Структурная модификация ферментных белков для изменения эффективности катализируемых реакций

Петровский, Арсений Сергеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурная модификация ферментных белков для изменения эффективности катализируемых реакций
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Структурная модификация ферментных белков для изменения эффективности катализируемых реакций"

На правах рукописи

005019188

Петровский Арсений Сергеевич

Структурная модификация ферментных белков для изменения эффективности катализируемых реакций

03.01.06 — Биотехнология (в т.ч. бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 МАЯ ш

Москва - 2012

005019188

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Российского химико-технологического университета им. Д.И. Менделеева.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Эль-Регистан Галина Ивановна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Звягильская Рената Александровна

заведующая лабораторией биологического окисления Института биохимии им. А.Н. Баха РАН

доктор биологических наук, доцент Лысак Людмила Вячеславовна доцент кафедры биологии почв факультета почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова

Ведущая организация:

Некоммерческое партнерство «Научно-технический центр «Лекарства и биотехнология»

Защита состоится «2г» мая 2012 года в /I на заседании объединенного

диссертационного совета ДМ 212.204.13 в Российском химико-технологическом

университете им. Д.И. Менделеева по адресу: 125047, Москва, Миусская пл., д. 9 в аудитории 443 (конференц-зал).

С диссертацией можно ознакомиться в Информационно-библиотечном центре РХГУ им. Д.И. Менделеева.

Автореферат диссертации разослан «¿с » 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета ДМ 212.204.13

ШакирИ.В.

Актуальность проблемы. Ферменты - биологические катализаторы, широко используются в различных областях хозяйственной деятельности человека. Одной из отрицательных сторон использования ферментов является свойственная им нестабильность, обусловленная необратимым нарушением их нативной структуры физическими, химическими и биологическими воздействиями. Изучение закономерностей стабилизации структуры белков, обеспечивающей сохранение их функциональных характеристик, имеет фундаментальную и практическую значимость. Добавление стабилизирующих веществ в растворы ферментных белков является наиболее простым и эффективным способом сохранения их активности в денатурирующих условиях, однако, во многих случаях, приводит к снижению их каталитической функции [Варфоломеев, 2005]. Способностью корректировать структурно-динамическое состояние белков обладают, в том числе, низкомолекулярные соединения - химические шапероны (ХШ) [Welch and Brown, 1996]. К их числу относятся синтезируемые микроорганизмами и растениями алкилоксибензолы (АОБ), имеющие функции универсальных адаптогенов и протекторов, повышающих устойчивость микроорганизмов к неблагоприятным условиям, а в высоких концентрациях индуцирующих переход клеток микроорганизмов в покоящееся анабиотическое состояние [Эль-Регистан с соавт., 2006]. Механизм действия АОБ основан на их способности к формированию водородных связей, гидрофобных и электростатических взаимодействий с соответствующими группами и доменами биополимеров, в том числе, ферментных белков [Stasiuk, Kozubek, 2010]. Ранее на примерах простых моносубъединичных ферментов in vitro было показано, что воздействие АОБ приводит к изменению их каталитической активности и повышению стабильности [Мартиросова с соавт., 2004]. Однако механизмы направленной модификации не только простых, но и сложных ферментных белков с помощью АОБ остаются не изученными. Кроме того, большой интерес представляет выяснение возможности использования АОБ для регуляции активности ферментных систем в живых организмах.

Цель работы: изучить эффекты взаимодействия АОБ с простыми и сложными ферментными белками в составе ферментных препаратов и живых организмов, включая модуляцию каталитической активности, изменение субстратной специфичности и повышение стабильности ферментов, а также исследовать молекулярные механизмы, обусловливающие эти процессы.

Задачи исследования: (1) Изучить влияние различных изомеров и гомологов АОБ на функциональные характеристики сложных ферментных белков (пероксидазы): активность, функциональную и операционную стабильность, субстратную специфичность. (2) Провести сравнительный анализ изменений функциональных характеристик простых (лизоцима) и сложных (пероксидазы) ферментных белков, модифицированных различными гомологами и изомерами АОБ. (3) Изучить молекулярные механизмы

действия АОБ как модификаторов структуры биополимеров, обусловливающих изменения

характеристик ферментных белков и эффективности ферментативных реакций. (4) Разработать приемы применения АОБ для регуляции каталитической активности и стабилизации ферментных белков в составе ферментных препаратов и живых организмов.

Научная новизна: (1) В опытах in vitro доказана способность различных гомологов АОБ модифицировать структуру сложных ферментных белков (пероксидазы), что приводит к изменению их каталитической активности и повышению устойчивости к денатурирующим воздействиям. (2) Впервые получена информация о влиянии пространственной организации ферментного белка на модифицирующие эффекты АОБ. Для простых моносубъединичных белков (лизоцима) решающую роль в их модификации играют структура АОБ и его концентрация, тогда как взаимодействие АОБ со сложными белками отличается: отсутствием зависимости модифицирующих эффектов от структуры АОБ; сужением диапазона действующих концентраций АОБ; влиянием на результативность модификации фермента времени его взаимодействия с АОБ (прединкубации). (3) Обнаружено, что модификация как простых, так и сложных ферментных белков с помощью АОБ приводит к снижению их субстратной специфичности, что обусловливает расширение спектра катализируемых субстратов. (4) На основании сравнения модифицирующих эффектов 10 гомологов и изомеров АОБ показано, что преимущественное влияние на вектор изменения (стимуляция-ингибирование) каталитической активности ферментов оказывают длина гидрофобного радикала и наличие заместителя во втором положении. (5) Методами молекулярной динамики белка и сканирующей микрокалориметрии установлено, что в результате воздействия одного из гомологов (С7-АОБ) на ферментный белок (лизоцим) повышается гидрофобная гидратация молекулы и понижается избыточная свободная энергии её денатурации, вследствие чего снижается конформационная стабильность белка и повышается его ферментативная активность.

Практическая ценность работы: (1) Приемы стабилизации и направленной модуляции каталитической активности простых и сложных ферментов с помощью АОБ должны учитывать зависимость выбора стабилизатора от свойств белка, концентрацию АОБ и время взаимодействия (прединкубации) АОБ с белком. (2) Модификация лизоцима АОБ приводит к увеличению его активности в отношении дрожжевых и грибных клеток, что может быть использовано в медицинской практике. (3) Предложены приемы регуляции каталитической активности ферментов в составе живых организмов. Контроль процесса солодоращения осуществляется внесением в замочную воду добавок АОБ, действие которых обусловливает деконтаминацию зерна от фитопатогенной микрофлоры и изменение активности гидролитических и окислительных процессов в зерне, что обеспечивает сокращение сроков солодоращения и повышение в солоде экстрактивных веществ.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на Международной научно-

практической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты» (Москва, 2008); 5-ом Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009); XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2009); X Юбилейной Международной научно-технической конференции «Оптические методы исследования потоков» (Москва, 2009), VIII Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2010). По материалам диссертации опубликовано 10 работ, из них 4 статьи и 6 тезисов.

