Влияние алкилоксибензолов на функциональные характеристики антител

Романенко, Наталья Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние алкилоксибензолов на функциональные характеристики антител
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние алкилоксибензолов на функциональные характеристики антител"

На правах рукописи

РОМАНЕНКО Наталья Александровна

ВЛИЯНИЕ АЛКИЛОКСИБЕНЗОЛОВ НА ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ АНТИТЕЛ (ИММУНОГЛОБУЛИНОВ)

03.01.04 - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 О ИЮН 2011

Саратов-2011

4851282

Работа выполнена на кафедре микробиологии

ГОУ ВПО «Оренбургский государственный университет», Оренбург

Научный руководитель - доктор медицинских наук, профессор

Дерябин Дмитрий Геннадьевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

старший научный сотрудник Антонюк Людмила Петровна

доктор медицинских наук, профессор

Никоноров Александр Александрович

Ведущая организация - ГОУ ВПО «Российский химико-

технологический университет им. Д.И. Менделеева», г. Москва

Защита состоится «6» июля 2011 г. в 13.00 часов на заседании диссертационного совета Д 002.146.01 при Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (410049, г. Саратов, просп. Энтузиастов, 13) Факс: (8452) 97-03-83

Автореферат диссертации размещен на сайте ИБФРМ РАН: http://www.ibppm.saratov.ru/obyav dis.html http://ibppm.ru/dissertacionnyy-sovet/

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФРМ РАН

Автореферат разослан «6» июня 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук — В.А. Богатырев

Общая характеристика работы

Актуальность темы

Алкилоксибензолы (АОБ) встречаются на разных уровнях организации живой материи (бактерии, грибы, растения) и демонстрируют чрезвычайно широкий спектр биологических активностей, что делает их объектом значительного числа междисциплинарных исследований (Kozubek А., Tyman J.H.P., 1999; Эль-Регистан Г.И. с соавт., 2006). В частности, у бактерий родов Azotobacter, Pseudomonas, Micrococcus, Thioalkalivibrio и др. эти вещества выполняют роль внеклеточных ауторегуляторов с функциями адаптогенов, способных индуцировать переход клеток в гипометаболическое и анабиотическое состояние (Suzina N.E. et al., 2006; Мулюкин A.JI. с соавт., 2009).

В основе биологической активности АОБ лежит их способность к ряду физико-химических взаимодействий (гидрофобных, электростатических, водородных) с липидами клеточных мембран (Вострокнутова Г.Н. с соавт., 1983), протеинами (Николаев Ю.А. с соавт., 2008) и нуклеиновыми кислотами (Ильинская О.Н. с соавт., 2002), что обуславливает изменение структурной организации и функциональной активности биомакромолекул и надмолекулярных структур. При этом универсальность действия АОБ как «химических шаперонов» (Мартиросова Е.И. с соавт., 2004) обуславливает развитие сходных эффектов в гетерологичных системах. В частности, в присутствии микромолярных концентраций гомологов АОБ показаны изменения каталитической активности, функциональной и операционной стабильности моно- и полисубъединичных ферментных белков не только микробного и растительного, но и животного происхождения (Колпаков А.И. с соавт., 2000; Петровский A.C. с соавт., 2009; Solyanikova I.P. et al., 2010), а также снижение аффинности рецепторов к фибриногену на поверхности тромбоцитов (Kozubek A., Wroblewki Z., 1990).

В связи с тем, что АОБ в значимых количествах поступают в организм человека и животных с пищей, а также синтезируются некоторыми представителями микробиоценоза, их концентрации в биологических жидкостях и тканях могут достигать нано- и микромолярных значений (Landberg R. et al., 2006; Ross A.B. et al., 2010). Это предполагает возможность участия АОБ в регуляции ряда иммунофизиологических и иммунопатологических процессов. Высказанное предположение подтверждает показанная в опытах in vitro способность АОБ изменять розеткообразующую активность Т-лимфоцитов (Казацкая Ж.А. с соавт., 2005), а также оказывать цитотоксическое действие на мононуклеарные фагоциты (Шушпанова О.Н., 2008). Итоговым результатом реализации такой биологической активности могут являться индуцируемые АОБ аллергические состояния (Ока К. et al., 2004; Hershko К. et al., 2005).

Однако до настоящего времени отсутствуют данные, характеризующие эффекты алкилоксибензолов в отношении антител - неферментных иммунных белков человека и животных, включая изменение их основного свойства -антигенсвязывающей способности, а также функциональной и операционной стабильности при экстремальных физических и химических воздействиях.

Цель работы - изучить влияние алкилкоксибензолов - химических аналогов бактериальных ауторегуляторов, на функциональную активность и стабильность антител (иммуноглобулинов).

Задачи исследования

1. Исследовать влияние алкилоксибензолов на функциональные характеристики иммуноглобулинов в реакциях «антиген-антитело».

2. Изучить действие алкилоксибензолов на стабильность иммуноглобулинов при денатурирующих воздействиях и неоптимальных условиях проведения реакций.

Научная новизна

Впервые установлено, что алкилоксибензолы - химические аналоги бактериальных ауторегуляторов, способны блокировать специфическое взаимодействие антител (иммуноглобулинов) с соответствующими антигенами. Выраженность эффектов АОБ зависит от длины алкильного радикала и определяемой этим гидрофобности данных веществ, а концентрационная зависимость их действия варьирует от характеристик реакционной системы. Механизм эффектов АОБ на иммуноглобулины связан с их модифицирующим действием на аффинность, а через него и авидность антител. Эффект распространяется на антитела различной специфичности и классов. В ряде случаев результатом взаимодействия «АОБ : антитела» может стать частичное изменение специфичности иммунных белков.

Обнаружено, что алкилоксибензолы способны дополнительно влиять на результат реакции в системе «антиген-антитело» через взаимодействие с антигенами. Ранжирование значимости эффектов АОБ в рассматриваемой системе позволило установить, что короткоцепочечные гомологи преимущественно реализуют свою биологическую активность через влияние на свойства антигенов, в то время как длинноцепочечные АОБ оказывают большее действие на свойства антител.

Выявлен модифицирующий эффект длинноцепочечных алкилоксибензолов на функциональную активность Бс-фрагментов антител, проявляющийся в затруднении инициации классического пути активации комплемента в реакции комплементзависимого гемолиза.

Изучение эффектов алкилоксибензолов на функциональную и операционную стабильность антител позволило установить разнокачественность отклика на внешние воздействия: АОБ снижали устойчивость белков к термоденатурации, преимущественно увеличивали их устойчивость к УФ-облучению и неоднозначно изменяли диапазон активности при низких и высоких значениях рН.

значимым эффектом 1,3-диокси-5-метилбензола явилась его способность увеличивать сроки сохранения функциональной активности антител при температуре +37°С.

Практическая значимость

Полученные результаты, свидетельствующие об изменении функциональных характеристик антител при взаимодействии с АОБ, позволяют говорить об алкилоксибензолах как о новой группе бактериальных ауторегуляторов с иммуномодулирующими свойствами с перспективой разработки на этой основе новых подходов к регуляции иммунологических реакций в системах in vitro и in vivo.

Результаты модификации антител 1,3-диокси-5-метилбензолом положены в основу оригинального подхода к стабилизации этих белковых молекул в условиях длительного нахождения в водных растворах, ориентированного на увеличение сроков хранения диагностических и лечебно-профилактических препаратов иммуноглобулинов без утраты их функциональной активности. Приоритет разработанного подхода закреплен «Способом стабилизации антител в водных растворах» (положительное решение ФИПС по заявке на изобретение № 2010136488 от 30.08.2010 г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Алкилоксибензолы — химические аналоги бактериальных ауторегуляторов, изменяют функциональные характеристики антител: антигенсвязывающую способность, специфичность и эффекгорные функции. Характер влияния алкилоксибензолов зависит от химического строения АОБ и наиболее выражен у их длинноцепочечных гомологов. Изменение параметров связывания в системе «антиген-антитело» дополнительно может быть обусловлено модификацией свойств антигенов в присутствии АОБ.

2. Алкилоксибензолы различной структуры разнокачественно влияют на стабильность антител при внешних воздействиях: повышают их чувствительность к термоденатурации, преимущественно снижают чувствительность к УФ-облучению и неоднозначно изменяют диапазон активности при различных значениях рН. 1,3-диокси-5-метилбензол увеличивает сроки сохранения функциональной активности антител в условиях их длительного нахождения в водном растворе.

Связь автора с выполнением научных программ и собственный вклад автора

Исследования выполнены в рамках ГБ НИР № 01200606125 «Влияние ауторегуляторных с^-факторов бактерий из группы алкилоксибензолов на структуру и функции биополимеров», а также при поддержке гранта РФФИ 08-04-99078-р_офи «Разработка технологии стабилизации иммунных и ферментных белков с использованием химических шаперонов микробного происхождения».

Научные положения и выводы диссертации полностью базируются на результатах собственных исследований автора.

Апробация работы

Отдельные фрагменты работы доложены и обсуждены на III и

V Межрегиональных конференциях молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой (Саратов, 2006, 2010);

V конференции иммунологов Урала «Актуальные вопросы фундаментальной и клинической аллергологии и иммунологии» (Оренбург, 2006); Региональной конференции молодых ученых с международным участием «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии» (Екатеринбург - Пермь,

2007); III Международной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал» (Пермь - Н. Новгород,

2008); IV Международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (СПб, 2008); Российской научной конференции с международным участием «Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» (Москва, 2009); Всероссийском симпозиуме с международным участием «Биологически активные вещества микроорганизмов: прошлое, настоящее, будущее» (Москва, 2011).

Основные результаты проведенных исследований представлены в 13 печатных работах, в том числе 5 статьях в рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК РФ для публикации материалов диссертационных исследований.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав, включая обзор литературы, описание материалов и методов, 2 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, содержащего 194 источника отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 7 таблицами и 21 рисунком.

Содержание работы

Материалы и методы исследований

При проведении исследований использованы химически синтезированные аналоги микробных алкилоксибензолов со степенью очистки 99.9%, различающиеся длиной алкильного радикала: 1,3-диокси-5-метилбегоол (С)-АОБ), 1,3-диокси-4н-гексилбензол (С6-АОБ), а в ряде экспериментов 1,3-диокси-5н-пропилбензол (Сз-АОБ) и 1,3-диокси-5н-додецилбензол (С12-АОБ) (таблица 1).

Основные эксперименты по исследованию влияния АОБ на показатели связывания в системе «антиген-антитело» выполнены с использованием тест-систем «ВектоТоксо-IgG» (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск, Россия) для иммуноферментного количественного определения иммуноглобулинов класса G к

Toxoplasma gondii. В качестве источника антител использовали имеющиеся в наборах контрольные образцы с известными активностями, выраженными в международных единицах (МЕ/мл).

Таблица 1

Химические аналоги бактериальных ауторегуляторов_

Название Структурная формула Молекулярная масса Производитель

1,3-диокси-5-метилбензол (СгАОБ) igbcH, НО' 124 «Sigma», США

1,3-диокси-5н-пропилбензол (Сз-АОБ) НО^_ )-' сн, сн, НО' 152 «Enamine», Украина

1,3-диокси-4н-гексилбензол (С 6-АО Б) ноч у ^/^СНд ^CH^CHj ^ СН, СН? СН-, 194 «Sigma», США

1,3-диокси-5н-додецилбензол (Си-АОБ) ноч_ / Q\ ^ СН, СН; СН, СИ? СН; ^сн, >-' CHj СН, CHj сн, сн, сн, но 278 «Enamine», Украина

В отдельной серии экспериментов использовали тест-системы «ВектоРубелла-IgG» и «ВектоРубелла-IgM» с оценкой относительных показателей связывания имеющихся в них положительного и отрицательного образцов контрольных сывороток к антигену Rubella virus. При исследовании влияния АОБ на взаимодействие «антиген-антитело» в гомологичных и гетерологичных системах использованы наборы «ИФА-ТТ3-1», «ИФА-Св-Т4-1», «ИммуноФА-ТС», «ИФА-Кортизол», «ИммуноФА-ПГ», «ИммуноФА-Эстрадиол» (ЗАО «НВО Иммунотех», Москва, Россия) для количественного определения в сыворотке крови трийодтиронина, свободного тироксина, тестостерона, кортизола, прогестерона и эстрадиола, соответственно. Иммунные белки инкубировали с АОБ, после чего определяли показатели их связывания с соответствующими антигенами, сорбированными в лунках полистироловых планшетов.

Для постановки иммуноферментного анализа использовался комплект оборудования, включающий планшетный ридер «Униплан», промыватель планшет «Проплан» (ЗАО «Пикон», Санкт-Петербург, Россия), термостатируемые шейкеры ST-3 («Elmi», Латвия).

Влияние АОБ на аффинность антител изучали методом гашения триптофановой флюоресценции на спектрофлюориметре «Флюорат-02 Панорама» (НПФ «Люмэкс», Санкт-Петербург, Россия). В этом случае в качестве источника антител использовали коммерческий препарат нормального иммуноглобулина человека (НПО «Микроген», Екатеринбург, Россия). Флюоресценцию триптофана в молекулах иммуноглобулинов возбуждали при 300 нм и регистрировали при 336-340 нм. Для тушения флюоресценции использовали нитроароматический

лиганд 2,4-динитрофенол (ДНФ) («А1с1г1сЬ», Германия), который добавляли порциями до достижения молярного избытка ДНФ.

Воздействие АОБ на показатели авидности антител изучали на примере тест-систем «ВектоРубелла-^О-авидность» методом денатурирующего иммуноферментного анализа с использованием в качестве денатурирующего агента 8М раствора мочевины. Расчет индекса авидности (ИА) проводили по формуле:

ИА = оп*»°"ИФАхт%> (1)

ОП^ИФА

где ОП„ряи и ОПденат - соответственно показатели связывания антител до и после воздействия денатурирующего агента.

