистан Г.И., Светличный В.А., Козлова А.Н., ДудаВ.И., Капрельянц А.С., Помазанов В.В. О химической природе ауторегуляторного фактора d\ Pseudomonas carboxydoflava II Микробиология. 1985. Т. 54. №2. С. 184-190.

24. Плакунов В.К. Основы энзимологии. М.: Логос. 2001. 128 с.

25. Пожарский Э.В., Зенченко Т.А. // Молекулярная биофизика. 1998. Т. 43. С. 31-34.

26. Пучкаев А.В., Власов А.П, Метелица Д.И. Стабильность глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы в составе комплексов с кофактором и субстратом в водных и мицеллярных средах // Прикладная биохимия и микробиология. 2002. Т. 38. № 38. С. 44-52.

27. Пучкаев А.В., Гирина Н.В., Метелица Д.И. Влияние температуры на стабильность уреазы в мицеллярных средах // Прикладная биохимия и микробиология. 1999. Т. 35. № 6. С. 662-670.

28. Рухлядева А.П., Полыгалина Г.В. Методы определения активности гидролитических ферментов // М.: Легкая и пищевая промышленность. 1981. 288 с.

29. Самойлова З.Ю. Проблемы и перспективы использования микробных протеолитических ферментов в биотехнологии // Молодежная наука Прикамья -2004. Пермь. 2004.

30. Светличный В.А., Романова А.К., Эль-Регистан Г.И. Изучение количественного содержания мембраноактивных ауторегуляторов при литоавтотрофном росте Pseudomonas carboxydoflava II Микробиология. 1986. T. 55. № 1. С. 55-59.

31. Семенов А.Н. Непротеолитические ферменты для синтеза пептидов // Биоорг. химия. 1994. Т. 20. № 11. С. 1141 -1147.

32. Серебрякова Е.В., Дармов И.В., Медведев Н.П., Алексеев С.А., Рыбак С.И. Оценка гидрофобных свойств бактериальных клеток по адсорбции на поверхности капель хлороформа // Микробиология. 2002. Т. 71. № 2. С. 237-239.

33. Степаненко И.Ю. Изучение роли алкилоксибензолов в стрессовом ответе микроорганизмов. // Дисс. на соиск. уч. ст. к.б.н. М. 2005. 178 с.

34. Тяги Р., Гупта М.Н. Использование химической модификации и химического сшивания для стабилизации белков (ферментов) // Биохимия. 1998. Т. 63. Вып. 3. С. 395-407.

35. Фёршт Э. Структура и механизм действия ферментов. Пер. с англ. М.: Мир. 1980. 432 с.

36. Хмельницкий Ю. Л., Мартинек К. Ферментативный синтез в двухфазных вводно-органических системах // Биоорг. химия. 1984. Т. 10. № 5. С. 626-630.

37. Abuin Е., Lissi Е., Calderón С. Kinetics of N-glutaryl-l-phenylalanine p-nitroanilide hydrolysis catalyzed by a-chymotrypsin in aqueous solutions of alkyltrimethylammonium bromides // J. Colloid Interface Sci. 2007. V. 308. P. 573-576.

38. Andersson M.M., Hatti-Kaul R. Protein stabilising effect of polyethyleneimine // J. Biotechnol. 1999. V. 72. P. 21-31.

39. Anjum F., Rishi V., Ahmad F. Compatibility of osmolytes with Gibbs energy of stabilization of proteins // Biochim. Biophys. Acta. 2000. V. 1476. P. 75-84.

40. Arakawa T., Bhat R., Timasheff S.N. Preferential interactions determine protein solubility in three component solutions: The MgCl2 system // Biochemistry. 1990. V. 29. P. 1914-1923.

41. Arakawa T., Ejima D., Kita Y., Tsumoto K. Small molecule pharmacological chaperones: From thermodynamic stabilization to pharmaceutical drugs // Biochim. Biophys. Acta. Proteins & Proteomics. 2006. V. 1764. P. 1677-1687.

42. Arakawa T., Prestrelski S.J., Kenney W.C., Carpenter J.F. Factors affecting short-term and long-term stabilities of proteins // Adv. Drug Deliv. Rev. 2001. V. 46. № 1-3. P. 307-326.

43. Athe's V., Guerra P., Combes D. Effect of soluble additives on enzyme thermo- and/or baro-deactivation // J. Mol. Catal. B: Enzymatic. 1999. V. 7. P. 1-9.

44. Back J.P., Oakenfull D,, Smith M.B. Increased thermal stability of proteins in the presence of sugars and polyols // Biochemistry. 1979. T. 18. P. 5191-5196.

45. Baptista R.P., Cabral J.M.S., Melo E.P. Trehalose delays the reversible but not the irreversible thermal denaturation of cutinase // Biotech. Bioeng. 2000. V. 70. P. 699-703.

46. Barbaric S., Luisi P.L. Micellar solubilization of biopolymers in organic solvents. Activity and conformation of a-chymotrypsin in isooctane-AOT reverse micelles // J. Amer. Chem. Soc. 1981. V. 103. P. 4239-4244.

47. Battistel E., Luisi P.L., Rialdi G. Thermodynamic study of globular protein stability in microemulsions // J. Phys. Chem. 1988. V. 92. №. 23. P. 6680-6685.

48. Bedell B.A., Mozhaev V.V., Clark D.S., Dordick J.S. Testing for diffusion limitations in salt-activated enzyme catalysts operating in organic solvents // Biotechnol. Bioeng. 1998. V. 58. P. 654-657.

49. Bell G., Hailing P., Moore B., Partridge J., Rees G. Biocatalyst behavior in low-water systems // Trends Biotechnol. 1995. V. 13 P. 468-473.

50. Bhosale S.H., Rao M.B., Deshpande V.V., Srinivasan M.C. Thermostability of high-activity alkaline protease from Conidiobolus coronatus (NCL 86.8.20) // Enzyme Microb. Technol. 1995. V. 17. P. 136-139.

51. Blow D.M. In: The enzymes/ Ed.P.D.Boyer. 3rd W.Y.L.: Acad.press. 1971. V.3.P. 185-285.

52. Blyumenfeld L.A. Problems of Biological Physics. Berlin: Springer-Verlag. 1981.

53. Bolivar J.M Wilson L., Ferrarotti S.A., Guisan J.M., Fernandez-Lafuente R., Mateo C. Improvement of the stability of alcohol dehydrogenase by covalent immobilization on glyoxyl-agarose // J. Biotechnol. 2006. V. 125. P. 85-94.

54. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein — due binding // Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.

55. Braxton S., Wells J.A. Incorporation of a stabilizing Ca2+-binding loop into subtilisin BPN7/ Biochemistry. 1992. T. 31. P. 7796-7801.

56. Breitling F., Dubel S. Recombinant antibodies. New-York: Wiley. 1999.

57. Broos J. Enzymes in organic media. Effects of crown ethers and other organic additives on the activity and selectivity // Thesis Enschede. 1994. Koninklijke biblioteek, Den Haag.

58. Bucke C. Oligosaccharide synthesis using glycosidases // J. Chem. Tech. Biotechnol. 1996. V. 67. P. 217-220.

59. Carpenter J.F., Crowe J.H. The mechanism of cryoprotection of proteins by solutes // Cryobiology. 1988. V. 25. P. 244-255.

60. Chattopadhyay K., Das T.K., Majumdar A., Mazumdar S. NMR studies on interaction of lauryl maltoside with cytochrome C oxidase: a model for surfactantinteraction with the membrane protein // J. Inorg. Biochem. 2002. V. 91. № 1. P. 116-124.

61. Cherry J.R., Lamsma M.H., Schneider P., Vind J., Svendson A., Jones A., Pedersen A.H. Directed evolution of a fungal peroxidase // Nature Biotech. 1999. V. 17. P. 379-384.

62. Cioci F. Thermostabilization of erithrociyte carbonic anhydrase by polyhydric additives // Enzyme Microb. Technol. 1995. V. 17. P. 592-600.

63. Clapés P., Pera E., Torres J. Peptide bond formation by the industrial protease, neutrase, in aqueous media // Biotechnol. Letters. 1997. V. 19. P. 1023-1026.

64. Climenti F., Palade C.E. Permeability to peroxidase and Ferritin // J. Cell Biol. 1969. V.41.P. 33-58.

65. Costa S.A., Tzanov T., Carneiro A.F., Paar A., Gubitz G.M., Cavaco-Paulo A. Studies of stabilization of native catalase using additives // Enzyme Microb. Technol. 2002. V. 30. P. 387-391.

66. Coulon D., Ghoul M. The enzymatic synthesis of non-ionic surfactants: the sugar esters // Agro Food Ind. Hi-Tech. 1998. V. 9. P. 22-26.

67. Dotsch V., Wider G., Siegal G., Wüthrich K. Salt-stabilized globular protein structure in 7M aqueous urea solution // FEBS Letters. 1995. V. 372. P. 288-290.

68. Eijsink V.G.H., Bjork A., Gaseidnes S., Reidun Sirevag R., Synstad B., van den Burg B., Vriend G. Rational engineering of enzyme stability // J. Biotechnol. 2004.V. 113. P. 105-120

69. Feliu J., de Mas C., López-Santín J. Studies on papain in the synthesis of Gly-Phe in two-liquid phase media // Enzyme Microb. Technol. 1995. V. 17. P. 882-887.

70. Fernández M., Fragoso A., Cao R., Villalonga R. Stabilization of a-chymotrypsin by chemical modification with monoamine cyclodextrin // Proc. Biochem. 2005. V. 40. P. 2091-2094

71. Finkelstein A.B., Ptitsyn O.B., Protein Physics. Academic Press. 2002.

72. Folch J., Less M., Sloane-Stanley C.A. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues // J. Biol. Chem. 1957. V. 226. № LP. 497-509.

73. Fu X., Zhang X., Cha Z. 4,4'-Dianilino-l,r-binaphthyl-5,5'-suIfonate, a novel molecule having chaperone-like activity // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005. V. 329. P. 1087-1093.

74. Garcia D., Marty J. Chemical modification of horseradish peroxidase with several methoxypolyethylene glycols // Appl. Biochem. Bioeng. 1998. V. 73. P. 173-184.

75. Gekko K. Calorimetric study on thermal denaturation of lysozyme in polyol-water mixtures // J. Biochem. (Tokyo). 1982. V. 91. P. 1197-1204.

76. Gekko K., Timasheff S.N. Mechanism of protein stabilization by glycerol: preferential hydration in glycerol-water mixtures // Biochemistry. 1981. V. 20. P. 4667-4676.

77. Gelamo E.L., Silva C.H.T.P., Imasato H., Tabak M. Interaction of bovine (BSA) and human (HSA) serum albumins with ionic surfactants: spectroscopy and modeling//Biochim. Biophys. Acta. 2002. V. 1594. P. 84-99.

78. Gianfreda L., Modafferi M., Greco J.G. Enzyme stabilization towards thermal, chemical and proteolytic deactivation // Enzyme Microb. Technol. 1985. V. 7. P. 78-82.

79. Gill I., Lopez-Fandino R., Jorba X., Vulfson E. Biologically active peptides and enzymatic approaches to their production // Enzyme Microb. Technol. 1996. V. 18. P.162-183.

80. Goller K., Galinski E.A. Protection of a model enzyme lactate dehydrogenase against heat, urea and freeze-thaw treatment by compatible solute additives //J. Mol. Catal. B: Enzymatic. 1999. V. 7. P. 37^5

81. Gonfalves A.M.D., Aires-Barros M.R., Cabral J.M.S. Interaction of an anionic surfactant with a recombinant cutinase from Fusarium solanipisi: a spectroscopic study // Enzyme Microb. Technol. 2003. V. 32. P. 868-879.

82. Goodenough P.W. Food enzymes and the new technology // Enzymes in Food Processing. 2nd ed. Glasgow: Academic and Professional. 1995

83. Gorin G., Wang S.F., Papapavlou L. Assay for lysozyme by its lytic action on M. lysodeikticus cells // Anal. Biochem. 1971. V. 39. P. 113-116.

84. Guo L., Wang J., Qian S., Yan X., Chen R., Meng G. Construction and structural modeling of a single-chain Fv-asparaginase fusion protein resistant to proteolysis // Biotechnol. Bioeng. 2000. V. 70. P. 456-463.

85. Hirokawa K., Kajiyama N., Murakami S. Improved practical usefulness of firefly luciferase by gene chimerization and random mutagenesis // Biochim. Biophys. Acta. 2002. V. 1597. P. 271-279.

86. Illanes A. Stability of biocatalysts // Electron. J. Biotechnol. 1999. V. 2. № 1.

87. Izotova L.S., Strongin A.Y., Chekulaeva L.N., Ostoislavskaya V.l., Lyublinskaya L.A., Timokhina E.A., Stepanov V.M. Purification and properties of serine protease from Halobacterium halobium II J. Bacteriol. 1983. V. 155. P. 826-830.

88. Jang J.W., Ko J.H., Kim E.K., Jang W.H., Kang J.H., Yoo O.J. Enhanced thermal stability of an alkaline protease, AprP, isolated from a Pseudomonas sp. by mutation at an autoproteolysis site, Ser-331 // Biotechnol. Appl. Biochem. 2001. V. 34. P. 81-84.

89. Jermutus L., Tessier M., Pasamontes L., van Loon A.P.G.M., Lehmann M. Structure-based chimeric enzymes as an alternative to directed evolution: phytase as a test case // J. Biotechnol. 2001. V. 85. P. 15-24.

90. John V., Abraham G. Lipase catalysis and its applications. In: Biocatalysts for Industry (Dordick, J. Ed.) // Plenum Press. New-York. 1991. P. 193-217.

91. Jones M.N., Manley P. Interaction between Iysozyme and n-alkyl sulphates in aqueous solution // J. Chem. Soc. Faraday Trans. 1980. V. 76. № 1. P. 654-664.

92. Illanes A. Stability of biocatalysts // Electron. J. Biotechnol. 1999. V. 2. № i.

93. Kabshima T., Li Y., Kanada N., Ito K., Yoshimoto T. Enhancement of the thermal stability of pyroglutamyl peptidase I by introduction of an intersubunit disulfide bond // Biochim. Biophys. Acta. 2001. V. 1547. P. 214-220.

94. Katchalsky-Katzir E. Immobilized enzymes learning from past successes and failures // Trends Biotechnol. 1993. V. 11. P. 471-478.

95. Kaushik J.K., Bhat R. Thermal stability of proteins in aqueous polyol solutions // J. Phys. Chem. B. 1998. V. 102. P. 7058-7066.

96. Kim J., Delio R., Dordick J. S. Protease-containing silicates as active antifouling materials // Biotechnol. Prog. 2002. V. 18. P. 551-555.

97. Kim J., Dordick J.S. Unusual salt and solvent dependence of a protease from an extreme halophile // Biotech. Bioeng. 1997. V. 55. P. 471-479.

98. Klibanov A.M. Approaches to enzyme stabilization // Biochem. Soc. Transact. 1983. V. 11. P. 19-20.

99. Klibanov A. Why are enzymes less active in organic solvents than in water?//Trends Biotechnol. 1997. V. 15. P. 97-101.

100. Knapp S., Ladenstein R., Galinski E.A. Extrinsic protein stabilization by the naturally occurring osmolytes ß-hydroxyectoine and betain // Extremophiles. 1999. V. 3.P. 191-198.

101. Krupyanskii Yu.F., Mikhailyuk M.G., Esin S.V., Korotina O.A., Okisheva E.A., Knox P.P., Nikolaev Yu.A., El Registan G.I. Effects of hydration and interactions with chemical chaperones on protein dynamics // Eur. Biophys. J. V. 34. №6. 2005. P. 615.

102. Kühlmeyer C., Klein J. Stabilization of enzymes with polyvinylsaccharides I: physical stabilization of horseradish peroxidase // Enzyme Microb. Technol. 2003. V. 32. P. 99-106.

103. Lalitha J., Mulimani V.H. Stability and activity of potato acid phosphatase in aqueous surfactant media // Biochem. Mol. Biol. Int. 1997. V. 41. № 4. P. 797-803.

104. Lamas E.M., Barros R.M., Balcro V.M., Malcata F.X. Hydrolysis of whey proteins by proteases extracted from Cynara cardunculus and immobilized onto highly activated supports // Enzyme Microb. Technol. 2001. V. 28 (7-8). P. 642-652.

105. Law B.A. Manipulation of enzymes for industrial application: Protein and environmental engineering // Industrial Enzymology 2nd ed. Basingstoke: Macmillan Press and New York: Stockton Press. 1996.

106. Lee J.C., Timasheff S.N. The stabilization of proteins by sucrose // J. Biol. Chem. 1981. V. 256. P. 7193-7201.

107. Lindsay J., Clark D.S., Dordick J. S. Combinatorial formulation of biocatalyst preparations for increased activity in organic solvents: salt activation of penicillin amidase //Biotechnol. Bioeng. 2004. V. 85. P. 553-561.

108. Liu J.-H., Tsai C.-F., Liu J.-W., Chemg K.-J., Cheng C.-L. The catalytic domain of a Piromyces rhizinflata cellulase expressed in E. coli was stabilized by the linker peptide of the enzyme // Enzyme Microb. Technol. 2001. V. 28. P. 582-589.

109. Longo M.A., Combes D. Thermostability of modified enzymes: a detailed study //J. Chem. Technol. Biotech. 1999. V. 74. P. 25-32.

110. Marchaeda-Egea F.C., Piera-Velazquez S., Cadenas C., Cadenas E. Reverse micells in organic solvents: a medium for biotechnological use of extreme halophilic enzymes at low salt concentrations // Archaea. 2002. V. l.P. 105-111.

111. Marcozzi G., Di Domenico C., Spreti N. Effects of surfactants on the stabilization of the bovine lactoperoxidase activity // Biotech. Prog. 1998. V. 14. P. 653-656.

112. Margolin A. Novel crystalline catalysts // Trends Biotechnol. 1996. V. 14. P. 223-230.

113. Matsushima A., Kodera Y., Hiroto M., Nishimura H., Inada Y. Bioconjugates of proteins and polyethylene glycol: potent tools in biotechnological processes // J. Mol. Catal. B: Enzymatic. 1996. V. 2 (1). P. 1-17.

114. Matsuura T., Miyai K., Trakulnaleamsai S., Yomo T., Shima Y., Miki S., Yamamoto K., Urabe I. Evolutionary molecular engineering by random elongation mutagenesis//Nature Biotech. 1999. V. 17. P. 58-61.

115. Matulis D., Wu C., Tong V.P., Guy C., Lovrien R. Protection of enzymes by aromatic sulfonates from inactivation by acids and elevated temperatures // J. Mol. Catal. B. 1999. V. 7. P. 21-36.

116. Menger F.M., Yamada K. Enzyme catalysis in water pools // J. Amer. Chem. Soc. 1979. V. 101. P. 6731-6734.

117. Miller G.L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar//Anal. Chem. 1959. V. 31. № 5. P. 426-428.

118. Morawski B., Quan S., Arnold F.H. Functional expression and stabilization of horseradish peroxidase by directed evolution in S. cerevisiae II Biotech. Bioeng. 2001. V. 76. P. 99-107.

119. Morello J.-P., Bouvier M., Petaja-Repo U.E., Bichet D.G. Pharmacological chaperones: a new twist on receptor folding // Trends Pharmacol. Sci. 2000. V. 21. P. 466-469

120. Moren A.K., Eskilsson K., Khan A. Phase behavior of oppositely charged protein and surfactant mixtures: DOTAC-BLG-Water // Colloids Surf. B: Biointerfaces. 1997. V. 9. P. 305-314.

121. Mozhaev V. Mechanism-based strategies for protein thermostabilization // Trends Biotechnol. 1993. V. 11. P. 88-95

122. Mrabet N.T., Van den Broeck A., Van den Brande I., Stanssens P., Laroche Y., Lambeir A.M., Matthijssens G., Jenkins J., Chiadmi M., van Tilbeurgh H. Arginine residues as stabilizing elements in proteins // Biochemistry. 1992. V.31.P. 2239-2253.

123. Nielsen A.D., Borch K., Westh P. Thermochemistry of the specific binding of C12 surfactants to bovine serum albumin // Biochim. Biophys. Acta. 2000. V. 1479. P. 321-331.

124. Noritomi H., Koyama K., Kato, S., Nagahama K. Increased thermostability of cross-linked enzyme crystals of subtilisin in organic solvents // Biotech. Technol. 1998. V. 12. P. 467-469.

125. Nouaimi M., Moschel K., Bisswanger H. Immobilization of tiypsin on polyester fleece via different spacers // Enzyme Microb. Technol. 2001. V. 29 (8-9). P. 567-574.

126. Nozaki Y., Reynolds J.A., Tanford C. The interaction of a cationic detergent with bovine serum albumin and other proteins // J. Biol. Chem. 1974. V. 249. p. 4452-4459.

127. Plaza del Pino I.M., Sanchez-Ruiz J.M. An osmolyte effect on the heat capacity change for protein folding // Biochemistry. 1995. V. 34. P. 8621-8634.

128. Quax W., Mrabet N., Liiten R., Schuurhuizen P., Stanssens P., Lasters I. Enhancing the thermostability of glucose isomerase by protein engineering // Biotechnology. 1991. V.9. P. 738-742.

129. Rao Y.K., Bahadur P., Bahadur A., Ghosh S. Stability and kinetic behaviour of some enzymes in surfactant environment // Indian J. Biochem. Biophys. 1989. V. 26. P. 390-393.

130. Rariy R.V., Klibanov A.M. Biochemistry correct protein folding in glycerol // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997 V. 94 (25). P. 13520-13523.

131. Rich J.O., Mozhaev V.V., Dordick J.S., Clark D.S., Khmelnitsky Y.L. Molecular imprinting of enzymes with water-insoluble ligands for nonaqueous biocatalysis // J. Am. Chem. Soc. 2002. V. 124. P. 5254-5255.

132. Ryu K., Kim J., Dordick J.S. Catalytic properties and potential of an extracellular protease from an extreme halophile // Enzyme Microb. Technol. 1994. V. 16. P. 266-275.

133. Sarney D., Vulfson E. Application of enzymes to the synthesis of surfactants //Trends Biotechnol. 1995. V. 13. P. 164-172.

134. Scheckermann C., Wagner F., Fischer, L. Galactosylation of antibiotics using the p-galactosidase from Aspergillus oryzae II Enzyme Microb. Technol. 1997. V. 20. P. 629-634.

135. Schein C.H. Solubility as a function of protein structure and solvent components//Biotechnology. 1990. V. 8. P. 308-317.

136. Schultz T.W. Relative toxicity of para-substituted phenols: log KOW and pKa-dependent structure-activity relationships // Bull Environ. Contam. Toxicol. 1987. V. 38. №6. P. 994-1002.

137. Sergeeva M., Paradkar V., Dordick J. Peptide synthesis using proteases dissolved in organic solvents // Enzyme Microb. Technol. 1997. V. 20. P. 623-628.

138. Shami E.Y., Ramjeesingh M. Rothstein A., Zywulko M. Stabilization of enzymes by their specific antibodies // Enzyme Microb. Technol. 1991. V. 13. P. 424-429.

139. Singer M.A., Lindquist S. Multiple effects of trehalose on protein folding in vitro and in vivo // Mol. Cell. 1998. V. 1. P. 639-648.

140. Spreti N., Profio P., Marte L., Bufali S., Brinchi L., Savelli G. Activation and stabilization of a-chymotrypsin by cationic additives // Eur. J. Biochem. 2001a. V. 268. P. 6491-6497.

141. Spreti N., Reale S., Amicosante G., Di Profio P., Germani R., Savelli G. Influence of sulfobetaines on the stability of the Citrobacter diversus ULA-27 ß-lactamase // Biotech. Prog. 2001b. V. 17. P. 1008-1013.

142. Srinivasulu S., Appu Rao A.G. Kinetic and structural studies on the interaction of surfactants with lipox // J. Agric. Food Chem. 1993. V. 41. P. 366-371.

143. Steet R., Chung S., Lee W.-S., Pine C.W., Do H., Kornfeld S. Selective action of the iminosugar isofagomine, a pharmacological chaperone for mutant forms of acid-ß-glucosidase // Biochem. Pharmacol. 2007. V. 73. P. 1376-1383.

144. Stemmer W.P.C. DNA shuffling by random fragmentation and reassembly // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1994. V. 91. P. 10747-10751.

145. Stemmer W.P.C. Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling // Nature. 1994. V. 370. P. 389-391.

146. Stepanov V.M., Rudenskaya G.N., Revina L.P., Gryaznova Y.B., Lysogorskaya E.N., Filipova I.Y., Ivanova I.I. A serine protease of anarchaebacterium Haloferax mediterranei. A homologue of eubacterial subtilisin//Biochem. J. 1992. 285. P. 281-286.

147. Stevenson D., Stanley R., Furneaux R. Optimization of ß-D-galactopyranoside synthesis from lactose using commercially available ß-galactosidases // Biotechnol. Bioeng. 1993. V. 42. P. 657-666.

148. Sunamoto J., Hamada T., Seto T., Yamamoto S. Microscopic evaluation of surfactant-water interaction in apolar media // Bull. Chem. Soc. Jap. 1980. V. 53. № 3. P. 583-589.

149. Sunamoto J., Kondo H., Akimaru K. Enhanced reactivities of «naked» metal ion and water afforded in reversed micelles // Chem. Lett. 1978. V. 7. № 8. P. 821-824.

150. Sundaram P., Venkatesh R. Retardation of thermal and urea induced inactivation of a-chymotrypsin by modification with carbohydrate polymers // Protein Eng. 1998. V. 11. P. 699-705.

151. Tatzelt J., Prusiner S.B., Welch, W.J. Chemical chaperones interfere with the formation of scrapie prion protein // The EMBO J. 1996. V. 15 (23). P. 6363-6373.

152. Timasheff S.N. The control of protein stability and association by weak interactions with water. How do solvents affect these processes? // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1993. V. 22. P. 67-97.

153. Timasheff S.N., Arakawa T. Stabilization of protein structure by solvents. In Protein Structure: A Practical Approach. Creighton T.E., ed. IRL Press. Oxford. U.K. 1989. P. 331-345.

154. Timasheff S.N., Inoue H. Preferential binding of solvent components to proteins in mixed water-organic solvent systems // Biochemistry. 1968. V. 7. P. 2501-2513.

155. Tiwari A., Bhat R. Stabilization of yeast hexokinase A by polyol osmolytes: Correlation with the physicochemical properties of aqueous solutions // Biophys. Chem. 2006. V. 124. P. 90-99.

156. Tluscik F., Kozubek A., Mejbaum-Katzenellenbogen W. Alkylresorcinols in rye (■Secale cereale L.) grains I I Act. Soc. Bot. Pol. 1981. V. 54. № 7. P. 645-651.

157. Tombs M.P. Stability of enzymes // J. Appl. Biochem. 1985. V. 7. P. 3-24.

158. Tor R., Dror Y., Freeman A. Enzyme stabilization by bilayer "encagement" // Enzyme Microb. Technol. 1989. V. 11. P. 306-312.

159. Triantafyllou A., Wehtje E., Adlercreutz P., Mattiasson B. How do additives affect enzyme activity and stability in nonaqueous media // Biotechnol. Bioeng. 1997. V. 54. P. 67-76.

160. Tropak M.B., Blanchard J.E., Withers S.G, Brown E.D., Mahuran D. High-throughput screening for human lysosomal (3-N-Acetyl Hexosaminidase inhibitors acting as pharmacological chaperones // Chem. Biol. 2007. V. 14. P. 153-164.

161. Tsuji R.F. Enhanced enzymatic activity and stability of trypsin by reductive alkylation in solid phase // Biotechnol. Bioeng. 1990. V. 36. P. 1002-1005.

162. Tzanov T., Andreaus J., Guebitz G., Cavaco-Paulo A. Protein interactions in enzymatic processes in textiles // Electron. J. Biotechnol. 2003. V. 6 №. 3.

163. Van Unen D., Engbersen J., Reinhoudt D. Large acceleration of a-chymotrypsin-catalyzed dipeptide formation by 18-Crown-6 in organic solvents //Biotechnol. Bioeng. 1998. V. 59. P. 553-556.

164. Vermeer A.W.P., Norde W. The influence of the binding of low molecular weight surfactants on the thermal stability and secondary structure of IgG // Colloids Surf. A: Physicochemical and Engineering Aspects. 2000. V. 161. P. 139-150.

165. Viparelli P., Alfani F., Cantarella M. Effect of cationic and non-ionic surfactants on the hydrolysis of N-glutaryl-l-phenylalanine catalysed by chymotrypsin iso-enzymes // J. Mol. Catal. B: Enzymatic. 2003. V. 21. P. 175-187.

166. Volkin D.B., Klibanov A.M. A practical approach. In: Protein function // Ed. Creighton T.E. IRL Press. Oxford. UK. 1989. P. 1-24.

167. Walker J.E., Wonacott A.J., Harris J.I. Heat stability of a tetrameric enzyme, D-glyceraldehyde-3-phosphate dehyrogenase // Eur. J. Biochem. 1980. V. 108. P. 581-586.

168. Welch W.J., Brown C.R. Influence of molecular and chemical chaperones on protein folding. Cell Stress Chaperones. 1996. V. 1 (2). P. 109-115.

169. Wimmer R.; Olsson M., Petersen M.T.N., Hatti-Kaul R., Petersen S.B. and Miiller N. Towards a molecular level understanding of protein stabilization: the interaction between lysozyme and sorbitol // J. Biotechnol. 1997. V. 55. P. 85-100.

170. Wintrode P., Miyazaki K., Arnold F.H. Patterns of adaptation in a laboratory evolved thermophilic enzyme // Biochim. Biophys. Acta. 2001. V. 1549. P. 1-8.

171. Yancey P.H., Clark M.E., Hand S.C., Bowlus R.D., Somero G.N. Living with water stress: Evolution of osmolyte systems // Science. 1982. T. 217. P. 1214-1222.

172. Yang L., Dordick J. S., Garde S. Hydration of enzyme in nonaqueous media is consistent with solvent dependence of its activity // Biophys. J. 2004. V. 87. P.812-821.

173. Ye W.N., Combes D., Monsan P. Influence of additives on the thermostability of glucose oxidase // Enzyme Microb. Technol. 1988. V. 10. P. 498-501.

174. Yuji I., Hidroyuki N., Kosunobu T., Takyuki Y., Anutosh R.S., Yuji S. Ester synthesis catalyzed by polyethylene glycol modified lipase in benzene // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1984. V. 122. P. 845-850.

175. Zancan P., Sola-Penna M. Trehalose and glycerol stabilize and renature yeast inorganic pyrophosphatase inactivated by very high temperatures // Arch. Biochem. Biophys. 2005. V. 444. P. 52-60.

176. Zhang X., Fu X., Zhang H., Liu C., Jiao W., Chang Z. Chaperone-like activity of p-casein // Int. J. Biochem. & Cell Biol. 2005. V. 37. P. 1232-1240.