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 160 страницах и состоит из введения, обзора литературы (Глава 1), экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы, включающего 235 публикаций отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 9 таблицами и 35 рисунками.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты исследования. В работе использовали простые ферментные белки: лизоцим яичного белка (Sigma), дезоксирибонуклеазу поджелудочной железы КРС (Самсон-Мед, С.-Петербург) и сложный ферментный белок - пероксидазу хрена (Sigma).

Биохимические методы анализа. В качестве структурных модификаторов ферментов использовали 10 химически чистых (99,9%) изомеров и гомологов АОБ (табл. 3), а также коммерческие препараты АОБ серии «Сидовит» (ООО «Новые технологии», Москва). Модификацию ферментов и полимерных субстратов проводили, смешивая их растворы с растворами АОБ и выдерживая смесь при t = 18-20°С в течение 0 (без прединкубации) или 10-60 мин (с прединкубацией). Активность лизоцима определяли: по степени снижения оптической плотности (ОП) суспензии клеток Micrococcus luteus фазы экспоненциального роста за 10 мин контакта [Gorin et al., 1971]; изменению максимальной скорости лизиса клеток (Vmax) через 250-300 с контакта; по количеству редуцирующих веществ, образующихся при гидролизе пептидогликана (ПГ) клеточной стенки М. luteus [Бухарин с соавт., 2005] или коллоидного хитина [Miller, 1959]. Активность ДНКазы определяли по количеству кислоторастворимых веществ, образующихся при гидролизе ДНК [Дэвидсон, 1968]. Активность пероксидазы измеряли колориметрически по изменению окраски в индикаторной реакции разложения Н202 и окисления субстратов о-дианизидина и 2,2'-азино-ди-(3-этил-бензотиазолин)-6-сульфокислоты (ABTS) [Фогарти, 1986]. Значения Кт и Vmax реакции определяли из зависимостей Лайнуивера-Берка.

Физико-химические методы анализа. Термодинамические параметры денатурации лизоцима определяли методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии (ДСМК) [Privalov, Dragan, 2007; Spink, 2008] с использованием прибора ДАСМ-4 (КББП РАН, г. Пущино). Термограммы получали в диапазоне температур 7 - 110°С. Обработку термограмм в области денатурации белка проводили с помощью стандартной программы WScal [Privalov, Potekhin, 1986].

Методами молекулярной динамики, диффузного рассеивания рентгеновских лучей

(ДРРЛ) и Релеевского рассеивания Мёссбауэровского излучения (РРМИ) определяли картину структурно-динамической организации системы белок-вода-АОБ при различных концентрациях АОБ [Шайтан, 2004].

Вязкость растворов белков и их гидрофобность определяли методом ВЭЖХ [Хеншен с соавт., 1988].

Статистический анализ проводили, используя t-тест Стьюдента в программе Microsoft Excel при критерии вероятности Р<0,05.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Регуляция алкилоксибензолами каталитической активности и стабильности простых моносубъединичных ферментов

Влияние АОБ на функциональную активность лизоцима в отношении специфического субстрата - ПГ клеточной стенки бактерии M. luteus, определяли для нативного и модифицированного АОБ фермента по изменению максимальной скорости лизиса клеток (VmI) и проценту падения ОП бактериальной суспензии (табл. 1). Основным эффектом С7-АОБ во всем диапазоне используемых концентраций (10"7 - 10"3 М; мольное соотношение «фермент : АОБ» (Мф : Маоб) от 1 : 1 и выше) являлось дозозависимое повышение эффективности литической реакции при прогрессивном возрастании значения VmaJt от 10883 до 15864 КОЕ/млс и падении ОП бактериальной суспензии на 14 % (табл. 1). С12-АОБ оказывал на активность лизоцима дозозависимый, но ингибирующий эффект: при максимальной из использованных концентраций (10"3 М) скорость гидролиза снижалась в 4 раза, до 2658 КОЕ/мл-с.

Таблица 1.

Параметры литической реакции в системе «лизоцим - клетки М. 1и1еш» при модификации фермента С7-АОБ и С12-АОБ, КОЕ/мл-с (% от контроля)

АОБ Параметры литической реакции Концентрация АОБ при модификации фермента, M

0 (контроль) ю-7 10"6 ю-5 ю-4 ю-3

С7-АОБ Ушах, КОЕ/млс 9961 (100) 10883 (109)*5 11990 (120) 13005*' (131) 14388*' (144) 15864*2 (159)

ОП через 10 мин, % от исходной*4 80,4 (100) 78,6 (98) 76,5 (95) 74,5 (93) 71,7 (89) 68,8 (86)

С12-АОБ Ушах, КОЕ/млс 10426 (100) 10108 (97) 8510 (82) 7426*' (71) 6342*-1 (61) 2658*J (25)

ОП через 10 мин, % от исходной*4 79,5 (100) 80,2 (101) 83,3 (105) 85,4*' (107) 87,5 *2 (110) 94,8*3 (119)

*' Р<0,05; Р<0,01; *J Р<0,001; *4 Начальные ОП = 0,5: 100 %; численность КОЕ клеток =

2,8 х Ю7 КОЕ/мл; *5 % от контроля.

На эффективность литической реакции также влияла модификация субстрата, однако, в меньшей степени, чем фермента (табл. 2).

Таблица 2.

Изменение максимальной скорости лизиса клеток (Утах) при модификации С7-АОБ субстратов - клеток микрококка и изолированного ПГ, КОЕ/мл с (% от контроля)

С7-АОБ, М 0 (контроль) 7 ■ 10"9 7 • 10"8 7 • 10"7 7 • Ю-6 7 ■ 10"5

Клетки 6539 6824 7142 7309 7389 7916

микрококка (100) (104) (109) (112) (ИЗ) (121)

ПГ 23585 (100) 23914 (101) 24874 (105) 26850 (114) 28319 (120) 29468 (125)

Влияние АОБ на функциональную активность лизоцима в отношении неспецифического субстрата. Новым и наиболее интересным эффектом модификации структуры лизоцима АОБ было изменение не только его активности, но и субстратной специфичности. При этом модификационные эффекты АОБ при гидролизе неспецифического субстрата — коллоидного хитина, были значительно более выражены, чем при воздействии на специфический субстрат - пептидогликан. Результативность гидролиза хитина зависела от структуры АОБ как лиганда и его концентраций (соотношений Мф : Маоб). Так, действие гидрофобного гомолога С12-АОБ в низких концентрациях (до 1,5 мг/мл) вызывало увеличение эффективности гидролиза хитина (до 575%), а в высоких концентрациях (больше 2,5 мг/мл) - ингибирование (рис. 1 а).

(мольное соотношение фермеит:С12-АОБ) Концентрация С7-АОБ, мг/мл

Рис. 1. Концентрационная зависимость действия С12-АОБ (а) и С7-АОБ (б) на ферментативную активность лизоцима при гидролизе коллоидного хитина (модификация фермента). Условия реакции: 1—1 = 37°С; 2-Х = 55°С; рН 5,5; время - 48 часов.

Другой гомолог С7-АОБ во всем диапазоне испытанных концентраций не обладал ингибирующим действием (рис. 1 б). Количество ацетилглюкозамина, образуемого модифицированным лизоцимом возрастало при: 1) увеличении концентрации АОБ до 0,5 -1,0 мг/мл; 2) повышении температуры до 55°С; 3) увеличении времени прединкубации фермента с АОБ до 1 час.