При исследовании влияния АОБ на функциональную активность Бс-фрагментов антител использовали суспензию сенсибилизированных гемолитической сывороткой (НПО «Микроген», Москва, Россия) эритроцитов барана в растворе Олсвера. Комплементзависимый лизис инициировали внесением коммерческого препарата «Сыворотка диагностическая гемолитическая жидкая» (МХ «МЕДЭП», Москва, Россия). Измерение оптических характеристик суспензии эритроцитов проводили на спектрофлюориметре «Флюорат-02 Панорама» (НПФ «Люмэкс», Санкт-Петербург, Россия) при длине волны 800 нм в кинетическом режиме. Для характеристики эффективности литической реакции использовали величину 150% - время (сек), необходимое для развития 50% лизиса эритроцитов, а также максимальную скорость лизиса (Утах)> рассчитываемую по формуле

Г_=ф4,-Л2/Дф/2.798, (2)

где АI и А] - оптическая плотность суспензии в начальной и конечной точке интервала времени Д1. Значения У^ выражали в величинах ЛЕК (логическая единица комплемента, соответствующая лизису 1 эритроцита в 1 мл за 1 сек).

Функциональную термостабильность интакгных и модифицированных АОБ антител определяли по сохранению их остаточной антигенсвязывающей активности после прогревания в течение 15 мин в твердотельном термостате «Термит» (ООО «НПО ДНК-Технология», Протвино, Россия) в диапазоне температур от 50°С до 80°С. Функциональную стабильность антител при ультрафиолетовом облучении оценивали после освещения широкополосной УФ-лампой («Оэгат», Германия), при этом измеренная с использованием УФ-радиомегра «ТКА-ПКМ» (ООО «НТП «ТКА», Санкт-Петербург, Россия) энергетическая освещенность образцов в диапазоне длин волн 200-280 нм составила 24.85 Вт/м2, а время экспозиции варьировало от 0 до 120 мин. При исследовании операционной стабильности антител при различных значения рН их растворы в равных объемах смешивали с фосфатным буфером с диапазоном значений рН от 3 до 11. Значения нормируемого параметра контролировали с использованием анализатора жидкости «Эксперт-001» (ООО «Эконикс-Эксперт», Москва, Россия).

Эксперименты по исследованию функциональной активности антител при их длительном нахождении в водных растворах проводили в температурных режимах +4°С и +37°С, выдерживая анализируемые образцы в герметичных стеклянных емкостях в защищенных от света условиях в течение 390 и 228 суток, соответственно. В первые сутки хранения, а также в течение всего указанного срока с интервалом 10-30 суток часть проб изымали и использовали для постановки иммуноферментного анализа. На основе результатов ИФА проводили количественный учет показателей связывания модифицированных и немодифицированных антител к T.gondii с соответствующими антигенами. Полученные данные использовали для расчета величин TI20, характеризующих время, за которое утрачивалось 20% функциональной (антигенсвязывающей) активности антител, и определяющие допустимые сроки их хранения.

Все эксперименты выполнены минимум в трех повторностях. Полученные результаты обработаны методами вариационной статистики с использованием компьютерной программы «Statistica» и пакета программ «Microsoft Excel».

Результаты собственных исследований

В ходе экспериментов с использованием метода неконкурентного иммуноферментного анализа, направленных на исследование функциональных характеристик модифицированных алкилоксибензолами антител, был зафиксирован ряд эффектов, зависящих как от особенностей строения используемых гомологов АОБ, так и от концентраций взаимодействующих компонентов (рисунок 1).

О 250 500 750 1000 Концентрация, М*10~

0 250 500 750 1000 Концентрация, AÎ*10 '6

0 250 500 750 1000 Концентрация, М*№~

О 250 500 750 1000 Концентрация, М*10 '6

Рисунок 1. Величины связывания антител к Т^отШ в присутствии различных концентраций С,-АОБ (а), Сз-АОБ (б), С6-АОБ (в) и Сц-АОБ (г). По оси абсцисс - концентрация АОБ, х 1 (Г'М; по оси ординат - значения связывания антител с соответствующими антигенами, характеризуемые оптической плотностью (ОП), отн. ед. Концентрации используемых антител, МЕ/мл: 1 — 0, 2 — 10, 3 -25,4-50,5- 100,6-200

Так СрАОБ и С3-АОБ слабо влияли на исследованные функциональные характеристики антител: достоверные изменения были отмечены только в вариантах с концентрациями СрАОБ 5x1 О^М и антител - 25 МЕ/мл, С3-АОБ ЫЮ^-бхЮ^М и антител - 10 МЕ/мл, в которых показатели связывания снизились до 80-86% от контрольных значений (Р<0.05).

В отличие от названных короткоцепочечных АОБ использование возрастающих концентраций С6-АОБ в диапазоне ЫЮ'МхЮ^М вело к существенно более выраженному угнетению образования комплексов «антиген-антитело». Максимальный эффект наблюдался при использовании С6-АОБ в концентрации ЫЮ^М и антител в концентрации 25 МЕ/мл, где показатель связывания характеризовался величиной 14.86±0.58% от контрольных значений (Р<0.001). В то же время дальнейшее увеличение концентрации Сб-АОБ не сопровождалось пропорциональным ростом эффекта, но напротив, частично восстанавливало показатели связывания. С12-АОБ в тех же концентрациях (1x10"4-2.5х10"4М), подобно С6-АОБ, также существенно изменял антигенсвязывающую способность антител, при этом эффект распространялся на антитела в широком диапазоне их концентраций 25-200 МЕ/мл, а зафиксированные показатели связывания не превышали 48-60% от контрольных.

Существенной особенностью регистрируемых эффектов являлось и то, что их выраженность варьировала в зависимости от используемой концентрации антител и, соответственно, молярных соотношений «АОБ : антитела». Например, наибольшие эффекты С6-АОБ были выявлены в вариантах его совместной инкубации с антителами в концентрациях 10-50 МЕ/мл, при которых показатели связывания с соответствующими антигенами составили 15-40% от контрольных значений.

Подавление взаимодействия в системе «антиген-антитело» было подтверждено и в другой серии экспериментов, предусматривающей исследование влияния АОБ на параметры специфического связывания антител с низкомолекулярными гаптенами (тестостероном, прогестероном, эстрадиолом, кортизолом, тироксином и трийодтиронином) с использованием метода конкурентного ИФА. Одновременно зафиксирована зависимость выраженности эффекта от особенностей исследуемых пар «антиген-антитело». Так антигенсвязывающая способность антител к прогестерону не изменялась ни одним из используемых АОБ. В свою очередь, наиболее выраженные эффекты имели место в отношении антител к тестостерону, уровень показателей специфического связывания которых в присутствии С6-АОБ снижался до 39.6±3.2% (Р<0.001), а в присутствии С,2-АОБ - до 74.0±4.2% (Р<0.01) по сравнению с контролем. При этом на фоне отсутствия эффектов СрАОБ выраженность таковых возрастала в ряду С3-, С6- и С12-АОБ, но была несколько менее существенной, чем в описанном выше случае с антителами к Т.^опйп с более линейной зависимостью от использованных концентраций АОБ.

В целом, полученные результаты могут свидетельствовать о возможности прямого взаимодействия гидрофобных гомологов АОБ с активными центрами

антител, что приводит к нарушению их специфического связывания с соответствующими антигенами. При этом особенности химического строения АОБ и обусловливаемые ими эффекты позволяют частично уподобить их гаптенам - низкомолекулярным веществам, также способным блокировать образование комплексов «антиген-антитело». Однако в отличие от проявляющих подобные свойства классических гаптенов, АОБ оказываются способными к блокированию антигенсвязывающей способности антител различной специфичности, что позволяет рассматривать исследованные малые молекулы как некие «супергаптены», обладающие расширенным спектром биологической активности.

С целью более детального анализа природы описанных эффектов на следующем этапе было исследовано влияние АОБ на аффинитет и авидность антител, характеризующие качество и количество силы их связывания с соответствующими антигенами.

В экспериментах, позволяющих оценить аффинитет изучаемых антител, в контрольных вариантах последовательное насыщение раствора нормальных иммуноглобулинов человека гаптеном из группы нитроароматических лигандов, а именно - 2,4-динитрофенолом, вело к прогрессирующему подавлению интенсивности флюоресценции, типичному для низкоаффинных антител и характеризуемому величиной Qmax=38.54%. При этом зависимость снижения интенсивности флюоресценции от вносимой концентрации ДНФ описывалась уравнением экспоненциального вида. В свою очередь в опытных вариантах прединкубация антител с С6-АОБ оказывала собственное слабое влияние на интенсивность регистрируемого свечения, что объясняется возможностью остаточной флюоресценции АОБ в используемом спектральном диапазоне. В то же время, предварительная инкубация антител с АОБ значительно более существенно сказывалась на их способности к последующему взаимодействию с ДНФ. Основным результатом было снижение значений Q, (гашения флюоресценции после внесения каждой из доз гаптена) при соответствующем увеличении значений нормирующих коэффициентов. При этом совокупность регистрируемых явлений позволила констатировать устойчивую тенденцию к снижению аффинности антител после их модификации Сб-АОБ.

Выявленные эффекты были подтверждены и дополнены при исследовании влияния АОБ на авидность антител с использованием двух образцов сывороток, содержащих высокоавидные и низкоавидные антитела к R. virus с исходными значениями индекса авидности равными 99.49±3.48% и 22.58±0.97%, соответственно. Прединкубация высокоавидных антител с С6-АОБ слабо влияла на показатели их прямого связывания с антигеном, в то время как регистрируемые значения ИА имели тенденцию к снижению (рисунок 2а). В частности, при использовании С6-АОБ в концентрации 1х10"3М наблюдалось уменьшение величины ИА высокоавидных антител до 86.15±3.52% (Р<0.05). С другой стороны, в экспериментах с использованием низкоавидных антител С6-АОБ уже изначально вызывал выраженное подавление их связывания (рисунок 26), На этом

фоне обработка сформировавшихся комплексов «антиген-антитело» денатурирующим агентом не вела к их диссоциации и обусловливала парадоксальный рост рассчитываемого ИА до 34.42±1.55% (Р<0.001). Возможной причиной подобной ситуации является то, что из всего гетерогенного пула модифицированных Сб-АОБ антител сохраняли способность к взаимодействию с соответствующими антигенами только наиболее авидные из них, в то время как менее авидные антитела утрачивали способность к связыванию еще до обработки денатурирующим агентом. Аргументом в пользу подобного предположения является тот факт, что относительное количество антител, предварительно инкубированных с С6-АОБ и сохранивших свою связь с антигеном после денатурации, не увеличилось, а напротив, составило лишь около половины от числа антител, не модифицированных Сб-АОБ.

Рисунок 2. Изменение характера связывания и авидности высокоавидных (а) и низкоавидных (б) антител в присутствии различных концентраций С6-АОБ. По оси абсцисс - концентрация Сб-АОБ, хЮ^М; по осям ординат: слева — значения связывания антител с соответствующими антигенами, характеризуемые оптической плотностью (ОП), отн. ед.; справа - индекс авидности антител (ИА), %. Обозначения: 1 - величины связывания антител до обработки денатурирующим агентом; 2 - величины связывания антител после обработки денатурирующим агентом; столбиками указаны значения авидности антител

Выявленные эффекты АОБ в отношении антигенсвязывающей способности антител проявлялись не только в отношении иммунных белков различной специфичности, но и не зависели от класса иммуноглобулинов, что было продемонстрировано при исследовании антител классов G и М к R. virus. Так увеличение концентрации С6-АОБ до 2.5х10"4М вело к прогрессирующему снижению их антигенсвязывающей способности. При этом в максимуме эффекта показатели связывания составили 72.02±3.60% от контрольных значений (Р<0.01)

в случае использования в качестве объекта воздействия иммуноглобулинов класса в и 73.58±3.94% (Р<0.01) при использовании иммуноглобулинов класса М. Дальнейшее увеличение действующих концентраций АОБ, как и в случае с антителами к Т^опсШ, частично восстанавливало показатели связывания.

Отмеченные при использовании указанных тест-систем закономерности получили свое оригинальное объяснение, определяемое тем, что в эксперименте с использованием тест-систем для иммуноферментного анализа «ВектоРубелла» были тестированы как «положительные», так и не содержащие антител к й.у/'пи «отрицательные» контрольные сыворотки, используемые для расчета пороговых значений специфического связывания. При этом на фоне описанных выше закономерностей действия АОБ в отношении «положительных» сывороток, «отрицательные», в присутствии возрастающих концентраций Сб-АОБ, демонстрировали парадоксальное двукратное увеличение показателей связывания.

С целью исследования причин подобного эффекта на следующем этапе проводилось исследование возможности неспецифического связывания антител с рядом гетерологичных антигенов (гаптенов), при этом короткоцепочечные гомологи не вызывали достоверного увеличения показателей неспецифического связывания, тогда как при использовании более длинноцепочечных аналогов происходила индукция подобных взаимодействий. Наиболее выраженные эффекты были установлены в вариантах модификации специфичных к тестостерону антител увеличивающимися концентрациями С12-АОБ, что вело к росту показателей их связывания с тироксином на 75.0±15.8% (Р<0.01), с прогестероном на 72.1±15.5% (Р<0.01), а с эстрадиолом на 25.9±6.3% (Р<0.01) от контрольных значений (таблица 2). Аналогичные эффекты были отмечены для пар: «прогестерон-тироксин», «кортизол-тироксин», «тироксин-прогестерон», при воздействиях не только Сп-, но и С6-АОБ, что было зарегистрировано как достоверное увеличение параметров неспецифического связывания в 36.7% от всех вариантов постановки опытов. С другой стороны в 46.6% случаев модификация антител АОБ не привела к изменению регистрируемых показателей, а в 16.7% - обусловливали подавление неспецифического связывания в парах: «трийодтиронин-тестосгерон», «тироксин-тестостерон», «кортизол-тестостерон», «прогестерон-тестостерон», «эстрадиол-тестостерон», «эстрадиол-кортизол», ранее охарактеризованных как примеры перекрестного реагирования.

