Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Окислительная модификация белков и активность протеаз, их расщепляющих, в тканях грызунов разного возраста

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Окислительная модификация белков и активность протеаз, их расщепляющих, в тканях грызунов разного возраста"

РГб од

2 ^ ММ Им

На правах рукописи

ПЛЕШАКОВА ОЛЬГА ВИКТОРОВНА

ОКИСЛИТЕЛЬНАЯ МОДИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ И АКТИВНОСТЬ ПРОТЕАЗ, ИХ РАСЩЕПЛЯЮЩИХ, В ТКАНЯХ ГРЫЗУНОВ РАЗНОГО ВОЗРАСТА

03.00.04 биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино- 1999

Работа выполнена в филиале Института биоорганической химии РАН и Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН.

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Газиев А.И. кандидат биологических наук Садовников В.Б.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Новоселова Е.Г. доктор химических наук Брусков В.И.

Ведущая организация: Институт биохимической физики РАН, г. Москва.

Защита состоится 1999 п в^^час. на заседании диссертационного

совета Д 200.23.01 при Институте биофизики клетки РАН, по адресу: 142292, Московская обл., г. Пущино, ул. Институтская, 3. ИБК РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики клетки РАН.

Автореферат разослан 1999 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 200.23.01 кандидат биологических наук

молихина Т.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Геронтологические исследования являются приоритетным направлением современной биологин и медицины. Согласно свободно-радикальной теории старения, старение организмов и связанные с ним болезни обусловлены накоплением повреждений в важнейших клеточных макромолекулах свободными радикалами, образующимся в целом ряде биохимических процессов (главным образом, в митохондриях) или под действием внешних факторов (радиация, ксенобиотики и др.) (Harman, 1994; Beckman and Ames, 1998). В отличие от липидов и ДНК, окислению которых посвящается большинство публикуемых в настоящее время работ, свободно-радикальное повреждение белков гораздо менее изучено, хотя описан целый ряд модификаций аминокислотных остатков (Stadtman, 1995; Dean et al., 1997). Вместе с тем, накопление окислительных повреждений в белках может сильно и достаточно быстро нарушить клеточный метаболизм, поскольку, как показывают эксперименты in vitro, окисление нарушает структуру и конформацию белковой молекулы, ее электрический заряд, гидрофобность и связывание лигандов, а также, в случае ферментов, снижает их активность (Fucci et al., 1983; Giulivi et al., 1994). Показано, что содержите окисленных белков в клетках животных повышается с возрастом, при различных патологиях и в условиях модельного окислительного стресса (Oliver et al., 1987; Starke-Reed and Oliver, 1989; Sohal et al„ 1993). Однако, корреляция между уровнем окислительных повреждении в белках и изменением их свойств при старении или окислительном стрессе in vivo изучена недостаточно. Чувствительность белков к окислительной модификации может различаться (Aganval and Sohal, 1995; Cabiscol and Levine, 1995; Yan et al., 1997). Выявление предпочтительных мишеней для свободных радикалов в клетке необходимо для понимания механизмов нарушения ее метаболизма при старении.

Одной из причин цакоштеш«! окисленных белков в тканях старых животных может быть снижешге активности протеаз, их расщепляющих. Однако, литературные данные весьма противоречивы: показано как снижеш1е протеолитической активности (Starke-Reed and Oliver, 1989), так и отсутствие ее изменений в тканях животных с возрастом (Sahakian et al., 1995), что указывает па необходимость дальнейшего изучения данного вопроса.

Значительный интерес представляет поиск и идентификация протеаз, специфичных к окисленным белкам, особенно, способных избирательно расщеплять собственные белки' организма; высвобождающиеся из гибнущих клеток при патологических состояниях (например, воспаление) и, таким образом, предотвращать развитие аутоиммунного "ответа (гипотеза "рестрикционных" протеаз (Lefkovits, 1986)). Изучение изменешы активности таких протеаз с возрастом может пролить свет на некоторые аспекты нарушения иммунологической толерантности и

повышения аутореактивности при старении.

Цель it задачи исследования

Целью настоящего исследования явилось изучение накопления окислительных повреждений белков в тканях лабораторных грызунов разного возраста, а также под действием окислительного стресса, вызванного у-облучением животных, выявление корреляции между окислительным повреждением белков и изменением их свойств in vivo, а также изучение изменения активности протеаз, расщепляющих окисленные белки, с возрастом.

В этой связи были поставлены следующие задачи:

1. Сравнить чувствительность белков различных субклеточных фракций печени и селезенки крыс к окислительному повреждению (по уровню карбонильных групп) с возрастом и под действием у-радиации.

2. Изучить корреляцию между содержанием окисленных белков в тканях и изменением их свойств (антигенности и доступности для протеолиза) in vivo.

3. Исследовать возможность предотвращения накопления окисленных белков и изменения их свойств в тканях 7-облученных животных диетическими антиоксидангами и витаминами.

4. Исследовать возможность пострадиационной активации протеаз в субклеточных фракциях тканей грызунов.

5. Изучить роль нейгрофилов как предполагаемых источников "рестрикционных" протеаз: исследовать их специфичность по отношению к различным белковым субстратам, в том числе, к окисленным in vitro и выделенным из старых животных.

6. Изучить изменение функциональной активности нейгрофилов (способности к активации "респираторного" взрыва и активности протеаз) с возрастом.

Научная новшиа ч практическая ценность работы

Проведешшю исследования впервые продемонстрировали различную чувствительность субклеточных фракции к окислительному повреждению при старении и под действием 7-радиации. Показана возможность предотвращения окислительного повреждения белков под действием у-облучения введением дополнительных количеств шптюксидалтов и витаминов в диету. Продемонстрирована пострадиационная активация протеаз в субклеточных фракциях тканей грызунов. Полученные данные могут быть использованы для разработки подходов к предотвращению накопления окисленных белков при старении v различных патологиях. Впервые исследовано расщепление различных субстратог протеазами нейгрофилов и показано, что они гораздо более эффективно расщепляют белки из близкородственных видов, что не противоречит гипотезе "рестрикционных' протеаз, а также проявляют специфичность по отношению к белкам модифицированным в системе металл-катализируемого окисления. На основанш полученных экспериментальных данных впервые предложено объяснение причт

нарушения иммунологической толерантности с возрастом с позиций свободно-радикальной теории старения и гипотезы "рестрикционных протеаз".

Апробация

Материалы диссертации докладывались на Ш и IV чтениях, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва - Пущгаю, 1996 и 1998), конференции Геронтологического общества "Старение и долголетие: системный и междисциплинарный подходы" (Москва, 1997), I Международном симпозиуме "Фундаментальные науки и альтернативная медицина" (Пущино, 1997), Третьем съезде по радиационным исследованиям (Москва, 1997), IV Международной конференции и дискуссионном научном клубе "Новые информационные технологии в медицине и технологии" (Украина, Ялта - Гурзуф, 1998), Ш Пущипской конференции молодых ученых (Пущино, 1998), на заседании научного коллоквиума ФИБХ РАН (1998) и научного семинара ИБК РАН (1999).

Публикации

По материалам диссертации опубликованы 3 статьи и ряд тезисов.

Структура и объем диссертации

Диссертация включает в себя введение, обзор литературы по данной теме (го трех глав), описание материалов и методов, результаты исследования и их обсуждение, выводы и список литературы, содержащий 339 наименований. Работа изложена на 135 стр. машинописного текста и содержит 18 рисунков и 6 таблиц.