Отмечено, что: 1) окисленные формы АОБ также обладали белок модифицирующим действием, при этом более эффективным, чем нативные; 2) модификационный эффект АОБ был более выражен в неоптимальных для ферментативной реакции условиях, что

важно для расширения диапазона (1°С, рН) эффективного ведения биотехнологических процессов.

Определение кинетических параметров гидролиза субстратов модифицированным АОБ лизоцимом. Эффекты С7-АОБ в широком диапазоне активирующих концентраций (0,001 - 0,032 М) в реакциях гидролиза (как специфического, так и) неспецифического субстрата - хитина, были характерны для активаторов неконкурентного типа:

Концентрация С7-АОБ, М 0 0,001 0,004 0,008 0,016 0,032

Кщ 38,0 135,7 135,7 135,7 38,0 38,0

Vmax, мг/мл-ч 0,056 0,18 0,19 0,2 0,09 0,12

Кинетика реакций, катализируемых лизоцимом, модифицированным С12-АОБ, подчинялась более сложным закономерностям. В экспериментах со специфическим субстратом использовали различные концентрации клеток (ОП = 0,1 -=- 0,7 или КОЕ/мл = 0,55-107 - 3,9-107) при стандартной концентрации фермента, 10"5 М. Результаты, проанализированные в координатах Лайнуивера-Берка, показали, что модификационные эффекты С12-АОБ по существующим представлениям характерны для действия ингибиторов смешанного типа:

Концентрация С12-АОБ, М 0 ю-' 10^ 10J

Кга 5,54 7,18 5,78 6,26

Vmax, КОЕ ■ 104/мл ч 7,57 7,46 5,23 4,03

Проведение графического анализа результатов, полученных при гидролизе клеток микрококка, в системах координат, характеризующих S; S/V и V/S; V, подтвердило это заключение (рис. 2): зависимости S/V от S и V от V/S при концентрации С12-АОБ 10"7 М характерны для конкурентного типа ингибирования, тогда как при насыщающих концентрациях С12-АОБ - для смешанного типа ингибирования.

Рис. 2. Графики, описывающие зависимости между концентрацией субстрата - клетки М. Ыею (Б), и скоростью (V) их гидролиза лизоцимом (10"5 М), модифицированным С12-АОБ в концентрациях: 1 - контроль; 2- 10"7М; 3 - 10"5М; 4- 10"3М.

Влияние АОБ на устойчивость лизоцима к денатурирующим воздействиям.

Модификация структуры фермента, отражающаяся на его каталитической активности,

влияла на: (1) функциональную стабильность (сохранение каталитической функции после денатурирующих воздействий): модифицированный С7-АОБ (2 мг/мл) фермент после термообработки в течение 30 - 90 мин при 70°С обладал большей остаточной активностью, чем нативный (рис. 3 а); (2) операционную стабильность (сохранение высокой активности в неоптимальных условиях катализа): лизоцим, модифицированный С7-АОБ (1 мг/мл), в широком диапазоне температур (30-55°С) имел такую же (или выше) активность при гидролизе хитина, как и нативный фермент при оптимальной температуре (53°С) (рис. 3 б).

а)

я 200 -

Е к а о

е а м 150 -

ш Ч

| н° я 100 -

л с

н о е 2 50 -

£ а. в>

Ё 0 -

96,5

100

72,4

90,7 й

П1 02

59,3

6) 0,2 -

0,16 -

1 1 8 « 2 о § Г) * 0,12 -

ч | 0,08 ■ л Ь & § г й 0,04 -г я

<1 £ 0 -0

Длительность прогревания при 70°С, мин

10 20 30 40 50 60 70 Температура, °С

Рис. 3 Функциональная (а) и операционная (б) термостабильность нативного (У) и модифицированного (2) лизоцима. Условия реакции: концентрация С7-АОБ (а) - 2 мг/мл, (б) - 1 мг/мл; субстрат - коллоидный хитин.

Влияние АОБ на каталитическую активность ДНКазы. Характер влияния С7- и С12-АОБ на активность другого моносубъединичного фермента, ДНКазы, был аналогичен показанному для лизоцима, хотя эффективные концентрации были ниже и действие менее выражено. Амфифильный гомолог С7-АОБ в широком диапазоне концентраций вызывал увеличение активности фермента (рис. 4 а), диапазон активирующих концентраций С12-АОБ был незначителен (0,01 - 0,10 мг/мл) (рис. 4 б), в дозах более 0,11 мг/мл он ингибировал активность фермента.

0,1 ОД 0,3 0,4 Концентрация С7-АОБ, мг/мл

0,05 0,1 0,15 Концентрация С12-АОБ, мг/мл

Рис 4. Действие на активность ДНКазы (время прединкубации 30 мин) (а) С7-АОБ: 1 -неокисленная форма, 2 - окисленная форма; (б) С12-АОБ.

На примере ДНКазы было более детально исследовано влияние структуры АОБ на модуляцию ферментативной активности (табл. 3). Активирующим действием обладали АОБ, имеющие метальный радикал в 5-ом (С7-АОБ) и/или 2-ом положении; имеющие углеводородный радикал в 4-ом (С 12-АОБ) или 5-ом положении - обладали двойственностью эффектов; увеличение длины радикала в 5-ом положении коррелировало с усилением ингибиторных свойств.

Таблица 3.

Действие изомеров АОБ на активность ДНКазы (диапазон концентраций АОБ 0-0,8 мг/мл)

Изомеры АОБ Стимуляция активности Ингибирование активности

Диапазон концентраций, мг/мл % от контроля (концентрация АОБ, мг/мл) Диапазон концентраций, мг/мл % от контроля (концентрация АОБ, мг/мл)

5-метилрезорцин (С7-АОБ) 0-0,8 126 (0,2) - -

2-метилрезорцин 0-0,8 120 (0,05) - -

2,5-диметилрезорцин 0-0,8 111 (0,2) - -

2-этил-5-метилрезорцин 0-0,8 123 (0,4) - -

2,4-диметилрезорцин 0-0,5 108 (0,02) 0,5-0,8 83 (0,8)

5 -этилрезорцин 0-0,06 108 (0,02) 0,06-0,8 88 (0,8)

5-пропилрезорцин 0-0,06 106 (0,02) 0,06-0,8 68 (0,8)

5-додецилрезорцин - - 0,02-0,8 0 (>0,06)

4-гексилрезорцин (С12-АОБ) 0,07-0,12 112 (0,05) 0,12-0,8 0 (>0,25)

2-(4-гидроксифенил)-этан-1-ол (тирозол) 0-0,8 119(0,8) - -

Таким образом, модификация структуры простых ферментных белков АОБ помимо влияния на эффективность катализируемых ими реакций и на повышение стабильности ферментов обусловливает изменение их субстратной специфичности. Наибольшее значение для модификационных эффектов АОБ имеют их структура и концентрация, варьированием которых можно направленно влиять на функциональную активность ферментов.

3.2. Регуляция алкилоксибензолами каталитической активности и стабильности сложных ферментных белков

Влияние АОБ на каталитическую активность пероксидазы. Объектом исследования была пероксидаза хрена, сложный ферментный белок, состоящий из гликопротеина и геминового компонента, включающего протопорфирин IX и Fe+3.

О модифицирующем действии С7- и С12-АОБ судили по изменению каталитической активности пероксидазы в отношении двух субстратов, о-дианизидина и ABTS, в вариантах без или с прединкубацией (10-30 мин) (рис. 5). За 100% активности принимали для о-дианизидина - 180 ед/мин мг белка, для ABTS - 920 ед/минмг белка. Характер воздействия обоих гомологов на активность пероксидазы отличался от их

эффектов на простые ферментные белки, что, вероятно, связано с влиянием АОБ как на третичную, так и четвертичную структуру фермента: 1) эффекты гомологов были довольно схожими и слабо зависели от их структуры; 2) каталитическая активность и уровень модифицирующего действия существенно зависели от используемого субстрата; 3) на модифицирующие эффекты влияло время прединкубации АОБ с белком.

б)

а)

190 -

170 -

<в ч 150 "

О 130 -

Б 110 -

■А

и О 90 -

а s 70 -

a < 0

0,05 0,1 0,15 0,2 Концентрация С7-АОБ, мкг/мл

0,25

0,05 0,1 0,15 0,2 Концентрация С7-АОБ, мкг/мл

0,25

В)

Г)

0,1 0,2 0,3 Концентрация С12-АОБ, мкг/мл

0,1 0,2 03 Концентрация С12-АОБ, мкг/мл

Рис. 5. Действие С7-АОБ (а, б) и С12-АОБ (в, г) на ферментативную активность пероксидазы при окислении субстратов: о-дианизидина (а, в) и ABTS (б, г); время прединкубации: J - без прединкубации, 2-10 мин, 3 — 20 мин.

Концентрационные зависимости эффектов АОБ при окислении о-дианизидина и ABTS отличались: оба лиганда имели узкий диапазон активирующих концентраций (0,02 -0,2 мкг/мл) при окислении о-дианизидина (рис. 5 а, в); при окислении ABTS (рис. 5 б, г) не наблюдалось ингибиторной области, а величины стимуляции активности были менее выражены (до 130%). Таким образом, модифицирующий эффект АОБ при их взаимодействии со сложным ферментным белком, также как и с простыми ферментами, был более выражен для «низкокатализируемых» субстратов.

Использование с биотехнологическими целями коммерческих препаратов Сидовита 1 и 2 (на основе окисленных форм С7-АОБ) подтвердило концентрационный характер их действия и зависимость эффектов от используемых субстратов, отличаясь при этом более высокими активирующими концентрациями.

На результативность катализируемой реакции влияла также модификация субстрата, что подтверждает данные, полученные ранее для ферментов гидролаз [Степаненко с соавт., 2001; Мартиросова с соавт., 2004]. При предварительном взаимодействии АОБ с о-дианизидином эффективность катализа возросла на 25% для С7-АОБ и на 30% для С12-АОБ (рис. 6).

130 п

120 -

S 110-

£ <

100

-I-г

0,03 0,06 0,09 0,12 0,15 Концентрация С7-АОБ, мкг/мл

0,05 0,1 0,15 0,2 Концентрация С12-АОБ, мкг/мл

Рис. 6. Действие С7-АОБ (а) и С12-АОБ (б) на ферментативную активность пероксидазы при модификации субстрата о-дианизидина: время прединкубации: 7-10 мин, 2 - 20 мин, 5-30 мин.

Влияние АОБ на устойчивость пероксидазы к денатурирующим воздействиям. Модификация структуры фермента АОБ (также препаратами Сидовит) приводила к повышению его функциональной стабильности: активность модифицированной как С7-, так и С12-АОБ пероксидазы в отношении о-дианизидина и ABTS после термообработки (15 мин, 70°С) была выше, чем в контроле на 10-42% (табл. 4).

Таблица 4.

АОБ Концентрация АОБ Активность пероксидазы, % от контроля до термообработки (остаточная активность, % после термообработки)

Субстрат

о-дианизидин ABTS

С7-АОБ 0 (контроль) 100 (45,1) 100 (33,0)

0,0124 мкг/мл (0,1 мкМ) 128,6(61,0) 107,6 (75,2)

0,248 мкг/мл (2 мкМ) 94,5 (62,5) 115,9(50,6)

С12-АОБ 0(контроль) 100(48,9) 100(34,0)

0,0194 мкг/мл (ОД мкМ) 128,7 (71,4) 114,3 (59,1)

0,388 мкг/мл (2 мкМ) 99,4 (60,0) 116,5(44,2)

Сравнительный анализ действия АОБ на простые и сложные ферментные белки показал, что если для моносубъединичных белков решающее значение в модификационных процессах имеют структура и концентрация АОБ, то для сложных ферментов - время их взаимодействия с АОБ при сравнительно узком диапазоне эффективных концентраций обоих модификаторов. По-видимому, в последнем случае АОБ действуют не только на третичную структуру апофермента, но и на взаимодействия

компонентов сложных белков.

Таким образом, можно констатировать, что АОБ в результате их взаимодействия с макромолекулами белков способны направленно изменять каталитическую активность как простых, так и сложных ферментных белков, повышать их стабильность к денатурирующим воздействиям и влиять на сродство к субстрату.

3.3. Молекулярные механизмы действия АОБ

Как правило, стабилизация ферментных белков добавками сопровождается ингибированием их каталитической активности [вбИег, СаНшИ, 1999]. Механизмы взаимодействий, при которых наряду с повышением стабильности фермента наблюдается одновременное увеличение его активности, что характерно для эффектов АОБ, до сих пор не выяснены. Методами молекулярной динамики (ДРРЛ и РРМИ) было показано, что взаимодействие лизоцима с С7-АОБ в широком диапазоне концентраций (а для С12-АОБ в области активирующих концентраций) приводит к увеличению междоменной подвижности и, как следствие, каталитической активности лизоцима. При изучении молекулярных механизмов действия С7-АОБ методом дифференциальной сканирующей микрокаллориметрии (ДСМК) были исследованы термодинамические параметры денатурации (10-110°С) нативного и модифицированного С7-АОБ лизоцима (1 ч и 120 ч прединкубации) при различных г - мольных соотношениях С7-АОБ/лизоцим. Обнаруженная в вариантах 1 ч прединкубации симметричность пика избыточной теплоемкости связана с кооперативным переходом лизоцима из упорядоченного в менее упорядоченное состояние по модели двух состояний, тогда как при 120 ч прединкубации несимметричность пика предполагала наличие более одной кооперативной единицы перехода. Из термограмм денатурации лизоцима были определены: температура денатурации (Т<)) (рис. 7 а), молярная энтальпия денатурации (ДаНСа1 (Та)) (рис. 7 б) и разность теплоемкости белка в денатурированном и нативном состояниях (Д^Ср) (рис. 7 в).

б) 500

я*

-я

400

300 -

200

100 200 300 400 г

-I—1—I—I

100 200 300 400 г

1—1—1—I—I—I—Г-

100 200 300 400 г

Рис. 7. Зависимость (а) температуры денатурации лизоцима (Та); (б) молярной энтальпии денатурации лизоцима (ДаНс»! (Т<])); (в) разности теплоемкости лизоцима в денатурированном и нативном состояниях (ДаСр) - от молярного соотношения С7-АОБ/лизоцим (г) и времени прединкубации 1 ч (/) и 120 ч (2).

Анализ полученных зависимостей (рис. 7) и рассчитанные величины свободной энергии денатурации лизоцима (рис. 8), модифицированного С7-АОБ, свидетельствовали об уменьшении термостабильности модифицированного лизоцима вследствие его предпочтительного связывания с денатурированной формой белка. Эти результаты согласуются с данными определения молекулярной динамики и модифицированного лизоцима и объясняют повышение его активности. Увеличение скачка теплоемкости между нативным и денатурированным состоянием лизоцима в области г = 0 — 50 свидетельствовало о повышении гидрофобной гидратации белка. Возможно, что наблюдаемое повышение функциональной и операционной стабильности модифицированного лизоцима связано со способностью АОБ образовывать множественные водородные связи, приводящие к формированию вокруг молекулы белка сольватной оболочки, отличающейся от объемной водной фазы.

Расчет зависимостей избыточной свободной энергии денатурации лизоцима (Д^6) от концентрации С7-АОБ при различных температурах указывает на дестабилизирующее действие лиганда, усиливающееся с ростом его концентрации и понижением температуры системы. Важно, что в диапазоне концентраций С7-АОБ 0,05 - 1,74 мг/мл (г = 3 - 100), приводящих к резкому снижению Дав1', наблюдалось наибольшее увеличение активности фермента, показанное выше (рис. 1 б) и сочетающееся с его функциональной стабильностью (рис. 3). Увеличение внутримолекулярной подвижности белка обеспечивает не только повышение его активности, но и может быть причиной снижения субстратной специфичности, что, в свою очередь, обусловливает расширение спектра катализируемых субстратов.

Рис. 8. Концентрационное влияние С7-АОБ на величину свободной энергии денатурации лизоцима при различных значениях температуры (время инкубирования 1 ч): / - I = 25°С; 2-1 = 40°С; 3 — 1 = 60°С.

100

150

200

Нелинейный характер температурной зависимости АлНс^Па) от Т<| при 120 ч прединкубации указывал на наличие более чем одного конформационного перехода, что подтверждено расчетом критерия АНса1/ДНуЬ (табл. 5). В случае 1 час прединкубации величина критерия близка к 1, что свидетельствует о применимости модели двух состояний. Однако, в случае длительного (120 ч) взаимодействия «фермент-АОБ» эта модель не применима. В последнем случае деконволюция показывает наличие в системе двух переходов, отражающих процессы плавления лизоцима: 1) в составе образовавшихся

белковых агрегатов (ДНса]/ДНУь >2) и 2) плавление двух структурных доменов лизоцима в рамках конформационного перехода белковой глобулы (ДНи1/ДН.л < 2).

Таблица 5.

Зависимость ДНса1/ДНуЬ от молярного соотношения С7-АОБ/лизоцим при времени инкубирования 1 и 120 ч_

г AHcal/AHvh

1ч инкубация 120 ч инкубация

Результаты деконволюции

Низкотемпературный пик Высокотемпературный пик

0 1,06 5,99 1,66

5 0,98 5,21 1,81

10 0,951 4,85 1,79

20 0,806 5,62 1,64

50 0,921 5,05 1,81

105 0,994 2,06 1,64

180 0,778 2,18 1,77

Таким образом, взаимодействия белка с АОБ приводят к изменениям его физико-химических констант и вследствие этого к повышению каталитической активности и функциональной стабильности, снижению субстратной специфичности.

3.4. Биотехнологические аспекты применения АОБ

Результаты исследований участия АОБ в модификации ферментных белков могут быть использованы в различных биотехнологических практиках. Приведем некоторые примеры применения АОБ.

3.4.1. Изменение субстратной специфичности лизоцима важно для расширения их антимикробной специфичности [Ibrahim, 1998]. Если спектр модификантов, активных против Г*нГ бактерий, достаточно велик [Radwan et al., 1994, Lesnierowski et al., 2004], то лизоцимов, действующих на грибные и дрожжевые клетки, практически неизвестно. Лизоцим, модифицированный С7-АОБ, оказался активен как в отношении хитина и, следовательно, грибов, так и интактных дрожжевых клеток S. cerevisiae, максимальный выход редуцирующих Сахаров в обоих вариантах опытов наблюдался при концентрации С7-АОБ 2 мг/мл.

3.4.2. Поддержание активности фермента ДНКазы в водных растворах при хранении. Одной из проблем применения ДНКазы в медицине является быстрая потеря активности её водных растворов. ДНКаза, модифицированная С7-АОБ (0,1 мг/мл), оказалась более стабильной: активность фермента через 24 часа была в 5,3 раза выше контрольной, а через 48 часов - в 4,5 раза.

3.4.3. Регуляция процессов солодоращения. Возможность направленной регуляции активности ферментов алкилоксибензолами позволяет решить в технологии солода комплексную задачу обеспечения необходимых изменений в прорастающем зерне с его

одновременной деконтаминацией.

Дезинфекция зерна. Обработка препаратом Сидовит, который вносили в первую замочную воду (0,1 г/л воды) в 16 раз снижала количество внутренней микрофлоры, имеющей самые негативные технологические последствия и не уничтожаемой традиционной обработкой (КМп04), и в 3 раза - поверхностной микрофлоры:

Поверхностная микрофлора, КОЕ/г Внутренняя микрофлора, КОЕ/г

КОНТРОЛЬ (КМПО4) Сидовит Контроль (КМпОд) Сидовит

4,4-10" 1,510й 1,6-104 1,010J

Влияние на прорастание и развитие вегетативных органов ячменя. Для активации процесса солодоращения в замочную воду добавляли растворы С7-АОБ (3 мкг/мл), С12-АОБ (0,3 мкг/мл) и препарата Сидовит различной концентрации (табл. 6). Все препараты увеличивали число проросших зерен, стимулировали рост корешка, тормозили развитие листового проростка, что является положительным результатом в технологии солодоращения.

Таблица 6.

Действие С7- и С12-АОБ (время проращивания 6 сут) и сидовита 2 (время проращивания 3 сут) на рост и развитие вегетативных органов зерна ячменя_

Количество зерен, %

Стадия прорастания Контроль С7-АОБ, Cl 2-АОБ, Сидовит, мкг/мл

3 мкг/мл 0,3 мкг/мл 0 0,15 7,5

Проросшие 90 100 96 92 100 92

С длиной корешка 1,5 длины зерна 80 98 95 80 97 90

С листочками 20 1 5 32 2 6

Влияние АОБ на ферментативные процессы в ячмене. Определение активности фермента пероксидазы в зерне, обработанном АОБ, подтвердило стимуляцию метаболических процессов (рис. 9). После внесения в замочную воду С7- и С12-АОБ (3 и 0,3 мкг/мл, соответственно) активность пероксидазы в опытных образцах составила 185 и 175 ед/мин против 112 ед/мин в контрольных. Активность пероксидазы в зерне, обработанном препаратом Сидовит (0,15 и 7,5 мкг/мл), также оказалась выше контрольной на 120 и 80 %, соответственно.

При повторной (через 4 сут) обработке ячменя С7- или С12-АОБ (50 и 3 мкг/мл, соответственно) (рис. 9) или препаратом Сидовит (250 мкг/мл) как активность ферментов, так и рост вегетативных органов в зерне ингибировались. Сочетание приемов стимуляции прорастания ячменя с последующим ингибированием ростовых процессов эффективно в технологии солодоращения для сокращения сроков получения солода и повышения в нем экстрактивных веществ.

Время, сут

Рис. 9. Влияние АОБ на активность пероксидазы ячменя: 1 - контроль; 2-3 мкг/мл С7-АОБ; 3 - 0,3 мкг/мл С12-АОБ; 4 - внесение через 4 сут 50 мкг/мл С7-АОБ; 5 - внесение через 4 сут 3 мкг/мл С12-АОБ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Обобщенный анализ результатов настоящего исследования демонстрирует роль АОБ в стабилизации и модуляции активности как простых, так и сложных ферментных белков. Варьируя параметры процесса модификации биополимеров: структуру гомологов АОБ, их концентрации, время взаимодействия с белком - можно направленно регулировать эффективность ферментативных реакций. Продемонстрированная схожесть в действии АОБ на простые и сложные белки предполагает универсальность их регуляторной функции в биологических системах. Изменение каталитической активности белков в их комплексах с АОБ коррелирует с изменением физико-химических свойств биополимеров. Результаты ДСМК свидетельствуют как о дестабилизации нативной конформации лизоцима С7-АОБ, так и о его предпочтительном взаимодействии с денатурированной формой белка и повышении гидрофобной гидратации глобулы, образовании множественных водородных связей, что может быть объяснением, как повышения каталитической активности, так и функциональной стабильности ферментного белка. Понижение избыточной энергии денатурации модифицированного лизоцима отражает увеличение свободного объема и конформационной подвижности фрагментов макромолекулы, что не только способствует повышению активности фермента, но и приводит к увеличению доступности для неспецифического субстрата дополнительных участков в районе активного центра фермента. Эта новая модификационная функция АОБ важна для объяснения их адаптогенного действия, а также эффективного решения ряда биотехнологических задач. Увеличение скачка теплоемкости между нативным и денатурированным состояниями лизоцима в присутствии С7-АОБ свидетельствует о повышении гидрофобной гидратации белка в присутствии С7-АОБ и объясняет его большее сродство к воде, согласно полученным ранее данным [Крупянский с соавт., 2011].

Описанные модификационные эффекты АОБ объясняют их широкие адаптационные возможности для защиты микро- и макроорганизмов от стрессорных воздействий. В

области биотехнологии использование АОБ перспективно для повышения эффективности производств, основанных на использовании ферментных препаратов или направленной регуляции энзиматических процессов в живых организмах.

ВЫВОДЫ

1. Показана способность химических аналогов микробных ауторегуляторов -алкилоксибензолов, изменять конформацию как простых, так и сложных ферментных белков, что обусловливает изменение их каталитической активности и повышение операционной и функциональной стабильности.

2. Модифицирущее действие АОБ зависит от природы ферментного белка: если модуляция каталитической активности простых белков, в основном, определяется структурой и концентрацией АОБ, то сложных белков - временем воздействия АОБ при сравнительно узком диапазоне их эффективных концентраций.

3. Следствием изменения конформации модифицированных АОБ ферментов является расширение спектра используемых субстратов. При этом как для простых, так и для сложных ферментных белков модифицирующие эффекты (изменение активности) более выражены в отношении «низкокатализируемых» субстратов.

4. Кинетические параметры реакций, катализируемых модифицированными АОБ ферментами, позволили отнести С7-АОБ к активаторам неконкурентного типа, а С12-АОБ - к ингибиторам смешанного типа.

5. Физико-химическими методами (ДСМК) показано понижение конформационной стабильности и снижение избыточной энергии денатурации модифицированного С7-АОБ белка (лизоцима), что объясняет повышение его активности и снижение субстратной специфичности.

6. Установлено, что взаимодействия С7-АОБ с ферментным белком (лизоцимом) приводят к образованию новых водородных связей и повышению его гидрофобной гидратации, что возможно является причиной повышения функциональной стабильности белка.

7. Применение АОБ позволяет регулировать эффективность действия ферментов в составе живых организмов.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Петровский A.C., Дерябин Д.Г., Лойко Н.Г., Михайленко H.A., Кобзева Т.Г., Канаев П.А., Николаев Ю.А., Крупянский Ю.Ф., Козлова А.Н., Эль-Регистан Г.И. Регуляция алкилоксибензолами функциональной активности лизоцима // Микробиология. 2009. Т. 78. № 2. С. 176-185.

2. Plashchina I.G., Zhuravleva I.L., Martirosova E.I., Petrovskii A.S., Loiko N.G., Nikolaev Yu.A., El'-Registan G.I. Effect of Methylresorcinol on the Catalytic Activity and Thermostability of Hen Egg White Lyzozyme. In Biotechnology, Biodegradation, Water and Foodstuffs. Nova Science Publishers. N.-Y. 2009. P. 45-57.

3. Martirosova E.I., Plashchina I.G., Zhuravleva I.L., Petrovskii A.S., Loiko N.G., EI'-egistan G.I. Effect of Methylresorcinol on the Catalytic Activity and Thermostability of Hen gg White Lysozyme depending on the storage time. In Biotechnology in Medicine, Foodstuffs, iocatalysis, Environment and Biogeotechnology. Nova Science Publishers. N.-Y. 2010. P. 877.

4. Мартиросова Е.И., Журавлева И.Л., Плащина И.Г., Петровский А.С., Лойко Н.Г., ль-Регистан Г.И. Регулирование каталитической активности и функциональности язоцима куриного яйца с использованием алкилоксибензолов // Вестник Московского [шверситета. Серия 2. Химия. 2010. Т. 51. № 3. С. 203-208.

5. Плащина И. Г., Журавлева И.Л., Петровский А.С., Лойко Н.Г., Николаев Ю.А., рупянский Ю.Ф., Эль-Регистан Г.И. Эффект метилрезорцина на ферментативную сгивность и конформационную стабильность лизоцима куриного яйца // Московская еждународная научно-практическая конференция «Биотехнология. Вода и пищевые родукты». Москва. 2008. С. 238-239.

6. Плащина И.Г., Мартиросова Е.И., Журавлева И.Л., Петровский А.С., Лойко Н.Г., ль-Регистан Г.И. Влияние времени инкубирования смеси лизоцима и метилрезорцина на ерментативную активность и конформационную стабильность лизоцима куриного яйца // -ый Международный Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». 1осква. 2009. С. 119-120.

7. E.I. Martirosova, I.L. Zhuravleva, I.G. Plashchina, N.G. Loiko, A.S. Petrovskii, G.I. El-egistan Controlling of the catalytic activity and functionality of hen egg white lysozyme by Ikylhydroxybenzenes. International Conference «Biocatalysis-2009». June 19-24 2009. P. 12223.

8. Петровский A.C., Мартиросова Е.И. Изучение роли метилрезорцина в изменении габильности и активности ферментных белков // Международная конференция студентов, :пирантов и молодых ученых «Ломоносов». Москва. 2009. С. 59-60.

9. Лойко Н.Г., Мулюкин А.Л., Нейматов А.Л., Кряжевских Н.А., Петровский А.С., олсторожих А.Н. Структурно-пространственная организация клеток различного уровня етаболической активности // X Юбилейная Международная научно-техническая онференция «Оптические методы исследования потоков». М.: Издательский дом МЭИ. 009. С. 382-385.

10. Петровский А.С., Лойко Н.Г., Шаненко Е.Ф., Крупянский Ю.Ф., Эль-Регистан '.И. Влияние окисленных фенольных антиоксидантов на активность, субстратную пецифичность и функциональную стабильность фермента пероксидазы // VIII 1еждународная конференция «Биоантиоксидант». Москва. 2010. С. 365-366.

Автор выражает искреннюю признательность за ценные консультации, оказанное нимание и помощь в работе к.б.н. Н.Г. Лойко, сотрудникам лаборатории классификации и ранения уникальных микроорганизмов (Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского АН), к.х.н. И.Г. Плащиной, к.б.н. Е.И. Мартиросовой (Институт биохимической физики м. Н.М. Эмануэля РАН), д.ф.н. Ю.Ф. Крупянскому (Институт химической физики им. I.H. Семенова РАН).

Подписано в печать 17.04.2012 г.

Формат 60x90/16. Заказ 1550. Тираж 100 экз. Усл.-печ. л. 1,0. Печать офсетная. Бумага для множительных аппаратов. Отпечатано в ООО "ФЭД+", Москва, Ленинский пр. 42, тел. 774-26-96

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Петровский, Арсений Сергеевич, Москва

61 12-3/907

Российский химико-технологический университет имени Д. И. Менделеева

На правах рукописи

Петровский Арсений Сергеевич

Структурная модификация ферментных белков для изменения эффективности катализируемых реакций

03.01.06 - Биотехнология (в т.ч. бионанотехнологии)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологический наук, профессор Г.И. Эль-Регистан

Москва -2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..........................................................................................................4

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................8

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..................................60

2.1. Объекты исследования.............................................................................60

2.2. Биохимические методы анализа..............................................................60

2.3. Физико-химические методы анализа.......................................................65

2.4. Обработка растений препаратами на основе АОБ..................................68

2.5. Статистическая обработка экспериментальных данных........................69

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ............................................70

3.1. РЕГУЛЯЦИЯ АЛКИЛОКСИБЕНЗОЛАМИ КАТАЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ И ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ СТАБИЛЬНОСТИ ПРОСТЫХ МОНОСУБЪЕДИНИЧНЫХ ФЕРМЕНТОВ..................................................70

3.1.1. Влияние АОБ на функциональную активность лизоцима в отношении специфического субстрата........................................................70

3.1.2. Влияние АОБ на функциональную активность лизоцима в отношении неспецифического субстрата....................................................72

3.1.3. Влияние АОБ на ферментативную активность лизоцима при модификации субстрата...............................................................................76

3.1.4. Определение кинетических параметров гидролиза субстратов модифицированным АОБ лизоцимом.........................................................80

3.1.5. Влияние АОБ на устойчивость лизоцима к денатурирующим воздействиям.................................................................................................82

3.1.6. Влияние АОБ на каталитическую активность ДНКазы....................85

3.1.7. Влияние АОБ на устойчивость ДНКазы к денатурирующим воздействиям.................................................................................................89

3.1.8. Обсуждение......................................................................................... 90

3.2. РЕГУЛЯЦИЯ АЖИЛОКСИБЕНЗОЛАМИ КАТАЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ И ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ СТАБИЛЬНОСТИ СЛОЖНЫХ ФЕРМЕНТНЫХ БЕЛКОВ..............................................................................93

3.2.1. Влияние АОБ на каталитическую активность пероксидазы............93

3.2.3. Влияние АОБ на устойчивость пероксидазы к денатурирующим воздействиям...............................................................................................101

3.2.4. Определение кинетических параметров реакции окисления о-дианизидина пероксидазой, модифицированной АОБ.............................102

3.2.5. Обсуждение.......................................................................................105

3.3. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ АОБ.......................107

3.4 БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПРИМЕНЕНИЯ АОБ..........124

3.4.1 Изменение субстратной специфичности лизоцима........................124

3.4.2. Поддержание активности фермента ДНКазы при хранении в водных растворах........................................................................................125

3.4.3. Регуляция процессов солодоращения.............................................127

3.4.4. Обсуждение.......................................................................................131

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.............................................................................................134

ВЫВОДЫ.......................................................................................................136

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................................137

ВВЕДЕНИЕ

представляет выяснение возможности использования АОБ для регуляции активности ферментных систем в живых организмах.

Задачи исследования

1. Изучить влияние различных изомеров и гомологов АОБ на функциональные характеристики сложных ферментных белков (пероксидазы): активность, функциональную и операционную стабильность, субстратную специфичность.

2. Провести сравнительный анализ изменений функциональных характеристик простых (лизоцима) и сложных (пероксидазы) ферментных белков, модифицированных различными гомологами и изомерами АОБ.

3. Изучить молекулярные механизмы действия АОБ как модификаторов структуры биополимеров, обусловливающих изменения характеристик ферментных белков и эффективности ферментативных реакций.

4. Разработать приемы применения АОБ для регуляции каталитической активности и стабилизации ферментных белков в составе ферментных препаратов и живых организмов.

Научная новизна

1. В опытах in vitro доказана способность различных гомологов АОБ модифицировать структуру сложных ферментных белков (пероксидазы), что приводит к изменению их каталитической активности и повышению устойчивости к денатурирующим воздействиям.

2. Впервые получена информация о влиянии пространственной организации ферментного белка на модифицирующие эффекты АОБ. Для простых моносубъединичных белков (лизоцима) решающую роль в их

модификации играют структура АОБ и его концентрация, тогда как взаимодействие АОБ со сложными белками отличается: отсутствием зависимости модифицирующих эффектов от структуры АОБ; сужением диапазона действующих концентраций АОБ; влиянием на результативность модификации фермента времени его взаимодействия с АОБ (прединкубации).

3. Обнаружено, что модификация как простых, так и сложных ферментных белков с помощью АОБ приводит к снижению их субстратной специфичности, что обусловливает расширение спектра катализируемых субстратов.

4. На основании сравнения модифицирующих эффектов 10 гомологов и изомеров АОБ показано, что преимущественное влияние на вектор изменения (стимуляция-ингибирование) каталитической активности ферментов оказывают длина гидрофобного радикала и наличие заместителя во втором положении.

5. Методами молекулярной динамики белка и сканирующей микрокалориметрии установлено, что в результате воздействия одного из гомологов (С7-АОБ) на ферментный белок (лизоцим) повышается гидрофобная гидратация молекулы и понижается избыточная свободная энергии её денатурации, вследствие чего снижается конформационная стабильность белка и повышается его ферментативная активность.

Практическая ценность работы

1. Приемы стабилизации и направленной модуляции каталитической активности простых и сложных ферментов с помощью АОБ должны учитывать зависимость выбора стабилизатора от свойств белка, концентрацию АОБ и время взаимодействия (прединкубации) АОБ с белком.

2. Модификация лизоцима АОБ приводит к увеличению его активности в отношении дрожжевых и грибных клеток, что может быть использовано в медицинской практике.

3. Предложены приемы регуляции каталитической активности ферментов в составе живых организмов. Контроль процесса солодоращения осуществляется внесением в замочную воду добавок АОБ, действие которых обусловливает деконтаминацию зерна от фитопатогенной микрофлоры и изменение активности гидролитических и окислительных процессов в зерне, что обеспечивает сокращение сроков солодоращения и повышение в солоде экстрактивных веществ.

Апробация работы

Результаты работы докладывались на Международной научно-практической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты» (Москва, 2008); 5-ом Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009); XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2009); X Юбилейной Международной научно-технической конференции «Оптические методы исследования потоков» (Москва, 2009), VIII Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2010).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 10 работ, из них 4 статьи и 6 тезисов.

Структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 160 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы, включающего 235 публикаций отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 9 таблицами и 35 рисунками.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В современном мире бурное развитие биотехнологии и научные открытия в области энзимологии сделали ферментные препараты одними из самых активных участников многих промышленных производств. Ферменты как биокатализаторы обладают рядом уникальных свойств, таких как высокая каталитическая активность и избирательность действия, что позволяет значительно ускорять технологические процессы, увеличивать выход готовой продукции, повышать ее качество при экономии сырья и энергозатрат.

В связи с ростом применения ферментных препаратов расширяется фронт инноваций, в таких областях как:

- модификация свойств промышленных ферментов с целью повышения их активности и удешевления целевых продуктов;

- скрининг новых микроорганизмов - продуцентов ферментов;

- получение новых рекомбинантных ферментов с заданными свойствами;

- разработка нанотехнологий с использованием ферментов.

Однако перечисленные возможности получения новых ферментных

препаратов не снимают целый ряд проблем, возникающих при их использовании. Одной из них является быстрая потеря функциональной активности и стабильности ферментов под воздействием различных факторов [Тигко§1и et а1., 2012, Тгойшоу е1 а1., 2012]. Изучение возможностей стабилизации и длительного сохранения активности ферментных белков имеет фундаментальное значение для современной энзимологии, микробиологии, биоорганической химии и биотехнологии. В связи с этим в обзоре литературы мы проанализировали информацию как последних лет, так и более раннюю, являющуюся основой современных разработок в области стабилизации ферментных белков.

1. Современные методы стабилизации ферментов

К определению типов стабильности подходят с различных позиций чаще всего под стабильностью понимают сохранение основных свойств ферментных белков:

• сохранение каталитической активности в условиях, отличных от стандартных (операционная стабильность);

• длительное сохранение активности при хранении фермента в определенных условиях;

• сохранение активности фермента после денатурирующих воздействий (функциональная стабильность).

Другое понимание стабильности основано на характеристике свойств функционирующей системы. Здесь выделяют такие параметры системы как температура плавления белковой глобулы, температура денатурации и др. и учитывают состав реакционной среды, присутствие в системе органических растворителей, денатурирующих агентов, детергентов и др.

Современные методы стабилизации ферментов позволяют: увеличивать устойчивость ферментов к действию различных химических реагентов и ингибиторов, рН и температурным воздействиям; изменять рН оптимум ферментов, их субстратную специфичность и связывающие свойства; регулировать предпочтения определенных металлов-кофакторов и каталитические свойства ферментов.

Существует несколько основных подходов для повышения стабильности ферментов:

• химическая модификация ферментной структуры;

• физико-химическая модификация ферментной структуры;

• иммобилизация на твердых носителях;

• приемы белковой инженерии;

• использование стабилизирующих добавок.

1.1. Химическая модификация белковой молекулы

Стабилизация за счет химической модификации белковой молекулы -наиболее известный вид модификации ферментов. Химически модифицированные ферменты применяют в условиях неполярной (не водной) среды.

До недавнего времени использование ферментов в неводной среде было ограничено из-за их низкой активности. Однако огромный технологический потенциал подобного использования ферментов послужил мощной движущей силой для исследований и развития этой области биокатализа [Wang, Chen, 2009, Klibanov, 1997]. Поскольку присутствие воды рассматривается как причина повышения внутримолекулярной динамики белка [Mozhaev, 1993], то её частичное замещение должно увеличивать стабильность биокатализатора [Bell et al, 1995].

Происходящее при этом снижение активности воды в реакционной системе существенно изменяет свойства ферментных белков: они приобретают способность катализировать обратные реакции, не протекающие в водной среде (для гидролаз - синтез пептидов, алифатических амидов и др.); образуются оптически активные продукты; повышается термостабильность фермента и его стабильность при хранении; ферменты проявляют активность в органических растворителях при температуре выше 100°С.

Способ химической модификации использовался для стабилизации таких ферментов, как липаза [Rahman et al., 2010], трипсин [Werkman et al, 2005], субтилизин [Bansal et al, 2010], полифенолоксидаза [Khan et al., 2005], глюкоамилаза [Bhatti et al., 2007], папаин [Szabo et al., 2009], хлоропероксидаза [Liu et al, 2007].

С учетом многообразия реагентов и приемов, которые могут быть использованы для целей химической модификации белков, данный подход следует признать одним из перспективных [Тяги, Гупта, 1998].

1.2. Физико-химическая модификация белковой молекулы

С помощью физико-химических методов модификации можно изменять силы электростатических и гидрофобных взаимодействий, количество водородных связей в молекулах белков. При модификации широко используемого для изомеризации глюкозы во фруктозу фермента ксилозоизомераза происходит увеличение его термостабильности, снижение значения pH оптимума, изменение предпочтения активирующего катиона металла, изменение субстратной специфичности от ксилозы к глюкозе [Mrabet et al., 1992, Quax et al., 1991].

Увеличение стабильности также достигается с помощью введения гидрофильных групп в поверхность молекулы фермента, что позволяет уменьшить контакт гидрофобных областей с водой, в связи с чем, предотвращается неправильный рефолдинг при обратимой денатурации [Mozhaev, 1993; O'Brien, 2003; Fernandez et al., 2005; Schwarz et al, 2007; Gote et al., 2007].

Механизмы физико-химической стабилизации белков включают следующие приемы:

• поперечное связывание аминокислотных цепей бифункциональными реагентами;

• усиление гидрофобных взаимодействий неполярными реагентами;

• введение новых полярных или заряженных групп, приводящих к увеличению количества ионных или водородных связей;

• гидрофилизация поверхности белка.

К этому списку может быть добавлено связывание белка с полисахаридами и полиэтиленгликолем.

1.3. Иммобилизация

Прием иммобилизации - традиционный метод стабилизации, успешно применяемый в химии белка и биотехнологии [Zhang et al, 2010, Kim et al., 2010, Adham et al., 2010].

Иммобилизованные ферментные препараты обладают рядом существенных преимуществ при использовании в прикладных (промышленных) целях по сравнению с чистыми препаратами. Гетерогенный (иммобилизованный) катализатор легко отделить от реакционной среды [Лг^сЬап^ е1 а1., 2006], что обус

Информация о работе

Петровский, Арсений Сергеевич
кандидата биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.01.06

Диссертация

Структурная модификация ферментных белков для изменения эффективности катализируемых реакций - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы