Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Комплексная переработка клубней топинамбура с получением фруктанов и пробиотического продукта для животных

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Комплексная переработка клубней топинамбура с получением фруктанов и пробиотического продукта для животных"

На правах рукописи

Кареткин Борис Алексеевич

Комплексная переработка клубней топинамбура с получением фруктанов и пробиотического продукта для животных

Специальность: 03.01.06 — Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

г 8 ноя т

Воронеж-2013

005541121

005541121

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Российский химико-технологический университет имени Д.И. Менделеева»

Научный руководитель: доктор технических наук, профессор

Панфилов Виктор Иванович

Официальные оппоненты: Бирюков Валентин Васильевич,

доктор технических наук, профессор заведующий кафедрой «Экологическая и промышленная биотехнология» ФГБОУ ВПО «Московский государственный машиностроительный университет» (МАМИ)

Гойкалова Ольга Юрьевна

кандидат биологических наук, доцент кафедры биохимии и биотехнологии ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет инженерных технологий»

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова»

Защита состоится «23» декабря 2013 года в _ ч мин на заседании

Диссертационного совета Д 212.035.06 при ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет инженерных технологий» по адресу: 394036, г.Воронеж, просп. Революции, 19.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет инженерных технологий».

Автореферат диссертации разослан « » ноября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Концепция «функционального питания» с каждым годом приобретает все большее распространение. В России рынок продуктов этой группы постоянно растет. Основным его сегментом являются кисломолочные продукты, введение в которые компонентов, относящихся к группе пребиотиков, усиливает положительный эффект на здоровье человека и коммерческую привлекательность продукции. Однако производство данных компонентов в нашей стране развито в недостаточной степени. Одной из задач, стоящих перед современной биотехнологией, является создание энергосберегающих малоотходных технологий комплексной переработки возобновляемого, в частности, растительного сырья с получением биологически-активных веществ, в том числе, относящихся к группе пребиотиков.

Среди ряда других веществ к группе пребиотиков относят фруктаны — инулин и фруктоолигосахариды (ФОС) [Gibson eí al., 1995], которые входят в состав таких растений как девясил, цикорий, топинамбур, чеснок, эхинацея и ряд других, в основном, относящихся к семейству Сложноцветных [Lingyun et al., 2007, Wack et al., 2006 и др.]. В нашей стране имеется богатый опыт по выращиванию топинамбура. Получены copra топинамбура с высокой урожайностью в нечерноземной полосе, например в условиях Верхневолжья сорт «Скороспелка» дает урожай до 35 т/га [Королева, 2009]. Урожай клубней в южной полосе России может составлять до 50 т/га [Голубев и др., 1995]. Клубни топинамбура при сборе урожая в конце сентября -начале октября содержат до 20 % инулина и ФОС.

Распоряжением правительства Российской Федерации от 31 июля 2013 г. № 1356-р одобрен проект Программы Союзного государства «Инновационное развитие производства картофеля и топинамбура», предусматривающей, в том числе, разработку инновационных технологий производства топинамбура, а также технологий и оборудования для получения продуктов питания, инулина, топливных добавок, кормов из него. Особый интерес может представлять технология комплексной переработки топинамбура с получением и инулина, и продукта для животноводства. При этом в качестве альтернативного способа выделения фруктанов может быть применена ультразвуковая экстракция, получившее в последнее время широкое распространение при выделении БАВ из растительного сырья [Акопян и др., 2005, Мартинсон, 2005].

Одной из проблем, возникающих при переработке растительного сырья, является отсутствие возможности полного извлечения БАВ за одну ступень экстракции. Уникальность топинамбура состоит в том, что образующийся после экстракции твердый отход (жом) содержит фруктаны, стимулирующие рост и повышающие стабильность пробиотических микроорганизмов, благодаря чему он может быть использованы в качестве основного компонента при производстве пробиотиков для животноводства. Известно, что пробиотики оказывают сильнейшее позитивное воздействие на здоровье и продуктивность сельскохозяйственных животных и птиц, особенно при введении в рацион с первых дней жизни [Пышманцева, 2012]. Поэтому продукт для животных, содержащий пробиотические микроорганизмы, будет иметь большую коммерческую привлекательность по сравнению с традиционными кормами.

Цель настоящей работы: разработать малоотходную технологию комплексной переработки топинамбура с получением фруктанов и пробиотического продукта для животных.

Для выполнения цели были сформулированы следующие задачи исследования:

— изучить кинетику экстракции фруктанов из клубней топинамбура путем непрямого ультразвукового воздействия и определить оптимальные значения гидромодуля, температуры и кислотности экстрагента;

— определить оптимальные условия удаления пигментных примесей из экстракта с помощью сорбентов (активированного угля различных марок и ионообменных смол), а также мембранных методов (ультрафильтрации);

— предложить оптимальную схему очистки экстракта и проанализировать состав получаемого продукта с помощью физико-химических методов анализа (ЯМР-спектросопии);

— подтвердить возможность глубинного гетерофазного культивирования молочнокислых бактерий (МКБ) на питательной среде, содержащей в качестве основного компонента твердый остаток после экстракции (жом топинамбура);

— провести скрининг штаммов лактобактерий, а также обосновать оптимальный для получения пробиотического продукта состав питательной среды, содержащей жом клубней топинамбура, и условия культивирования;

— исследовать воздействие жома в качестве компонента питательной среды на стабильность культуры МКБ при хранении и стрессовых воздействиях;

— рассмотреть влияние бактериальных ауторегуляторов - алкилоксибензолов (АОБ) на стабильность МКБ, полученных путем глубинного гетерофазного культивирования в присутствии жома клубней топинамбура;

— провести технико-экономическую оценку предлагаемой технологии. Научная новизна. Изучено влияние гидромодуля, температуры и рН

экстрагента на выход фруктанов при водной экстракции из клубней топинамбура с помощью непрямого ультразвукового воздействия, а также кинетика экстракции при всех значениях рассмотренных параметров.

Впервые изучены различные методы (ультрафильтрационные и сорбционные) очистки от пигментных примесей экстракта, полученного из клубней топинамбура с помощью ультразвуковой экстракции, и представлено научное обоснование оптимального способа их удаления. Структура фруктанов была подтверждена методом ЯМР-спектроскопии.

Впервые показано, что внесение в питательную среду для глубинного гетерофазного культивирования МКБ твердой фазы в виде жома, образующегося после первой ступени экстракции фруктанов из клубней топинамбура, повышает стабильность жизнеспособных клеток при длительном хранении (8 недель, 5 °С), а также их устойчивость к стрессовым воздействиям (прогрев 50°С, 15 мин; замораживание-оттаивание). Установлено, что при внесении АОБ, в особенности С12-АОБ, в суспензии МКБ, полученные на питательной среде, содержащей жом, устойчивость клеток к воздействию указанных факторов увеличивается.

Практическая значимость. Разработана комплексная малоотходная технология переработки клубней топинамбура в условиях лаборатории. Даны практические рекомендации по созданию опытно-промышленной установки, позволяющей получить фруктаны, а также пробиотический продукт для животных с высоким содержанием

живых клеток МКБ.

Установлено, что применение ультразвука для экстракции фруктанов из клубней топинамбура позволяет снизить температуру экстракции на 10-15 °С и сократить продолжительность процесса до 15 мин. Предложен способ, позволяющий полностью удалить пигментные примеси из полученного экстракта путем его фильтрации через полисульфонамидную мембрану с порогом удержания 20 кДа с последующей обработкой фильтрата активированным углем марки ОУ-А.

Подобраны оптимальные условия глубинного гетерофазного культивирования МКБ на питательной среде, содержащей жом клубней топинамбура. Получены лабораторные образцы пробиотического продукта для животных на основе культуры Lactobacillus plantarum, содержащие не менее 1,0*109 КОЕ/мл клеток МКБ.

На основании полученных результатов проведена технико-экономическая оценка предлагаемой технологии исходя из расчетной мощности производства 2 ООО тонн/год по перерабатываемому сырью.

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на IV, VI, и VII Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития». (Москва, 2007, 2011, 2013): XXII Международной конференциии молодых ученых по химии и химической технологии («МКХТ-2008», Москва); VI Международной молодежной научной конференции «Научный потенциал XXI века» (Ставрополь, 2012); Международной научно-практической конференции «Биотехнология: Реальность и перспективы в сельском хозяйстве» (Саратов, 2013); Международной научно-практической конференции «Наука в современном информационном обществе» (2013).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ, в том числе 2 публикации в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание объектов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 207 наименований, в том числе 90 иностранных авторов. Основной текст работы изложен на 200 страницах машинописного текста, включает 16 таблиц, 31 рисунок. Диссертация содержит 3 приложения.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В обзоре литературы изложены сведения о строении, физико-химических свойствах и известных источниках инулина и ФОС. Представлены характеристики топинамбура как сельскохозяйственной культуры, приведен химический состав клубней топинамбура и известные технологии его переработки с получением фруктанов. Изложены основные представления о пробиотиках и пребиотиках, рассмотрены механизмы их действия, а также влияние иммобилизации клеток на стабильность культур, входящих в состав препаратов-пробиотиков. Рассмотрено применение ультразвука в химической промышленности и биотехнологии, в частности для выделения БАВ из растительного сырья.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали клубни топинамбура, собранные в осенний период (конце сентября - начало октября) в 2006-2012 гг.

В качестве объектов использовали культуры МКБ: четыре штамма рода Lactobacillus'. L. plantarum, L. fermentum, L. acidophilus и L. sp., и два штамма рода

Lactococcus: L. lactis и L. ¡actis subsp. cremoris, полученные из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов.

Содержание сырого протеина определяли по Кьельдалю, сырого жира - по Сокслету, сырой клетчатки - по Геннесбергу-Штоману, золы - минерализацией при 500-550 °С. Для определения фруктанов рассчитывали концентрацию олиго- и полисахаридов в среде по разнице концентраций редуцирующих веществ, измеренных по методу Бертрана, и полисахаридов по Бертрану-Шорлю, а при изучении кинетики экстракции определяли концентрацию углеводов в экстракте по Дюбуа [Шакир и ф.,2008]. Цветность экстракта измеряли в кювете 10 мм при длине волны 395 нм (максимум поглощения).

Для проведения экстракции клубни предварительно мыли, измельчали на терке до частиц размером 3-5 мм («стружка»), что соответствует измельчению на роторных свеклорезках, либо до частиц размером 0,5-1,0 мм («кашка»), что соответствует измельчению на промышленных картофелетерках. Экстракцию проводили водой при непрямом ультразвуковом воздействии (частота источника 22-25 кГц, удельная вводимая мощность 45 Вт/дм3) в ультразвуковой ванне. Для изменения pH экстрагента использовали растворы серной кислоты (ч.д.а., по ГОСТ 4204-77) и гидроокиси натрия (ч.д.а., по ГОСТ 4328-77). После экстракции жом отделяли фильтрацией через бельтинг (по ГОСТ 332-91).

В работе использовали катиониты марок С-100, С106, С-145 и С-160 (Purolite SA, США) в Н-форме, а также древесный активированный уголь марки ОУ-А (по ГОСТ 4453-74), косточковый активированный уголь КАУ-А (ЗАО «Экспериментальный химический завод», Россия) и активированный уголь АГ-3 (по ГОСТ 20464-75), изготавливаемый из каменного угля. Ультрафильтрацию проводили в лабораторных ячейках с использованием полупроницаемых мембран марок УПМ-10, УПМ-20 и УАМ-50 (ЗАО НТЦ «Владипор») при давлении не более 0,2 МПа.

Данные 13С-ЯМР получены на спектрометре "BRUKER СХР- 200" (50,3 MHz) в растворе Н20 с добавкой Dö-ДМСО в качестве внутреннего стандарта при температуре 298 К. В качестве стандартного образца использовали высокомолекулярный инулин (Merck, США).

Инокулят МКБ выращивали в питательной среде MRS и вносили на стационарной фазе роста в количестве, дающем начальную оптическую плотность клеточной суспензии 0.2 (X = 650 нм, { = 10 мм, Specord, Германия). При разработке питательной среды для глубинного гетерофазного культивирования МКБ состав варьировали следующим образом: молочная сыворотка (MC) - 5-50 %; дрожжевой экстракт (ДЭ) - 3-5 г/л; Na2HP04-12H20 - 2 г/л; pH 7,0-7,5. В питательную среду вносили жом клубней топинамбура (10% масс.) различной степени измельчения. Культивирование проводили при температуре 28 и 37° С в пробирках на 25 мл (10 мл среды) и колбах-качалках на 250 мл (100 мл среды), а также в лабораторном ферментере Minifors (Infors HT, Швейцария) на 5 л (3 л среды).

Жизнеспособность МКБ определяли по числу колониеобразующих единиц (КОЕ) при высеве клеточных суспензий из соответствующих разведений на агаризованные среды MRS. Численность адгезированных клеток определяли после их десорбции с жома как разницу между общим числом и числом планктонных клеток в культуре. Десорбцию клеток проводили методом трипсинизации, добавляя к гетерофазной культуре трипсин (200 ед./мл культуры, Merck) с последующей

инкубацией в течение 15 мин при температуре 37°С.

Термоустойчивость МКБ определяли по сохранению ими жизнеспособности (по численности КОЕ) после прогревания аликвот клеточных культур (0.7 мл) в ультратермостате «UV-Ю» при температуре 50°С в течение 15 мин. Устойчивость МКБ к замораживанию-оттаиванию определяли после 1 цикла замораживания (при -20°С) - оттаивания (при 20°С) клеточных суспензий с последующим определением числа КОЕ. Антагонистическую активность определяли методом отложенного антагонизма по [Постникова Е.А. и др., 2004]. В качестве тест-штаммов использовали Staphylococcus aureus и Escherichia coli.

Представленные в работе данные отражают усредненные величины с расчетом стандартных отклонений для вероятности Р>0.95. Обработку экспериментальных данных проводили с использованием пакета программ «MS Excel 2007» и «Statistica 8.0». РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Исследование кинетики н определение оптимальных значений параметров УЗ-экстракции фруктанов из клубней топинамбура На первом этапе работы исследовали экстракцию фруктанов из клубней топинамбура под действием ультразвука. При всех рассмотренных значениях гидромодуля, температуры экстракции и рН экстрагента наблюдали увеличение концентрации общих углеводов в экстракте в течение примерно 15 мин., после чего концентрация не изменялась. При гидромодулях меньше 12 наблюдали снижение выхода фруктанов, вероятно, вследствие того, что при больших концентрациях твердой фазы происходило интенсивное гашение УЗ-колебаний, в то время, как при больших гидромодулях - происходило разбавление экстракта, и в результате концентрация углеводов снижалась, что увеличивает затраты на процесс выделения.

При определении оптимальной температуры также рассмотрено влияние данного параметра на цветность экстракта. Максимальный выход фруктанов наблюдали в интервале температур от 60 до 70°С, однако и цветность экстракта в данных условиях была на 25-35% выше, чем при меньших температурах экстракции. В результате определяющим критерием считали выход фруктанов. Согласно полученным результатам наибольший выход фруктанов наблюдался в интервале рН экстрагента от 4,0 до 6,0, однако при рН 4,0 и ниже заметно увеличивалось общее содержание углеводов в среде, что, вероятно, связано с

Таблица 1

Влияние параметров ультразвуковой экстракции из клубней топинамбура на выход фруктанов_

Гидромодуль Температура экстракции, °С рН экстрагента Стационарная концентрация углеводов в экстракте, г/л ■ Выход фруктанов, отн. %

4 60 5,0 68,0 36,7

8 60 5,0 70,6 51,1

10 60 5,0 71,6 64,2

12 60 5,0 73,0 73,5

15 60 5,0 44,2 74,0

20 60 5,0 20,1 73,4

12 40 5,0 41,0 38,2

12 50 5,0 42,2 66,4

12 55 5,0 63,2 71,9

12 60 5,0 74,1 73,6

12 65 5,0 76,5 75,2

12 70 5,0 75,9 77,1

12 75 5,0 36,3 63,5

12 65 3,0 93,7 69,9

12 65 3,5 93,7 72,7

12 65 4,0 93,7 74,5

12 65 4,5 77,3 75,7

12 65 5,0 733 74,5

12 65 5,5 74,2 74,1

12 65 6,0 73,0 74,5

12 65 6,5 73,9 69,9

12 65 7,0 69,1 68,9

частичным гидролизом и переходом в экстракт других углеводов. Таким образом, оптимальным для экстракции является рН в интервале 5,0-6,0. Результаты опытов представлены в табл. 1.