Список сокращений

ABC - смесь антиоксидантов и витаминов; АФ - адьювант Фрейнда; АФК -активные формы кислорода; 2,4-ДНФГ - 2,4-дишпрофеш1Лгидразин; НСТ -нитросиний тетразолиевый; ПОЛ - перекисное окисление липидов; РБП -растворимые белки печени; FITC - флуоресцеин изотаоцианаг, HSA - человеческий сывороточный альбумин; OVA - овальбумин; РМА - форболмиристатацетат.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

В работе использовали крыс линии Wistar (самцы 4 и 26 мес.) и мышей линий NMRI и С57В1 (самцы 3-22 мес.).

Крысы (3 мес.) получали стандартный корм или корм с добавками антиоксидантной и витаминной смеси (ABC) (витамины С, Е, В-каротии, рутин) в течение 1 мес. Животных подвергали у-облучению в дозе 10 Гр (мощность дозы - 2.3 Гр/мин) на установке ГУБЭ (б0Со) и определяли содержание карбонильных групп, чувствительность к действию протеаз и антигенные свойства белков.

Для изучения антигенных свойств белков печени крыс, мышей NMRI иммунизировали этими белками в АФ. Антитела к белкам крыс в сыворотке крови

мышей тестировали стандартным иммуноферменгным методом.

Субклеточные фракции из органов грызунов выделяли методом дифференциального центрифугирования (Bimie, 1972). Общий белок из митохондрий и ядер экстрагировали 10 мМ трис-HCl буфером (pH 7.2), содержащим 0.5% NIM0, а также, в случае ядер, 2 M NaCl и 1.5 мМ MgCl2, в присутствии ЭДТА, дитиотреитола и ингибиторов протеаз при 4°С. ДНК из экстрактов удаляли с помощью 1% стрептомицин сульфата (Oxenburgh and Snoswell, 1965). Суммарные гистоны экстрагировали из ядер 0,4 N H2SO4 (Bonner et al., 1968). Активность протеаз, ассоциированных с гистонами, определяли, инкубируя препараты гистонов в трис-HCl буфере (pH 8.0) при 37°С в отсутствие или в присутствии денатурированной ДНК (Gaziev and Kutsyi, 1992). После инкубации гистоны подвергали электрофорезу в 15% ПААГ (Laemmli, 1970).

Нейтрофилы выделяли из перитонеальной полости мышей по стандартной методике через 6 часов после в/б инъекции зимозана; продукцию 02~* этими клетками оценивали по восстановлению HCT (ODj)5) (Сухарев и др., 1995). Лизаты нейтрофилов получали в фосфатном буфере, содержащем 0.1% тритон Х-100. Супернатанты нейтрофилов, содержащие ферменты, освобождающиеся при дегрануляции, получали после их инкубации с РМА.

Протеолитическую активность в субклеточных фракциях печени и селезенки и лизатах нейтрофилов определяли флуориметрическими методами: по реакции с о-фталевым альдегидом и с использованием FlTC-меченных белков (Twinning, 1984).

Для изучения протеолитической активности нейтрофилов в качестве субстратов использовали также белковые экстракты клеток К562 или дрожжей (Saccharomyces carlsbergensis, штамм ИБФМ-366), метаболически радиоактивно меченные [35S]-метионином, которые инкубировали различное время при 37°С с суспензией нейтрофилов в присутствии РМА (для индукции "респираторного взрыва" и дегрануляции этих клеток). Нейтрофилы удаляли центрифугированием. Супернатанты лиофилизировали и передавали в Базельский институт иммунологии, где их анализировали методом двумерного электрофореза (O'Farrell, 1975). Радиоавтографы гелей сканировали на денситометре и анализировали с использованием компьютерной программы KEPLER 8.0.

Белки окисляли in vitro в системе аскорбат + Fe3+ (Levine, 1984). Модифицированные и исходные белки метили FITC по (Twinning, 1984).

Окислительные повреждения в белках измеряли двумя методами: спектрофотометрически по содержанию карбонильных групп (реакция с 2,4-ДНФГ) (Levine et al., 1990) и по снижению флуоресценции триптофана при 350 нм (возбуждение - 275 нм) (Wolff and Dean, 1986).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием стандартного r-теста Стыодента.

Результаты и обсуждение

1. Окислительная модификация и изменение свойств белков в тканях крыс при старении и окислительном стрессе in vivo, вызванном у-облучением. Влияние диетических антиоксидантов и витаминов на накопление окисленных белков в тканях у-облученных животных.

Одним из широко используемых маркеров окислительного повреждения белков является уровень карбонильных групп в них; это комплексный параметр, отражающий как непосредственное повреждение аминокислотных остатков свободными радикалами кислорода, так и, в меньшей степени, их модификацию продуктами ПОЛ и редуцирующими сахарами (Stadtman, 1995). Мы впервые сравнили чувствительность белков различных субклеточных фракций двух органов крыс к накоплению карбонильных групп при старении и модельном окислительном стрессе in vivo, вызванном у-облучением животных.

В табл. 1 показано содержание карбонильных групп в белках митохондрий, ядер и цитоплазмы печени и селезенки молодых (4 мес) и старых (26 мес) крыс Wistar. Уровни белковых карбонилов во всех субклеточных фракциях достоверно выше у старых крыс (группа 4), чем у молодых (группа 1). В обоих органах, относительный прирост карбонильных групп в митохондриях старых животных над молодыми (на 79 и 82% в селезенке и печени, соответственно) был выше прироста карбонильных групп в цитоплазме (на 41 и 67% в селезенке и печени, соответственно), что указывает на высокую чувствительность этих органелл к окислительному повреждению. Действительно, митохондрии являются основным источником оксидантов в клетке и поэтому, очевидно, их "первичной" мишенью. Содержание белковых карбонилов в ядрах печени старых животных превышало таковое у молодых на 90%, в то время как в селезенке оно повышалось всего лишь на 15%. Т.е. в селезенке наиболее чувствительной фракцией к окислительной модификации с возрастом оказались белки митохондрий и наименее чувствительной - ядер, а в печени эта чувствительность снижалась в ряду ядра > митохондрии > цитоплазма.

Особый интерес представляла оценка уровня окислительного повреждения в белках ядер старых животных, поскольку литературные дшшые ограничены демонстрацией возрастания содержания гликатированных гистонов у крыс с экспериментальным диабетом (Guglucci and Bendayan, 1995). Даже у молодых крыс ядерные фракции белков печени и селезенки содержат гораздо больше карбонильных групп, чем митохондрии и цитоплазма (табл. 1), что, вероятнее всего, объясняется интенсивной модификацией лизиновых и аргининовых остатков в гистонах, которые, как известно, составляют основную часть ядерных белков.

у-Облучение молодых (4 мес) крыс в дозе 10 Гр (группа 2) вызывало возрастание содержания карбонильных групп в митохондриях и цитоплазме печени и селезенки, причем до уровней, достоверно более высоких, чем у старых животных (табл. 1).

Табл. 1. Содержание белковых карбонилов в субклеточных фракциях печени и селезенки у-облученных и старых крыс (нмоль ДНФГ/мг белка)

Группа Печень Селезенка

крыс цит мх ядра цит мх ядра

1 2.29 ± 0.62 2.51 ±0.42 5.22 ± 0.49 3.19 ±0.49 2.76 ±0.81 12.48 ± 1.63

2 5.29 ± 1.83 5.44 ± 0.77 5.28 ± 0.94 7.63 ± 1.78 5.60 ±1.52 9.22 ± 2.02

3 3.12 ±0.70 3.46 ± 0.46 5.71 ± 0.60 4.80 ± 1.33 3.29 ±0.64 11.86+ 1.03

4 3.83 ±0.40 4.58 ±0.92 9.96 ±1.38 4.50 ±0.62 4.94 ±0.60 14.42 ± 1.81

1 - 4-месячные интактные крысы (контроль); 2 - 4-месячные крысы, у-облучение (10 Гр), забой через 2 час после облучения; 3 - 4-месячные крысы дополнительно получали ABC с диетой в течение 1 месяца перед у-облучением (10 Гр), забой через .2 час после облучения; 4 -26-месячные крысы.

цит - цитоплазматическая фракция; мх - митохондрии.

Этот факт, возможно, связан с тем, что свободные радикалы, образующиеся при действии у-радиации, вызывают в основном быстрое окисление ряда аминокислотных остатков и фрагментацию полипегтгидных цепей с образованием карбонильных производных (Stadtman, 1993). В то же время, спектр белковых модификаций, накапливающихся при старении, значительно шире: наряду с непосредственным окислением аминокислот, более важное значение приобретает постепенное накопление высокомолекулярных белковых агрегатов с многочисленными поперечными сшивками белковых молекул с участием продуктов ПОЛ и поздних стадий реакции Майяра - так называемых AGE-продуктов (advanced glycation end products), природа которых, вероятно, отличается от карбонильной (Njoroge and Monnier, 1989). Следует поэтому отметить, что, хотя ионизирующая радиация часто используется как модель старения, результата, полученные на облученных животных, можно экстраполировать на нормальное старение с учетом особенностей действия радиации.

Тот факт, что все субклеточные фракции селезенки старых и у-облученных крыс имели более высокое содержание белковых карбонилов, чем в печени (табл. 1), говорит о том, что этот орган более чувствителен к действию свободных радикалов. Окислительное повреждение этого лимфоидного органа может вносить вклад в нарушения иммунных функции с возрастом и под действием облучения (Tian et al., 1995).

Возрастание уровня окислительных повреждений в белках под действием

радиации могло бьггь обусловлено недостаточной активностью эндогенных антиоксидантов для защиты организма от резко возросшей концентрации свободных радикалов в тканях. Для проверки этого предположения, группа молодых крыс в течение 1 мес. перед облучением получала дополнительно смесь антиоксидантов и витаминов (ABC) с кормом. В данном эксперименте впервые показано (табл. 1), что дополнительное диетическое потребление ABC в течение 1 мес. перед облучением (группа 3) предотвращало возрастание содержания карбошшьных групп в митохондриальных и цигоплазматических белкач под действием у-радиации как в печени, так и в селезенке крыс. Ранее положительный эффект антиоксидантов на биохимическом уровне оценивали в основном по снижению окислительного повреждения липидов (Alleva et al., 1995; Douillet et al., 1998) и мутаций ДНК (Gaziev et al., 1995). Эти результаты, как и литературные данные, показывают, что организм нуждается в поступлении антиоксидантов извне для защиты от повреждения своих макромолекул в условиях окислительного стресса.

В литературе показана корреляция между накоплением карбонильных групп в белках с возрастом и снижением активности отдельных ферментов в тканях грызунов (Starke-Reed and Oliver, 1989; Carney and Carney, 1994). Мы изучили возможную связь между содержанием карбонильных групп и изменением других свойств (антигенности и чувствительности к протеолизу) in vivo для фракции растворимых (цигоплазматических) белков печени (РБП), выделенных из молодых у-облученных и старых крыс.

Табл. 2 показывает, что чувствительность к расщеплению эндогенными протеазами печени (аутолиз РБП) и доступность для действия экзогенной протеиназы К возрастали в препаратах РБП, полученных из старых (группа 4) и молодых облученных животных (группа 2); однако, эти показатели не коррелировали с содержанием карбонильных групп в РБП (табл. 1). Так, в то время как содержание белковых карбонилов возрастало у старых животных (группа 4) в 1.6 раза по сравнению с молодыми ингактными (группа 1 - контроль), скорость аутолиза их РБП увеличивалась более чем в 3 раза. Уровень карбонильных групп особенно сильно возрастал у у-облученных крыс (группа 2) (в 2.3 раза по отношению к контролю); однако, скорость аутолиза РБП этих животных увеличивалась лишь в 1.5 раза.

Для изучения изменения антигенных свойств белков с возрастом и при у-облучении in vivo, мышей групп I - IV иммунизировали РБП крыс групп 1 - 4 в АФ, соответственно. Мыши группы V служили контролем (вводили только АФ). В табл. 3 представлены результаты иммуноферментного анализа (OD49o при разведении сыворотки крови мышей 1 : 600). РБП крыс группы 1 практически не являются антигенами для мышей (нет достоверных различий между группами мышей I и V). Иммунизация мышей белками из облученных крыс (группа 2) вызывала у них иммунный ответ (величина OD490 для группы мышей П достоверно отличалась от

таковой для группы V). Однако, антигенность этих белков была только незначительно выше РБП группы 1. В то же время, белки из старых крыс (группа 4) являются сильными антигенами для мышей (группа IV).

Таким образом, основной вклад в возрастание чувствительности к протеолитической деградации и . ангигешюсти белков, очевидно, вносят окислительные модификации, отличные от образования карбонильных групп (у старых животных, вероятнее всего, продукты поздних стадий гликатирования). Тот факт, что включение ABC в диету предотвращало накоплешю карбонильных групп у облученных животных (группа 3), но не снижало чувствительность к протеолитической деградации (табл. 2) и антигешюсть (табл. 3) их РБП, свидетельствует в пользу этого предположения.

Табл. 2. Скорости расщепления РБП крыс эндогенными протеазами (аутолиз) и экзогенной протеазой (протеиназой К)

Группа крыс Аутолиз (нмоль глиц. экв./час) Р Расщепление протеиназой К (нмоль глиц. экв./час) Р

1 3.2 ±0.2 - 27.6 ± 6.8 -

2 4.8 ± 1.1 ns 44.9 ± 7.8 <0.01

3 5.0 ± 1.7 ns' 50.0 ±4.1 <0.01

4 11.3 ±4.0 <0.01 57.9 ± 8.2 <0.001

Обозначения групп крыс - см. табл. 1.

Уровни достоверности указаны по отношению к контролю (группа 1). ns = nonsignificant (статистически недостоверная разница)

Таил. 3. Антигенные свойства растворимых белков печени крысы

Группа мышей Антиген О Di» Р, Pv

I 1 0.333 ±0.147 - ns

II 2 0.490 ± 0.144 ns <0.05

III 3 0.572 ± 0.270 ns" <0.05

IV 4 1.220 ± 0.404 <0.01. <0.01

V - 0.205 ± 0.070 ns -

Колонка "Антиген" представляет номер группы крыс, из которых выделен препарат РБП для иммунизации мышей (см. подпись к табл. 1). OD490 показана для разведения сыворотки 1/600. Pi - уровень статистической достоверности по отношению к группе мышей I. Pv — уровень статистической достоверности по отношению к группе мышей V. ns = non-significant (статистически недостоверные отличия).

2. Активация протеаз в тканях грызунов под действием у-облучения и их участие в элиминацин окисленных белков

В поддержании низкого уровня окисленных белков в нормально функционирующей клетке участвуют протеолигаческие ферменты, которые элиминируют поврежденные молекулы и поэтому рассматриваются как вторичные антиоксидантные системы (Gruñe et al., 1997; Beckman and Ames, 1998). Изучение активности протеаз в тканях и ее изменения в условиях окислительного стресса важно для понимания кругооборота белков в организме.

Уровень белковых карбонилов в ядрах печени у-облученных крыс (группа 2) практически не отличался от контроля (группа 1), а в селезенке даже несколько снижался (табл. 1), что заставило нас предполагать эффективное удаление окисленных белков протеазами, присутствующими в ядрах. Поскольку основную массу белков ядер составляют гистоны, особенно чувствительные к окислительной модификации из-за высокого содержания лизина и аргинина в них, мы изучили присутствие и возможную пострадиационную активацию гистон-специфических протеаз у крыс.

Выделяли гистоны из селезенки молодых (4 мес) и старых (26 мес) животных через 2, 4 и 24 час после их у-облучения. При инкубации выделенных суммарных гистонов в течение 2 час при 37°С наблюдалась их деградация, что указывало на присутствие гистон-ассоциированных протеаз в образцах (рис. 1). Протеазная активность, ассоциированная с гистонами, была выше у старых крыс, чем у молодых, и значительно возрастала после облучения животных обоих возрастов (рис. 1). У молодых крыс наибольшая скорость деградации гистонов приходилась на 24 час после облучения. У старых животных максимальная активация гистон-специфических протеаз наблюдалась уже через 2 час после облучения.

Рис. 1. Пострадиационная активация гистон-ассоциированных протеаз в селезенке молодых (4-месячных) и старых (26-мссячных) крыс.

Протеолитаческую активность определяли по деградации суммарных гистонов. Абсцисса: (а) ядра выделяли из необлученных крыс; (Ь), (с), (d) ядра выделяли через 2, 4 и 24 час после у-облучения (10 Гр), соответственно. Ордината: процент деградировавших гистонов.

IUU -

75-

50-

25-

X

X

abed □ 4msc Q26NES

Анализ расщепления индивидуальных тисггонов в отсутствие и в присутствии денатурированной ДНК методом SDS-электрофореза показал присутствие двух типов гистон-ассоциированных протеаз в селезенке (первый - специфичный к коровым гистонам (Н2А, Н2В и, у старых животных, НЗ), второй, ДНК-активируемый, -специфичный к гистону HI), которые активируются под действием ионизирующей радиации и, вероятно, поэтому эффективно расщепляют окисленные белки в ядрах в пострадиационный период.

Пострадиационная активация протеаз была обнаружена нами также во всех субклеточных фракциях печени у-облученных (10 Гр) мышей С57В1, которая, очевидно, была ответственна за эффективную элиминацию окислительных повреждений белков в них в пострадиационный период (изучение динамики уровня карбонильных групп показало быстрое возрастание содержания окисленных белков сразу же после облучения; однако, уже через 24 час этот параметр возвращался к исходному значению во всех фракциях).

Наши эксперименты предполагают, что активация протеаз в тканях в условиях окислительного стресса является важным звеном защиты организма от накопления свободно-радикальных повреждений клеточных белков.

3. Нейтрофилы - источник протеаз, специфичных к окисленным белкам. Изменение функциональной активности нейтрофилов при старении

Как показали опыты с РБП крыс, белки, выделенные из старых и у-облученных животных обладают повышенными антигенными свойствами для мышей (табл. 3) и, следовательно, являются потенциальными аутоантигенами. При различных патологических состояниях (например, воспаление) клеточные белки могут повреждаться свободными радикалами, высвобождаться наружу из гибнущих клеток и, при контакте с клетками иммунной системы, вызывать аутоиммунный ответ. Поэтому поиск и идентификация протеаз, способных расщеплять собствешше белки организма до неиммуногенных фрагментов (гипотеза "рестршсционных" протеаз (Lefkovits, 1986)), и изучение их специфичности к окисленным белкам представляет значительный интерес. Поскольку нейтрофилы являются основным участником воспалительных реакций в организме и, с одной стороны, производят значительные количества АФК при активации, а, с другой стороны, обладают целым набором протеолитических ферментов, мы предложили эти клетки на роль источников таких протеаз и впервые исследовали расщепление различных белковых субстратов протеазами этих клеток.

Радиоактивно меченные клеточные белки из эволюционно отдаленных видов (дрожжей и млекопитающих - человеческой миелогенной лейкемии К562) инкубировали с активированными нейтрофилами. Расщепление белков анализировали методом двумерного электрофореза В нулевой момент времени белковый профиль К562 содержал 619 пятен (рис. 2а), а дрожжей - 177 (рис. 26). При

Рис. 2. Протеолитическая деградация полипептидов KJ62 (А) и дрожжей (Б) при их инкубации с активированными нейтрофилами.

Абсцисса: время инкубации белковых субстратов с нейтрофилами. Ордината: количество сохранившихся на двумерной электрофореграмме белковых пятен в конце каждого указанного периода инкубации.

50

100 150 200 250

50

100 150 200 250

инкубации с суспензией активированных нейтрофилов происходило постепенное снижеиие количества пятен на электрофореграммах, отражающее расщеплеште субстратов протеазами нейтрофилов. Как видно из рис. 2, белки К562 расщепляются гораздо быстрее, чем белки дрожжей. Расчет Хт для индивидуальных белковых пятен показал, что две трети белков К562 имели 11/2 менее 8 мин и только несколько пятен оставались относительно стабильными в течение всего периода инкубации (240 мин). В то же время, менее 10% белков дрожжей имели t|/2 < 8 мин, и значительная часть белков была устойчива к протеолизу нейтрофилами. Таким образом, нейтрофилы обладают мощным протеолитическим аппаратом, который гораздо более эффективен в отношении белков из эволюционно близких видов (К562), что не противоречит гипотезе "рестрикционных" протеаз.

Для устранения возможного влияния АФК нейтрофилов на деградацию белковых субстратов, далее использовали лизаты этих клеток или супернатанты активированных нейтрофилов, содержащие протеазы, освобождающиеся из клеток в результате дегрануляции.

На рис. 3 показаны результаты измерения расщепления коммерческих препаратов белков трипсином (1) и лизатами нейтрофилов (2) по реакции с о-фталевым альдегидом (а) и с использованием ПТС-метки (б). Видно, что лизаты нейтрофилов обладают высокой протеолитической активностью (по расщеплению стандартного субстрата казеина). Однако, человеческий альбумин (HSA) и овальбумин (OVA) слабо расщепляются как трипсином, так и протеазами нейтрофилов. Инкубация в системе металл-катализируемого окисления (аскорбат + Fe3+) приводила к

¿30

i15

л

I O

Cas

L

H3A OVA

¿ 45n

O)

ce со

30-

15

>4

I 0

I

Cas

* ■

HSA (Ж

V 1000 1 VO

Qs

HSA OVA

B- 1000

VO

! 750 g

S 500

ю

S 250-

-e-

1

Qs

HSA OVA

Рис. 3. Протеолиз окисленных белков трипсином (1) и лизатами нейтрофилов (2).

А - протеолиз измеряли с о-фталевым альдегидом. Б - протеолиз измеряли с использованием FITC-меченных белков. Cas - казеин; HSA- человеческий альбумин; OVA - овальбумин. (~| исходная форма В окисленная форма

возрастанию содержания карбонильных групп и падению флуоресце1щии триптофана в этих белках (см. табл. 4). Окислите HSA и OVA делало их более доступными для протеолиза как трипсином, так и протеазами нейтрофилов. Так, флуоресценция FITC в ТХУ-супернатантах после инкубации с лизатами нейтрофилов была выше для HSA0X в 2.2 раза, OVA^ в 1.6 раза, по сравнению с их исходными формами.

Причиной повышения чувствительности белков к протеолизу нейтрофилами могла быть их частичная денатурация при окислении, приводящая к разворачиванию белковой молекулы и "обнажению" сайтов, узнаваемых обычными протеазами (Davies et al., 1987а). Однако, тепловая денатурация HSA нагреванием в водяной бане при 100°С, хотя и заметно увеличивала степень его расщепления лизатами

нейтрофилов, не приводила к исчезновению различий между окисленной и неокиеленной формами: даже после денатурации HSAoX расщеплялся лучше, чем исходный HSA, что указывает на возникновение новых сайтов расщепления для специфичных протеаз в результате окислительной модификации некоторых аминокислотных остатков.

Протеаза (или протеазы), специфически расщепляющая окисленные белки, скорее всего, локализована в гранулах нейтрофилов, т.к. супернатшпы активированных нейтрофилов также значительно лучше расщепляли окисленные белки; чем исходные формы (данные не показаны).

Такие протеазы относятся к классу сериновьгх, поскольку обнаружено сильное (более чем на 60%) ингибирующее действие PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride) и практически полное отсутствие эффекта иодацетамида и ЭДТА в концентрациях, максимально эффективных для подавления активности тиоловых и металлопротеаз, соответственно, на протеолиз OVAox нейтрофилами. Однако, ингибиторы двух различных подклассов сериновых протеаз - химотрипсиноподобных (ТРСК - N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone) и трипсиноподобных (TLCK- Na-p-tosyl-L-lysine chloromethyl ketone) - слабо ингибировали или не влияли, соответственно, на расщепление окисленного белка, т.е., вероятнее всего, протеазой, специфичной к окисленным белкам, является эластаза или подобные ей ферменты и, в меньшей степени, химотрипсиноподобные протеазы.

Как упоминалось выше, металл-катализируемое окисление аминокислотных остатков, вероятно, не играет основную роль в модификации белков при старении. Природа окислительных модификаций белков в тканях in vivo до конца не известна. Поэтому представляло интерес сравнить расщепление протеазами нейтрофилов трепаратов РБП, выделенных из молодых и старых мышей той же линии С57В1. Содержание карбонильных групп в РБП старых мышей почти в 4 раза превышало гаковое у молодых (табл. 4). Окисление РБП из молодых животных in vitro (в 1рисугствии аскорбата + Fe3+) вызывало возрастание содержания карбонилов в них, соторое, однако, не достигало уровня, характерного для старых животных. Как и ледовало ожидать, РБП, модифицированные в системе метагш-катализируемого жисления (РБПуч)Х), расщеплялись лизатами нейтрофилов активнее, чем нативные 'БПУ (табл. 4). Однако, деградация РБП старых мышей (РБПои) в присутствии мзатов нейтрофилов была даже ниже уровня деградации контрольных РБПУ, т.е. рступность белков печени для расщепления протеазами нейтрофилов не оррелировала с содержанием карбонильных групп в них. Вероятнее всего, ¡акопление других окислительных модификаций, отличных от карбонильных, в легочных белках заметно ухудшает их доступность для ферментов нейтрофилов. К аким модификациям может относиться образование перекрестных сшивок в езультате протекания поздних стадий реакции Майяра. В пользу этого

предположения свидетельствует тот факт, что гликатированный человеческий альбумин (HSAgiyC) также хуже расщеплялся лизатами нейтрофилов, чем его исходная форма (табл. 4).

Очевидно, интенсивное окислительное повреждение белков организма при старении препятствует их элиминации "рестрикционными" протеазами нейтрофилов, что и приводит к возрастанию концентрации аутоантигенов в тканях старых животных, тем самым повышая риск развитая аутоиммунных патологий.

Снижение активности "рестрикционных" протеаз нейтрофилов с возрастом могло бы также нарушать кругооборот белков в пользу накопления аутоантигенов и, таким образом, усиливать повышение аутореактивности при старении. Однако, как видно из рис. 4, с возрастом как общая протеолитическая активность (по расщеплению FITC-казеина), так и активность протеаз, специфичных к окисленным белкам (по расщеплению FITC-OVAox), в лизатах нейтрофилов повышается. Тенденция к снижению протеолитической активности наблюдается только у очень старых животных. Способность нейтрофилов к дегрануляции протеаз при активации РМА практически не отличается у 3- и 14-месячных мышей С57В1 (Рис. 5). В то же время, способность нейтрофилов к активации "окислителыюго взрыва" при действии различных концентраций РМА была снижена у 14-месячных мышей по сравнению с 3-месячными (рис. 6), что может объяснять снижение их бактерицидности и повышенную восприимчивость к инфекционным заболеваниям при старении.

Табл. 4. Протеолиз белковых субстратов с различным уровнем окислительного повреждения

лизатами нейтрофилов

Субстрат* Содержание карбонильных групп, нмоль ДНФГ/мг белка Флуоресценция триптофана, фл. ед./мг белка Протеолиз за 20 час, флуор. ед. 490/525 нм

USA 7.3 950 69.3

HSAox 23.3 422 235.1

HSAgiyc 14.0 735 29.5

OVA 3.9 1269 336.9

OVAox 10.1 922 379.8

РБП, 2.5 791 312.4

РБП,.ох 7.7 480 365.0

PEn„id 9.8 ' 92 150.9

Прогеолиз измеряли с использованием FITC-меченных субстратов: HSA, HSA> х, HSAgiyc -человеческий альбумин (исходный препарат, инкубированный с аскорбатом и гликатированный, соответственно); OVA, OVAox - овальбумин (исходный препарат и инкубированный с аскорбатом); РБПУ, РБПу_„х - растворимые белки печени молодых (3 мес.) мышей (исходный препарат и инкубированный с аскорбатом); РБП0и - растворимые белки печени старых (22 мес.) мышей.

800 600 400

F? 200 -е.

P 200 -

I

5 10 15 20 возраст животиых, мес

0 5 10 15 20 25 возраст животных, ыес

—OVA -"—OVAox

Рис. 4. Изменение протеолитической активности в лизатах перитонеальных нейтрофилов мышей С57В1 с возрастом.

Протеолиз измеряли с использованием

ПТС-мсченпЫх белхов:

(а) казеин; (б) OVA и OVAox

Рис. 5. Способность перитонеальных нейтрофилов мышей CS7B1 разного возраста к дегрануляции

протеолитических ферментов.

Нейтрофилы инкубировали с РМА 2 час при 37°С. Протеолитическую активность в супернатантах измеряли по расщеплению FITC-казеина.

о.ооо

50 100 150 200 250

PMVimtol

Рис. 6. Восстановление ИСТ перитонеальными нейтрофилами мышей C57BI разного возраста.

Мы обнаружили, что содержшше окисленных белков повышено в нейтрофилах, выделенных из старых (14 мес.) мышей (уровень карбонильных групп в них составлял б.00 ± 1.07 против 3.98 ± 0.56 нмоль ДНФГ/мг белка, а флуоресценция триптофана - 1296 против 1787 флуор. ед/мг белка у З-месяшшх), что может объясняться описанным в литературе сшскением уровня антиоксидантов в плазме крови при старении (Congy et al., 1995). По-видимому, NADPH-оксидаза, ответственная за "окислительный взрыв" нейтрофилов, наиболее чувствительна к

окислению, т.к. она расположена в клеточной мембране и может инактивироваться как свободными радикалами в крови (например, при функционировании ксангиноксидазы эндотелия сосудов), так и своим продуктом - 02'. В то же время, локализация протеаз в гранулах, в условиях относительной изоляции от оксидантов, препятствует их повреждению даже у старых животных.

Таким образом, мы впервые продемонстрировали возможную роль нейтрофилов как источников особого типа "рестрикционных" протеаз, способных эффективно расщеплять белки вне клеток и участвующих в поддержании толерантности иммунной системы к собственным белкам, показали специфичность этих ферментов к окислительно модифицированным белкам, а также предложили оригинальное объяснение для повышения аутореактивносги при старении.

ВЫВОДЫ

1. Показано накопление окисленных белков во всех субклеточных фракциях печени и селезенки старых крыс по сравнению с молодыми. Фракция ядерных белков имела наиболее высокий уровень карбонильных групп, вероятнее всего, вследствие интенсивной модификации лизиновых и аргининовых остатков в гистонах.

2. Впервые показано окислительное повреждение белков в субклеточных фракциях печени и селезенки при у-облучении животных в летальной дозе. Дополнительное диетическое потребление ангиоксидантов и витаминов необходимо для повышения активности эндогенных шггиоксидантных систем и частично предотвращает окислительное повреждение белков под действием у-радиации.

3. Обнаружена пострадиацжишая активация гистон-специфических протеаз ядерного матрикса, которая обеспечивает эффективную элиминацию окисленных белков из ядер у-облучешых животных.

4. Показано возрастание чувствительности к протеолизу и антигенности белков тканей старых животных, которое обусловлено их модификацией.

5. Показано, что активность щелочных протеаз, предположительно, отвечающих за расщепление окислешгых белков в ядрах клеток печени, селезенки и нейтрофилах, не снижается с возрастом.

6. Установлено, что моноый протеолитический аппарат нейтрофилов намного эффективнее расщепляет белки из эвошоционно более близких видов, чем из отдаленных, а также специфичен по отношению к белкам, модифицированным в системе металл-катализируемого окисления in vitro. Белки старых животных гораздо менее чувствительны к расщеплению протеазами нейтрофилов, что может приводить к возрастанию концентрации аутоантигенов в организме и лежать в основе нарушения иммунологической толерантности при старении.

7. Окислительное повреждение белков в нейтрофилах старых мышей приводит к снижению способности этих клеток к активации "респираторного взрыва".

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Lefkovits, I., Frey, J.R., Kuhn, L., Sadovnikov, V.B., Pleshakova, O.V., and Sukharev, S.A. (1997) Neutrophils as a source of putative restriction proteases: degradation of mammalian and yeast proteins monitored by 2D gel electrophoresis. J. Immunol., vol. 158, no. 10, pp. 4908-4915.

2. Sukharev, S.A., Pleshakova, O.V., Moshnikova, А.В., Sadovnikov, V.B., and Gaziev,

A.I. (1997) Age- and radiation-dependent changes in carbonyl content, susceptibility to proteolysis, and antigenicity of soluble rat liver proteins. Сотр. Biochem. Physiol.

B, vol. 116, no. 3, pp. 333 -338.

3. Pleshakova, O.V., Kutsyi, M.P., Sukharev, S.A., Sadovnikov, V.B., and Gaziev, A.I. (1998) Study of protein carbonyls in subcellular fractions isolated from liver and spleen of old and y-irradiated rats. Mech. Ageing Dev., vol. 103, no. 1, pp. 45 - 55.

4. Плешакова O.B., Куцый М.П., Сухарев C.A., Садовников В.Б., Газиев А.И. (1997) Исследование уровня белковых карбонилов в субклеточных фракциях белков старых и гамма-облученных крыс. Тезисы докладов и сообщений на конференции Геронтологического общества "Старение и долголетие: системный и междисциплинарный подходы" (Москва, 25 апреля 1997 г). Цитология, том 39, № б, стр. 501.

5. Плешакова О.В., Рассказова Е.А., Садовников В.Б. (1997) Окислительный метаболизм и протеолитическая активность нейтрофилов при старении и облучении. Тезисы докладов I Международного симпозиума "Фундаментальные науки и альтернативная медицина" (Пущино, 22 - 25 сентября 1997 г). Пущино, 1997, стр. 63.

6. Плешакова О.В., Кузнецова Е.А., Куцый М.П., Садовников В.Б., Газиев А.И. Влияние ингибиторов протеаз на уровень белковых карбонилов и протеолитическуго активность в печени у-облученных мышей. Тезисы докладов Третьего съезда по радиациошгым исследованиям (Москва, 14-17 октября 1997 г). Пущино, 1997, т. 1,стр. 128.

7. Рассказова Е.А., Плешакова О.В., Садовшшов В.Б. (1998) Нейтрофилы как источник протеолитических ферментов, специфичных к окислительно модифицированным белкам. Тезисы докладов на III Пущинской конференции молодых ученых (27 - 30 апреля 1998 г.). Пущино, 1998, стр. 166 - 167.

8. Плешакова О. В., Сухарев С. А., Мошникова А.Б., Куцый М. П., Рассказова Е. А., Садовников В. Б., Газиев А. И. (1998) Использование in vivo животных биомоделей в исследовании окислительного повреждения белков при старении. IV Международная конференция и дискуссионный научный клуб "Новые информациошпле технологии в медицине и экологии" (Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, 26 мая - 4 июня 1998 г.) Труды конференции, часть 2, стр. 372 - 374.

9. Плешакова О.В., Рассказова Е.А., Сухарев С.А., Садовников В.Б. (1998) Нейтрофилы как биомодель дня исследования возможных механизмов иммунологической толерантности. Тезисы докладов IV чтений, посвященных памяти акадешжа Ю.А. Овчинникова (Москва - Пущино, 2-12 ноября 1998 г.), стр. 76.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Плешакова, Ольга Викторовна, Пущино

./ , а ..л

0 7 ; : '

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ФИЛИАЛ ИНСТИТУТА БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. М.М. ШЕМЯКИНА И Ю.А. ОВЧИННИКОВА

На правах рукописи

ПЛЕШАКОВА ОЛЬГА ВИКТОРОВНА

ОКИСЛИТЕЛЬНАЯ МОДИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ И АКТИВНОСТЬ ПРОТЕАЗ, ИХ РАСЩЕПЛЯЮЩИХ, В ТКАНЯХ ГРЫЗУНОВ

РАЗНОГО ВОЗРАСТА

03.00.04 биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: д.б.н., проф. Газиев А.И. к.б.н. Садовников В.Б.

Пущино - 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 3

ВВЕДЕНИЕ 4

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8

1. СВОБОДНО-РАДИКАЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ 8

1.1. Характеристика и взаимные превращения активных форм кислорода 8

1.2. Митохондрии - основной источник свободных радикалов в клетке 11

1.3. Воспалительные процессы и нейтрофилы 15

1.4. Пероксисомы и микросомы как источники свободных радикалов 19

1.5. Экзогенные источники свободных радикалов: ионизирующая радиация

_ как модель старения ■ . 20

2. АНТИОКСИДАНТНЫЕ СИСТЕМЫ ЖИВЫХ ОРГАНИЗМОВ 21

2.1. Эндогенные антиоксидантные системы 21

2.2. Изменение активности эндогенных антиоксидантов при старении 29

2.3. Подходы к замедлению старения и увеличению продолжительности жизни 31

1) Ограничение калорийности пищи 32

2) Применение антиоксидантов 33

3. ОКИСЛИТЕЛЬНАЯ МОДИФИКАЦИЯ И ПРОТЕОЛИЗ БЕЛКОВ В ОРГАНИЗМЕ 37

3.1. Окисление аминокислот и белков под действием ионизирующей радиации 37

3.2. Металл-катализируемое окисление белков 39

3.3. Модификация аминокислотных остатков продуктами ПОЛ 42

3.4. Неферментативное гликозилирование (гликатирование) белков 43

3.5. Изменение свойств белков при окислении и накопление модифицированных

белков при старении и "свободно-радикальных" патологиях 46

3.6. Кругооборот белков в клетке и его нарушение при старении 53.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 58

РЕЗУЛЬТАТЫ 66

1. Окислительная модификация и изменение свойств белков в тканях крыс

при старении и окислительном стрессе, вызванном у-облучением 66

1.1. Накопление карбонильных групп в белках субклеточных фракций

печени и селезенки старых и у-облученных крыс 66

1.2. Изменение чувствительности к протеолитической деградации и антигенных свойств белков печени, выделенных из старых и у-облученных крыс 69

1.3. Влияние диетического потребления смеси антиоксидантов и витаминов на накопление окисленных белков и изменение их свойств уу-облученных крыс 73

2. Активация протеаз в тканях грызунов под действием у-облучения и их участие

в элиминации окисленных белков 74

2.1. Активация гистон-ассоциированных протеаз в ядрах селезенки

у-облученных крыс 74

2.2. Влияние ингибиторов протеаз на динамику протеолитической активности и уровень карбонильных групп в белках субклеточных фракций печени у-облученных мышей С57В1 78

3. Нейтрофилы - источник протеаз, специфичных к окисленным белкам 84

3.1. Расщепление белков дрожжей и млекопитающих при их инкубации

с активированными нейтрофилами 84

3.2. Расщепление окисленных белков протеазами нейтрофилов 89

3.3. Изменение функциональной активности мышиных перитонеальных нейтрофилов при старении 97

ОБСУЖДЕНИЕ 103

ВЫВОДЫ 116

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 117

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ABC - смесь антиоксидантов и витаминов

АФ - адъювант Фрейнда

АФК - активные формы кислорода

Г-6ФДГ - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа

ГПО - глутатионпероксидаза

2,4-ДНФГ - 2,4-динитрофенилгидразин

ДТТ - дитиотреитол

КАТ - каталаза

МАО - моноаминоксидаза

МДА - малоновый диальдегид

МКП - мультикаталитическая протеиназа

МСО-система - система "окисления, катализируемого металлами" (metal-catalyzed oxidation)

НСТ - нитросиний тетразолиевый

ОК - ограничение калорий

ПОЛ - перекисное окисление липидов

РБП - растворимые белки печени

СОД - супероксиддисмутаза

ТХУ- трихлоруксусная кислота

ЭТЦ - электрон-транспортная цепь

AGE-белки - продукты поздних стадий реакции гликатирования (advanced glycation end products)^

ANT - переносчик адениловых нуклеотидов

BSA - бычий сывороточный альбумин

FITC - флуоресцеин изотиоцианат

4-HNE - 4-гидроксиноненаль

HSA, HSA0X, HSAgiyc -человеческий сывороточный альбумин (исходная форма, модифицированный в системе металл-катализируемого окисления и гликатированный, соответственно)

IAA - иодацетамид

LDL - липопротеин низкой плотности

8-OHdG - 8-гидрокси-2-дезоксигуанин

OVA, OVAox -овальбумин (исходная форма и модифицированный в системе металл-катализируемого окисления, соответственно)

PBN - а-фенил-И-терт-бутилнитрон

PB S - изотонический фосфатный буфер

РМА - форболмиристатацетат

PMSF - phenylmethylsulfonyl fluoride

SS - стрептомицин сульфат

TLCK - Na-p-tosyl-L-lysine chloromethyl ketone

ТРСК - N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone

ВВЕДЕНИЕ

Геронтологические исследования являются приоритетным направлением современной биологии и медицины. Демографическая статистика свидетельствует, что средняя продолжительность жизни в развитых странах превысила 75 лет (Kirkwood, 1996; Harman, 1994), а доля людей старше 65 лет приближается к 20% всего населения (Kirkwood, 1996). Однако, и в настоящее время большинство людей не достигает биологического предела продолжительности жизни, а период старости связан со снижением активности всех органов, утратой способности к физической адаптации к стрессу, а также с повышением риска возникновения целого ряда заболеваний (в первую очередь, сердечно-сосудистых, нейродегенеративных, рака и др.). В этой связи становится очевидным, что необходимо не просто увеличить число проживаемых лет, а продлить период активной жизнедеятельности человека, т.е. отсрочить или предотвратить процесс старения. Как звучит девиз Американской ассоциации геронтологов, надо "добавить больше жизни к годам, а не больше лет к жизни" ("add life into years and not years into life") (цит. по Канунго, 1982).

Для объяснения механизмов старения предложен ряд генных теорий (Szilard, 1959; Orgel, 4963).—Старение пытались объяснить нарушениями иммунологических функций (Walford, 1974), повреждением митохондрий (Miquel et al., 1980) и др.

В 1956 г Harman выдвинул свободно-радикальную теорию старения, которая получила дальнейшее развитие и экспериментальное подтверждение в его собственных работах (Harman, 1982; Harman, 1994) и многочисленных публикациях других авторов (см., напр., обзор Beckman and Ames, 1998). Согласно этой теории, старение организмов и связанные с ним болезни обусловлены повреждением важнейших клеточных макромолекул свободными радикалами, образующимися в целом ряде биохимических процессов (главным образом, в митохондриях). Организм, однако, снабжен рядом антиоксидантных ферментов и низкомолекулярных антиоксидантов, а также ферментов, репарирующих или элиминирующих поврежденные молекулы. Возрастание скорости генерации свободных радикалов или снижение эффективности защитных систем в организме с возрастом приведет к повышению стационарной концентрации свободных радикалов и накоплению поврежденных макромолекул в клетках. Внешние факторы (радиация, загрязнение среды, ксенобиотики) также могут усилить окислительный стресс и, таким образом, способствовать преждевременному старению.

Из трех основных типов мишеней свободных радикалов в клетке (липиды, нуклеиновые кислоты и белки), наиболее хорошо изучено аутоокисление липидов и его последствия для клетки (нарушение структуры мембран и активности мембранных ферментов) (Gutteridge and

Halliwell, 1990). Окислительное повреждение нуклеиновых кислот также интенсивно изучается. Накопление свободно-радикальных повреждений нуклеотидов (в частности, образование 8-гидрокси-2'-дезоксигуанозина, которое рассматривают как один из маркеров старения), очевидно, создает предпосылки для изменения конформации и возникновения разрывов молекулы ДНК (Ozawa, 1995; Ames et al., 1993) и, таким образом, может стать причиной повреждения структуры хромосом и функциональных расстройств, а также играет важную роль в канцерогенезе.

Окислительное повреждение белков гораздо менее изучено, хотя описан целый ряд модификаций белковых молекул, начиная с непосредственного повреждения боковых аминокислотных остатков свободными радикалами и кончая образованием перекрестных сшивок с продуктами перекисного окисления липидов, восстанавливающими сахарами и продуктами их окисления (Njoxoge and Monnier, 1989; Stadtman, 1993; Dean et al., 1997). Вместе с тем, накопление поврежденных окислением белков в клетке может оказать сильнейшее и очень быстрое отрицательное воздействие на ее метаболизм, поскольку, как показали многочисленные исследования in vitro, окисление нарушает структуру и конформацию белковой молекулы, ее электрический заряд, гидрофобность и связывание лигандов, а также, в случае ферментов, подавляет их активность (Fucci et al., 1983; Wolff and Dean, 1986; Stadtman, 1993; Giulivi et al., 1994). Одним из результатов окисления аминокислотных остатков является включение карбонильных групп в молекулу белка. Экспоненциальное возрастание содержания карбонильных групп с возрастом продемонстрировано для различных лабораторных животных (Starke-Reed and Oliver, 1989; Sohal et al., 1993). Повышенные уровни белковых карбонилов были обнаружены в фибробластах старых людей и пациентов с болезнями преждевременного старения (синдром Werner и прогерия) (Oliver et al., 1987), а также у животных под действием модельного окислительного стресса (гипероксия, ионизирующая радиация) (Starke-Reed and Oliver, 1989; Agarwal and Sohal, 1993; Carney and Carney, 1994). Уровень белковых карбонилов в тканях в настоящее время широко используется в качестве маркера старения и окислительного стресса (Stadtman, 1995). Однако, остается неясным, является ли включение карбонильных групп в белки простым индикатором их свободно-радикального повреждения или определяет нарушение их свойств и метаболизма клеток и органов в целом. Показано, что накопление окисленных белков (по уровню карбонильных групп) в тканях грызунов с возрастом коррелирует со снижением активности отдельных ферментов в них (Starke-Reed and Oliver, 1989; Carney and Carney, 1994). Однако, возможная корреляция этого маркера старения с изменением других свойств белков при старении и модельном окислительном стрессе in vivo

остается неизученной. Представляет также интерес изучение возможности коррекции окислительного повреждения белков и изменения их свойств диетическими антиоксидантами и витаминами.

Белки представляют собой семейство весьма разнородных молекул, которые могут проявлять различную чувствительность к окислительной модификации, так же как и последствия одинаковой модификации могут быть различны для разных белков. Имеющиеся в настоящее время литературные данные по чувствительности отдельных клеточных белков к окислительной модификации весьма немногочисленны (Agarwal and Sohal, 1995; Cabiscol and Levine, 1995; Yan et al., 1997). Вместе с тем, выявление предпочтительных мишеней для свободных радикалов в клетке необходимо для понимания механизмов нарушения ее метаболизма при старении. В различных органах и тканях чувствительность отдельных белковых фракций может различаться, что может обусловить особенности дегенеративных изменений в данном органе.

Одной из причин накопления поврежденных белков в тканях старых животных может быть снижение активности расщепляющих их протеаз. Изучение деградации окисленных белков в стареющем организме или в условиях стресса in vivo важно для выявления подходов к предотвращению накопления окисленных белков. Однако, имеющиеся литературные данные по изучению возрастных изменений протеолитической активности у лабораторных животных весьма противоречивы: в ряде работ показано снижение активности нейтральных и щелочных протеаз (Starke-Reed and Oliver, 1989; Agarwal and Sohal, 1994), в то время как другие авторы сообщают о сохранении протеолитической активности с возрастом (Sahakian et al., 1995; Cao and Cutler, 1995a). В большинстве таких работ в качестве субстратов использовались индивидуальные белки, окисленные in vitro в системах металл-катализируемого окисления или под действием высоких доз у-радиации. В то же время, при физиологическом старении накапливается широкий спектр окислительных модификаций в белках, природа которых не всегда известна. Поэтому особенно важно изучить связь между степенью окислительной модификации белков в тканях in vivo и их чувствительностью к действию различных эндогенных протеаз в зависимости от возраста животного.

Отдельный вопрос представляет собой поиск и идентификация протеаз, специфичных к окисленным белкам, в клетках. Основную роль в расщеплении большинства внутриклеточных белков играет сложный ферментативный комплекс - мультикаталитическая протеиназа (МКП), которая проявляет повышенное сродство к белкам с умеренной степенью окисления (Orlowski, 1990; Gruñe et al., 1996). Расщепление отживших (поврежденных) и регуляторных белков МКП играет важную роль в кругообороте белков в клетке. Однако, при различных

патологических состояниях (например, воспаление) внутриклеточные белки могут высвобождаться наружу из гибнущих клеток. При контакте с клетками иммунной системы они могут вызывать развитие аутоиммунного ответа. Существование протеаз, способных расщеплять собственные белки организма вне клеток и, таким образом, предотвращать развитие аутоиммунного ответа (гипотеза "рестрикционных" протеаз (Lefkovits, 1986)), и их специфичность к окисленным белкам (поскольку в очаге воспаления происходит сильное окислительное повреждение макромолекул как собственных, так и бактериальных клеток АФК фагоцитов) остается под вопросом. Вместе с тем, очевидно, что изучение активности таких протеаз и ее изменения с возрастом может пролить свет на некоторые аспекты нарушения иммунологической толерантности и повышения аутореактивности при старении. Поскольку нейтрофилы являются основным участником воспалительных реакций в организме и, с одной стороны, производят значительные количества АФК при активации, а, с другой стороны, обладают целым набором протеолитических ферментов (Маянский и Маянский, 1983), мы предложили их на роль источников таких протеаз и впервые исследовали расщепление различных белковых субстратов протеазами этих клеток.

Целью настоящего исследования явилось изучение накопления окислительных повреждений белков в тканях лабораторных грызунов разного возраста, а также под действием окислительного стресса, вызванного у-облучением животных, выявление корреляции между окислительным повреждением белков и изменением их свойств in vivo, а также изучение изменения активности протеаз, расщепляющих окисленные белки, с возрастом.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. СВОБОДНО-РАДИКАЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ

1.1. Характеристика и взаимные превращения активных форм кислорода Молекулярный кислород составляет 21% в атмосфере Земли и является основным источником жизни для большинства живых организмов. Молекула 02 представляет собой дирадикал, т.к. она обладает двумя неспаренными электронами на разных орбиталях, имеющими однонаправленные спины. Из-за своей способности принимать электроны кислород является мощным окислителем. В силу спинового запрета одноэлектронное восстановление молекулы Ог энергетически более выгодно, чем четырехэлектронное (Fridovich, 1978; Chuaqui and Petkau, 1987): e" + Oz 02~* e + 02~* + 2 H+ ^H202 e" + H202 + H+ -» HO* + H20 e" + HO* + H+ -» H20

В тканях, благодаря наличию сложных ферментативных комплексов со специфическими электрон-транспортными простетическими и коферментативными группами, процесс восстановления 02 протекает по многоэлектронному механизму, что сводит до минимума возможность_образования и_освобождения его высокореактивных интермедиатов. Однако, в— ряде ферментативных и спонтанных реакций может происходить и одноэлектронное восстановление кислорода с образованием супероксидного анион-радикала 02~*.

Основным источником 02~* являются митохондриальная и микросомальная электрон-транспортные цепи. Супероксйд является также первичным продуктом респираторного взрыва фагоцитов в очаге воспаления. Ряд 02-утилизирующих ферментов (триптофангидроксилаза, индоламиндиоксигеназа, циклооксигеназа) непосредственно генерируют 02"*. Генерация 02~* может быть связана с окислительно-востановительными реакциями, катализируемыми флавиновыми оксидазами (ксантиноксидазой, альдегидоксидазой, галактозооксидазой) или дегидрогеназами (дигидрооротатдегидрогеназа и др.) (Massey et al., 1969). Супероксидный анион-радикал может образовываться при аутоокислении флавинов, катехоламинов, тетрагидроптеринов, тиолов (Massey et al., 1969; Fisher and Kaufman, 1973; Cohen and Heikkila, 1974; Misra, 1974). Примером неферментативной генерации 02"* служит также образование метгемоглобина (Caughey et al., 1975).

В водных растворах (V* является слабым основанием, нуклеофилом и при физиологических pH существует в равновесии со своей протонированной формой (НОг"*). При реакциях одноэлектронного переноса супероксидный радикал может выступать как оксидант и как восстановитель. Так, он окисляет катехолы, витамин Е и родственные соединения до хинонов и Н2О2 и восстанавливает хиноны и органические перекиси до семихинонов и оксирадикалов, соответственно, с образованием Ог. Однако, его реакционноспособность невелика из-за сильной соль