Вероятной причиной регистрируемых эффектов является формирование неспецифических «ошибочных» комплексов «антиген-антитело», возникающих как результат частичного изменения специфичности активных центров антител, модифицированных АОБ. Не исключено также, что феномен как подавления специфического связывания, так и одновременного формирования неспецифических комплексов «антиген-антитело» является следствием единого механизма, возникающего в результате изменения мотива укладки модифицированных АОБ полипептидных цепей в области активных центров белковых молекул. Сказанное позволяет рассматривать бактериальные ауторегуляторы из группы алкилоксибензолов как малые биоинформационные

молекулы особого типа либо создающие «информационный шум», либо «дополняющие информацию» в сетевых иммунологических системах.

Таблица 2

Величины связывания антител с гетерологичными антигенами (% от контроля) в присутствии Сп-АОБ в концентрации Ю''М_

Антиген

Специфичность антител Трийодтиронин Тироксин Тестостерон Кортизол Прогестерон Эстрадиол

Трийодтиронин 124.6* 50.5*** 102.4 128.9** 127.6*

±6.2 ±3.5 ±8.2 ±6.4 ±7.6

Тироксин 89.4 18.9*** 102.4 151.1** 126.7*

±7.1 ±0.9 ±6.1- ±10.6 ±8.9

Тестостерон 102.4 175.0** 102.4 172.1** 125.9**

±10.2 ±15.8 ±6.3 ±15.5 ±6.3

Кортизол 111.6 173.6*** 64.4*** 131.7* 135.0**

±6.7 ±8.7 ±4.5 ±10.4 ±8.1

Прогестерон 100.0 187.8** 62.0*** 106.8 135.6**

±6.5 ±15.0 ±3.6 ±11.7 ±7.9

Эсградиол 102.4 136.8* 49.6*** 68.0** 107.5

±8.2 ±9.6 ±3.5 ±5.4 ±9.7

* Р<0.05; ** Р<0.01; *** Р<0.001 по отношению к контролю

В ходе дальнейших экспериментов было установлено, что алкилоксибензолы способны дополнительно усиливать свое действие в системе «антиген-антитело» посредством изменения поверхностных свойств антигена. Так предварительная инкубация антигенов Т^опсШ с АОБ приводила к частичному снижению показателей их связывания с соответствующими антителами, в максимуме эффекта не превышающему 10.7-15.7%. Ранжирование значимости эффектов АОБ в двухкомпонентной системе было осуществлено с использованием метода дисперсионного анализа. При этом в качестве независимых переменных нами рассматривались комплексы «антитело-АОБ» и «антиген-АОБ», формирующиеся при различных концентрациях алкилоксибензолов, а в качестве зависимых - достигаемые при различных вариантах их сочетаний значения оптической плотности системы. Проведенный расчет дисперсионного отношения показал статистическую достоверность влияния каждой из независимых переменных на уровне Р<0.05 для СгАОБ и Р<0.001 для Сб-АОБ, одновременно зафиксировав ряд различий между коротко- и длинноцепочечными гомологами АОБ. При этом в вариантах с С,-АОБ преимущественное влияние на изученную двухкомпонентную систему реализовывалось через модифицирующее воздействие на антигенную составляющую системы: коэффициент детерминации (Ь2Аг) составил 0.61, в то

время как лишь 16% эффекта определялось влиянием на антигенсвязывающую способность антител. Отметим, что в этих вариантах неучтенными оставалось 23% дисперсии, что существенно превышало аналогичное значение (<1%), вычисленное для системы, модифицированной С6-АОБ. На этом фоне значимое отличие в эффектах С6-АОБ по сравнению с С,-АОБ заключалось в том, что его влияние было максимальным в отношении антигенсвязывающей способности антител (Ь2Ат = 0.99), в то время как в отношении антигенов оно характеризовалось минимальнои величинои п дг = 0.0047 (рисунок 3).

Рисунок 3. Оценка модифицирующего действия С|-АОБ (а) и С6-АОБ (б) на компоненты системы «антиген-антитело», выраженная коэффициентом детерминации (Ь2), описывающим силу их влияния на отдельные компоненты системы. Обозначения: 1 - антитела к Т.%опсШ, 2 - антигены Т.ёопсШ, 3 - прочие (неучтенные) факторы

Результаты следующей серии экспериментальных исследований позволили констатировать, что эффект АОБ распространяется не только на антигенсвязывающие участки, но делокализуется по молекуле антитела, при этом еще одной «мишенью» в структуре антител, подверженной модифицирующему действию АОБ, являются их Ре-фрагменты, ответственные за инициацию классического пути активации комплемента. Подобные эффекты были установлены при модификации Бс-фрагментов антител, предварительно специфически связавшихся с соответствующими антигенами на поверхности эритроцитов. При этом не установлено влияния АОБ на параметр скорости реакции комплементзависимого гемолиза \'1ган устойчиво находящийся в диапазоне З.21х103-З.55х103 ЛЕК. С другой стороны, характеризующие сроки развития литического эффекта значения tso%, демонстрировали достоверный рост с увеличением длины алкильного радикала и концентрации АОБ (рисунок 4) В частности, предварительная инкубация сенсибилизированных эритроцитов в контакте с Сб- и Сп-АОБ вела к достоверному увеличению значений на 12.86±0.62%-19.88±1.09%, соответственно (по сравнению с контролем), для С6-АОБ выраженному в концентрациях 2.5x10 7М и 2.5х10"5М, а при использовании наиболее гидрофобного Сп-АОБ закономерно возрастающему до

(0.0047)

концентрации 2.5х10"4М. При этом использование более высоких концентраций длинноцепочечных АОБ было невозможно из-за их собственной гемолитической активности в отношении клеток-мишеней. В свою очередь использование Ср и Сз-АОБ достоверно не изменяло временных характеристик литической реакции и

не оказывало гемолитического эффекта.

контроль 10»-7 Ю'-б 10"-5 Ю'-4 10*-3 Концентрации АОБ, М

Рисунок 4. Изменение времени наступления 50% комплементзависимого лизиса эритроцитов (по оси ординат, % от контроля) в зависимости от химической природы и используемых концентраций алкилоксибензолов (по оси абсцисс, М), предварительно взаимодействующих с Рс-фрагментами сенсибилизирующих антител. Обозначения: 1 - СгАОБ, 2 - С3-АОБ, 3 - Сб-АОБ и 4 - Сц-АОБ. * Р < 0.05

Таким образом, химические аналоги бактериальных ауторегуляторов из группы алкилоксибензолов в зависимости от особенностей химической структуры и используемых концентраций способны подавлять взаимодействие специфических антител с соответствующими антигенами. В основе данных процессов лежит уменьшение аффинности модифицированных алкилоксибензолами иммуноглобулинов, а сам подобный эффект в большей степени развивается в отношении низкоавидных, а не высокоавидных антител. Существенной особенностью биологической активности АОБ в отношении молекул антител является частичное изменение их специфичности с возникновением возможности связывания с гетерологичными антигенами. Действие в системе «антиген-антитело» дополнительно может потенцироваться через изменение поверхностных свойств антигенов. Показана возможность делокализации эффекта АОБ по всей молекуле антитела, в том числе затрагивающей активность его Бс-фрагмента.

Полученные результаты явились основой для выполнения следующего этапа работы, задачей которого стало изучение влияния алкилоксибензолов на

способность антител к взаимодействию с соответствующими антигенами при денатурирующих воздействиях (функциональная стабильность) и неоптимальных условиях проведения реакции (операционная стабильность). При этом основанием для формулировки подобной задачи стали известные протекторные эффекты АОБ в отношении ряда биомакромолекул.

Термообработка специфичных к Т^опсШ антител с последующим определением показателей их связывания с соответствующими антигенами, сорбированными в лунках полистироловых планшетов, позволила зафиксировать характерную Б-образную зависимость результативного параметра от интенсивности температурного воздействия. При этом наибольшее относительное снижение показателей связывания регистрировалось в диапазоне от 59°С до 71°С с достижением величин ЕТ20 и ЕТ50, соответствующих снижению показателей связывания антител с антигенами на 20% и 50% от исходных значений. В контрольных вариантах рассчитанные величины составили 61.5±0.5°С и 65.9±0.4°С, соответственно, а в присутствии 5% этанола- 51.1±0.4°С и 52.8±0.3°С.

В свою очередь предварительная модификация антител в ряде случаев вела к изменению уровня их терморезистентности. Так, обработка антител С г АОБ в концентрации 10"5М приводила к повышению значения ЕТ20 до 62.9±0.3°С (Р<0.05) и его снижению до 52.3±0.4°С (Р<0.001) при использовании СгАОБ в более высокой концентрации Ю^М в отсутствие достоверного влияния этого фактора на параметр ЕТ50. Сз-АОБ в малых концентрациях не оказывал влияния на измеряемый параметр, но в максимальной концентрации достоверно уменьшал величину ЕТ20 до 60.4±0.4°С (Р<0.05). С другой стороны, модификация антител Сб-АОБ проявлялась не только в значимом изменении величин ЕТ20, как в случае с короткоцепочечными АОБ, с максимумом эффекта при использовании в концентрации 10"4М (ЕТ20 = 55.18±0.3°С; Р<0.001), но и в снижении величины ЕТ50 до 64.5±0.3°С при использовании Сб-АОБ в концентрации Ю^М и до 63.7±0.6°С при концентрации 10"3М (Р<0.05). Наконец для С12-АОБ, вызывающего изначально сильное подавление параметров связывания антител с соответствующими антигенами, сочетание его эффектов с денатурирующим воздействием температуры обусловило лишь незначительное снижение параметра ЕТ50 до 50.78±0.3°С (Р<0.05) при концентрации 10"3М.

Другим исследованным повреждающим фактором стало УФ-облучение образцов антител. Подобное воздействие обусловливало пропорциональное дозе/времени снижение показателей связывания антител с соответствующими антигенами. При этом рассчитанное для интактного препарата антител значение дозы УФ-излучения, приводящего к его 50%-ой инактивации (Ш50) находилось в диапазоне от 1017±50 до 1048±39 Дж, в присутствии 5% этанола повышаясь до 2401±127 Дж.

Предварительная инкубация антител как с С г АОБ, так и с Сз-АОБ сопровождалась умеренным ростом УФ-резистентности образующихся комплексов (таблица 3). При этом рассчитанные значения Ш50 наиболее значимо изменялись при использовании короткоцепочечных АОБ в концентрации 10"3М:

этот показатель возрастал до 1423±75 Дж (Р<0.01) при модификации антител СрАОБ и до 1223±54 Дж (Р<0.05) при использовании С3-АОБ. В свою очередь длинноцепочечные гомологи С6- и С12-АОБ также преимущественно проявляли себя как УФ-протекторы, что, в частности, результировалось в росте значения ГО50 до 1472±74 Дж (Р<0.01) при использовании С6-АОБ и до 2996±183 Дж при использовании Си-АОБ в концентрациях 10ДМ (Р<0.05), в то время как повышение концентрации этих АОБ до 10"3М сопровождалось снижением определяемой УФ-резистентности: 709±40 Дж и 1445±72 Дж (Р<0.01) для С6- и Сп-АОБ, соответственно.

Таблица 3

Дозы УФ-излучения, приводящие к 50%-ой инактивации антител (Ш50) в присутствии различных гомологов АОБ. Пояснение: в числителе - ГО50 (Дж); в знаменателе - относительная величина (%) по отношению к контролю _

Использованные гомологи Концентрации АОБ

Контроль 10°М ю-'м ю-'м

С,-АОБ 1021±51 Дж 986±46 Дж 1194±48 Дж 1423±75 Дж**

100% 97% 117% 139%

Сз-АОБ 1048±39 Дж 966±49 Дж 927±44 Дж 1223±54 Дж*

100% 92% 88% 117%

С6-АОБ 1017±50 Дж 1169±81 Дж 1472±74 Дж** 709±40 Дж**

100% 115% 145% 70%

С,гАОБ 2401±127 Дж 2737±134 Дж 2996±183 Дж* 1445±72 Дж**

100% 114% 125% 60%

* Р<0.05; ** Р<0.01 по отношению к контролю

Исследование способности антител к связыванию с соответствующими антигенами при их взаимодействии при различных, в том числе, неоптимальных значениях рН позволило констатировать нелинейную зависимость между регулирующим и зависимым параметрами. Наибольшие значения связывания интактных антител с соответствующими антигенами регистрировались в диапазоне рН от 6 до 8, примерно двукратно снижались при рН 4 и рН 9, прогрессивно стремясь к нулевым значениям с приближением к крайним точкам исследованного диапазона.

Предварительная инкубация антител с АОБ оказывала на показатели их связывания разнонаправленное действие. Так, активность СрАОБ была минимальной, заключаясь в относительном снижении показателей связывания при использовании этого гомолога в концентрации 10"3М при рН 4 и 6, одновременно в 1.24 раза повышая таковые при рН 8 в случае использования СрАОБ в концентрации 1(Г5М. В свою очередь, модификация антител Сб-АОБ, оказывающая существенное ингибирующее влияние на их связывание с соответствующими антигенами при нейтральных значениях рН, значительно сказывалась на их операционной стабильности при неоптимальных значениях рН. Наибольшее снижение относительных величин связывания регистрировалось в области рН 3-6 и концентрациях С6-АОБ в диапазоне КИ-Ю^М. С другой стороны, использование этого гомолога в концентрации 10"4М в условиях

проведения реакции при рН 10 вело к двукратному увеличению относительных показателей связывания антител с соответствующими антигенами.

Таким образом, полученные результаты позволили выявить ряд достоверных эффектов алкилоксибензолов на функциональную и операционную стабильность антител, что может рассматриваться в качестве еще одной серии доказательств взаимодействия между этими молекулами. Однако, в отличие от известных примеров модификации ферментных белков, регистрируемые эффекты часто оказывались разнонаправленными. Так, АОБ повышали чувствительность антител к термоденатурации, преимущественно снижали их чувствительность к УФ-облучению и разнонаправленно изменяли диапазон активности при различных значениях рН: при кислых (низких) значениях - АОБ проявляли себя как дестабилизаторы антител, в то время как при щелочных (высоких) значениях -обуславливали эффекты расширения операционной стабильности.