Необходимо отметить, что степень измельчения клубней в рассмотренных вариантах не оказывала существенного влияния на выход фруктанов при оптимальных значениях гидромодуля, температуры и кислотности среды.

Изучение способов удаления из экстракта пигментных примесей

При водной экстракции из растительного сырья окраску продукту могут придавать вещества различной природы, например, фенольные соединения, продукты окисления белков и углеводов и др. При исследовании сорбционных методов оценивали не только сорбционную активность в отношении балластных веществ (определяли по снижению оптической плотности экстракта), но и потери целевого продукта. Активированные угли традиционно используются для удаления пигментных веществ, например, при производстве гидролизатов крахмала. Как видно из результатов, представленных на рис. 1, при применении углей марок КАУ-А и АГ-3 цветность экстракта снижалась не более чем на 36%, в то время как использование угля марки ОУ-А позволяло уменьшить цветность экстракта на 84,6% даже при расходе 1 г на 100 мл экстракта, при этом потери фруктанов составляли 12,5%.

Из исследованных катионитов только смола марки С-145 позволяла достигнуть результатов, сопоставимых с предыдущими: цветность снижалась на 84,6%, в то время как потери фруктанов составляли всего 12,9 %. Результаты представлены в табл. 2. Также обращает на себя внимание сильное падение рН в пробах после обработки катионитами. При низких рН возможен частичный гидролиз инулина с образованием низкомолекулярных продуктов, включая фруктозу, что может привести к потере пребиотических свойств продукта, поэтому их использование было

отвергнуто.

100 '

Таблица 2

Удаление пигментных примесей из экстракта клубней топинамбура с помощью катионообменных смол

навеска активированного угля на 100 ыт экстракта, г

Рисунок 1. Удаление пигментных веществ из экстракта клубней топинамбура с помощью активированных углей: 1 - ОУ-А, 2 — КАУ-А, 3 — АГ-3.

Марка катионита Потери фруктанов, % от исх. Степень осветления экстракта, % рН после обработки

С-100 20,8 68,2 3,2

С-106 21,8 83,6 5,6

С-145 12,9 84,6 3,5

С-160 30,0 85,1 3,4

Поскольку сорбционные методы не позволили полностью удалить из экстракта пигментные примеси, были также рассмотрены методы мембранного разделения. Предполагали, что использование мембран с порогом удержания 10 кДа и более

позволит получить фильтрат, содержащий фруктаны, молекулярная масса которых не превышает 5 кДа. Эффективность удаления пигментных примесей оценивали по селективности мембраны в их отношении. Для оценки потерь целевого продукта определяли селективность мембраны по полисахаридам и ее производительность, которая, фактически, определяет конечную степень концентрирования экстракта.

Мембрана УАМ-50 обладала меньшей селективностью по пигментным веществам, чем мембраны других марок, и низкой производительностью. Хотя сравнение мембран УПМ-10 и УПМ-20 показывает практически полную идентичность их действия по рассмотренным критериям, особенно при больших степенях концентрирования (см. табл. 3), нельзя исключать возможность, что мембрана марки УПМ-10 будет частично задерживать фракции фруктанов с высокой молекулярной массой, что требует изучения высокочувствительными методами. Поэтому рационально использование мембран марки УПМ-20.

Представляет интерес тот факт, что среди веществ, придающих окраску раствору после ультразвуковой экстракции, значительную часть составляют высокомолекулярные соединения, которые способны задерживаться на мембранах с порогом удержания не только 10 или 20, но и 50 кДа.

Таблица 3

Удаление пигментных веществ из экстракта клубней топинамбура с помощью

ультрафильтрации (1 - УПМ-10, 2 - УПМ-20, 3 - УАМ-50)

Степень концентрирования Интегральная селективность по пигментным веществам, % Интегральная селективность по фруктанам, % Удельная производительность по пермеату, л/(м2 ■ ч)

1 2 3 1 2 3 1 2 3

2 78,5 74,8 57,6 11,8 6,2 33,3 15,2 17,3 2,3

4 75,0 70,0 51,5 7Д 4,1 24,7 14,2 15,0 2,2

6 73,6 68,2 48,6 5,2 3,6 18,5 13,7 13,9 2,1

8 72,2 67,4 46,9 4,9 3,4 15,9 13,3 13,1 2,0

10 71,3 66,5 - 4,8 3,2 - 13,2 12,5 -

Анализ полученных фруктанов с помощью ЯМР-спектроскопии

Для анализа структуры фруктанов проводили удаление пигментных примесей ультрафильтрацией экстракта через мембрану УПМ-20 и последующую его обработку активированным углем марки ОУ-А. При анализе 13С-ЯМР спектров стандартного и опытного образцов учитывали, что у поли- и олигосахаридов химические сдвиги атомов углерода мономеров, находящихся «внутри» полимерной цепи, и атомов терминальных мономеров различаются [\Vack <?/ а/.,2006].

При сравнении спектров видно, что полученный экстракт характеризуется рядом сигналов, отсутствующих на спектре инулина. Эти сигналы соответствуют химическим сдвигам терминальных атомов углерода Б-фруктофуранозы и О-глюкопиранозы, причем сигналы последней отличаются меньшей интенсивностью, что говорит о меньшем содержании в образце данного вещества по сравнению с фруктозой. Наличие упомянутых сигналов в спектре опытного образца, предположительно, являются следствием частичной деполимеризации фруктанов. Таким образом, в полученном образце содержатся в основном ФОС.

Необходимо отметить, что преобладание в опытном образце ФОС может быть следствием не только воздействия ультразвука, но и изначального состава клубней, поскольку степень полимеризации фруктанов зависит от условий выращивания топинамбура. Также необходимо учесть, что стандартный образец представляет собой фракцию фруктанов высокой степени очистки, в то время как в пищевой промышленности в качестве пребиотиков - компонентов функционального питания успешно используют как высокомолекулярный инулин, так и олигофруктаны со средней степенью полимеризации от 5 до 9, не подвергнутые фракционированию.

Выбор штаммов МКБ. обоснование оптимального состава среды и условий культивирования

На следующем этапе работы исследовали возможность переработки жома, образующегося на первой ступени экстракции. Предварительные исследования показали, что после гидролиза жома в УЗ-поле (pH 2,0; 90°С) максимальная концентрация общих Сахаров достигает 6,1 г/л. Очевидно, что содержание углеводов в данном случае не достаточно для эффективного использования жома в качестве субстрата для производства кормового белка. Проведение же гидролиза в более жестких условиях с целью полного разрушения клетчатки не •экологично [Панфилов, 2004]. С другой стороны, после первой экстракции жом содержит 43,6% фруктанов от СВ (с учетом того, что около 65% всех СВ из клубней переходят в экстракт, получаемый на первой ступени). Из литературы известно, что фруктаны, особенно ФОС, стимулируют рост МКБ [Makros et al.,2005]; продемонстрированы стрессопротекторные свойства фруктанов, в частности, по отношению к желчным кислотам [Takemura et al., 2010]; при иммобилизации клеток МКБ на твердом носителе повышается их стабильность [Григорьев и др., 1994]. Поэтому введение в питательную среду для культивирования МКБ образующегося жома с целью получения пробиотического продукта для животноводства представляется перспективным способом его утилизации.

При определении оптимальных условий роста, состава среды и выборе штаммов МКБ для получения пробиотического продукта руководствовались следующими критериями: высокий титр МКБ к концу стационарной фазы роста и сохранение высокой численности бактерий при длительном хранении продукта. В качестве дополнительного источника углерода, азота и микроэлементов использовали молочную сыворотку (MC), а также дрожжевой экстракт (ДЭ). Жизнеспособность МКБ определяли в культурах стационарной фазы роста (48 ч). Для определения численности жизнеспособных клеток МКБ, выращенных на среде с жомом, проводили предварительную десорбцию бактерий методом трипсинизации.

Рисунок 3. |3С-ЯМР спектры стандартного образца инулина (вверху) и фруктанов, полученных из клубней топинамбура УЗ-экстракцией (внизу).

Как видно из результатов {табл. 4), снижение температуры культивирования с 37СС до 28°С приводило к снижению количестве живых клеток на 3-8% (сравнить строки № 5 и 6; 12 и 13; 14 и 15, 18 и 19). Культура L. acidophilus (строки № 12 и 13) по сравнению с другими лактобациллами характеризовалась низкой активностью роста и плотностью популяции при культивировании на среде, содержащей 10 об.% МС, а рассмотренные культуры лактококков (строки № 20—23) — даже при концентрации МС 25 об.%. Предварительными исследованиями установлено, что после хранения в течение двух месяцев при 5°С количество жизнеспособных клеток L. fermentum (образец — строка № 16) снижалось до 4,6x105 КОЕ/мл, что составляет 0,023% от первоначального. На основании полученных результатов для дальнейшей работы использовали культуры L. plantarum и L. sp.

При оценке влияния состава среды на рост L. plantarum установлено, что оптимальная концентрация МС составляла не менее 25об.% (сравнить № 1 и 3; 7 и 10; 2 и 4; 6, 8 и 11; 15 и 16). Увеличение концентрации ДА в среде с 3 до 5 г/л существенным образом не отражалось на титре МКБ. Изменение начального рН с 7,0 до 7,5 приводило к незначительному увеличению количества жизнеспособных МКБ (сравнить строки № 8 и 9).

Таблица 4

Влияние условий культивирования и состава питательной среды на титр клеток МКБ

МКБ № строки Условия культивирования Титр клеток МКБ через 48 ч культив., КОЕ/мл

MC, об.% рн среды Температур а,°С жом (10%)

L. plantarum 1 5 7,0 37 нет 6,8x10'

2 5 7,0 37 «стружка» 5,2x10'

3 10 7,0 37 нет 7,3x10s

4 10 7,0 37 «стружка» 5,7x10s

5 10 7,0 37 «кашка» 7,8x10s

6 10 7,0 28 «кашка» 7,2x10s

7 25 7,0 28 нет 1,0x10*

8 25 7,0 28 «кашка» 1,3x10"

9 25 7,5 28 «кашка» 1,7x10"

10 50 7,0 28 нет 1,2x10"

11 50 7,0 28 «кашка» 1,5x10"

L. acidophilus 12 10 7,0 28 «кашка» 2,8x10s

13 10 7,0 37 «кашка» 3,0x105

L. fermentum 14 10 7,0 37 «кашка» 9,7x10s

15 10 7,0 28 «кашка» 9,4x10s

16 25 7,0 28 «кашка» 2,0x10*

L.sp. 17 25 7,0 28 нет 2,3x10"

18 25 7,0 28 «кашка» 4,0x10"

19 25 7,0 37 «кашка» 4,3x10"

L. lactis 20 25 7,0 28 нет 9,7x10'

21 25 7,0 28 «кашка» 1,5x10s

L. cremoris 22 25 7,0 28 нет 1,2x10'

23 25 7,0 28 «кашка» 2,7x10'

6)

Внесение в питательную среду жома топинамбура в виде «кашки» приводило к увеличению титра по сравнению с контрольными вариантами без внесения жома (сравнить строки № 3 и 5; 7 и 8; 10 и 11; 17 и 18), в то время как в питательной среде с жомом в виде стружки титр клеток не был выше, чем в контроле (сравнить строки № 1 и 2; 3 и 4). Это является следствием адгезии клеток МКБ и их роста на поверхности измельченного жома, а также переходом из жома в питательную среду фруктанов и других БАВ. При этом жом с меньшей степенью измельчения («стружка») характеризуется меньшей площадью поверхности, а значит процессы, связанные с фазовыми переходами, проходили менее интенсивно.

Необходимо отметить, что в образцах с жомом в виде кашки после обработки трипсином количество клеток увеличивалось на 30-50%, тогда как в образцах с жомом в виде стружки только на 10-20 %. Таким образом, факт адгезии клеток МКБ на жоме топинамбура подтверждался увеличением их численности после проведения процедуры трипсинизации вследствие гидролиза протеинов молекул адгезинов, связывающих бактерии с частицами твердой фазы. Следует подчеркнуть, что используемая в данной работе процедура трипсинизации является наиболее близким аналогом «естественной» десорбции МКБ, происходящей в ЖКТ. Исследование стабильности МКБ при хранении Эффективность использования про-биотических препаратов предполагает сохранение в них титра МКБ на достаточно высоком уровне в течение нескольких месяцев. Поэтому в следующей серии экспериментов с заданной периодичностью определяли количество жизнеспособных клеток в культуральной жидкости лакто-бацилл Ь. р1аШагит и Ь,. ¡р. , выращенных в присутствии жома и без него (контроль), в ходе хранения в течение 8 недель при 5°С (рис. 4). Установлено, что во всех исследуемых вариантах число клеток в опытных образцах, полученных при глубинном гетерофазном культивировании, было на 1-2 порядка выше, чем в контрольных, где заметная гибель клеток начиналась уже через одну-две недели хранения. Необходимо отметить, что задержка гибели клеток, наблюдаемая для образ-

0 2 4 6 8 недели

Рисунок 4. Динамика численности жизнеспособных МКБ I. р!ап1агит (а, б) и I. ¿р. (в) в ходе хранения культур при 5°С. Содержание молочной сыворотки - 25% (а, в); 50% (б). Среда с жомом - кривые 2 и 3. начальный рН 7,5 — кривая 3.

цов, содержащих жом, также наблюдалась при хранении лиофилизированной биомассы бифидобактерий, сорбированных на угле.

Было показано, что выращивание МКБ на богатой среде, содержащей 50 об.% МС, а также на среде с начальным рН 7,5, снижало стабильность культуры. Также оказалось, что, несмотря на более высокий урожай клеток в культуре L. sp., их стабильность ниже, чем у L. plantarum — через 8 недель хранения при 5°С разница в титре жизнеспособных клеток составила 1 порядок. Поэтому дальнейшие исследования проводили со штаммом L. plantarum. Также из результатов видно, что предпочтительным является начальный рН среды 7,0.

Исследование стабильности МКБ при воздействии температур

Гибель клеток в результате теплового воздействия (в процессе концентрирования культуры или при конвективной сушке) или замораживания (при лиофилизации) является одной из основных проблем при производстве пробиотических продуктов. Согласно литературным данным иммобилизация бактерий на твердых носителях защищает клетки при стрессовых воздействиях [Lee et al.,2004; Aslim et al.,2009 и др.]. В наших экспериментах тепловому воздействию, а также процедуре замораживания-оттаивания подвергали культуральные жидкости МКБ, выращенных на питательной среде с жомом и без него (контроль), в ходе хранения. Во всех опытных вариантах количество жизнеспособных бактерий L. plantarum после прогрева было выше, чем в контрольных культурах в 1,3-30 раз, а при замораживании-оттаивании в 1,2-4,5 раз {табл. 5).

Таблица 5

Термоустойчивость бактерий L. р1аШагит в ходе хранения при 5°С _(рН питательной среды - 7,0)._

Варианты Число жизнеспособных клеток, КОЕ/мл (% от КОЕ до воздействия)

Продолжительность хранения Вариант среды До воздействия Прогрев, 50°С, 15 мин Замораживание-оттаивание

МС,% жом

48 час. (стационарная фаза) 25 - 1.0х10у(100) 2.0x10" (0,2) 7.4xl0s(74,2)

25 + ЬЗхЮ'аОО) 5.6x10' (4,3) 1.1x10" (87.9)

50 - 1.2хЮу(100) 1.6x10" (0,13) 8.5xl0s(70.5)

50 + 1.5*10^(100) 1.4x10'(0,9) 1.3хЮу(84.3)

2 нед. 25 - 1.0xl0s (100) 8.0x10" (0.08) 7.3хЮ7 (73.0)

25 + 1.1х109(100) 2.6х107 (2.4) 9.7xl08 (88.2)

50 4.0x10' (100) 5.8х104 (0.14) 2.7x107 (67.5)

50 + 9.8х108 (100) 9.7х 10б (1.0) 8.0x108 (81.6)

4 нед. 25 - 2.5x10'(100) 6.0x10J (0.02) 2.4x10''(9.6)

25 + 6.0х108 (100) 4.4x105 (0.07) 8.8xl07 (14.7)

50 - 6.8х 106 (100) 5.5x103 (0.08) l.OxlO6 (14.7)

50 + 9.5*Ю7 (100) 9.6x104 (0.1) 1.8xl07 (18.9)

8 нед. 25 - 8.0х103 (100) 2.4x10' (0.3) 6.6xl04 (8.3)

25 + 5.0x10" (100) 2.5x10" (0.5) 2.0x10" (40.0)

50 - 1.3хЮ5 (100) 7.8хЮ2(0.6) 7.9x10J (6.1)

50 + 1.1x10" (100) 1.9x10" (1.7) 8.6x10" (7.8)

Также обращает на себя внимание, что предлагаемый состав среды обладает более ярко выраженным крио- нежели термопротекторным эффектом, следовательно лиофилизация культуры является предпочтительным, хотя и более дорогостоящим методом высушивания, нежели конвективная (распылительная) сушка. Данный вопрос требует отдельных исследований.

Изучение влияния АОБ на стабильность МКБ

Ранее было показано, что микробные ауторегуляторы из группы АОБ принимают участие в механизмах адаптации микроорганизмов к стрессовым воздействиям различной природы [Эль-Регистан и др.,2006]. Поэтому в следующей серии экспериментов исследовали влияние двух гомологов АОБ - гидрофильного С7-АОБ и гидрофобного С12-АОБ - на рост МКБ, стабильность их популяции при хранении и воздействиях низких и высоких температур.

Гомолог С7-АОБ вносили в концентрации 10"5 М в питательную среду перед инокуляцией и на стационарной фазе роста культуры (48 часов), а С12-АОБ - в концентрации 10" М только на стационарной фазе. В контрольном варианте АОБ не вносили. Культивирование проводили на питательной среде с жомом и подобранным ранее содержанием остальных компонентов, при температуре 28°С. Суспензии МКБ хранили при температуре 5°С в течение первой недели, и далее одну часть - при 20°С, а вторую - при 5°С до общей продолжительности 4 недели, оценивая их жизнеспособность по числу КОЕ (табл. б). После недельного хранения при 20°С в опытных образцах титр жизнеспособных клеток был в 1,2-1,5 раз выше, чем в контрольном.

Еще через три недели хранения клеточных суспензий при той же температуре титр МКБ в образце с С12-АОБ был в 5,5 раза выше, чем в контрольном, хотя во всех вариантах данная величина снижалась более чем на 3 порядка. В случае дальнейшего хранения суспензии при 5°С количество жизнеспособных клеток в варианте опыта с внесением С12-АОБ было в 1,7 раза больше, чем в контроле, снижаясь всего на 33,1% от первоначального. Использование С7-АОБ не позволило получить столь выразительных результатов, что можно объяснить способностью С12-АОБ обусловливать переход вегетативных клеток в гипометаболическое состояние, характеризующееся повышением устойчивости клеток к стрессовым воздействиям, в том числе за счет активации стрессовых генов, в то время как С7-АОБ обладает иным типом действия на клетки, являясь прямым адаптогеном и антиоксидантом [Эль-Регистан и др.,2006]. Вероятно, поэтому эффект от применения этого гомолога был менее выражен на длительных сроках хранения и в большей степени проявлялся при хранении МКБ в течение первой недели.

Таблица 6

Влияние АОБ на титр бактерий ¿. р1аптгит в ходе хранения при температуре 20 и 5°С.

Способ внесения АОБ Число жизнеспособных клеток КОЕ/мл (% от КОЕ в стационарной культуре)

Условия хранения

48 часов (стац. культура) 1 неделя при 20°С 4 недели при 20°С 1 неделя при 20°С + 3 недели при 5°С

Контроль 1,3х10"(100) 7,7ХЮ8(59,5) 1,7хЮ5(0,013) б.ОхЮ^бЛ)

С7-АОБ (10"5 М до инокулирования) 1,3 хЮ^ 100) 1,0x10^(77,5) 8,3х104(0,06) 5.0х108(38,5)

С7-АОБ (10°М в стац. культуру) 1,3х109(100) 9,0х10к(53,3) 2,2*103(0,017) 8.5хЮ8(65,4)

С12-АОБ (Ю^М в стац. культуру) 1,3 хЮ^ 100) 1,2Х109(89,7) 8,5хЮ5(0,07) 1.Ох 10^(76,9)

Применение алкилокеибензолов позволило также дополнительно повысить термоустойчивость лактобацилл {табл. 7). Наиболее устойчивыми как к воздействию высокой температуры (в 1,8 раз), так и к замораживанию-оттаиванию (в 2 раза) оказались клетки, хранившиеся в присутствии С12-АОБ. Повышение стрессоустойчивости МКБ при применении АОБ представляет практический интерес, особенно если учесть, что один из гомологов АОБ - 4-гексилрезорцин (Е586) - разрешен к применению в составе пищевых продуктов.

Таблица 7

Устойчивость к температурным воздействию бактерий Ь. р1аШагит, полученных при длительном

хранении в присутствии АОБ

Варианты опыта Число жизнеспособных клеток, КОЕ/мл (% от КОЕ до воздействия)

Условия хранения Способ внесения АОБ До воздействия Прогрев, 50°С, 15 мин Замораживание-оттаивание

1 нед. при 20°С Контроль 7.7x108 (100) 5.1хЮ'(6.6) 3.6ХЮ8(46.8)

С7-АОБ (10"5М до инокулирования) 1.0х10"(100) 6.4x10'(6.4) 6.1хЮ8(61.0)

С7-АОБ (10"5М в стац. культуру) 0.9х10"(100) 6.1x10' (6.8) 4.4x108(48.9)

С12-АОБ (Ю^М в стац. культуру) 1 2х 10^(100) 8 6x10'(7.2) 7.4х108 (61.7)

1 неделя при 20°С + 3 недели при 5°С Контроль 6.0х108(100) 4.4x10'(0.073) 8.8x10'(14.7)

С7-АОБ (10"3 М до инокулирования) 5.0х108(100) 5.3Х105(0.11) 9.8хЮ'(19.6)

С7-АОБ (ЮР'М в стац. культуру) 8.5х108(100) 6.8х103(0.080) 2.0х108(23.5)

С12-АОБ (Ю^М в стац. культуру) ЬОхЮ^ЮО) 1.3х106(0.13) 2.9X1 08(29.0)

Получение ппобиотического продукта в лабораторном ферментере

Для апробации предложенных приемов при производстве пробиотиче-ского продукта было проведено культивирование Ь. р1аШагит в лабораторном ферментере. Значение рН в ходе культивирования поддерживали в интервале 6,3— 6,7. Через 12 часов культура достигала стационарной фазы роста с титром жизнеспособных клеток 8,1x109 КОЕ/мл. Максимальная удельная скорость роста составляла 0,48 ч"1. Концентрация углеводов в среде снижалась с 10.7+0.6 до 2.1±0.2 г/л. Полученную культуральную жидкость МКБ хранили при 5°С в течение 6 месяцев. Характеристики полученной суспензии представлены в табл. 8.

На основе проведенных исследований разработана принципиальная технологическая схема получения фруктанов и пробиотического продукта для животных из клубней топинамбура (рис. 5), а также рассчитаны технико-экономические показатели процесса (табл. 9).

Таблица 8

Характеристики суспензии /.. р1аШагит, полученной в ферментере

Показатель Значение

Титр МКБ, КОЕ/мл

- после культивирования 8,1хЮы

- после 2 месяцев хранения 7,2x10s

- после 6 месяцев хранения 4,2x10'

Биохимические показатели

Титруемая кислотность, °Т 63

Активная кислотность (рН) 6,3

Сухие вещества, % 2,3

«Сырой» жир, % от СВ 7,9

«Сырой» протеин, % от СВ 24,5

«Сырая» клетчатка, % от СВ 0,8

«Сырая» зола, % от СВ 11,7

Антагонистическая активность (величина зоны угнетения роста тест-штаммов), мм

Staphylococcus aureus 30

Escherichia coli 32

На фасовку и упаковку

На фасовку и упаковку

Рисунок 5. Технологическая схема процесса комплексной переработки клубней топинамбура с получением фруктанов и пробиотического продукта для животных

Таблица 9

Технико-экономические показатели технологии комплексной переработки топинамбура

№ п/п Наименование показателя Единица измерения Значение показателей

1. Годовой выпуск продукции в натуральном выражении - фруктаны - пробиотический продукт для животных т м3 200 18 200

Годовой выпуск продукции в натуральном выражении - фруктаны - пробиотический продукт для животных тыс. руб. тыс. руб. 40 000 455 000

2. Капитальные затраты тыс. руб. 182 606,99

3. Полная себестоимость годового выпуска тыс. руб. 257 526,76

4. Себестоимость единицы продукции - фруктаны - пробиотический продукт для животных тыс. руб./т тыс. руб./м' 104,07 13,01

5. Стоимость годового выпуска продукции тыс. руб./т 495 000,00

6. Прибыль годовая тыс. руб. 237 473,24

7. Рентабельность а) производственных фондов б) продукции % % 118,7 92,2

8. Срок окупаемости капитальных вложений год 0,76

выводы

1. Установлено, что оптимальными условиями для выделения фруктанов из клубней топинамбура с помощью непрямого ультразвукового воздействия являются: гидромодуль 12, температура 65 "С, кислотность среды 5,0-6,0, продолжительность процесса 15 мин. Полученный при этом экстракт обладает высокой цветностью -до 1,8 ед. ОП.

2. Доказано, что для полного удаления пигментных примесей из получаемого экстракта целесообразно применение ультрафильтрации с использованием мембраны марки УПМ-20, которая характеризуется наибольшей интегральной селективностью по пигментным примесям и производительностью, с последующей обработкой древесным активированным углем марки ОУ-А в соотношении 10 г на 1 л экстракта.

3. Анализ структуры полученного продукта методом ЯМР-спектроскопии показал, что она соответствует фруктанам со средней степенью полимеризации, характерной для ФОС. Полученный описанным способом продукт может быть непосредственно использован в качестве источника фруктанов или подвергнут дальнейшему фракционированию с целью выделения фракций инулина и ФОС.

4. Показана принципиальная возможность культивирования МКБ на среде, содержащей жом клубней топинамбура (10 % масс.), а также молочную сыворотку (25 % об.) и дрожжевой экстракт (3 г/л), при этом высокие титры не менее 1х109 КОЕ/мл демонстрировали культуры 1. ркт1агит и Ь.зр.

5. Подтверждено, что внесение жома клубней топинамбура в питательную среду для культивирования МКБ позволяет повысить стабильность Ь. р1аШагит при хранении (8 недель, 5 °С) на 1-2 порядка, в случае термического воздействия (прогрев 50°С, 15 мин)- до 30 раз, в случае замораживания-оттаивания - до 4,5 раз.

6. Показано, что внесение С12-АОБ в концентрации 10"6 М на 48 ч культивирования (стационарная фаза) позволяет повысить титр жизнеспособных клеток в 1,5 раза после недельного хранения при комнатной температуре, и в 1,7 раз при дальнейшем хранении при 5°С до четырех недель, а также в 1,8 раз в случае воздействия повышенной температуры и в 2 раза в случае замораживания-оттаивания.

7. Оценка технико-экономических показателей предлагаемой технологии при мощности производства по перерабатываемому сырью 2 ООО тонн/год показала, что себестоимость получаемых фруктанов составляет 104,07 тыс. руб./т, а пробиотического продукта для животных 13,01 тыс. руб./м3.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

Статьи, опубликованные в журналах из перечня ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, определяемого ВАК Минобрнауки РФ:

1. Кареткин Б.А./Глубинное гетерофазное культивирование молочнокислых бактерий/ Кареткин Б. А., Лойко Н. Г., Шакир И. В., Панфилов В. И.//Биотехнология. 2013. -№1. - С. 59-68 (1,25 п.л., доля автора- 0,4 пл.).

2. Кареткин Б.А./Пробиотические продукты. Новые приемы повышения качества/ Лойко Н.Г., Кареткин Б.А., Симон H.A., Шаненко Е.Ф., Пичугина Т.Ф., Гриневич

A.И., Ганина В.И.// Молочная промышленность. 2013. — № 10. — С. 57-58 (0,13 п.л., доля автора — 0,02 п.л.).

Научные статьи:

3. Кареткин Б.А. Интенсификация процесса получения инулина из клубней топинамбура с использованием ультразвука/ Кареткин Б.А., Шакир И.В., Панфилов

B.И. // Материалы Четвертого Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». М.:ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2007 — часть 2, с. 62 (0,06 п.л., доля автора - 0,03).

4. Кареткин Б.А. Создание малоотходной энергосберегающей технологии получения инулина из топинамбура с использованием ультразвука/ Пасынкова М.А., Кареткин Б.А. // Международная конференция молодых ученых по химии и химической технологии, «МКХТ-2008» Успехи в химии и химической технологии. М.: РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2008 - Т.22, №13 (93), с. 71-73 (0,19 п.л., доля автора 0,15).

5. Кареткин Б.А. Получение кормовой пробиотической добавки путем гетерофазного культивирования лактобактерий/ Кареткин Б.А., Шакир И.В., Лойко Н.Г., Эль-Регистан Г.И., Панфилов В.И.// Материалы Шестого Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». М.:ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2011 — часть 1, с. 323-324 (0,06 п.л., доля автора 0,02).

6. Кареткин Б.А. Комплексная переработка клубней топинамбура с получением фруктанов и кормовой пробиотической добавки/ Кареткин Б.А., Шакир И.В., Панфилов В.И.// Научный потенциал XXI века: Материалы VI Международной молодежной научной конференции. Ставрополь: «СевКавГТУ» 2012 —Т. 1, с.321-323 (0,13 п.л., доля автора 0,08).

7. Кареткин Б.А. Переработка клубней топинамбура с получением фруктанов и пробиотического продукта для животных Кареткин Б.А., Шакир И.В., Лойко Н.Г., Панфилов В.И., Эль-Регистан Г.И.// Биотехнология: Реальность и перспективы в сельском хозяйстве: Материалы Международной научно-практической конференции. Саратов: Издательство «КУБиК» 2013 - с.321-323 (0,13 п.л., доля автора 0,05).

8. Кареткин Б.А./ 13С-ЯМР исследование фруктанов, полученных путем ультразвуковой экстракции из клубней топинамбура/ Кареткин Б.А., Шакир И.В., Прудсков Б.М., Малков A.B., Панфилов В. И.// Материалы Международной научно-практической конференции Наука в современном информационном обществе. США: CreateSpace, 2013 - с. 186-188 (0,19 п.л., доля автора 0,09).

9. Кареткин Б.Л./ Повышение эффективности переработки растительного сырья/ Смирнова В.Д. Червякова О.П., Шубукина Е.В., Кареткин Б.А., Шакир И.В., Панфилов В. И.//Материалы Седьмого Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». М.:ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2013 - часть 1, с. 295-296 (0,06 п.л., доля автора 0,01).

Заказ 130

Объем 1.0 пл.

Тираж 100 экз.

Издательский центр РХТУ им. Д.И. Менделеева

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата технических наук, Кареткин, Борис Алексеевич, Воронеж

Российский химико-технологический университет им. Д. И. Менделеева

На правах рукописи

0420145 5503

Кареткин Борис Алексеевич

Комплексная переработка клубней топинамбура с получением фруктанов и пробиотического продукта для животных

Специальность: 03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук

Научный руководитель:

доктор технических наук, профессор

Виктор Иванович Панфилов

Воронеж - 2013

СОДЕРЖАНИЕ

Введение.......................................................................................................................5

Глава 1. Обзор литературы.........................................................................................9

1.1. Характеристика инулина, фруктоолигосахаридов и их источников...............9

1.1.1. Строение и физико-химические свойства фруктанов....................................9

1.1.2 .Современные методы анализа инулина и ФОС............................................11

1Л .3. Источники инулина и ФОС и способы их выделения.................................19

1.1.4. Применение инулина и ФОС..........................................................................34

1.2. Характеристика, состав и применение топинамбура......................................44

1.2.1. Характеристика топинамбура.........................................................................44

1.2.2. Химический состав топинамбура..................................................................46

1.2.3. Возделывание и хранение топинамбура.......................................................49

1.2.4. Использование топинамбура в питании........................................................56

1.2.5. Использование топинамбура в кормовых целях..........................................61

1.2.6. Использование топинамбура в биотехнологии............................................62

1.3. Концепция пробиотиков и пребиотиков..........................................................66

1.3.1. Характеристика и значение пробиотиков.....................................................66

1.3.2. Применение пробиотиков в животноводстве...............................................79

1.3.3. Характеристика и значение пребиотиков.....................................................90

1.3.4. Повышение стабильности микроорганизмов в пробиотических продуктах..................................................................................................................101

1.4. Применение ультразвука для выделения биологически активных веществ из растительного сырья................................................................................................106

Экспериментальная часть.......................................................................................115

Глава 2. Материалы и методы исследования........................................................115

2.1. Объекты исследования.....................................................................................115

2.2. Биохимические и физико-химические методы анализа...............................115

2.3.Микробиологические методы..........................................................................124

2.4.Проведение ультразвуковой экстракции.........................................................128

2.5. Проведение обработки сорбентами................................................................128

2.6. Проведение ультрафильтрации.......................................................................129

Результаты и обсуждение.......................................................................................131

Глава 3. Исследование кинетики и определение оптимальных значений параметров ультразвуковой экстракции фруктанов из клубней топинамбура. 131

3.1. Выбор оптимального гидромодуля.................................................................132

3.2. Выбор оптимальной температуры экстракции..............................................135

3.3. Подбор оптимального рН экстрагента..........................................................138

3.4.Влияние степени измельчения на эффективность ультразвуковой экстракции................................................................................................................140

Глава 4. Очистка экстракта от пигментных примесей и анализ полученных фруктанов с помощью ЯМР-спектроскопии........................................................143

4.1. Сорбционные методы очистки экстракта......................................................143

4.1.1. Применение активированных углей для удаления пигментных примесей...................................................................................................................143

4.1.2. Применение ионообменных смол для удаления пигментных примесей. 145

4.2. Мембранные методы очистки экстракта........................................................146

4.3. Анализ полученных фруктанов с помощью ЯМР-спектроскопии..............148

Глава 5. Культивирование молочнокислых бактерий на жоме клубней топинамбура и исследование свойств получаемого продукта............................152

5.1. Анализ химического состава жома.................................................................152

5.2. Исследование роста молочнокислых бактерий в глубинной культуре в присутствии жома топинамбура............................................................................154

5.2.1. Подбор штамма молочнокислых бактерий с высокой продуктивностью.....................................................................................................155

5.2.2.Обоснование степени измельчения жома....................................................157

5.2.3.Определение оптимального содержания источника азота.........................159

5.3.Исследование стабильности МКБ при хранении...........................................161

5.4. Исследование стабильности МКБ при воздействии различных температур................................................................................................................164

5.5. Лиофильное высушивание биосуспензии МКБ и исследование стабильности сухой биомассы................................................................................165

5.5. Изучение влияния алкилоксибензолов на стабильность молочнокислых бактерий....................................................................................................................167

5.5.1. Влияние алкилоксибензолов на стабильность молочнокислых бактерий при хранении...........................................................................................167

5.5.2. Влияние алкилоксибензолов на устойчивость молочнокислых бактерий к воздействию различных температур..................................................169

5.6.Получение пробиотического продукта в ферментере...................................170

5.7. Технологическая схема комплексной переработки клубней топинамбура с получением фруктанов и пробиотического продукта для животных................173

Выводы......................................................................................................................175

Список литературы..................................................................................................177

Приложения..............................................................................................................201

ВВЕДЕНИЕ

Концепция «функционального питания» с каждым годом приобретает все большее распространение. В России рынок продуктов этой группы постоянно растет. Основным его сегментом являются кисломолочные продукты, введение в которые компонентов, относящихся к группе пребиотиков, усиливает положительный эффект на здоровье человека и коммерческую привлекательность продукции. Однако производство данных компонентов в нашей стране развито в недостаточной степени.

Среди ряда других веществ к группе пребиотиков относят фруктаны -инулин и фруктоолигосахариды (ФОС) [1], которые входят в состав таких растений как девясил, цикорий, топинамбур, чеснок, эхинацея и ряд других, в основном, относящихся к семейству Сложноцветных [2, 3]. В нашей стране имеется богатый опыт по выращиванию топинамбура. Получены сорта топинамбура с высокой урожайностью в нечерноземной полосе, например в условиях Верхневолжья сорт «Скороспелка» дает урожай до 35 т/га [4]. Урожай клубней в южной полосе России может составлять до 50 т/га [5]. Клубни топинамбура при сборе урожая в конце сентября - начале октября содержат до 20 % инулина и ФОС.

Распоряжением правительства Российской Федерации от 31 июля 2013 г. № 1356-р одобрен проект Программы Союзного государства «Инновационное развитие производства картофеля и топинамбура», предусматривающей в том числе разработку инновационных технологий производства топинамбура, а также технологий и оборудования для получения продуктов питания, инулина, топливных добавок и кормов из него. Особый интерес представляла бы технология комплексной переработки топинамбура с получением и инулина, и продукта для животноводства. При этом в качестве альтернативного способа выделения фруктанов может быть изучена экстракция ультразвуком, использование которой для выделения БАВ из растительного сырья в

последнее время получило широкое распространение [6 с. 185, 7].

Одной из проблем, возникающих при переработке растительного сырья, является отсутствие возможности полного извлечения БАВ за одну ступень экстракции. Уникальность топинамбура состоит в том, что образующийся после экстракции твердый отход (жом) содержит фруктаны, стимулирующие рост и повышающие стабильность пробиотических микроорганизмов, благодаря чему они могут быть использованы в качестве основного компонента при производстве пробиотиков для животноводства. Известно, что пробиотики оказывают сильнейшее позитивное воздействие на здоровье и продуктивность сельскохозяйственных животных и птиц, особенно при введении в рацион с первых дней жизни [8]. Поэтому производство продукта для животных, содержащий пробиотические микроорганизмы, будет иметь большую коммерческую привлекательность по сравнению с традиционными кормами.

Цель настоящей работы: разработать малоотходную технологию комплексной переработки топинамбура с получением фруктанов и пробиотического продукта для животных.

Для выполнения цели были сформулированы следующие задачи исследования:

- изучить кинетику экстракции фруктанов из клубней топинамбура путем непрямого ультразвукового воздействия и определить оптимальные значения гидромодуля, температуры и кислотности экстрагента;

- определить оптимальные условия удаления пигментных примесей из экстракта с помощью сорбентов (активированного угля различных марок и ионообменных смол), а также мембранных методов (ультрафильтрации);

- предложить оптимальную схему очистки экстракта и проанализировать состав получаемого продукта с помощью физико-

химических методов анализа (ЯМР-спектроскопии);

- подтвердить возможность глубинного гетерофазного культивирования молочнокислых бактерий (МКБ) на питательной среде, содержащей в качестве основного компонента твердый остаток после экстракции (жом);

- провести скрининг штаммов лактобактерий, а также обосновать оптимальный для получения пробиотического продукта состав питательной среды, содержащей жом клубней топинамбура, и условия культивирования;

- исследовать влияние жома в качестве компонента питательной среды на стабильность культуры МКБ при хранении и стрессовых воздействиях;

- рассмотреть влияние различных бактериальных ауторегуляторов -алкилоксибензолов (АОБ) - на стабильность МКБ, полученных путем глубинного гетерофазного культивирования в присутствии жома клубней топинамбура;

- провести технико-экономическую оценку предлагаемой технологии.

Научная новизна. Изучено влияние гидромодуля, температуры и рН

экстрагента на выход фруктанов при водной экстракции из клубней топинамбура с помощью непрямого ультразвукового воздействия, а также кинетика экстракции при всех значениях рассмотренных параметров.

Впервые изучены различные методы (ультрафильтрационные и сорбционные) очистки от пигментных примесей экстракта, полученного из клубней топинамбура с помощью ультразвуковой экстракции, и представлено научное обоснование оптимального способа их удаления, позволяющего получить неокрашенный продукт. Структура фруктанов была подтверждена методом ЯМР-спектроскопии.

Впервые показано, что внесение в питательную среду для глубинного гетерофазного культивирования МКБ твердой фазы в виде жома,

образующегося после первой ступени экстракции фруктанов из клубней топинамбура, повышает стабильность жизнеспособных клеток при длительном хранении (8 недель, 5 °С), а также их устойчивость к стрессовым воздействиям (прогрев 50°С, 15 мин; замораживание-оттаивание). Установлено, что при внесении АОБ, в особенности С-12 АОБ, в суспензии МКБ, полученные на питательной среде, содержащей жом, устойчивость клеток к воздействию указанных факторов увеличивается.

Практическая значимость. Разработана комплексная малоотходная технология переработки клубней топинамбура в условиях лаборатории. Даны практические рекомендации по созданию опытно-промышленной установки, позволяющей получить фруктаны, а также пробиотический продукт для животных с высоким содержанием живых клеток МКБ.

Установлено, что применение ультразвука для экстракции фруктанов из клубней топинамбура позволяет снизить температуру экстракции на 10-15 °С и сократить продолжительность процесса до 15 мин. Предложен способ, позволяющий полностью удалить пигментные примеси из полученного экстракта, путем его фильтрации через полисульфонамидную мембрану с порогом удержания 20 кДа с последующей обработкой активированным углем марки ОУ-А.

Подобраны оптимальные условия глубинного гетерофазного культивирования МКБ на питательной среде, содержащей жом клубней топинамбура. Получены лабораторные образцы пробкотического продукта для животных на основе культуры Lactobacillus plantanun, содержащие не менее 1,0х 109 КОЕ/мл клеток МКБ.

На основании полученных результатов проведена технико-экономическая оценка предлагаемой технологии исходя из расчетной мощности производства 2 ООО тонн/год по перерабатываемому сырью.

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Характеристика инулина, фруктоолигосахаридов и их источников 1.1.1. Строение и физико-химические свойства фруктанов

Фруктаны - группа углеводов, наиболее распространенными представителями которых считают инулин и фруктоолигосахариды (ФОС), накапливаемые растениями в качестве запасных веществ. Инулин - это полисахарид, содержащий до 65 остатков D-фруктофуранозы (F), соединенных 2—> 1 -(3-гликозидными связями, для гидролиза которых требуется отсутствующий у человека фермент - инулиназа, и концевым остатком D-глюкопиранозы (G), образующей с остатком фруктозы 1 —»2-а-гликозидную связь (см. рис. 1). Имеются сведения, что инулин цикория и георгина также содержит небольшое количество 2—>6-(3-гликозидных связей [2, 9]. Количество таких ответвлений в полимерной цепи не превышает 2% [10]. Инулин впервые был выделен немецким химиком Валентином Розе-мл. из девясила (Inula helenum), о чем сообщалось в опубликованной в 1804 г работе [11].

Рис. 1.1. Структурная формула инулина (по [16]).

ФОС состоят из 2 и более остатков фруктозы, организованных аналогичным образом. При этом концевая молекула глюкозы может отсутствовать, т.е. возможен как вариант ОРп, так и РРП [9]. Иногда, в качестве

синонима ФОС используют термин «олигофруктоза» [12] и «инулоолигосахарид» [13]. Наименьшим гомологом ФОС со степенью полимеризации (СП) 2, фактически, является сахароза (вР). Также к ним относятся кестоза (ОР2) и нистоза (вРз) и др. К не содержащим остаток глюкозы ФОС может быть отнесена инулобиоза (Р2) [2, 13]. Считается, что ФОС могут образовываться в растениях, содержащих инулин, под действием эндогликозидаз [14].

Молекулярная масса фруктанов в зависимости от СП может колебаться в пределах от 340 до 4620 г/моль [15]. По другим данным инулин может иметь молекулярный вес до 5000-6000 [16].

Фруктаны, выделяемые из природных источников, фактически являются смесью ФОС и инулина разной СП, в зависимости от того из какого растения он был получен и от технологии выделения. СП влияет не только физико-химические, но и органолептические свойства. Как инулин, так и ФОС представляют собой в высушенном состоянии белые кристаллические порошки [17]. Инулин не обладает выраженным вкусом и запахом [18]. Тот факт, что коммерчески доступные продукты могут обладать слабо сладким вкусом [19], можно связать с наличием в них ФОС с низкой степенью полимеризации [15].

Инулин характеризуется средней растворимостью в холодной воде, причем растворимость снижается с увеличением СП. Например, растворимость высокомолекулярной фракции инулина из цикория со средней СП 25 при температуре 25°С составляет 25 г/л, не фракционированного инулина со средней СП 12 - 120 г/л, в то время как ФОС со средней СП 4 (максимальная СП 7) - более 750 г/л [20]. Растворимость в воде высокомолекулярной фракции инулина из артишока при комнатной температуре не превышает 5% [18]. При температуре воды от 60°С растворимость высокомолекулярных фракций инулина возрастает [16, 21]. Угол удельного вращения растворов инулина и ФОС может составлять от -17 до -40° в зависимости от фракции. Высокомолекулярные гомологи инулина характеризуется удельным вращением

от-33 до-40° [11].

Фруктаны осаждаются органическими растворителями, такими как ацетон, метанол и этанол, причем последний является наиболее эффективным. Увеличение концентрации этанола приводит к осаждению фракций инулина с меньшей СП. Например, при осаждении инулиноподобных фруктанов, выделенных из корней эхинацеи 80%-ным этанолом, средняя СП продукта составляла 35, при использовании 60%-ного раствора этанола - 44, а 40%-ного -55 [2, 10].

Фруктаны не являются редуцирующим веществом, а также интактны по отношению к пищеварительной системе человека [9, 13]. Заметное разложение высокомолекулярных фракций инулина (до 20 %) начинается при температурах выше 135°С, а при температуре 190°С в течение 60 мин происходит его полное разрушение. При этом образуются и дегидратированные производные [22].

Устойчивость фруктанов к действию кислоты снижается с увеличением температуры при рН от 4 и ниже, однако п