Сказанное определило направление завершающего фрагмента работы, связанного с исследованием возможности использования АОБ в качестве потенциальных стабилизаторов коммерческих препаратов антител. При этом в предварительной серии экспериментов было установлено, что хранение растворов немодифицированных антител к Т^опсШ при температуре +4°С сопровождается относительно медленной утратой их антигенсвязывающей способности, характеризуемой величиной 20% потери активности Т120 = 351.1±7.0сут, что соответствует заявленному сроку годности используемого препарата. В свою очередь нахождение антител в водном растворе при температуре +37°С вело к значительно более быстрой утрате их функциональной активности, характеризуемой величиной Т120 = 44.0±3.3 сут.

При исследованиях динамики изменения функциональных характеристик антител, инкубируемых в присутствии АОБ, значимой особенностью явилось развивающееся во времени восстановление их первоначально ингибированного связывания с соответствующими антигенами. При этом скорость отмеченного восстановления антигенсвязывающей способности зависела как от температурного режима хранения исследуемых проб, так и от структуры использованного гомолога АОБ. В частности, в условиях хранения модифицированных С6-АОБ антител при температуре +4°С восстановление не менее чем 95% показателей их связывания достигалось к 75±15 сут, а повышение температуры инкубации до +37°С уменьшало продолжительность этого периода до 43±2 сут. Для модифицированных С3-АОБ антител этот срок не превышал 25±3 сут, в то же время, восстановления связывания антител, модифицированных С12-АОБ в диапазоне его концентраций 5х10"4-1х10"3М в течение всего периода наблюдений не происходило.

Обсуждая полученные результаты, представляется возможным связать их с развивающимся во времени перераспределением (диффузией) АОБ по всей молекуле модифицируемого белка, скорость которого зависит от температуры инкубации. С другой стороны, динамика перераспределения оказывается обратно пропорциональной размеру алкильного радикала АОБ и обусловленной этим

первоначальной интенсивности взаимодействия с антигенсвязывающими участками антител.

На этом фоне использование короткоцепочечного гомолога СрАОБ, изначально не вызывающего значимого подавления антигенсвязывающей способности, сопровождалось достоверным увеличением сроков сохранения функциональной активности модифицируемых им антител (рисунок 5).

оп, %

Время, сут

Рисунок 5. Показатели связывания модифицированных различными концентрациями С1-АОБ иммуноглобулинов класса в к Т^опсШ в концентрации 25 МЕ/мл в условиях длительного хранения при температуре +37°С. По оси абсцисс - время хранения, сут; по оси ординат - показатели связывания, %. Обозначения: концентрации С1-АОБ, М: 1 - 0, 2 - 1х10'5, 3 - 1Х10"1, 4 - 1-/10'5. * Р<0.05; ** Р < 0.01; *** Р< 0.001

Использование этого гомолога АОБ в оптимальной концентрации Ю^М к концу периода хранения при +37°С почти двукратно увеличивало значение Т120 (с 44.0±3.3 до 86.6±7.4 сут; Р<0.05) и обусловливало превышение показателя антигенсвязывающей способности антител к Т^опсШ на 79.0±1.4% (Р<0.001) по сравнению с интактными немодифицированными антителами. Одновременно эти показатели достоверно не отличались от зафиксированных на старте эксперимента показателей связывания.

Обнаружение факта сохранения функциональной активности модифицированных С г АОБ антител в условиях длительного пребывания в водных растворах было положено в основу нового подхода к стабилизации антител (положительное решение ФИПС по заявке на изобретение № 2010136488 от 30.08.2010 г.). Способ заключается во внесении в раствор антител модифицирующей добавки СрАОБ в концентрации Ю^М в соотношении 1:1 и дальнейшем хранении полученной смеси в герметично упакованных стеклянных емкостях при температуре от +4°С до +37°С с последующим использованием для постановки соответствующих иммунологических реакций. Основным положительным результатом, достигаемым при использовании способа, является увеличение сроков годности коммерческих препаратов антител, в том числе, при отклонении от рекомендуемых температурных режимов хранения.

Выводы

1. Алкилоксибензолы способны блокировать специфическое взаимодействие антител с соответствующими антигенами; выраженность подобных эффектов зависит от особенностей химической структуры АОБ и характеристик системы «антиген-антитело».

2. Влияние алкилоксибензолов на параметры специфического связывания антител с соответствующими антигенами обусловлено уменьшением аффинности и авидности иммуноглобулинов.

3. В результате взаимодействия антител с АОБ может происходить частичное изменение их специфичности с возникновением возможности связывания с гетерологичными антигенами.

4. Алкилоксибензолы способны потенцировать свое действие в системе «антиген-антитело» через изменение поверхностных свойств антигена, что в большей степени характерно для короткоцепочечных АОБ по сравнению с длинноцепочечными.

5. Длинноцепочечные АОБ изменяют функциональную активность Fc-фрагмента антител, затрудняя инициацию классического пути активации комплемента.

6. Алкилоксибензолы увеличивают чувствительность антител к термоденатурации, преимущественно снижают чувствительность к УФ-облучению и разнонаправленно изменяют диапазон активности при различных значениях pH.

7. При длительном хранении модифицированных АОБ антител в водных растворах происходит восстановление показателей их связывания с соответствующими антигенами, первоначально ингибированного в результате модификации АОБ.

8. 1,3-диокси-5-метилбензол, оказывающий наименьшее влияние на антигенсвязывающую способность антител, существенно увеличивает сроки сохранения их функциональной активности в условиях длительного пребывания в водном растворе.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

* - публикация в изданиях перечня ВАК РФ

1. Михайленко, H.A. Влияние гексилрезорцина на ферментные и неферментные белки иммунологической защиты / H.A. Михайленко, Т.Г. Кобзева, М.С. Терехова, Д.Г. Дерябин // Материалы III региональной конференции «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой». - Саратов, 2006. - С. 32-33.

2. Дерябин, Д.Г. Влияние ауторегуляторного di-фактора микроорганизмов (С12-АОБ) на антигенсвязывающую способность антител / Д.Г. Дерябин, H.A. Михайленко // Иммунология Урала, 2006. -№1 (5).- С. 159-160.

3. Михайленко, H.A. Влияние ауторегуляторных di-факгоров бактерий (алкилоксибензолов) на функциональную активность лизоцима и

иммуноглобулинов / H.A. Михайленко, Т.Г. Кобзева, М.С. Терехова // Материалы региональной конференции с международным участием «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии». -Пермь, 2007. - С. 151-153.

4. Михайленко, H.A. Бактериальные ауторегуляторные d,-факторы как потенциальные иммунорегуляторы / H.A. Михайленко, Т.Г. Кобзева, Д.Г. Дерябин // Материалы III Международной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал». - Пермь, 2008. -С. 71-72.

5. Дерябин, Д.Г. Эффекты бактериальных ауторегуляторов (алкилокибензолов) на гуморальные и клеточные факторы противоинфекционной резистентности / Д.Г. Дерябин, H.A. Михайленко, Т.Г. Кобзева, И.Ф. Каримов // Материалы IV международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями». - СПб, 2008. - С. 144.

6. * Дерябин, Д.Г. Дисперсионный анализ эффектов алкилоксибензолов в системах .«фермент-субстрат» и «антиген-антитело» /. Д.Г. Дерябин, H.A. Михайленко, Т.Г. Кобзева // Вестник Оренбургского государственного университета. -2008. -№12. -С. 143-147.

7. * Дерябин, Д.Г. Влияние алкилоксибензолов на антигенсвязывающую способность антител / Д.Г. Дерябин, H.A. Михайленко (Романенко), Г.И. Эль-Регистан // Микробиология. - 2009. - Т. 78. -№5. - С. 629-635.

8. *Романенко, H.A. Влияние алкилоксибензолов на активность и стабильность антител (иммуноглобулинов) / H.A. Романенко, Т.Г. Кобзева, Д.Г. Дерябин // Бюлл. Московского общества испытателей природы. Отдел биологический. - 2009. - Т. 144. - №2. - С. 90-92.

9. *Романенко, H.A. Влияние алкилоксибензолов на функциональную активность Fc-фрагментов антител / H.A. Романенко, М.С. Терехова, Д.Г. Дерябин // Вестник Оренбургского государственного университета. - 2009. - №12. -С. 111-114.

10. * Дерябин, Д.Г. Влияние алкилоксибензолов на функциональную и операционную стабильность антител / Д.Г. Дерябин, H.A. Романенко, Г.И. Эль-Регистан//Микробиология.-2010.-Т. 79.-№3.-С. 314-320.

11. Романенко, H.A. Влияние алкилоксибензолов на функциональные характеристики антител / H.A. Романенко // Материалы V региональной конференции «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой». - Саратов, 2010. - С. 140.

12. *Романенко, H.A. Способ стабилизации антител в водных растворах / H.A. Романенко, Д.Г. Дерябин, Г.И. Эль-Регистан // Положительное решение ФИПС по заявке на изобретение № 2010136488 от 30.08.2010 г.

13. Дерябин, Д.Г. Бактериальные ауторегуляторы как потенциальные иммуномодуляторы / Д.Г Дерябин, H.A. Романенко, Т.Г. Свиридова, Э.И. Умудова // Материалы всероссийского симпозиума с международным участием «Биологически активные вещества микроорганизмов: прошлое, настоящее, будущее». - Москва, 2011. - С. 38.

Лицензия № ЛР020716 от 02.11.98 Формат 60x84 Vi6. Бумага офисная. Усл. печ. листов 1,2. Тираж 100 экз.

ИПК ГОУ ОГУ 460018, г.Оренбург, ГСП, пр.Победы,13. Государственное образовательное учреждение «Оренбургский государственный университет»

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Романенко, Наталья Александровна

Введение.

Глава 1. Алкилоксибензолы (АОБ) и их биологическая активность в гомо- и гетерологичных системах.

1.1. Многообразие' внеклеточных ауторегуляторных факторов микроорганизмов. Своеобразие АОБ и их влияние в биологических системах.

1.2. Эффекты алкилоксибензолов в отношении макроорганизмов.

Глава 2. Материалы и методы исследований.

2.1. Объекты исследования.

2.2. Иммуноферментный анализ.

2.2.1. Неконкурентный и конкурентный иммуноферментный анализ.:.

2.2.2. Метод денатурирующего иммуноферментного анализа.

2.3. Определение аффинности антител^ методом «гашения»-* триптофановой флюоресценции.

2.4. Реакция комплементзависимого лизиса эритроцитов.

2.5. Определение функциональной и операционной стабильности иммуноглобулинов.

2.6. Методы статистической обработки результатов.

Глава 3. Влияние АОБ на параметры взаимодействия в системе «антиген-антитело».'.

3.1. Изменение антигенсвязывающей способности антител под влиянием АОБ.

3.2. Частичное изменение специфичности антител под влиянием АОБ.

3.3. Интегральные эффекты АОБ в системе «антиген-антитело».

3.4. Изменение функциональной активности Рс-фрагментов антител

Глава 4. Влияние АОБ на стабильность антител.

4.1. Влияние АОБ на функциональную и операционную стабильность антител при денатурирующих воздействиях.

4.2. Изменение сроков сохранения функциональной активности антител под влиянием АОБ в условиях длительного нахождения в водном растворе.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние алкилоксибензолов на функциональные характеристики антител"

Общая характеристика работы

Актуальность темы

Алкилоксибензолы (АОБ), в том числе и входящие в эту группу веществ алкилрезорцины (АР), встречаются на разных уровнях организации живой материи (бактерии, грибы, растения) и демонстрируют чрезвычайно широкий спектр биологических активностей, что делает их объектом значительного числа междисциплинарных исследований/1, 2/. В частности, у бактерий родов Azotobacter, Pseudomonas, Micrococcus, Thioalkalivibrio и др. эти вещества выполняют роль внеклеточных ауторегуляторов с функциями адаптогенов, способных индуцировать переход клеток в гипометаболическое и анабиотическое состояние /3, 4/.

В основе биологической активности АОБ лежит их способность к ряду физико-химических взаимодействий (гидрофобных, электростатических, водородных) с липидами клеточных мембран /5/, протеинами /6/ и нуклеиновыми кислотами /7/, что обуславливает изменение структурной организации и функциональной активности биомакромолекул и надмолекулярных структур. При этом универсальность действия АОБ как «химических шаперонов» /8/ обуславливает развитие сходных эффектов в гетерологичных системах. В частности, в присутствии микромолярных концентраций гомологов АОБ показаны изменения каталитической активности, функциональной и операционной стабильности моно- и полисубъединичных ферментных белков не только микробного и растительного, но и животного происхождения /9-11/, а также снижение аффинности рецепторов к фибриногену на поверхности тромбоцитов/12/.

В связи с тем, что АОБ в значимых количествах поступают в организм человека и животных с пищей, а также синтезируются некоторыми представителями микробиоценоза, их концентрации в биологических жидкостях и тканях могут достигать нано- и микромолярных значений /13, 14/. Это предполагает возможность участия АОБ в регуляции ряда иммунофизиологических и иммунопатологических процессов. Высказанное предположение подтверждает показанная в опытах in vitro способность АОБ изменять розеткообразующую активность Т-лимфоцитов /15/, а также оказывать цитотоксическое действие на мононуклеарные фагоциты /16/. Итоговым результатом реализации такой биологической активности могут являться индуцируемые АОБ аллергические состояния/17, 18/.

Однако до настоящего времени отсутствуют данные, характеризующие эффекты алкилоксибензолов в отношении антител — неферментных иммунных белков человека и животных, включая изменения их основного свойства — антигенсвязывающей способности, а также функциональной и операционной стабильности при экстремальных физических и химических воздействиях.

Цель и задачи исследования

Цель работы — изучить влияние алкилкоксибензолов — химических аналогов бактериальных ауторегуляторов, на функциональную активность и стабильность антител (иммуноглобулинов).

Для достижения данной цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи:

Научная новизна

Впервые установлено, что алкилоксибензолы — химические аналоги бактериальных ауторегуляторов, способны блокировать специфическое взаимодействие антител (иммуноглобулинов) с соответствующими I антигенами. Выраженность эффектов АОБ зависит от длины алкильного радикала и определяемой этим гидрофобности данных веществ, а концентрационная зависимость их действия варьирует от характеристик реакционной системы. Механизм эффектов АОБ на иммуноглобулины связан с их модифицирующим действием на аффинность, а через него и авидность антител. Эффект распространяется на антитела различной специфичности и классов. В ряде случаев результатом взаимодействия «АОБ : антитела» может стать частичное изменение специфичности иммунных белков.

Обнаружено, что алкилоксибензолы способны дополнительно влиять I на результат реакции в системе «антиген-антитело» через взаимодействие с антигенами. Ранжирование значимости эффектов АОБ в рассматриваемой системе позволило установить, что короткоцепочечные гомологи преимущественно реализуют свою биологическую активность через влияние на свойства антигенов, в то время как длинноцепочечные АОБ оказывают большее действие на свойства антител.

Выявлен модифицирующий эффект длинноцепочечных алкилоксибензолов на функциональную активность Рс-фрагментов антител, проявляющийся в затруднении инициации классического пути активации комплемента в реакции комплементзависимого гемолиза.

Изучение эффектов алкилоксибензолов на функциональную и операционную стабильность антител позволило установить разнокачественность отклика на внешние воздействия: АОБ снижали устойчивость белков к термоденатурации, преимущественно увеличивали их устойчивость к УФ-облучению и неоднозначно изменяли диапазон i активности при низких и высоких значениях рН.

При длительной инкубации модифицированных АОБ антител в водных растворах выявлено развивающееся во времени восстановление показателей их связывания с соответствующими антигенами, первоначально ингибированного в результате взаимодействия белков с длинноцепочечными АОБ. На этом фоне значимым эффектом 1,3-диокси-5-метилбензола явилась его способность увеличивать сроки сохранения функциональной активности антител при температуре +37°С.

Практическая значимость

Полученные результаты, свидетельствующие об изменении функциональных характеристик антител при взаимодействии с АОБ, позволяют говорить об алкилоксибензолах как о новой- группе бактериальных ауторегуляторов с иммуномодулирующими свойствами с перспективой разработки на этой основе новых, подходов к регуляции иммунологических реакций-,в системах in vitro и in vivo.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Алкилоксибензолы - химические аналоги бактериальных ауторегуляторов, изменяют функциональные характеристики антител: антигенсвязывающую способность, специфичность и эффекторные функции. Характер влияния алкилоксибензолов зависит от химического строения АОБ и наиболее выражен у их длинноцепочечных гомологов. Изменение параметров связывания в системе «антиген-антитело» дополнительно может быть обусловлено модификацией свойств антигенов в присутствии АОБ.

Связь автора с научными программами и собственный вклад автора

Исследования выполнены в рамках ГБ НИР № 01200606125 «Влияние ауторегуляторных ёрфакторов бактерий из группы алкилоксибензолов на структуру и функции биополимеров», а также при поддержке гранта РФФИ 08-04-99078-рофи «Разработка технологии стабилизации иммунных и ферментных белков с использованием химических шаперонов микробного происхождения».

Публикации

Основные результаты представлены в 13 печатных работах, в том числе 5 статьях в рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК РФ для публикации результатов диссертационных исследований.

Апробация работы

Отдельные фрагменты работы доложены и обсуждены на III и V Межрегиональных конференциях молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой (Саратов, 2006, 2010); V конференции иммунологов Урала «Актуальные вопросы фундаментальной и клинической аллергологии и иммунологии» (Оренбург, 2006); Региональной конференции молодых ученых с международным участием . «Современные проблемы экологии, микробиологии и ' иммунологии» (Екатеринбург - Пермь, 2007); III Международной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал» (Пермь — Н. Новгород, 2008); IV Международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (СПб, 2008); Российской научной конференции с международным участием «Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» (Москва, 2009); Всероссийском симпозиуме с международным участием «Биологически активные вещества микроорганизмов: прошлое, настоящее, будущее» (Москва, 2011).

Структура и объем диссертации

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Романенко, Наталья Александровна

Выводы

3. В результате взаимодействия антител с АОБ. может происходить частичное изменение их специфичности с возникновением возможности связываниям гетерологичными антигенами.

5. Длинноцепочечные АОБ изменяют функциональную активность Бс-фрагмента антител, затрудняя инициацию классического пути активации комплемента.

6. Алкилоксибензолы увеличивают чувствительность антител к термоденатурации, преимущественно снижают чувствительность к УФ-облучению и разнрнаправленно изменяют диапазон активности при различных значениях рН.

8. 1,3-диокси-5-метилбензол, оказывающий наименьшее влияние на антигенсвязывающую способность антител, существенно увеличивает сроки сохранения, их. функциональной активности в условиях длительного пребывания в водном- растворе.

Заключение

Малые органические молекулы, вероятно, являются одними из наиболее эволюционно древних компонентов живых систем. История их открытия связана с исследованием цвета, запаха и вкуса продуктов растительного и животного происхождения /188/, а распространение подобного поиска в мир микроорганизмов позволило выявить у малых молекул и иные, не менее значимые функции. Так, одним из наиболее ярких открытий в микробиологии конца XX века явилось описание феномена межклеточной коммуникации и определяемого этим коллективного поведения1 бактерий; за которые в качестве химических сигналов отвечают именно малые молекулы /19/. При этом к настоящему времени количество известных малых регуляторных молекул, представленных лактонами гомосерина, циклическими олигопептидами и др. достигло нескольких десятков и продолжает возрастать /25/.

Среди малых молекул с регуляторными свойствами обращает на себя внимание широкий спектр изомеров и гомологов алкилоксибензолов (АОБ), в научной литературе описываемых также как фенольные липиды /54/ или алкилрезорцины /1/. Исследование характера индуцируемых ими эффектов позволило связать биологическую роль АОБ с индукцией перехода микроорганизмов в гипометаболическое и анабиотическое состояние /3, 4/. В свою очередь лежащие в основе- подобной активности молекулярные механизмы оказались связанными со способностью АОБ к взаимодействию с липидными мембранами /5/, протеинами /6/ и нуклеиновыми кислотами /7/, ведущему к изменению структурных особенностей и функциональных характеристик данных биополимеров.

Глубокое биохимическое единство жизни, а также отобранная в процессе эволюции оптимальная структура АОБ определили их присутствие и значимые биологические функции у ряда эукариот - грибов и растений /66, 69/. При этом помимо проявившейся еще в мире прокариот способности АОБ к модификации структуры и функции белковых макромолекул, у растений они дополнительно принимают участие в контроле окислительных процессов, а также реализации антимутагенных и антибактериальных эффектов/189, 190/.

Эндогенное образование алкилоксибензолов в организме животных и I человека в настоящее время не установлено. Однако, в связи с тем, что АОБ в значимых количествах поступают с растительной пищей, а также образуются некоторыми представителями микробиоценоза, они могут выступать и в качестве потенциальных участников ряда'физиологических и патологических процессов данной группы высших эукариот. При этом обоснованность подобного предположения подтверждается обнаружением присутствия АОБ в биологических жидкостях и тканях человека и животных в нано- и микромолярных /13,14/ концентрациях.

Первыми экспериментальными доказательствами регуляторных эффектов АОБ в гетёрологичных системах стали изменение каталитической активности ряда ферментных белков животного происхождения /6, 10/ и обусловленное ими снижение аффинности рецепторов к фибриногену на поверхности тромбоцитов, /12/. В свою очередь доказательствами возможного участия АОБ в регуляции активности иммунной системы стало обусловленное ими изменение розеткообразующей активности Тлимфоцитов, адгезивных свойств и фагоцитарной активности мононуклеарных фагоцитов, а также активности белков системы комплемента /16/.

Однако, в научной литературе отсутствуют данные, характеризующие эффекты алкилоксибензолов в отношении антител - неферментных иммунных белков человека и животных, а именно их основного свойства -антигенсвязывающей способности, а также функциональной и операционной стабильности при экстремальных физических и химических воздействиях, что и определило цель настоящего исследования.

В процессе достижения указанной цели на примере ряда гомологов алкилоксибензолов (СгАОБ, С3-АОБ, Сб-АОБ и С12-АОБ), различающихся длиной алкильных радикалов и определяемой этим гидрофобностью молекул, впервые показана зависимость изменения функциональных характеристик и параметров стабильности антител от структуры и действующих концентраций АОБ. При этом установлено, что направленность и выраженность действия АОБ характеризуется выраженной зависимостью от особенностей их химического строения (в первую очередь — длины углеводородного алкильного радикала) и в зависимости от этого проявляется в формировании двух основных групп эффектов:

1) для длинноцепочечных гомологов АОБ впервые показано влияние на ряд функциональных характеристик антител — их антигенсвязывающую способность, специфичность и эффекторные функции, что позволяет охарактеризовать данную группу малых молекул как бактериальные ауторегуляторы с иммуномодулирующими свойствами;

2) впервые охарактеризовано влияние АОБ на чувствительность антител к различным денатурирующим воздействиям, а также стабильность их функциональных' характеристик при длительном нахождении в водном растворе, каковая может быть существенно увеличена в присутствии короткоцепочечного 1,3-диокси-5-метилбензола и позволяет рекомендовать названный гомолог АОБ в качестве стабилизатора препаратов антител.

Обобщая и обсуждая полученные при проведении работы указанные фундаментальные и прикладные результаты, еще раз обратим внимание на следующие детализирующие их основные моменты, а также определим возможные направления дальнейшего научного поиска.

Первая группа научных результатов работы связана с выявлением I способности АОБ к' блокированию специфического связывания антител с соответствующими (гомологичными) антигенами. С использованием различных вариантов иммуноферментного анализа, включающего классический «сендвич-метод» и конкурентный ИФА показано, что присутствие в реакционной системе возрастающих концентраций АОБ приводит к достоверному снижению показателей связывания антител I различной специфичности и классов. Данная способность существенно зависела от химического строения использованных гомологов алкилоксибензолов, будучи наиболее выраженной у длинноцепочечных Сб- и С12-АОБ в сравнении с короткоцепочечными С г и Сз-АОБ.

В подобном контексте малый размер, а также особенности молекулярной организации АОБ позволяют уподобить их гаптенам, активность которых также связана с блокированием антигенсвязывающей способности антител /166/. Однако, в отличи от истинных гаптенов, представляющих собой фрагменты детерминантных групп антигенов и в этой связи блокирующих взаимодействие только в определенных парах «антиген-антитело», эффект АОБ распространялся на антитела самой разной специфичности. Сказанное позволило рассматривать исследованные малые молекулы как некие «супергаптены», обладающие расширенным спектром биологической активности.

Обнаружение подобной уникальной способности АОБ ставит вопрос о механизмах, лежащих в основе вызываемого ими блокирования антител. При этом вероятные возможности определяются взаимодействием длинноцепочечных гомологов АОБ с остатками гидрофобных аминокислот непосредственно в активных центрах антител, а также обуславливаемым ими изменением характера укладки полипептидных цепей, нарушающего точную организацию макромолекулы в области активного центра, как это было ранее показано для ряда ферментных белков /51, 108-110/.

Окончательное решение данного вопроса требует продолжения исследований в обозначенном направлении, в том числе с использованием методов исследования третичной структуры белков (рентгеноструктурный анализ, двух- и многомерная ЯМР-спектроскопия). Полученные же при проведении настоящего исследования экспериментальные результаты позволили детализировать выявленные эффекты АОБ через влияние на аффинитет и авидность антител, характеризующие качество и количество силы их связывания с соответствующими антигенами.

Так изменение аффинитета антител под действием АОБ было зафиксировано с использованием метода гашения триптофановой флюоресценции при добавлении нитроароматического лиганда динитрофенола. При этом выявленное подавление гашения флюоресценции антител, предварительно инкубированных с С6-АОБ, по сравнению с интактными иммуноглобулинами позволило говорить о снижении их аффинности в присутствии названных малых молекул. В свою очередь методом денатурирующего иммуноферментного анализа был показан более выраженный прямой блокирующих эффект АОБ по отношению к низкоавидным антителам по сравнению с высокоавидными, а также снижение самого показателя авидности последних в присутствии Сб-АОБ.

На этом фоне вторым значимым научным результатом представляется I экспериментально обнаруженная способность АОБ не только блокировать взаимодействие антител с гомологичными антигенами, но и обуславливать возможность их неспецифического взаимодействия с рядом гетерологичных антигенов. Так в опытах с антителами шести специфичностей к стероидным и нестероидным гормонам человека продемонстрировано повышение показателей их взаимодействия с гетерологичными антигенами под действием С6-АОБ, а особенно С12-АОБ. Сказанное позволило констатировать, что подобная способность вновь была характерна именно для длинноцепочечных АОБ, тем самым заставляя рассматривать два описанных выше феномена (блокирование специфического взаимодействия и возникновение возможности неспецифического взаимодействия в системе «антиген-антитело») как проявление одного и того же механизма биологической активности гидрофобных гомологов алкилоксибензолов, определяемого изменением структуры активных (антигенсвязывающих) центров антител.

Обсуждая полученный результат, представляется целесообразным сопоставить его с недавно полученными данными о влиянии АОБ на внутримолекулярную динамику белка, рассмотренную на примере ферментного белка — лизоцима /191/. При этом обращает на себя внимание повышение внутримолекулярной подвижности модифицированной- АОБ белковой глобулы, в том числе проявляющейся в увеличении флуктуаций в области активного центра. Результатом же происходящих процессов оказывается снижение характеризуемой константой Михаэлиса субстратной специфичности ферментных белков, одновременно* сопровождающееся-парадоксальным расширением спектра их субстратной специфичности. Так в варианте модификации лизоцима, наряду с изменением его активности к типичному субстрату — бактериальному пептидогликану, отмечена выраженная стимуляция гидролитической активности фермента в отношении коллоидного хитина /10/.

В подобном контексте представляется вероятным предположение о том, что изменение специфичности белков как результат их модификации АОБ, по-видимому, является универсальным эффектом этих малых молекул, распространяющимся как на иммунные, так и на ферментные белки (в частности — лизоцим /10/, оксигеназы /11/ и др.). Применительно же именно к антителам возможность частичного изменения их специфичности при взаимодействии с АОБ может иметь дополнительные медико-биологические аспекты. В частности, модификация антител АОБ микробного происхождения представляется одним из молекулярных механизмов «уклонения» инфекционных агентов от эффекторов иммунной системы. В свою очередь механизмы индуцируемых АОБ растительного происхождения иммунопатологических состояний /17, 18/ также могут быть опосредованы именно этой особенностью биологической активности названных малых молекул.

Дополнительным вопросом, требующим своего решения при описании взаимодействияАОБ с белковыми макромолекулами, являлся избирательный или неизбирательный характер их контакта именно с активными (антигенсвязывающими) центрами антител. Проведенное с этой целью экспериментальное исследование влияния АОБ на активность еще одного функционального участка — Бс-фрагмента антител, позволило констатировать, что эффект алкилоксибензолов проявляется и в изменении его активности, тем самым свидетельствуя о делокализованности данных малых молекул по всей глобуле белка. При этом действие алкилоксибензолов на эффекторные функции иммуноглобулинов в реакции комплементзависимого лизиса эритроцитов проявлялось через увеличение кинетического параметра 150%, характеризующего скорость инициации классического пути активации комплемента. В совокупности же с известными данными о влиянии АОБ на собственную активность белков системы комплемента /16/, их действие на эффекторные функции антител может рассматриваться в качестве еще одного механизма «уклонения» микроорганизмов от контакта с бактерицидными факторами организма-хозяина.

Наконец еще одним экспериментально выявленным эффектом АОБ в системе «антиген-антитело», усиливающим направленность и выраженность происходящих процессов, явилась способность данных малых молекул, наряду с изменением функциональных характеристик антител, модифицировать и значимые для взаимодействия с ними поверхностные свойства антигенов. При этом подобная способность в наибольшей степени была выражена уже не у длинноцепочечных, но у короткоцепочечных гомологов АОБ, что вероятно определялось их влиянием на гидратную оболочку антигенов. В свою очередь результаты проведенного двухфакторного дисперсионного анализа свидетельствовали о преобладании у длинноцепочечных АОБ способности к модификации антигенсвязывающей способности антител, развернутая характеристика которой была дана нами выше.

Таким образом, результатом выполнения первой части работы явились выявление и характеристика изменения функциональной активности антител (иммуноглобулинов) как результата их взаимодействия с химическими аналогами низкомолекулярных регуляторных факторов бактериального и растительного происхождения, что позволяет по-новому оценить роль I последних при их поступлении или образовании в организме человека и животных. В целом полученные результаты позволили с новых позиций оценить эволюционно древние химически консервативные малые молекулы из группы алкилоксибензолов как иммуномодуляторы особого типа, формирующие «информационный шум», дезорганизирующий и дискоординирующий иммунный ответ и потенциально ведущий к развитию иммунодефицитных и аутоиммунных состояний.

В подобном контексте полученные результаты хорошо согласуются с формирующимся в мировой науке представлениям о наличии у некоторых I бактериальных ауторегуляторов способности к воздействию на; функционирование иммунной системы млекопитающих /192/. Однако^ в отличие от известных фактов стимуляции продукции цитокинов при воздействии на клетки иммунной системы образуемого Chromobacterium violaceum ауторегулятора N-додеканоил-гомосеринлактона /193/ или показанного у образуемого Pseudomonas aeruginosa автоиндуктора N-оксододеканоил-гомосеринлактона способности к индукции апоптоза макрофагов и нейтрофилов /194/, оригинальность полученных результатов заключается в выявлении воздействия бактериальных ауторегуляторов не на клеточное, но на гуморальное звено иммунитета.

Второй блок полученных экспериментальных результатов включает оценку эффектов алкилоксибензолов на функциональные характеристики иммунных белков при денатурирующих воздействиях (функциональная стабильность) или неоптимальных условиях проведения реакций (операционная стабильность). При этом основанием для подобной постановки вопроса явились представления об АОБ как своеобразных химических шаперонах», предотвращающих денатурацию белковых молекул при экстремальных внешних воздействиях /8, 9/. Однако, экспериментально зафиксированные эффекты АОБ в отношении стабильности антител при воздействии высоких температур, ультрафиолетового облучения и неоптимальных значениях рН оказывались достаточно разнонаправленными.

Так короткоцепочечный гомолог СгАОБ в низких концентрациях повышал, а в высоких понижал значения характеризующего процесс термоденатурации параметра ЕТ20, не оказывая достоверного влияния на параметр ЕТ50. В свою очередь проведение модификации с использованием Сб-АОБ и последующая термообработка образующихся комплексов вели не только к значимому изменению величин ЕТ20, но и к снижению ЕТ50 существенно ниже такового у немодифицированных антител. При этом полученный результат, свидетельствующий о происходящем снижении терморезистентности комплексов «антитело+АОБ», согласуется с приведенными выше данными о повышении внутримолекулярной подвижности белковой глобулы при ее модификации алкилоксибензолами /191/, одновременно еще раз подтверждая факт связывания АОБ в области активных центров антител.

Еще одним, воспроизводящим ранее полученный на примере ферментных белков эффект /9/, стало протективное действие АОБ на функциональную стабильность антител при УФ-облучении, в основе которого может лежать близость спектральных максимумов (277 нм у Ср АОБ и 280 нм у Сб-АОБ) с таковыми у входящих в структуру белков остатков ароматических аминокислот — тирозина и триптофана (около 280 нм). Соответственно, в результате частичного перекрывания данных спектров в УФ-диапазоне возникает возможность формирования своеобразного «оптического экрана» из молекул АОБ, поглощающих кванты света на пути к белку. В то же время подобное предположение не способно полностью объяснить связь выраженности УФ-протекторного эффекта с особенностями химического строения АОБ, а также формирующиеся при этом нелинейные концентрационные зависимости, вновь заставляя признать роль в этих процессах прямого взаимодействия в системе «антитело+АОБ».

Наконец эффекты на операционную стабильность антител при неоптимальных значениях рН также оказывались достаточно неоднозначными. При этом наиболее общей зависимостью стало то, что при низких (кислых) значения рН АОБ проявляли себя как дестабилизаторы антител, а единичные- факты расширения их операционной стабильности продемонстрированы при высоких (щелочных) значениях рН.

На фоне столь неоднозначного эффекта АОБ на функциональную и операционную стабильность антител важной задачей представлялось исследование эффектов данной группы малых молекул на стабильность их характеристик в водных растворах, потенциально определяемых особыми амфифильными свойствами АОБ. При этом предпосылки для подобного исследования дополнительно определялись собственными результатами компьютерного моделирования взаимодействия молекул воды с различными гомологами АОБ, позволившими методом функционала плотности БРТ/ КОШ7/ ВЗ ЬУР/ в базисе 6-310 провести расчет межмолекулярных потенциалов и определить возможность создания устойчивых по энергии комплексов. Выполнение соответствующих расчетов позволило констатировать особенность свойств коротокоцепочечных гомологов АОБ и, особенно, С1-АОБ, формирующего устойчивые связи с молекулами воды и, тем самым, способного существенно модифицировать гидратную оболочку биополимеров.

Экспериментальное исследование влияния СрАОБ на антитела, изначально не вызывающего значимых изменений функциональных характеристик данных белков (см. выше), сопровождалось достоверным увеличением сроков сохранения их антигенсвязывающей способности. В частности, использование названного гомолога к концу периода хранения при +37°С почти двукратно увеличивало время, за которое происходила потеря 20% функциональной активности антител и обуславливала превышение показателя их антигенсвязывающей способности на 79.0% по сравнению с интактными антителами. В свою очередь использование длинноцепочечных гомологов АОБ в динамике хранения хотя и вело к частичному восстановлению показателей связывания модифицированных ими антител с соответствующими антигенами, не сопровождалось значимым увеличением сроков сохранения подобной функциональной активности.

Полученные результаты определили перспективу инновационного подхода к стабилизации иммунных белков как результата их взаимодействия с АОБ, включающего определение химической структуры стабилизатора (Сг АОБ) и его оптимальной концентрации (10"4М), не оказывающих негативного эффекта на антигенсвязывающую способность и другие значимые характеристики антител, но позволяющих достичь увеличения сроков сохранения их функциональной активности при длительном нахождении в водных растворах. Приоритет подобного подхода закреплен «Способом стабилизации антител в водных растворах» (положительное решение ФИПС по заявке на изобретение № 2010136488 от 30.08.2010 г.).

Таким образом, проведенное исследование, свидетельствующее о взаимодействии малых регуляторных молекул из группы алкилоксибензолов с антителами, изменяющем их функциональные характеристики и параметры стабильности, приобретает оригинальные медико-биологические и биотехнологические приложения. С одной стороны, полученные результаты позволяют раскрыть' новые механизмы взаимодействия «микроорганизм-макроорганизм», определяемые бифункциональностью длинноцепочечных гомологов АОБ в подобной системе и потенциально ведущие к созданию на данной основе новой группы иммуномодуляторов. С другой стороны, в ряде случаев полученные результаты могут быть биотехнологически полезными, что заключается в возможности длительного сохранения функциональных характеристик антител при их модификации короткоцепочечными АОБ.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Романенко, Наталья Александровна, Саратов

1. Kozubek A., Tyman J.H.P. Resorcinolic lipids, the natural non-isoprenoid phenolic amphiphiles and their biological activity // Chemical Reviews. 1999. V. 99. No. l.P. 1-31.

2. Эль-Регистан Г.И., Мулюкин A.JI., Николаев Ю.А., Сузина Н.Е., Гальченко В.Ф., Дуда В.И. Адаптогенные функции внеклеточных ауторегуляторов микроорганизмов // Микробиология. 2006. Т. 75. № 4. С. 446-456.

3. Вострокнутова Г.Н., Капрельянц А.С., Светличный В.А.,I

4. Эль-Регистан Г.И., 'Шевцов В.В., Островский Д.Н. Мембраноактивные свойства препарата из культуральной жидкости бактерий, обладающего ауторегуляторным действием // Прикладная биохимия и микробиология. 1983. Т. 19. №4. С. 21-25.

5. Давыдова O.K., Дерябин Д.Г., Никиян А.Н., Эль-Регистан Г.И. О механизмах взаимодействия ДНК с химическими аналогами микробных аутоиндукторов анабиоза // Микробиология. 2005. Т. 74. № 5. С. 616-625.

6. Мартиросова Е.И., Карпекина Т.А., Эль-Регистан Г.И. Модификация ферментов естественными химическими шаперонами микроорганизмов1 // Микробиология. 2004. Т. 73. № 5. С. 708-715.

7. Kozubek A., Wroblewski Z. Cereal grain long chain amphiphiiicresorcinolic lipids inhibit significantly binding, of fibrinogen by platelets whereas short chain resorcinolic lipids and fatty acids do not // Studia biophysica. 1990. No. 139. P. 177-181.

8. Landberg R., Linko A-M., Kamal-Eldin A., Vessby В., Adlercreutz H., Aman Pi Human plasma kinetics and relative bioavailability of- alkylresorcinols after intake of ryebran // The Journal of Nutrition. 2006. Y. 136: P. 2760-2765.

9. Ross A.B., Redeuil.K., Vigo M., Rezzi S., Nagy K. Quantification of alkylresorcinols in human plasma by liquid chromatography/tandem mass spectrometry // Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2010: V. 24. No. 5. P. 554-560.

10. Казацкая Ж.А., Николаева Н.В., Липова В.В., Шушпанова О.Н. Влияние алкилоксибензолов на некоторые иммунологические реакции in vitro // Паллиативная медицина и реабилитация. 2005. № 1. С. 68.

11. Шушпанова О.Н. Оценка иммунотропной активности алкилоксибензолов // Материалы XV Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов». 2008. С. 46.

12. Ока К., Saitp F., Yasuhara Т., Sugimoto A. A study of cross-reactions between mango contact allergens and urushiol // Contact Dermatitis. 2004. V. 51. P. 292-296.

13. Hershko K., Weinberg I., Ingber A. Exploring the mango poison ivy connection: the riddle of discriminative plant dermatitis // Contact Dermatitis. 2005. V. 52. P. 3-5.

14. Хохлов A.C. Низкомолекулярные микробные ауторегуляторы. M.: Наука, 1988.-270 с.

15. Stephens К. Pheromones among the procaryotes // CRC Critical Reviews in Microbiology. 1986. No. 13. P. 309-334.

16. Whittaker R.H., Feeny P.P. Allelochemics: chemical interactions between species // Science. 1971. V. 171. P. 757-770.

17. Miller M.B., Bassler B.L. Quorum sensing in bacteria // Annual Review of Microbiology. 2001. V. 55. P. 165-199.

18. Waters C., Bassler B.L. Quorum sensing: Cell-to-cell communication in bacteria // Annual Review of Cell and Developmental Biology. 2005. V. 21. P. 319-346.

19. Lal A. Quorum Sensing. How bacteria talk to each other // Resonance. 2009. P. 866-871.

20. Bassler B.L.,, Wright M., Showalter R.E., Silverman M.R. Intercellular signaling in Vibrio harveyh sequence and function of genes regulating expression of luminescence//Molecular Microbiology. 1993. V. 9. P. 773-786.

21. Dworkin M., Gibson S.M. A system for studying microbial morphogenesis: rapid formation of microcysts in Myxococcus xanthus II Science. 1964. No. 146. P. 243-244.

22. Piper K.R., Beck von Bodman S., Farrand S.K. Conjugation factor of Agrobacterium tumefaciens regulates Ti plasmid transfer by autoinduction // Nature. 1993. V. 362. P. 448-450.

23. Bainton N.J., Stead P., Chhabra S.R., Bycroft B.W., Salmond G.P.C., Steward G.S.A.B., Williams P. N-(3-Oxohexanoyl)-L-homoserine lactone regulates carbapenem antibiotic production in Erwinia carotovora И Biochemical Journal. 1992. V. 288. P. 997-1004.

24. Феофилова Е.П. Торможение жизненной активности как универсальный биохимический механизм адаптации микроорганизмов к стрессовым возействиям // Прикладная биохимия и микробиология. 2003. Т. 39. № 1. С. 5-24.

25. Мулюкин A.JL, Луста К.А., Грязнова М.Н., Бабусенко Е.С., Козлова А.Н., Дужа JVLB., Митюшина JI.A., Дуда В.И., Эль-Регистан Г.И. Образование покоящихся форм в автолизирующихся суспензиях микроорганизмов//Микробиология. 1997. Т. 66. № 1. С. 42-49.

26. Демкина Е.В., Соина B.C., Эль-Регистан Г.И. Образование покоящихся форм Arthrobacter globiformis в автолизирующихся суспензиях // Микробиология. 2000. Т. 69. № 3. С. 383-388.

27. Kozubek A., Zarnowski R., Stasiuk М., Gubernator J. Natural amphiphilic phenols as bioactive compounds // Cellular and Molecular Biology Letters. 2001. V. 6. No. 2A. P. 351-355.

28. Kozubek A., Pietr S., Czerwonka A. Alkylresorcinols are abundant lipid components in different strains of Azotobacter chroococcum and Pseudomonas spp. II Journal of Bacteriology. 1996. V. 178. No. 14. P. 4027-4030.

29. Zarnowski R., Suzuki Y., Zarnowska E.D., Esumi Y., Kozukek A., Pietr S.J. 5-n-Alkylresorcinols from the nitrogen-fixing soil bacterium Azotobacter chroococcum Azl2 // Zeitschrift fur Naturforschung. 2004. V. 59c. P. 318-320.

30. Rejman J., Kozubek A. The effect of alkylresorcinol on lipid metabolism in Azotobacter chroococcum II Zeitschrift fur Naturforschung. 2004. V. 59c. P. 393-398.

31. Мулюкин А.Л., Козлова А.Н., Капрельянц А.С., Эль-Регистан Г.И. Обнаружение и изучение динамики накопления ауторегуляторного фактора di в культуральной жидкости и клетках Micrococcus luteus II Микробиология. 1996. Т. 65. № 1.С. 20-25.

32. Бабусенко Е.С., Эль-Регистан Г.И., Градова Н.Б., Козлова А.Н., Осипов Г.А. Исследование мембраннотропных ауторегуляторных факторов метанокисляющих бактерий // Успехи химии. 1991. Т. 60. № 11. С. 2362-2372.

33. Бухарин О.В., Гинцбург A.JL, Романова Ю.М., Эль-Регистан Г.И. Механизмы выживания бактерий. М.: Медицина, 2005. — 367с.

34. Reusch R.N., Sadoff H.L. 5-n-Alkylresorcinols from encysting Azotobacter vinelandii: isolation and characterization // Journal of Bacteriology. 1979. V. 139. P. 448-453.

35. Reusch R.N., Sadoff H.L. Novel lipid components of the Azotobacter ■vinelandii cyst membranen // Nature. 1983. V. 302. P. 268-270.

36. Su C.-J., Reusch R.N., Sadoff H.L. Isolation and characterization of several unique lipids from Azotobacter vinelandii cyst // Journal of Bacteriology. 1981. V. 147. P. 80-90.

37. Tsuge N., Mizokami М., Imai S., Shimazu A., Seto H. Adipostatins A and B, new inhibitors of glycerol-3phospate dehydrogenase // Journal of Antibiotics. 1992. V. 45. P. 886-891.

38. Запрометов M.H. Фенольные соединения: распространение, метаболизм и функции в растениях. М.: Наука, 1993. 272 с.

39. Рогинский В.А. Фенольные антиоксиданты: реакционная способность и эффективность. М.: Наука, 1988. — 247 с.

40. Stasiuk М., Kozubek A. Biological activity of phenolic lipids // Cellular and Molecular Life Sciences. 2010. V. 67. P. 841-860.

41. Zarnowska E.D;, Zarnowski R., Kozubek A. Alkylresorcinols in fruit pulp and leaves of Ginkgo biloba L II Zeitschrift fur Naturforschung. 2000. V. 55. P. 881-885.

42. Deszcz L., Kozubek A. Higher cardol homologs (5-alkylresorcinols) in rye seedlings // Biochimica et Biophysica Acta. 2000. V. 1483. P. 241-250.

43. Landberg R'., Kamal-Eldin A., Salmenkalio-Marttila M., Rouau X., Eman P. Localization of alkylresorcinols in wheat, rye and barley kernels // Journal of Cereal Science. 2007. Accepted Manuscript. 19 p.

44. Ross A.B. Alkylresorcinols in cereal grains: occurrence, absorption, and possible use as biomarkers of whole grain wheat and rye intake. Doctoral thesis. Swedish University of Agricultural Sciences. Uppsala, 2003. — 20 p.

45. Magnucka E.G., Suzuki Y., Pietr S.J., Kozubek A., Zarnowski R. Effect of norflurazon on resorcinolic lipid metabolism in rye seedlings // Zeitschrift fur Naturforschung C. 2007. V. 62. P. 239-245.

46. Ji X., Jetter R. Very long chain alkylresorcinols accumulate in the intracuticular wax of'rye (Secale cereale L.) leaves near the tissue surface // Phytochemistry. 2008. V. 69. No. 5. P. 1197-1207.

47. Zarnowski R., Kozubek A. Alkylresorcinol homologs in Pisum sativum L. varieties // Zeitschrift fur Naturforschung. 1999. V. 54. P. 44-48.

48. Zarnowski R., Suzuki Y., Yamaguchi I., Pietr S.J. Alkylresorcinols in barley (Hordeum vulgare L. distichon) grains // Zeitschrift fur Naturforschung. 2002. V. 57. P. 57-62.

49. Zarnowski R., Suzuki Y. 5-n-Alkyresorcinols from grains of winter barley (.Hordeum vulgare L.) II Zeitschrift fur Naturforschung С. 2004. V. 59. P. 315-317.

50. Zarnowski R., Zarnowska E.D., Kozubek A. Alkylresorcinols in the family Fabaceae II Acta Societatis Botanicorum Poloniae. 2001. V. 70. No. 1. P. 25-29.

51. Jin W., Zjawiony J.K. 5-alkylresorcinols from Merulius incarnates // Journal of Natural Products. 2006. V. 69. No. 4. P. 704-706.

52. Zarnowski R., Suzuki Y., Esumi Y., Pietr S.J. 5-n-Alkyresorcinols from the green microalga Apatococcus constipates // Phytochemistry. 2000. V. 55. No. 8. P. 975-977.

53. Barrow R.A., Capon R.J. Alkyl and alkenyl resorcinols from an Australian marine sponge, Haliclona sp. (Haplosclerida: Haliclonidae) // Australian Journal of Chemistry. 1991. No. 44. P. 1393-1405.

54. Светличный В.А., Эль-Регистан Г.И., Романова A.K., Дуда В.И. Характеристики ауторегуляторного фактора d2, вызывающего автолиз клеток Pseudomonas carboxydoflava и Bacillus cereus II Микробиология. 1983. T. 52. № l.C. 33-38.

55. Мулюкин A.JI., Демкина Е.В., Козлова А.Н., Соина B.C., Эль-Регистан Г.И. Синтез аутоиндукторов анабиоза у неспорообразующихбактерий как механизм регуляции их активности в почве и осадочных породах//Микробиология. 2001. Т.70. № 5. С. 620-628.

56. Мулюкин А.Л., Сузина Н.Е., Дуда В.И., Эль-Регистан Г.И. Структурное и физиологическое разнообразие цистоподобных покоящихся клеток бактерий рода Pseudomonas // Микробиология. 2008. Т. 77. № 4. С. 512-523.

57. Маргулис А.Б., Ильинская О.Н., Колпаков А.И., Муфер К. Индукция гипометаболических форм у неспорообразующих грамположительных бактерий // Ученые Записки Казанского Государственного Университета. Естественные науки. 2005. Т. 147. Кн. 2. С. 108-114.

58. Горшков В.Ю., Петрова O.E., Мухаметшина Н.Е., Агеева М.В., Мулюкин А.Л., Гоголев Ю.В. Образование «некультивируемых» покоящихся форм фитопатогенной энтеробактерии Envina carotovora II Микробиология. 2009. Т. 78. № 5. С. 647-655.

59. Погорелова А.Ю., Лойко Н.Г., Ванькова A.A. Образование цистоподобных покоящихся форм Sinorhizobium meliloti Р221 под влиянием алкилоксибензола // Известия ТСХА. 2009. № 1. С. 149-154.

60. Николаев Ю:А., Мулюкин А.Л., Степаненко И.Ю., Эль-Регистан Г.И. Ауторегуляция стрессового ответа микроорганизмов // Микробиология. 2006. Т. 75. № 4. С. 489-496.

61. Конаныхина И.А., Шаненко Е.Ф., Лойко Н.Г., Николаев Ю.А., Эль-Регистан Г.И. Регулирующее действие микробных алкилоксибензолов различной структуры на стрессовый ответ дрожжей // Прикладная биохимия и микробиология. 2008. V. 44. № 5. Р. 571-575.

62. Конаныхина И.А., Шаненко Е.Ф., Николаев Ю.А., Эль-Регистан Г.И. Разработка способов защиты пивоваренных дрожжей от осмотического стресса // Хранение и переработка сельхозсырья. 2007. № 3. С. 40-41.

63. Miche L., Belkin S., Rozen R., Balandreau J. Rice seedling whole exudates and extracted alkylresorcinols induce stress-response in Escherichia coli biosensors // Environmental Microbiology. 2003. V. 5. No. 5. P. 403-411.

64. Ильинская O.H., Колпаков А.И., Шмидт M.A., Дорошенко Е.В., Мулюкин А.Л., Эль-Регистан Г.И. Роль бактериальных ауторегуляторов роста группы алкилоксибензолов в ответе стафилококков на стрессовые воздействия //Микробиология. 2002. Т. 71. № 1. С. 23-29.

65. Маргулис А.Б., Ильинская О.И., Колпаков А.И., Эль-Регистан Г.И. Индукция SOS-ответа клетки под действием ауторегуляторных факторов микроорганизмов // Генетика. 2003. Т. 39. № 9. С. 1180-1184.

66. Конаныхина И.А., Шаненко Е.Ф., Шабурова Л.Н., Кирдяшкин В.В., Николаев Ю.А., Эль-Регистан Г.И. Стабилизация дрожжей Saccharomyces cerevisiae И Хранение и переработка сельхозсырья. 2007. № 8. С. 44-46.

67. Конаныхина И.А., Шаненко Е.Ф., Николаев Ю.А., Эль-Регистан Г.И. Регулирующие действия микробных алкилоксибензолов различной структуры на стрессовый ответ дрожжей // Прикладная биохимия и микробиология. 2008. Т. 44. № 5. С. 571-575.

68. Funabashi М., Fuña N., Horinouchi S. Phenolic lipids synthesized by type III polyketide synthase confer penicillin resistance on Streptomyces griseus II Journal of Biological Chemistry. 2008. V. 283. No. 20. P. 13983-13991.

69. Халатур П.Г. Самоорганизация полимеров // Соросовский образовательный журнал. 2001. Т. 7. № 4. С. 36-43.

70. Kozubek A. Determination of octanol/water partition coefficients for long-chain homologsof orcinol from cereal grains // Acta Biochimica Polonica. 1995. V. 42. No: 2. P. 247-251.

71. Siwko М.Е., de Vries А.Н., Mark A.E., Kozubek A., Marrink S.J. Disturb or stabilize? A molecular dynamics study of the effects of resorcinolic lipids on phospholipid bilayers // Biophysical Journal. 2009. V. 96. P. 3140-3153.

72. Kozubek A., Demel R.A. Permeability changes of erythrocytes and liposomes by 5-(n-alk(en)yl)resorcinols from rye //Biochimica et Biophysica Acta. 1980. V. 603. P. 220-227.

73. Kozubek A. The effect of 5-(n-alk(en)yl)resorcinols on membranes. I. Characterization of the permeability increase induced by 5-(n-heptadecenyl)resorcinol // Acta Biochimica Polonica. 1987. V. 34. P. 357-367. . .!

74. Stasiuk M., Kozubek A. Modulation of hemolytic properties of resorcinolic lipids by divalent cations // Cellular and Molecular Biology Letters. 1996. V. l.P. 189-198.

75. Stasiuk M., Kozubek A. Modulation of hemolytic properties of resorcinolic lipids by divalent cations. Dependence of the effect of cations on alkylresorcinol structure // Cellular and Molecular Biology Letters. 199.7. V. 2. P. 77-87.

76. Kozubek A. Detergent-like effect of phenolic lipids on biological membranes // Acta Universitatis Wratislaviensis. 1989. V. 868. P: 27-32.

77. Kozubek A. The effect of some nonisoprenoid phenolic lipids upon biological membranes//Acta Universitatis Wratislaviensis. 1986. V. 886. P. 122.

78. Комолова Г.С., Горская И.А., Каверинская T.B., Шевелева И.Д. Влияние алкилрезорцина на дыхание, синтез нуклеиновых кислот и белка в изолированных тимоцитах И Биохимия. 1989. Т. 54. № 11. С. 1847-1851.

79. Ненашев В.А., Придачина Н.Н., Проневич JI.A., Батраков С.Г. 5-алкил(С19-С25)резорцины регуляторы окисления митохондриями сукцината и NAD-зависимых субстратов // Биохимия. 1989. V. 54. № 5. С. 784-787.

80. Ненашев Е.А., Придачина Н.Н., Эль-Регистан Г.И., Золотарева И.Н., Батраков С.Г. Действие ауторегуляторов анабиоза некоторых микроорганизмов на дыхание митохондрий печени крыс // Биохимия. 1994. Т. 59. № 1. С. 1511-1515.

81. Sikorski A.F., Michalak К., Bobrowska M., Kozubek A. Interaction of spectrin with some amphipatic compounds // Studia biophysica. 1987. V. 121. P. 183-191.

82. Kieleczawa J., Szalewicz A., Kozubek A., Kulig E. Effect of resorcinols on electron transport in pea chloroplasts // Progress in Photosynthetic Research. 1987. V. 2. P. 585-587.

83. Kozubek A. Interaction of alkylresorcinols with proteins // Acta Biochimica Polonica. 1995. V. 42. P. 241-246.

84. Kozubek A., Nietubyc M., Sikorski A.F. Modulation of the activities of membrane enzymes by cereal grain resorcinolic lipids // Zeitschrift fur Naturforschung. 1992. V. 47. P. 41-46.

85. Rejman J., Kozubek A. Long-chain orcinol homologs from cereal bran are effective inhibitors of glycerophosphate dehydrogenase // Cellular and Molecular Biology Letters. 1997. V. 2. P. 411-419:

86. Rejman J., Kozubek A. Inhibitory effect of natural phenolic lipids upon NAD-dependent dehydrogenases and- on triglyceride accumulation in 3T3-L1 cells in culture // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2004. V. 52. P. 246-250.

87. Лысюк В.М., Шаненко Е.Ф., Гернет М.В., Эль-Регистан Г.И. Активация ферментного комплекса LaminexBG GlucanaseComplex в производстве пива//Пиво и напитки. 2010. № 1. С. 12-14.

88. Лысюк В.М., Шаненко Е.Ф., Гернет М.В., Эль-Регистан Г.И. Практические аспекты применения активации ферментных препаратов при получении пивного сусла // Пиво и напитки. 2010. № 2. С. 14-15.

89. Липова В.В., Шушпанова О.Н., Казацкая Ж.А., Эль-Регистан Г.И., Новиков В.В. Стабилизирующее действие алкилоксибензолов на антитела против HBs-антигена // Иммунология. 2007. № 1.С. 22-23.

90. Tatzelt J., Prusiner S.B., Welch W.J. Chemical chaperones interfere with the formation of scrapie prion protein // EMBO Journal. 1996. V. 15. No. 23. P. 6363-6373.

91. Давыдова O.K., Дерябин Д.Г., Эль-Регистан Г.И. Влияние химических аналогов микробных ауторегуляторов на чувствительность ДНК к УФ-облучению // Микробиология. 2006. Т. 75. № 5. С. 654-661.

92. Давыдова O.K., Дерябин Д.Г., Эль-Регистан Г.И. Длительное сохранение ДНК в водных растворах в присутствии химических аналогов микробных ауторегуляторов // Микробиология. 2006. Т. 75. № 5. С. 662-669.

93. Давыдова O.K., Дерябин Д.Г., Эль-Регистан Г.И. Исследование влияния химических аналогов ауторегуляторных с1гфакторов микроорганизмов на структурные переходы ДНК методом ИК-спектроскопии //Микробиология. 2007. Т. 76. № 3. С. 306-312.

94. Ильинская О.Н., Колпаков А.И., Зеленихин П.В., Круглова З.Ф., Чойдаш Б., Дорошенко Е.В., Мулюкин А.Л., Эль-Регистан Г.И. Влияние аутоиндукторов анабиоза бактерий на геном микробной клетки // Микробиология. 2002. Т. 71. № 2. С. 194-199.

95. Мулюкин А.Л., Козлова А.Н., Эль-Регистан Г.И. Свойства фенотипических диссоциантов бактерий Pseudomonas aurantiaca и Pseudomonas fluorescens II Микробиология. 2008. Т. 77. № 6. С. 766-776.

96. Маргулис А.Б., Колпаков А.И., Ильинская О.Н. Сравнительное действие гомосеринлактона и гексилрезорцина в индукции фенотипической диссоциации бактерий // Микробиология. 2006. Т. 75. № 4. С. 468-471.

97. Fate G.D., Lynn D.G. Xenognosin methylation is critical in defining the chemical potential gradient that regulates the spatial distribution in Striga pathogenesis // Journal of the American Chemical Society. 1996. V. 118. P. 11369-11376.

98. Hladyszowski J., Zubik L., Kozubek A. Quantum mechanical and experimental oxidation studies of pentadecyl-resorcinol olovetol, orcinol and resorcinol // Free Radical Research. 1998. V. 28. P. 359-368.

99. Musialik M., Litwinienko G. DSC study of linolenic acid autoxidation inhibited by BHT, dehydrozingerone and olivetol // Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. 2007. V. 88. P. 781-785.

100. Struski D.G.J., Kozubek A. Cereal grain alk(en)ylresorcinols protect lipids against ferrous ions-induced peroxidation // Zeitschrift fur Naturforschung. 1992. V. 47. P. 47-50.

101. Kozubek A., Nienartowicz B. Cereal grain resorcinolic lipids inhibit H202-induced peroxidation of biological membranes // Acta Biochimica Polonica.1995. V. 42. P. 309-316.i

102. Deszcz L., Kozubek A. Inhibition of soybean lipoxygenases by resorcinolic lipids from cereal bran // Cellular and Molecular Biology Letters. 1997. V. 2. P. 213-222.

103. Kubo I., Masuoka N., Ha T.J., Tsujimoto K. Antioxidant activity of anacardic acids //Food Chemistry. 2006. V. 99. P: 555-562.

104. Hengtrakul P., Mathias M., Lorenz K. Effects of cereal alkylresorcinols on human platelets thromboxane production // The Journal of Nutritional Biochemistry. 1991. V. 2. P. 20-24".

105. Kulawinek M., Kozubek A. 5-n-alkylresorcinols of whole graincereals and whole grain cereal products as biomarkers of healthy food // Postepy Biochemii. 2007. V. 53. No. 3. P. 287-296.

106. Ross A.B., Kamal-Eldin A., Aman P. Dietary alkylresorcinols: absorption, bioactivities, and possible use as biomarkers of whole-grain wheat- and rye-rich foods //Nutrition-Reviews. 2004. V. 62. No. 3. P. 81-95.

107. Ross A.B., Kamal-Eldin A., Lundin E.A., Zhang J.-X., Hallmans G., Aman P. Cereal alkylresorcinols are absorbed by humans // The Journal of Nutrition. 2003. V. 133. P. 2222-2224.

108. Chen Y., Ross A.B., Aman P., Kamal-Eldin A. Alkylresorcinols asimarkers of whole grain wheat and rye in cereal products // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2004. V. 52. P. 8242-8246.

109. Montonen J., Landberg R., Kamal-Eldin A., Aman P., Knueppel S., Boeing H., Pischon T. Reliability of fasting plasma alkylresorcinol concentrations measured 4 months apart // European Journal of Clinical Nutrition. 2010. V. 64. No. 7. P. 698-703.

110. Landberg R., Kamal-Eldin A., Aman P., Christensen J., Overvad K., Tjonneland A., Olsen A. Determinants of plasmaalkylresorcinol concentration in Danish post-menopausal women // European Journal of Clinical Nutrition. 2011. V. 65. No. l.P. 94-101.

111. Linko A.M., Parikka K., Wahala K., Adlercreutz H. Gasichromatographic mass spectrometric method for the determination of alkylresorcinols in human plasma // Analytical Biochemistry. 2002. V. 308. No. 2. P. 307-313.

112. Ross A.B., Eman P., Andersson R., Kamal-Eldin A. Chromatographic analysis of alkylresorcinols and their metabolites // Journal of Chromatography A. 2004. V. 1054. P. 157-164.

113. Linko A.M., Ross A.B., Kamal-Eldin A., Serena A., Bjornbak Kjaer A.K., Jorgensen H., Penalvo J.L., Adlercreutz H., Eman P, Knudsen K.E.B.

114. Kinetics of the appearance of cereal alkylresorcinols in pig plasma // British Journal of Nutrition. 2006. V. 95. P. 282-287.

115. Koskela A., Linko-Parvinen A.-M., Hiisivuori P., Samaletdin A., Kamal-Eldin A., Tikkanen M.J., Adlercreutz H. Quantification of alkylresorcinol metabolites in urine by HPLC with coulometric electrode array detection // Clinical

116. Chemistry. 2007. V. 53. No. 7. P. 1380-1383.i

117. Ross A.B., Eman P., Kamal-Eldin A. Identification of cereal alkylresorcinol metabolites in human urine — potential biomarkers of wholegrain wheat and rye intake // Journal of Chromatography B. 2004. V. 809. P. 125-130.

118. Jansson E., Landberg R:, Kamal-Eldin A., Wolk A., Vessby B., Aman P. Presence of alkylresorcinols, potential whole-grain biomarkers, in human adipose tissue // British Journal of Nutrition. 2010. V. 104. No. 5. P. 633-636.

119. Arisawa M., Ohmura K., Kobayashi A., Morita N. A cytotoxic constituent of Lysimachia japónica Thrunb. (Primulaceae) and the structure-activity relationships of related compounds // Chemical and Pharmaceutical

120. Bulletin. 1989. V. 37. P. 2431.

121. Filip P., Anke T., Sterner O. 5-(20-oxoheptadecyl)-resorcinols and 5-(20-oxononadecyl)-resorcinol, cytotoxic metabolites from a wood-inhabiting Basidiomycete II Zeitschrift fur Naturforschung. 2002. V. 57. P. 1004-1008.

122. Tamai H., Yamane T., Tasaka K. Anticancer agents containing 4-alkylresorcinols. Patent Jpn. Kokai Tokkyo Koho J.P.02.292.213, 1990.

123. Gosteli J. Antimicrobial resorcinols. Ger. Offen. 2.359.410, 1974.

124. Katsuta T. Oral bactericidial compositions containing phenols. Patent Jpn. Kokai Tokkyo Koho J.P. 02.255.609, 1990.

125. Uchida H. 2-Alkylresorcinols. Jpn. Kokai Tokkyo Koho J.P. 60.139.637, 1985.

126. Kozubek A., Gubernator J., Przeworska E., Stasiuk M. Liposomal drug delivery, a novel approach: PLARosomes // Acta Biochica Polonica. 2000. V. 47. No. 3.P 639-649.

127. Porter R.R. The hydrolysis of rabbit y-globulin and antibodies with crystalline papain // Biochemical Journal. 1959. V. 73. P. 119-126.

128. Wasserman R.L., Capra J.D. Immunoglobulins. In: The Glycoconjugates, edited by M.I. Horowitz and W. Pigman. Academic Press, New York. 1977. P. 323-348.

129. Hilschmann N., Craig L.C. Amino acid sequence studies with Bence Jones proteins // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 1965. V. 53. P. 1403-1409.

130. Edmundson A.B., Ely K.R., Abola E.E., Schiffer M., Panagiotopoulos N. Rotational allomerism and divergent evolution of domains in immunoglobulin light chains // Biochemistry. 1975. V. 14. P. 3953-3961.

131. Capra J.D., Kehoe J.M. Hypervariable regions, idiotypy and the antibody combining site // Advances in Immunology. 1975. V. 20. P. 1-40.

132. Биохимия. Краткий курс с упражнениями и задачами / Под ред. члена-кореспондента РАН, проф. Е.С. Северина, проф. А.Я. Николаева. М.: ГЭОТАР-МЕД, 2001. 448 с.

133. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. Пер. с англ. / М.: Мир, 2000.-592 с.

134. Иммунология: В 3-х т. Т. 3. Пер. с англ. / Под ред. У. Пола. М.: Мир, 1987-1989. 360 с.

135. Антитела. Методы: Кн. 1: Пер с англ. / Под ред. Д. Кэтти. М.:.Мир, 1991.- 287 с.

136. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия. М.: Высшая школа, 1998.-479 с.

137. Method of stabilizing antibody and stabilized solution-type antibody preparation. US 0020255, 2007.

138. Stabilized aqueous composition containing antibodies. US 5237054,1993.

139. Stabilization of antibodies. US 4902500, 1990.

140. Monoclonal antibody stabilization. US 4650772, 1987.

141. Process for modifying the stability of antibodies. US 6262238, 2001.

142. Самуилов В.Д. Иммуноферментный анализ // Соросовский образовательный журнал. 1999. № 12. С. 9-15.

143. Rezus Y.L.A., Bakker H.J. Effect of urea on the structural adynamics of water // PNAS. 2006. V. 103 . No. 49. P. 18417-18420.

144. Wetlaufer D.B., Malik S.K., Stoller L., Coffin R.L. Nonpolar group participation in the derlaturation of proteins by urea and guanidinium salts. Model compound studies // Journal of the American Chemical Society. 1964. V. 86. P. 508-514.

145. Иммунологические методы / Под ред. Г. Фримеля. Пер. с англ. Тарасов А.П. М.: Медицина, 1987. 472 с.

146. Кэбот Е., Мейер М. Экспериментальная иммунохимия. М.: Мир, 1968.-684 с.

147. Бриттон Г. Биохимия природных пигментов: Пер. с англ. М.: Мир, 1986.-422 с.

148. Брудастов Ю.А. Определение антикомплементарной активности бактерий по кинетике иммунного гемолиза // Вестник ОГУ. 2005. № 12. С. 51-54.

149. Лакин Г.Ф. Биометрия: учеб. пособие для биол. спец. ВУЗов. М.: Высшая школа, 1990. — 352 с.I

150. Linko A.M., Adlercreutz Н. Whole-grain rye and wheat alkylresorcinols are incorporated into human erythrocyte membranes // British Journal of Nutrition. 2005. V. 93. № 1. P. 10-13.

151. Vagel A., Roo E. Alkylresorcinols — rare chemicals available in bulk // Innovations in Pharmaceutical Technology. 2004. P. 94-95.

152. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия: Учебник. М.: Медицина, 1998. 7041 с.

153. Stabilization of immunoglobulins at low pH. United States Patent 7220409, 2001.

154. Литвинов M. Малые молекулы организмов // Химия и жизнь 21 век. С. 23-26.

155. Zarnowski R., Kozubek A., Pietr S.J. Effect of rye5.n-alkylresorcinols on in vitro growth of phytopathogenic Fusarium andi

156. Rhizoctonia fungi // Bulletin of the Polish. Academy of Sciences. Biological Sciences. 1999. V. 47. No. 2-4. P. 231-235.

157. Gasiorowski K., Szyba K., Brokos В., Kozubek A. Antimutagenic activity of alkylresorcinols from cereal grains // Cancer Letter. 1996. V. 106. P. 109-115.

158. Hooi D.S.W., Bycroft B.W., Chhabra S.R., Williams P., Pritchard D.I. Differential immune modulatory activity of Pseudomonas aeruginosa quorum-sensing signal molecules // Infection and Immunity. 2004. V. 72. No. 11. P. 6463-6470.

Информация о работе

Романенко, Наталья Александровна
кандидата биологических наук
Саратов, 2011
ВАК 03.01.04

Диссертация

Влияние алкилоксибензолов на функциональные характеристики антител - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы