Термолизиноподобные металлопротеазы бактерий и их роль в инвазии эукариотических клеток

Божокина, Екатерина Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Термолизиноподобные металлопротеазы бактерий и их роль в инвазии эукариотических клеток
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Термолизиноподобные металлопротеазы бактерий и их роль в инвазии эукариотических клеток"

На правах рукописи

БОЖОКИНА Екатерина Сергеевна

ТЕРМОЛИЗИНОПОДОБНЫЕ МЕТАЛЛОПРОТЕАЗЫ БАКТЕРИЙ И ИХ РОЛЬ В ИНВАЗИИ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК

03 00 03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Г2 1ЭО

Санкт-Петербург 2008

003172190

Работа выполнена в Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург, и в Институте микробиологии и гигиены Chante, Берлин

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ

доктор биологических наук

София Юрьевна ХАЙТЛИНА

Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

доктор Томас АДАМ

Институт микробиологии и гигиены

Chante, Берлин

доктор биологических наук, профессор Владимир Иосифович ВОРОБЬЕВ Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

доктор биологических наук, профессор Михаил Андреевич БЕЛОЗЕРСКИЙ Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им А Н Белозерского

Биолого-почвенный факультет Казанского государственного университета

Защита состоится 27 июня 2008г в _ ч на заседании Диссертационного совета

Д 002 230 01 при Институте цитологии РАН по адресу 194064, Санкт-Петербург,

Тихорецкий пр, д 4

e-mail cellbio@mail cvtspb rssi ru

сайт http //www cvtspb rssi ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН Автореферат разослан'

мая 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук . Е В Каминская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Исследования последних лет показали, что протеолитические ферменты не только участвуют в обмене веществ, но и играют фундаментальную роль во внутриклеточной регуляции на посттрансляционном уровне Для понимания этих процессов необходимо изучение внутриклеточных протеаз и тех реакций, которые они катализируют Кроме того, протеолитические ферменты все более активно применяются в промышленности, медицине и в различных биохимических исследованиях Особенно перспективным является применение ферментов бактерий, так как бактерии обладают широким набором различающихся по субстратной специфичности протеаз С этой точки зрения особый интерес вызывают металлопротеазы, поскольку они обладают высокой субстратной специфичностью В частности металлопротеазы внеклеточного матрикса участвуют в формировании иммунного ответа на инфекцию, привлечении лейкоцитов, процессинге цитокинов и хемокинов, модулировании внеклеточного матрикса Металлопротеазы бактерий активируют экспрессию металлопротеаз внеклеточного матрикса хозяина и тем самым влияют на развитие инфекции в организме (Elkington et al, 2005) Металлопротеазы также участвуют в процессах ограниченного протеолитического расщепления, например, в образовании активных ферментов из их предшественников (Neurath, 1989), в процессинге секреторных и мембранных белков (Cheyance, Hughes, 2008), морфогенезе вирусов (Galloway et al, 2005), разрушении колицинов (Gillor et al, 2004), инактивации некоторых регуляторных белков (Bramkamp et al, 2006) и др

Кроме того, подобные ферменты находят применение в структурно-функциональных исследованиех белков с помощью метода ограниченного протеолиза Примером такого использования протеиназ может служить исследование структуры и функций актина, одного из основных сократительных белков клетки Актин обладает несколькими функциональными центрами, локализованными в разных частях молекулы Одним из возможных подходов к изучению локализации этих центров в молекуле актина является исследование функциональных свойств фрагментов молекулы, полученных с помощью разных протеиназ В ходе такого исследования был обнаружен ограниченный протеолиз актина бактериальной протеазой ЕСР32 в единственном сайте между Гли42 и Вал43 Актин, расщепленный протеазой ЕСР32, обратимо теряет способность к полимеризации (Khaithna et al, 1991), а бактерии-продуценты протеазы ЕСР32 оказались способными к инвазии в эукариотические клетки (Efremova et al, 2001) Аналогичная протеолитическая активность была обнаружена в мутантных штаммах Sh flexneri, полученных в результате обработки патогенных Sh flexneri фуразолидоном (Хайтлина, Федорова, 1990)

распространение актина в живых клетках и большое разнообразие и важность выполняемых им функций вызывают огромный интерес исследователей к этому белку, и продукт ЕСР32-протеолиза является уникальной моделью для исследования актина т vitro и in vivo Таким образом, протеаза ЕСР32 важна и как объект, и как инструмент в исследованиях процессов в про- и эукариотической клетке и механизмов взаимодействия бактерия - эукариотическая клетка в патогенезе

Цель и задачи исследования. Целью данной работы является исследование ЕСР32 и ЕСР32-подобных бактериальных металлопротеаз, ограниченно расщепляющих актин, в связи с их возможным участием в инвазии бактерий в эукариотические клетки

Задачами данной работы было

1 Выяснить, содержат ли непатогенные мутанты Sh flexneri 5а2с, полученные с помощью фуразолидона, известные вирулентные гены Shigella flexneri, и сохраняют ли они способность к инвазии

2 Провести скрининг бактерий, выделенных из клинических изолятов, для выявления штаммов, способных к синтезу ЕСР32-подобных актин-специфических протеаз

3 Клонировать и экспрессировать ген протеазы ЕСР32

4 Исследовать свойства рекомбинантного фермента ЕСР32

5 Исследовать инвазивную активность природных и рекомбинантных бактерий, синтезирующих актин-специфические протеазы

Основные положения, выносимые на защиту:

1 В референтном штамме Serratia gnmesit 30063 DZMO обнаружена новая металлопротеаза - гримелизин, сходная по молекулярной массе, N-концевой последовательности, способности ограниченно расщеплять молекулу актина между Гли42 и Вап43 и чувствительности к действию хелаторов с протеазой ЕСР32 Таким образом, ЕСР32, по-видимому, является гримелизином

2 Клонирован и экспрессирован ген гримелизина Сравнение гримелизина с металлопротеазой протеализином из S proteamaculans выявило различия по 8 аминокислотным остаткам, большинство из которых находится на N-конце молекулы фермента и, возможно, имеет функциональную значимость

3 Скрининг бактерий из клинических изолятов выявил бактериальные штаммы, способные к ограниченному протеолизу актина, сходному с ограниченным протеолизом актина ЕСР32/гримелизином Протеолиз актина термолизиноподобными металлопротеазами энтеробактерий видов Serratia, Proteus и Pseudomonas может быть частью механизма инвазии этих бактериальных штаммов в эукариотические клетки

Научная новизна. Впервые установлено точное систематическое положение штамма бактерий-продуцентов протеазы ЕСР32, специфически расщепляющей актин Показано, что поданным 47 биохимических реакций и последовательности 16S-pPHK бактерии, определенные ранее как Ecoli А2, идентичны энтеробактериям Serratia grimesii А2 В референтном штамме Serratia grimesu 30063 DZMO впервые выявлена и охарактеризована протеаза гримелизин Ген гримелизина клонирован и экспрессирован в штамме Е coli К-12 Показано, что фермент является нейтральной термолизин-подобной металлопротеазой семейства М4 Показано, что гримелизин и ЕСР32 - это один и тот же белок Впервые выявлена ЕСР32/гримелизиноподобная актиназная активность в широком спектре бактериальных штаммов Впервые показано, что бактерии S grimesu 30063 DZMO способны к инвазии в эукариотические клетки Впервые установлена корреляция между протеолитической

активностью рекомбинантных штаммов, продуцентов ЕСР32/гримелизина и их инвазией в эукариотические клетки

Теоретическое и практическое значение работы. Рекомбинантный гримелизин может быть использован для ораничениого протеолиза актина с целью изучения его свойств и процесса полимеризации, лежащею в основе функционирования актина в клетке, а также при исследовании внутриклеточных функций актина Кроме тою, возможно использование рекомбинантного гримелизина при изучении структуры и функций других белков

Рекомбинантные бактерии продуценты могут быть использованы для изучения инвазии бактерий в эукариотические клетки, а также для изучения функциональных особенностей клетки Поскольку высокой чувствительностью к инвазии обладают только трансформированные клетки, инвазия рекомбинантных бактерий, экспрессирующих гримелизин, может использоваться в качестве физиологического теста при изучении факторов, связанных с трансформацией клеток, и фармакологических агентов, влияющих на трансформацию

Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 2 статьи и 6 тезисов Основные положения работы были представлены на 14-й Европейской студенческой конференции (Berlin, Germany, 2003), Всероссийской конференции молодых исследователей «Физиология и медицина» (С-Петербург, 2005 г), VI Симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 2007), Международной конференции, посвященной 50-летню Института цитологии РАН (С-Петербург, 2007), Международном симпозиуме «Biological motility Achievements and Perspectives» (Пущино, 2008) и на научных семинарах Отдела клеточных культур Института цитологии РАН и Института микробиологии и гигиены Chante, Берлин

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающих т ссылок Диссертация изложена на . страницах и иллюстрирована 4$ рисунками и

таблицами

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные штаммы, использованные в работе, условия культивирования В работе использовали бактериальные штаммы Serratia liquefaciens 4487, Senatia grunesii 30063, Seriaíia proleamaciilans 4543 из Немецкой коллекции микроорганизмов (DZMO, Германия, Берлин) и штамм Е coli А2 20671/В3697 (Serratia grunesii А2) из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (Москва) Бактерии культивировали с аэрацией при 200-230 об/мин при 37 °С и 30 °С в среде Luria broth LB (Sambrook et al, 1989) Генно-инженерные штаммы культивировали в среде LB с добавлением антибиотика ампициллина (200 мкг/мл)

Клеточные линии и условия культивирования. Клетки эпидермоидной карциномы гортани человека Нер-2, полученные из Всероссийской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург) или клетки линии HeLa (Chante, Берлин) культивировали на покровных стеклах или на чашках Петри до образования 80%-ого монослоя в течение 48 ч в атмосфере 5% С02 при 37 °С в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной сыворотки (Sigma)

Заражение эукариотических клеток бактериями. Бактерии выращивали при 37°С при интенсивной аэрации (250-300 об/мин) в среде LB в течении 24 или 48 ч

Бактерии инкубировали в течение 2 ч с FITC (fluorescein-5-isothiocyanate, Sigma) в темноте, осаждали центрифугированием при 14 000 об/мин в течение 15 мин и ресуспендировапи в среде DMEM без сыворотки Для клеток линии Нер-2 меняли кондиционированную среду на свежую (DMEM, 10% эмбриональной сыворотки) и добавляли к клеткам суспензию бактерий в среде DMEM Бактерии с клетками инкубировали в течение 2-4 ч в атмосфере 5% С02 при 37 °С В ряде опытов после двухчасовой инкубации клетки промывали и выдерживали в среде с гентамицином в течение 2 ч, и далее среду меняли на среду без антибиотика и продолжали инкубацию с внутриклеточными бактериями в течение следующих 2 ч

Оценка количественной инвазии бактерий Клеточные линии HeLa выращивали в среде MEM, 10% эмбриональной сыворотки в течение 48 ч до достижения концентрации 2 105/ мл на 6-луночных планшетах (Sarstedt, Германия) Бактерии добавляли к клеткам в количестве, необходимом для величины заражения (multiplicity of infection) =100, и осаждали при 800 об/мин в течение 5 мин для точного определения времени начала инвазии После различного времени инкубирования с бактериями (от 1 до 4 ч) в атмосфере 5% С02 при 37 °С, клетки промывали 3 раза буфером PBS и прикрепившиеся клетки удаляли однократной обработкой трипсином (Sigma), после чего суспензию клеток инкубировали с гентамицином (концентрация зависела от конкретного эксперимента) в течение 2 часа при 37 °С для удаления всех внеклеточных бактерий Далее клетки лизировали 4,5 % раствором дезоксихолата (Sigma), быстро титровали в среде TSB (Sambrook et al, 1989) и высевали на чашки с твердым агаром

Определение протеолитической активности. К раствору G-актина (0,5 мг/мл) добавляли равный объем бактериального экстракта, полученного из осветленного центрифугированием бактериального лизата Реакцию проводили в буфере G (5 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 0,2 мМ ATP, 0,1 мМ СаСЬ) Смесь инкубировали 30-60 мин при копатной температуре, затем дополнительно 18 ч при +4 °С Реакцию останавливали добавлением буфера Лаэммли, содержащего 2% SDS (sodium dodecil sylfate) (Laemmli, 1970) Контрольная проба содержала 20 мкл раствора актина в концентрацией 0,5 мг/мл, 20 мкл буфера G и буфер Лаэммли Анализировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле По окончании разделения гели фиксировали и окрашивали в 0,25%-ом растворе KyMaccn-G250 (Sigma) Величину протеолитической активности определяли по интенсивности зоны, подвижность которой соответствовала подвижности фрагмента актина с молекулярной массой 36 кДа За 100% принимали активность препарата, который в стандартных условиях инкубации полностью превращал актин во фрагмент

Определение сайта расщепления актина. Ограниченный протеолиз актина (0,5 мг/мл) проводили с лизатами рекомбинантных штаммов, экснрессирующих ген гримелизина Белки разделяли в 12%-ом полиакриламидном геле по методу Лаэммли (Laemmli, 1970) Перенос белков на мембрану PVDF (Amersham) и окраску мембраны красителем Ponceau Red осуществляли по стандартным методикам Фрагмент с молекулярной массой 36 кДа вырезали из мембраны и подвергали N-концевой деградации по методу Эдмана с последующим анализом отщепленных аминокислот высокоэффективной жидкостной хроматографией (Odense, Denmark)

Клонирование гена гримелизина. Для клонирования гена гримелизина в вектор pQTEV-2 (Novagen) в качестве праймеров были использованы следующие олигонуклеотидные последовательности прямой праймер 280 (5'-АТТ СТС GGA ТСС ATG CCG АСС СТА АСА GCA CGA-3'), обратные праймеры 281 (5'-АТТ СТС GGA ТСС GCG AAA АСС ТСС AGC GCT GGT-3') и 282 (5'-АТТ СТС GCG GCC

GCT TAT GCC ACC CCC ACC TGA TGC CA-3'), сконструированные на основе последовательности гена протеализина (Demidyuk et al, 2006) ПЦР-продукт полноразмерного гена гримелизина, содержащего пропептид (280/282) и ПЦР-продукт гена гримелизина, не содержащего 50-аминокислотныи пропептид (281/282) были клонированы в вектор pQTEV-2 (Novagen) по сайтам рестрикции BamHI/Notl

Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия. Актиновый щпоскелет выявляли окраской клеток родамин-фаллоидином Бактерии окрашивали реактивом FITC (Sigma) Препараты заключали в раствор, препятствующий выгоранию флуоресцентного красителя (mounting medium, Sigma), и анализировали с помощью лазерного сканирующего микроскопа Leica TCS SL (Zeiss, Германия) Зеленую флуоресценцию (FITC) возбуждали аргоновым лазером (488 нм), красную (родамин-фаллоидин) - He-Ne лазером (543 нм) Флуоресценцию FITC (500-530 им) и родамин-фаллоидина (580-630 нм) сканировали раздельно с помощью программы Leica Confocal Software Анализ изображений выполняли с помощью программы "WCIF ImageJ 1 371" (National Institute of Health, Maryland, USA)

Компьютерные методы исследования. Для сравнения последовательностей ДНК применяли программу BLAST (http //www nebl nlm nih gov/BLAST/) Нуклеотидные и аминокислотные последовательности различных протеаз сравнивали с помощью программы «Multiple sequence alignment by Florence Corpet» (http //bioinfo genopole-toulouse prd fr/multalin/multahn html) Для анализа

секвенированных последовательностей 16S рРНК бактериальных штаммов использовали базы данных GenBank

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Ограниченный протеолиз актина и инвазнвный фенотип бактерий, подвергшихся действию фуразолидона.

1.1 Инвазивные свойства непатогенного мутанта Sit flexneri 5а2с, полученного в результате действия фуразолидона.

Инвазия бактерий вида Sh flexneri в эукариотические клетки включает два процесса проникновение бактерий в клетку и их распространение Первый процесс связан с экспрессией генов семейства ipa А-С (Sansonetti, 1991), для второго абсолютно необходим белок, кодированный геном icsA, который инициирует сборку актиновых «хвостов» на поверхности бактерий (Goldberg et al, 1994) Для выявления этих генов в бактериях штаммов Sh flexneri 5а2с и Sh flexneri 2а 4115 были сконструированы пары специфических праймеров и проведена ПЦР реакция с тотальной ДНК исследуемых штаммов (рис I) Последовательности олигонуклеотидных праймеров подбирали при помощи программы DNAMAN™ Version 4 0 (Lynnon BioSoft) На кафедре микробиологии и вирусологии Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им акад И П Павлова было показано, что однократное воздействие препарата фуразолидона проводит к образованию L-форм Sh flexneri, ревертанты которых не патогенны для мышей и для морских свинок Штамм, обладающий такими свойствами, назван Sh flexneri 5а2с (Федорова, 1982)

Рис. I Анализ ДНК Shigella flexneri

а. Анализ методом ПЦР с праймерами, специфическоми к генам ipciA-C и íes А. В качестве матрицы для ПЦР использовали тотальную ДНК штаммов Shigella flexneri 4115 (1), Shigella flexneri 5a2c (2) и вирулентного штамма Shigella flexneri (3).

б. Электрофореграмма препаратов плазмидной ДНК штаммов Shigella flexneri 4115 (1), Shigella flexneri 5a2c (2) и вирулентного штамма Shigella flexneri (3). В качестве маркера (М) использовали ДНК фага X, обработанную рестриктазой Hindill (Fermentas). Обозначены размеры фрагментов в парах нуклеотидов.

В качестве контроля использовали ДНК вирулентного штамма Sh. flexneri, выделенного от больного дизентерией. Гены /раА-С и icsA присутствовали в штамме Sh. flexneri, но не были обнаружены в штаммах Sh. flexneri 5а2с и Sh. flexneri 2а 4115 (рис. 1а). Бактерии Sh. flexneri от больного дизентерией содержали плазмиду, которая, по-видимому, соответствует «большой вирулентной плазмиде» (рис. 1, б). Эта плазмида не обнаружена в штаммах Sh. flexneri 5а2с и Sh. flexneri 2а 4115.

Таким образом, бактерии штаммов Sh.flexneri 5а2с и Sh. flexneri 2а 4115 не содержат генов, которые считаются необходимыми для инвазии бактерий Sh.flexneri (Sansonetti, 1991, Menard et al., 1993). Поэтому можно было ожидать, что эти бактерии не способны проникать а эукариотические клетки. Действительно, инкубация клеток Нер-2 с бактериями штамма Sh. flexneri 2а 4115 не влияла ни на морфологию клеток, ни на организацию их цитоскелета (рис. 2, а).

При анализе препаратов с помощью электронной микроскопии бактерии были обнаружены только в межклеточном пространстве (рис. 2, в). Оказалось, однако, что инкубация клеток Нер-2 с бактериями штамма Sh. flexneri 5а2с приводит к разрыхлению клеточного монослоя, появлению множества протрузий и перестройкам актинового цитоскелета (рис. 2, б), что указывает на взаимодействие этих бактерий с клетками.

Рис. 2 Взаимодействие бактерий Shigella flexneri с клетками карциномы гортани Нер-2. После инкубации с бактериями штаммов Sh. flexneri 2а 4115 (а, в) или Sh. flexneri 5а2с (б, г) клетки Нер-2 были окрашены родамин-фаллоидином или зафиксированы для электронной микроскопии (а, б - линейка 9 мкм, в, г - линейка О, 5 мкм)

Результаты электронной микроскопии подтвердили, что бактерии штамма Sh.flexneri 5а2с проникают в клетки Нер-2 (рис. 2, г). Таким образом, бактерии штамма Sh. flexneri 5а2с способны к инвазии, несмотря на отсутствие «вирулентных» генов.

Способностью проникать в клетки обладали те бактерии, которые были взяты на стационарной фазе роста бактериальной культуры. Ранее было обнаружено, что бактерии штамма Sh.flexneri 5а2с обладали протеолитической активностью, сходной с активностью протеазы ЕСР32. специфически расщепляющей актин (Федорова. Хайтлина. 1990). Оказалось, что протеолитическая активность появляется в бактериях на стационарной фазе роста культуры (рис. 3, а).

В бактериях штамма Sh. flexneri 2а 4115 протеаза. расщепляющая актин, не обнаружена (рис. 3, б). Эти данные свидетельствуют о том, что присутствие в бактериях актин-специфической протеазы совпадает с проявлениями инвазивной активности. Аналогичные результаты были получены ранее при исследовании инвазивных свойств бактерий непатогенного штамма E.coli А2-продуцента протеазы ЕСР32 (Ефремова и др.. 1998; Efremova et al„ 2001).

Полученные данные указывают на то. что обработка бактерий фуразолидоном может приводить к утрате «вирулентной» плазмиды. Гены семейства ipaA-C, ответственные за проникновение бактерий вида Sh .flexneri в эукариотические клетки, находятся на "вирулентной" плазмиде (Rosenshine, Finlay, 1993; Sansonetti. 2001). Утрата плазмиды при обработке бактерий фуразолидоном могла привести к утрате этих генов, что подтветдилось ПЦР-анализом тотальной ДНК. выделенной из исследуемых бактерий. В настоящее время бактерии штамма Sh. flexneri 2а 4115 также не содержат "вирулентной" плазмиды, что, по-видимому, связано с длительным культивированием штамма в лабораторных условиях (Schuch. Maurelli. 1997). Однако, в отличие от бактерий штамма Sh. flexneri 2а 4115. бактерии штамма Sh. flexneri 5а2с сохранили способность проникать в эукариотические клетки.

1.6 1.4 12 1.0

0.8 O.fi

0.4 0.2 О

-!> ■- . ■ —

I г

—— -------

1 2 3 4 5 6 7 дни

2.0

vo 1.5

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100110 120 Время, ч

— -----

1 2 3 4 5 6 7 дни

20 40

60 80 100 Время, ч

120 140

Рис. 3 Кривые роста бактерий и анализ протеолитической активности штаммов Shigella flexneri 5а2с (а) и Sh. flexneri 2а 4115 (б). О протеолитической активности судили по появлению фрагмента актина размером 36 кДа.

Эта способность коррелирует с присутствием у этих бактерий ЕСР 32 специфической акгиназной активности. Бактерии штамма Sh. flexneri 2а 4115 такой активности не проявляли. Поэтому мы предположили, что проникновение бактерий Sh. flexneri 5а2с в клетки может быть связано с участием протеазы ЕСР32. Появление ЕСР32-подобной протеазной активности может быть результатом селекции бактериального штамма при действии фуразолидона или в процессе реверсии L-форм бактерий. По нашим предварительным данным, вирулентный штамм Sh. flexneri, свежевыделенный от больного дизентерией, такой активностью не обладает.

1.2 Анализ клинических изолятов ZF3, ZF7 и ZF53, полученных от пациентов, длительно лечившихся фуразолидоном.

В настоящее время препараты нитрофуранового ряда, в частности фуразолидон, активно применяют в медицинской практике, в частности при лечении дизентерии и хронических инфекций мочеполовой системы. На кафедре микробиологии и вирусологии Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.В.Павлова из клинических изолятов пациентов, длительно принимавших фуразолидон, были выделены штаммы, идентифицированные нами с помощью системы Vitek 2 (bioMerieux, Франция) на основании результата 47 биохимических реакций, анализируемых во времени. Помимо этого мы провели первичный морфологический анализ колоний на различных твердых средах и определяли чувствительность штамма к 25 основным антибиотикам и оксидазный тест.

Результаты опеределения систематического положения трех клинических изолятов показывают, что выделенные бактерии относятся к семейству Pseudomonadaceae род Pseudomonas. Кроме того, три бактериальных штамма, выделенных из клинических изолятов, обладали ЕСР32-подобной актиназной активностью, что было показано методом ограниченного протеолиза актина (рис. 4).

Рис. 4 Выявление протеолитической активности у штаммов вида Pseudomonas методом ограниченного протеолиза. Актин, 0,5 мг/мл (дорожки I и 5), инкубировали с лизатом бактерий P. aeruginosa ZF3 (дорожка 2), P. stutzeri ZF7 (дорожка 3) и Р. oryzihabitans ZF53 (дорожка 4), а также с лизатом бактерий Е.соИ А2 (дорожка 6). О наличии протеолитической активности судили по образованию фрагмента актина размером 36 кДа. Время инкубирования лизатов с бактериями 2 ч.

Все штаммы с данной протеолитической активностью проникали в эукариотичесие клетки, что определяли методом конфокальной мироскопии. Для этого клетки инкубировали с бактериями в течение двух ч. фиксировали на стеклах и стандартно окрашивали и исследовали с помощью срезов 0.2 - 1 мкм в плоскости X-Z в микроскопе LFJCA TCS SL. На рис. 5 (а-в) представлены результаты конфокальной микроскопии клеток Нер-2 после их инкубации с бактериями, выделенными от больных с тяжелыми хроническими циститами (штаммы P. aeruginosa ZF3, P. stutzeri ZF7. P. oryzihabitans ZF53).

■ЩЩР

Рис 5. Анализ инвазии бактериальных штаммов в клетки линии Нер-2 методом конфокальной микроскопии. Время инвазии 2 ч.

а. После инкубации с бактериями Р. aeruginosa ZF3. Срез через середину клетки в плоскости XOZ.

б. После инкубации с бактериями P. stutzeri ZF7. Срез через середину клетки в плоскости XOZ.

в. После инкубации с бактериями Р. oryzihabitans ZF53 Реконструкция всех срезов в плоскости XOZ. Актиновый цитоскелет клеток окрашен родамин-фаллоидином, бактерии - реактивом F1TC.

Бактерии всех исследованных штаммов были обнаружены внутри клеток в значительном количестве, они располагались преимущественно в цитоплазме клеток, наблюдали резкое ухудшение состояния монослоя и разрушение цитоскелета клеток с образованием выростов на их поверхности После двух ч инкубирования с бактериями значительная часть клеток откреплялась от субстрата, поэтому более длительную инвазию не исследовали

Таким образом, все бактерии вида Pseudomonas, обладавшие ЕСР32-подобным фенотипом, достаточно интенсивно инвазировали в эукариотические клетки в течение 2 ч, что подтверждает корреляцию между ЕСР32-подобной протеолитической активностью и способностью бактерий с такой активностью проникать в трансформированные клетки Как уже отмечалось ранее, появление ЕСР-подобной протеолитической активности можно объяснить мутагенным действием фуразолидона С другой стороны, данная активность может быть широко распространена в различных бактериальных штаммах

Для проверки первой гипотезы бактериальные штаммы, не обладающей ЕСР-подобной активностью и способностью проникать в эукариотические клетки, были обработаны фуразолидоном in vitro С этой целью была модифицирована методика получения фуразолидоновых мутантов Sh flexneri с актиназной активностью (Федорова, 1982) Однако данные опыты не дали значимых результатов После всех этапов эксперимента в бактериях не наблюдали актиназной активности Возможно, это связано с тем, что в оригинальной методике использовали пассирование L-форм бактерий через животных (морские свинки), а не через клетки в культуре, или с тем, что необходима дальнейшая модификация метода в целом

Эти результаты, хотя они и не исключают мутагенную роль фуразолидона в появлении специфической актин-расщеплякмцей активности бактерий, делают более перспективным поиск аналогичных протеаз в условно-патогенных бактериях, широко распространенных в природе Для проверки этой гипотезы мы провели скрининг энтеробактерий для выявления штаммов, способных к синтезу ЕСР32-подобных актин-специфических протеаз и к инвазии

2. Исследование распространения ЕСР-подобной протеолитической активности в различных бактериях.

2.1. Выявление ЕСР32-подобной активности в энтеробактериях.

В результате скрининга 67 бактериальных штаммов энтеробактерий, полученных из немецкой коллекции микроорганимов, а также от пациентов госпиталя Chante (Берлин, Германия), были обнаружены штаммы, лизаты которых ограниченно расщепляли актин Среди проанализированных штаммов способность расщеплять актин с образованием фрагмента 36 кДа была обнаружена в 1 из 8 штаммов вида Serratia marcescens, в 8 из 9 штаммов вида Proteus mirabilis и в 5 из 10 штаммов вида Pseudomonas aeruginosa На рис 6 представлены результаты инкубации актина с лизатами бактерий этих штаммов Как показано на рис 6, расщепление актина является ограниченным и ингибируется специфическим ингибитором металлопротеаз, о-фенантролином

Таким образом, результаты скрининга показали, что разные представители широкой группы энтеробактерий обладают ЕСР32-подобной протеазной активностью, то есть они оганиченно расщепляли актин с образованием фрагмента размером 36 кДа Эту активность полностью ингибировали такие хелаторы, как о-

фенантролин и ЕДТА, что указывает на то, что расщепление осуществляет металлопротеаза.

Из литературы известно, что бактерии этих видов могут инвазировать в эукариотические клетки, выделяя специфические токсины (Hertie, Schwarz. 2004; Hirakata. 2007). Наши исследования показали, что способностью к инвазии обладали те штаммы, лизаты которых ограниченно расщепляли актин.

2.2. Количественная инвазия штаммов энтеробактерий, обладающих и не обладающих ЕСР32/гримелизин-подобным фенотином.

Способность бактерий Pseudomonas aeruginosa, Proteus miribalis, Serratia marcesens к инвазии оценивали количественным методом. Для этого после заражения клеток бактериями и инкубации с ними в течение определенного времени, которое зависит от вида бактерий, все внеклеточные (неинвазировавшие) бактерии удалялись инкубацией клеток в среде с гентамицином. После быстрого лизиса клеток, титрования и высева на твердые среды подсчитывали число колоний.

о-фенаитролин + + + +

Актин 36 кДа

10 11 12

Рис 6. Протеолитическая активность штаммов энтеробактерий, обладающих ( ) и не обладающих ( ) ЕСР32-подобной активностью. Протеолитическую активность определяли по способности бактериальных лизатов расщеплять актин, с образованием фрагмента размером 36 кДа. Ингибирование протеотитической активности проводили хелатором о-фенантролином в течение 30 мин.

1. Актин 0,5 мг/мл 5. Pseudomonas aeruginosa

2. E.coli А2 6. Serratia marcescens

3. E.coli A2 7. Proteus mirabilis"

4. Proteus mirabilis 8. Pseudomonas aeruginosa'

9. Serratia marcescens'

10. Proteus mirabilis

11. Pseudomonas aeruginosa

12. Serratia marcescens

образованных внутриклеточными бактериями.

Для данного опыта мы использовали пары энтеробактерий обладающих не обладающих ЕСР32-подобной активностью (таблица). Негативным контролем были клетки, инкубировавшиеся в среде без бактерий. Клетки HeLa выращивали в течение ночи до достижения 50%-ого монослоя в среде MEM, 10% эмбрионалоной сыворотки. После трех промывок средой MEM. клетки инфицировали бактериями 2-10 КОЕ/мл в течение разного времени. Инфицирование останавливали тремя промывками буфером PBS с последующим откреплением клеток трипсином. Внеклеточные бактерии убивали инкубированием клеточной суспензии в растворе MEM, 10% FCS, гентамицин (50 мкг/мл) при 37 °С в течение 2 ч. КОЭ внутриклеточных бактерий (таблица) подсчитывали после быстрого лизиса клеток 1,5% (в/о) раствором дезоксихолата натрия. Каждый результат получен после усреднения трех независимых вариантов.

На диаграмме (рис 7) хорошо видно различие в количестве бактерий ЕСР32-положительных и ЕСР32-отрицательных штаммов, проникающих в эукариотические клетки Наибольший эффект наблюдали у бактерий вида Р aeruginosa, «гримелизин+» штамм которых был принят за 100% входа бактерий, так как в случае

Рис. 7 Инкубирование клеток НеЬа с различными энтеробактериями Колонки показывают относительные значения входа бактерий по сравнению с контрольными штаммами, нормализованное к 100%

этих бактерий наблюдали наибольшее число колоний внутриклеточных бактерий Штаммы продуценты ЕСР32 А2 и X grlmesu 30063 07М0 обладали примерно одинаковым уровнем инвазии, 67 и 59 колоний соответственно

Таблица. Количество колоний, образованных внутриклеточными бактериями разных штаммов (КОЕ)

№ Штаммы бактерий Гримелизии-подобный фенотип Количество колоний

1 Serratia marcescens MV6272-1 (2006) + 49

2 Serratia marcescens 5071 - 5

3 Pseudomonas aeruginosa MV6256-l/Pyo + 194

4 Pseudomonas aeruginosa 5118/Pyo - 40

5 Proteus mirabilis 5127-1 + 86

6 Proteus mirabilis WV9045 - 2

7 Serratia grimesu A2 + 67

8 Serratia grimesu 30063 DZMO + 59

9 Serratia liquefaciens 4487 DZMO - 0

10 Serratia proteamaculans 4543 DZMO - 0

11 Контроль - 0

3. Клонирование гена протеазы и характеристика фермента.

3.1. Идентификация штамма А2, продуцента протеазы ЕСР 32.

Для определения нуклеотидной последовательности гена протеазы ЕСР32 предполагалось синтезировать вырожденный праймер на основе известного N-концевого фрагмента протеазы (Matveyev et al, 1996), обработать тотальную ДНК штамма Е coli А2 рестриктазой, к концам полученных после рестрикции фрагментов лигировать короткие (40 нп) синтетические фрагменты ДНК (адаптеры), провести

ПЦР реакцию с вырожденными праймерами к известному фрагменту протеазы и праймером к адаптеру, используя как матрицу фрагменты тотальной ДНК с адаптерами, клонировать и секвенировать полученные ПЦР продукты Однако нуклеотидные последовательности полученных ПЦР продуктов не были обнаружены в полностью секвенированном геноме бактерий Escherichia coli Этот факт, а также особенности роста бактерий на селективных твердых средах привели нас к дополнительному исследованию систематического положения штамма А2 с использованием биохимического и молекулярно биологических подходов

По данным биохимического анализа штамма А2 в системе Vitek 2 (bioMerieux Франция), по антибиотикограммам и по гомологии гена 16S рРНК штамма А2 (GenBank record EU287454) с генами 16S рРНК бактериальных штаммов, имеющим установленное систематическое положение, штамм А2 сходен или идентичен Serratia grimesu

3.2. Последовательность гена гримелизина из штаммов-продуцентов Serratia grimesu А2 и Serratia grimesu 30063 DZMO.

Анализ литературных данных, направленный на поиск данных о металлопротеазах у энтеробактерий семейства Serratia, показал, что S proteamaculans содержат металлопротеазу протеализин (Demidyk et al, 2006), N-концевая последовательность которой сходна с определенной раннее N-концевой последовательностью ЕСР 32 (Matveyev et al, 1996) На основе последовательности гена протеализина были сконструированы пары специфических праймеров (см Материалы и методы) для клонирования гена протеазы ЕСР 32 из штамма-продуцента А2 и референтного штамма S grimesu 30063 из немецкой коллекции микроорганизмов. Ген был клонирован в вектор pQTEV-2, секвенирован и экспрессирован в штамме Е coli К-12 Нуклеотидные последовательности отличались (GenBank records EU287453 - А2 и GenBank records EU287452 - S grimesu 30063) no 12 нуклеотидным остаткам Несмотря на это, вследствие вырожденности генетического кода, аминокислотные последовательности из обоих штаммов А2 и S grimesu были идентичны Этот результат подтверждает идентичность А2 с S grimesu Молекула гримелизина состоит из 342 аминокислотных остатков Анализ первичной структуры рекомбинантного белка выявил ее сходство со структурой протеализина Оба белка содержат 50-аминокислотный пропептид, каталитический сайт, содержащий характерный Zn^-связывающий мотив HELAH (Jongeneel et al., 1989) и аминокислотные остатки, участвующие в катализе, субстрат связывающий сайт и четыре Са2+-связывающих сайта (рис 8) Тем не менее, аминокислотная последовательность гримелизина на 8 аминокислотных остатков отличается от последовательности протеализина (рис 8, красный жирный шрифт)

s g 1 M'TLTARSVI PPYM.RW [ E HGSLPQRDCA LHTLNHVQSL LGNKPLRAPG AKTSSAGWI s p M'TLTARSVI PPYM.RRI IE HGSLPQRDCA LHTLNHVQSL LGNKPLRAPG AKTSTGCEVI

s g 61 RH FDAENGT QLPGKQVRNE GQASNHDVAV DEAYDYLGVT YDFFVQAFKR s p RDIFDAENST QLPGKQVRNE GQASNHDVAV DEAYDYLGVT YDFFVQAFKR

s g 121 TGSVHYGKEY QNAFWCQQVf VFGfXDGEIF NRFTIAIDW QU I AUGVTE s p TGSVHYGKEY QNAFVNGQQM VFQXDCEIF NRFTIAIDW Oll I AHOVTE

s g 181 AGALNESLSD VFGSLVKQFH LQQTAEKADW LI GECLLAKG I NGKdRSMS s p AGALNESLSD VFGSLVKQFH LKgTAEKADW LI CEGLLAKG I_NOCGLRSNB

s g 241 LGKDPQPASM KDYI QTKEDN GGVHLNSGIP NRAFYLAATA LGGFAW-KAG s p LGKDPQPASM KDYIQTKEDN GGVHLNSCJ P NRAFYLAATA LGGFAVEKAG

s g 301 ALF'QDADFAT FARTTVKHAK QlifTSTVADK VQQAVHQVGV A s p ALPQDADFAT FARTTVKHAE QRFDSKVAIK VQQAVHQVGV A

Вариабельные а к 55, 56, 58, 69,116,202, 320, 326

Рис 8. Аминокислотная последовательность гримелизина в сравнении с протеализином Аминокислотный остаток в положении 51 является первой аминокислотой зрелого белка Уникальный Zn-связывающий мотив (НЕХХН) обозначен зеленым, аминокислоты, составляющие Са2+-связывающие сайты, подчеркнуты Аминокислотные различия между гримелизином и протеализином обозначены цветом (красный) (s,g : S grimesu, s p.- S proteamaculans) Вариабельные аминокислоты обозначены номерами

По этим особенностям структуры фермент можно отнести к классу термолизиноподобных металлопротеиназ MEROPS М4 По аналогии с термолизином Bacillus thermoproteolyticus (Takai et al, 1985), который является референтным ферментом группы MEROPS М4, и протеализином из Serratia proteamaculans, метадлопротеаза, обнаруженная нами в Serratia grimesu, была названа гримелизином

3.3. Экспрессия рекомбинантного белка с последовательностью His 6 на N-конце.

Рекомбинантный фермент был клонирован в вектор pQTEV2 В результате экспрессии гена гримелизина в Ecoli Kl 2 были получены продукты с молекулярной массой 37 и 32 кДа, соответствующие полной (содержащей пропептид) и активной (не содержащей пропептид) форме фермента (рис 9) Индукция экспрессии с помощью IPTG приводила к увеличению доли фермента до 50-60% от всего белка лизата

NKLDNKCLPL NSLDNQGLPL

SEACLIYFQQ SEACLI YFQQ

APGTAYDDPL APGTAYDCPL

YIWYDTLCDK YIWDTLCDK

Рис 9. Экспрессия рекомбинантного гримелизина с пропептидом и без 32 кДа пропептида. Экспрессия полноразмерного гена гримелизина из штамма-продуцента А2 (блок 1) или из S. grimesii 30063 (блок 2). Экспрессия гена гримелизина без N-концевого пропептида из штамма-продуцента А2 (блок 3) или из штамма S. grimesii 30063 (блок 4). Экспрессию индуцировали 0,5 мМ IPTG в течение 1 или 4 ч. Блок 5 показывает лизаты E.coli К-12, экспрессирующие регуляторную последовательность вектора pQTEV-2 без вставки гена (Ergin et al., 2007). В каждом блоке дорожка (а), контроль без индукции (б), индукция IPTG 1 ч, (в), индукция IPTG 4 ч.

3.4. Исследование ограниченного протеолиза актина рекомбинантным белком.

Далее было проверено, гидролизуют ли рекомбинантные бактерии актин. В соответствии с данными, полученными ранее на препарате протеазы ЕСР32 (Khatlina et al.. 1991), очищенная протеаза ЕСР32 не ингибировалась ингибиторами сериновых и аспарагиновых протеаз. но ингибировалась хелаторами - ингибиторами металлопротеаз - о-фенантролином, ЕДТА. Поэтому проверили ингибирование рекомбинантного фермента теми же агентами. В результате было установлено, что данная протеолитическая активность аналогично ингибируется о-фенантролином и ЕДТА (рис.10). PMSF не ингибировал протеолитическую активность (не показано).

Рис. 10 Протеолитическая активность рекомбинантного гримелизина по отношению к актину. Актин (0,5 мг/мл) (дорожка 1). Проанализированы лизаты бактерий E.coli SCSI, экспрессирующие полноразмерный 12 3 4 5 6 7 гримелизин из А2 (дорожка 2) и S. grimesii 30063 (дорожка 3), и гримелизин без пропептида (дорожка 4), IPTG-индуцированный полноразмерный гримелизин из А2 (дорожка 5), и полноразмерный гримелизин из А2, предварительно инкубированный с 2 мМ о-фенантролином в течение 30 мин (дорожка 6) или с 10 мМ ЕДТА в течение 12 ч (дорожка 7).

Таким образом, рекомбинантный гримелизин имеет аналогичную ЕСР32 картину протеолиза актина. Протеолиз ингибировался хелаторами и ограничивался образованием фрагмента актина размером 36 кДа, который не подвергался дальнейшему протеолизу.

3.5. Определение сайта расщепления актина рекомбинантным гримелизином

Для определения сайта расщепления актина был проведен ограниченный протеолиз актина лизатами бактерий, содержащими рекомбинантный гримелизин из штаммов А2 и S. grimesii 30063. Разделенные с помощью SDS-PAGE электрофореза фрагменты иммобилизовали на PVDF мембране (Invitrogen™) и анализировали N-

1 2 3 4 5

4» -4 м 1Ш

т ■ -___¡£ А

концевую аминокислотную последовательность фрагмента с массой 36 кДа. Для обоих рекомбинантных белков N-концевая последовательность фрагмента актина была определена как:

А2: Val-Met—Val—Gly—Met-Gly

Sg: Val-Met—Val—Gly—Met-Gly r

ECP32: Val-Met—Val—Gly—Met-Gly

В известной аминокислотной последовательности актина эта последовательность соответствует сайту расщепления между Гли42 и Вал43. Этот сайт идентичен сайту расщепления актина протеазой ЕСР32 (Khaitlina et al., 1991).

Таким образом, рекомбинантные белки из А2 и S. grimesii 30063 имели ¡ одинаковые свойства, и эти свойства, а именно, молекулярная масса, ограниченный протеолиз актина, ингибирование хелаторами, сайт расщепления актина и 14 амино- | кислот на N-концевом участке белка идентичны ранее описанным для ЕСР32 (Matveyev et al., 1996). Поскольку вероятность ошибки определения последней аминокислоты возрастает по сравнению с предыдущими, последняя 15-я аминокислота N-концевого участка ЕСР32 была, по-видимому, определена ошибочно. Таким образом, протеаза энтеробактерий, названная в данной работе гримелизином. идентична ранее обнаруженной протеазе ЕСР32.

3.6. Очистка рекомбинантного гримелизина на Ni-содержащих аффинных носителях.

Индукция экспрессии гена гримелизина с помощью (PTG приводила к увеличению доли фермента до 50-60% от всего белка лизата. Однако большая часть

Рис. 11. Очистка гримелизина в нативных условиях с Hiss на N-конде. Лизат рекомбинантных бактерий (HÍSf, на N-конце) без индукции (дорожка 1), индукция 1PTG (дорожка 2), супернатант после лизиса бактерий (дорожка 3), последовательные промывки (блок 4), элюат рекомбинантного гримелизина (дорожка 5)

фермента оказывалась нерастворимой и находилась в так называемых «телах включения» (рис. 11, дорожки 3 и 4). Эти результаты получили, проверив после индукции и лизиса рекомбинантные белки, клонированные в экспрессионном векторе pQTEV-2.

Очистка рекомбинантного гримелизина в денатурирующих условиях.

Известно, что препарат очищенного фермента ЕСР32 терял активности до 60% при обработке 1,6 М мочевиной. При увеличении концентрации от 4 до 8 М мочевины активность уменьшалась до 5%. Однако после удаления мочевины активность почти полностью восстанавливалась. Поэтому было решено провести аналогичную процедуру очистки в присутствии 6М мочевины с последующим восстановлением активности фермента диализом. В денатурирующих условиях (6М мочевина) большая часть белка была растворима, что позволило провести процедуру

очистки. Однако при последующей ренатурации белка (диализ против растворов с понижающейся концентрацией мочевины) гримелизин не был способен расщеплять актин, то есть белок был неактивным (рис. 12, б).

М123 4 5 М 1 2 3 4

Рис. 12 Очистка рекомбинантного гримелизина в денатурирующих условиях.

а. Лизат рекомбинантных бактерий (Hisr, на N-конце) без индукции (дорожка 1), индукция IPTG (дорожка 2), супернатант после лизиса бактерий (дорожка 3), последовательные промывки (блок 4). элюат рекомбинантного гримелизина (дорожка 5)

б. Проверка очищенного гримелизина после ренатурации на способность ограниченно расщеплять актин. Раствор рекомбинантного гримелизина, после ренатурации (конц. примерно 0.25 мг/мл) (дорожка 1). Инкубация раствора гримелизина с актином, в соотношении фермент:актин 1:1 (дорожка 2), 1:50. (дорожка 3). Актин в концентрации 0,5 мг/мл (дорожка 4).

Поэтому на данном этапе очистка гримелизина на аффинном носителе, которую обычно применяют для выделения рекомбинантных белков с гистидиновым тагом, оказалась невозможной. Необходима дальнейшая отработка методики, направленная на повышение доли растворимого белка по сравнению с долей белка в «телах включения» в лизате рекомбинантных бактерий. Для этого необходимо оптимизировать условия индукции, роста и лизиса бактерий.

4. Анализ инвазии рекомбинантных штаммов-продуцентов гримелизина.

4.1. Анализ инвазии поданным конфокальной микроскопии

Методом конфокальной микроскопии (микроскоп Leica TCS ) была исследована инвазия штаммов, продуцентов рекомбинантного гримелизина. По данным конфокальной микроскопии, бактерии штамма E.coli К-12. несущие полноразмерную последовательность гримелизина, инвазировали в клетки линии Нер-2 и были локализованы преимущественно в цитоплазме (рис. 13, а-г). В то же время бактерии, экспрессирующие гримелизин без пропептида, находились преимущественно в межклеточном пространстве и не проникали внутрь клеток (рис. 13, д). Аналогичную картину наблюдали в контроле (рис. 13, е). Следует отметить, что сами бактерии штамма E.coli К-12 не способны к инвазии.

Таким образом, по данным конфокальной микроскопии, экспрессия гримелизина делает бактерии инвазивными.

Рис 13. Инвазия клеток линии Нер-2 с рекомбинантными бактериями.

а и б - E.coU К-12, экспрессирующие полноразмерный гримелизин А2, срезы с

интервалом 0,2 мкм в плоскости XOZ через середину клетки;

в - E.coli К-12, экспрессирующие полноразмерный гримелизин А2

г — E.coli К-12, экспрессирующие полноразмерный гримелизин А2

(увеличенная выноска)

д - E.coli К-12, экспрессирующие гримелизин без последовательности N-концевого пропептида

е - E.coli К-12, экспрессирующие регуляторную последовательность вектора pQTEV-2 без вставки гена, срез в плоскости XOZ через середину клетки. Актиновый цитоскелет клеток окрашен родамин-фаллоидином, бактерии окрашены реактивом FITC. Время инвазии 2 ч.

4.2. Количественная инвазия рскомбинантных штаммов.

Количественную инвазию рекомбинантных штаммов-продуцентов полпоразмериого гена гримелизина по сравнению с бактериями, экспрессирующими регуляторную последовательность вектора pQTEV-2 без вставки гена оценивали с помощью метода, описанного в разделе «Материалы и методы»

Клетки HeLa выращивали в течение ночи до достижения 50%-ого монослоя в среде MEM, 10% эмбриональной сыворотки После трех промывок средой MEM, клетки инфицировали бактериями 2 10 КОЕ/мл в течение 4-х ч Инфицирование останавливали тремя промывками буфером PBS с последующим откреплением клеток трипсином Внеклеточные бактерии убивали инкубированием клеточной суспензии в растворе MEM, 10% эмбриональной сыворотки, гентамицин (50мкг/мл) при 37 °С в течение 2-х ч КОЭ внутриклеточных бактерий подсчитывали после быстрого лизиса клеток 1,5% (в/о) раствором дезоксихолата натрия Каждый результат получен усреднением трех независимых вариантов трех независимых экспериментов (рис 14)

120,

100 •

« во.

X ей 60

* до

20 •

1 2 Бактериальные штаммы

Рис. 14 Инкубирование клеток HeLa с рекомбинантными Е cok, экспрессирующими гримелизин (колонка 2) и экспрессирующими последовательность вектора без вставки гена (колонка 1), Колонки показывают относительные значения входа бактерий по сравнению с контрольным штаммом нормализованное к 100%

Штамм бактерий, экспрессирующий полноразмерный гримелизин (рис 14, колонка 2), обнаруживал почти в десять раз большую эффективность инвазии по сравнению с контролем (рис 14, колонка 1) Следует, однако, отмети ib, что эффективность инвазии при исследовании рекомбинантного штамма Е coli К12, экспрессирующего гримелизин без пропептида, была практически сравнима или незначительно меньше эффективности инвазии бактерий, экспрессирующих полноразмерный белок Таким образом, бактерии, экспрессирующие рекомбинантный белок гримелизин, обладали выраженным инвазивным фенотипом по сравнению с контрольным штаммом

Таким образом, полученные результаты подтверждают ранее обнаруженную корреляцию между способностью бактерий к ограниченному протеолизу актина и инвазией этих бактерий в эукариотические клетки Кроме того, при введении гена ЕСР32/гримелизина не способные к инвазии штаммы Е coli К-12 приобретают способность к инвазии Эти результаты позволяют предположить, что ограниченный протеолиз актина может быть частью механизма инвазии бактерий в эукариотические клетки

выводы

1 Бактериальный штамм А2, продуцент протеазы ЕСР32, ранее определенный как Е coli, сходен или идентичен Serratia grimesii

2 В референтном штамме Serratia grimesii 30062 обнаружена новая металлопротеаза гримелизин Гримелизин и ЕСР32 сходны по молекулярному весу, N-концевой последовательности, способности ограниченно расщеплять актин между Гли42-Вал43 и чувствительности к действию хелаторов Таким образом, ЕСР32, по-видимому, является гримелизином

3 Клонирован и секвенирован ген гримелизина, анализ его последовательности позволяет отнести протеазу гримелизин к семейству М4 термолизин-подобных металлопротеиназ Гримелизин отличается от протеализина из бактерий S proleamaciilans восемью аминокислотными заменами, что, возможно, приводит к различиям в их субстратной специфичности

4 Рекомбинантные штаммы Е coli К-12, экспрессирующие ген гримелизина, приобретают способность к инвазии в эукариотические клетки

5 В клинических изолятах выявлены штаммы бактерий Serratia marcesense, Pseudomonas aeruginosa, Proleus mirabhs, способные к ограниченному протеолизу актина, и штаммы, которые этой способностью не обладают Способность штаммов к ограниченному протеолизу актина коррелирует с инвазивной активностью этих бактерий

6 Полученные данные позволяют предположить, что ограниченный протеолиз актина может быть частью механизма бактериальной инвазии

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Bozhokina Е. Matveyev I 2003 Invasion of eukaryotic cells by non-pathogenic mutant Sh flexneri 5a2c that produces actin-specific proteases ECP32 Abstract of 14lh Eup Stud conf Chante, Berlin, p 401

2 Ефремова T H , Груздева И Г , Матвеев И В , Божокина Е С . Комиссарчик Я Ю, Федорова 3 Ф , Хайтлина С Ю 2004 Инвазивные свойства непатогенного мутанта Sh flexneri 5а2с, полученного под действием фуразолидона Бюллетень экспериментальной биологии и медицины Том 137, № 5, стр 546-550

(Efremova Т N , Gruzdeva I G , Matveyev IV , Bozhokina E S . Komissarchik Yd Yu , Fedorova Z F , Khaitlina S Yu 2004 Invasive characteristics of apathogenic Sh flexneri 5a2c mutant obtained under the effect of furazolidone английская версия Bulletin of Experimental biology and Medicine No 5, Immunology and microbiology p 479-482)

3 Божокина E С . Матвеев И В , 2005 Появление инвазивной активности и актин-специфической протеазы ЕСР32 в бактериях, подвергшихся действию фуразолидона Материалы Всероссийской конференции молодых исследователей Физиология и медицина Санкт-Петербург стр 15

4 Божокина Е С, Хайтлина С Ю, Адам Т, 2007 Гримелизин - новая нейтральная металлопротеаза семейства металлопротеиназ М4, выявленная в Serratia grimesii Материалы VI Симпозиума химия протеолитических ферментов Москва стр 77

5 Божокина Е С, Хайтлина С Ю, Адам Т 2007 Инвазивные свойства рекомбинантного штамма Ecoli, продуцента металлопротеиназы гримелизина, ограниченно расщепляющей актин Материалы II съезда Общества клеточных биологов Санкт-Петербург, Цитология 49 стр 718

6 Bozhokma Е , Khaitlina S, Adam Т 2008 Biochem Biophys Res Commun Mar 21, 367(4) 888-92 Grimelysin, a novel metalloprotease from Senatia grimesu, is similar to ECP32

7 Khaitlina S Yu, Efremova T N , Bozhokina E S . Tsaplma О A, Adam T , Demidyuk IV , Kostrov S V, Kever L V , Komissarchik Y Y , 2008 Specific actin proteolysis with bacterial metal!oproteinases and its possible role in bacterial invasion Biological Motility, achievements and perspectives, Pushchino p 219-220

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Bramkamp M, Weston L , Darnel R A , Errington J 2006 Regulated intramembrane proteolysis of FtsL protein and the control of cell division in Bacillus subtilis

Chevance F F, Hughes К T, 2008 Coordinating assembly of a bacterial macromolecular machine Nat Rev Microbiol 6 455-65

Demidvuk IV, Kalashmkov AE, Gromova TY, Gasanov EV, Safina DR, Zabolotskaya MV, Radenskaya GN, Kostiov S V, 2006 Cloning, sequencing, expression, and characterization of protealysin, a novel neutral proteinase from Serratia proteamaculans representing a new group of thermolysm-hke proteases with short N-terminal region of precursor Protein Expr Pun f 47 551-61

Efremova T, Ender N, Brudnaja M, Komissarchik Y, Khaitlina S 2001 Specific invasion of transformed cells by Escherichia coll A2 strain Cell Biol Int 25 557-561

Ellington FT, O'Kane CM, Fnedland JS, 2005 The paradox of matrix metal loprotemases in infectious disease Clin Exp Immunol 142 12-20

Ergin A , Bussow К, Siepei J, Thiel A , Duchmann R, Adam T, 2007 Homologous high-throughput expression and purification of highly conserved E coll proteins FEBSLett 242 211-4

GallowayCS, Wang P, Winstanley D, Jones IM ,2005 Comparison of the bacterial Enhancin-like proteins from Yersinia and Bacillus spp with a baculovirus Enhancm J Invertebr Pathol 90 134-7

Gillor О, Kirkup В С, Riley MA , 2004 Colicms and microcms the next generation antimicrobials Adv Appl Microbiol 54 129-46

Goldbeig MB, Theriot J A , Sansonetti P J, 1994 Regulation of surface presentation of IcsA, a Shigella protein essential to intracellular movement and spread, is growth phase dependent Infect Immun 62 5664-8

Hamaoka T, Takai Y, Kosugi A , Mizushima Y, Shuna J, Kitsama T, Fujiwara H, 1985 The augmentation of tumor-specific immunity using haptenic muramyl dipeptide (MDP) derivatives I Synthesis of a novel haptenic MDP derivative cross-reactive with Bacillus Calmette Guerin and its application to enhanced induction of tumor immunity Cancer Immunol Immunother 20 183-8

Hertle R, Schwarz H, 2004 Seiratia marcescens internalization and replication in human bladder epithelial cells BMC Infect Dis 4 16

Jongeneel С V, BouvierJ, Baitoch A , 1989 A unique signature identifies a family of zinc-dependent metallopeptidases J Bacterid 175(18) 5899-906

Khaitlina S Yu, Collins JH, Kuznetsova IM, Pershina VP, Synakevich IG, Turoverov KK, Usmanova A M, 1991 Physico-chemical properties of actin cleaved with

bacterial protease from E call A2 strain Biochim Biophys Acta 279 49-51

Laemmli UK, 1970 Cleavage of the structural proteins during the assembly of the head of bacteriophag T4 Nature 227 680-685

Matveyev V V, Usmanova A M, Morozova A V, Collins J H, Khaitlma S Yu , 1996 Purification and characterization of the proteinase ECP32 from Escherthia coli A2 strain Biochem Biophys Acta 1296 55-62

Ménard R, Sansonetti P, Parsot С, 1993 Nonpolar mutagenesis of the ipa genes defines IpaB, IpaC, and IpaD as effectors of ShJlexneri entry into epithelial cells J Bacteriol 1993 175 5899-906

Neurath H, 1989 Proteolytic processing and physiological regulation Trends Biochem Sci 14 268-71

Rosenshme I, Fmlay В В, 1993 Exploitation of host signal transduction pathways and cytoskeletal functions by invasive bacteria Bioessays 15 17-24

SambrookJ, Fntch E F, Maniatis T, 1989 Molecular cloning A laboratory Manual, second ed Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spnng Harbor NY

Sansonetti P, 2001 Phagocytosis of bacterial pathogens implications in the host response Semin Immunol 13 381-90

Sansonetti PJ, 1991, Genetic and molecular basis of epithelial cell invasion by Shigella species Rev Infect Dis 13 285-92

Schuch R, Maurelh A T, 1997 Virulence plasmid instability in Sh Jlexneri 2a is induced by virulence gene expression Infect Immun 65 3686-92

Ефремова TH, Эндер HA , Брудная M С, Комиссарчик Я Ю, Хайтлина СЮ , 1998 Инвазия Escherichia coli А2 вызывает реорганизацию актиновых микрофиламентов клетках Нер-2 Цитология 40 524-8

Федорова 3 Ф, 1982 JI-трансформирующий эффект фуразолидона на клетки Sh flexnet i Антибиотики 27 527-30

Федорова ЗФ, Хайтлина СЮ, 1990 Обнаружение протеазы, специфически расщепляющей актин, у рефертантов JI-формы Sh Jlexneri Бюл эксп биол мед 7 стр 46-48

Лицензия ЛР №020593 от 07 08 97

Подписано в печать 23 05 2008 Формат 60x84/16 Печать цифровая Уел печ л 1,0 Тираж 100 Заказ 3020Ь

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул , 29 Тел 550-40-14 Тел /факс 297-57-76

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Божокина, Екатерина Сергеевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Основные принципы классификации протеолитических ферментов

2. Протеолитические ферменты микроорганизмов

2.1. Сериновые протеиназы

2.2. Цистеиновые протеиназы

2.3. Аспарагиновые протеиназы

2.4. Металлопротеиназы

2.5. Бактериальные внеклеточные цинксодержащие металлопротеазы

3. Механизмы регуляции протеолитических ферментов

3.1. Роль протеолитических ферментов в биологической регуляции

3.2. Механизмы активации зимогена

3.3. «Цистеиновый свитч»

3.4. Регуляция активности бактериальных протеиназ

3.5. Организация генов бактериальных протеиназ

3.6. Контроль генетической экспрессии на уровне транскрипции и трансляции

3.7. Посттрансляционные модификации протеиназ

3.8. Внеклеточные бактериальные протеазы и из роль в патогенезе

3.9. Взаимодействие протеиназ с ингибиторами

3.10. Другие факторы, контролирующие активность протеиназ

4. Ограниченный протеолиз

4.1. Ограниченный протеолиз как метод исследования структуры и функции белков

4.2. Актин и его протеолиз

4.3. Протеолиз актина бактериальной протеазой ЕСР

5. Механизмы бактериальной инвазии 41 5.1. Инвазирующие бактерии 43 5.2 Инвазирующие бактерии, проникающие в цитоплазму

5.3. Генетические основы инвазии бактерий Sh. flexneri

5.4. Организация генов Sh. flexneri на большой вирулентной плазмиде

5.5. Хромосомные гены бактерий, связанные с вирулентностью 51 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Бактериальные штаммы, использованные в работе, условия культивирования

2. Клеточные линии и условия культивирования

3. Получение актина скелетных мышц кролика

4. Определение протеолитической активности

5. Клонирование гена гримелизина

6. Определение сайта расщепления актина

7. Заражение эукариотических клеток бактериями

8. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия

9. Оценка количественной инвазии бактерий

10. Саузерн-гибридизация ДНК

11. Аффинная очистка белков

12. Методы компьютерного анализа 59 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

1. Ограниченный протеолиз актина и инвазивный фенотип бактерий, подвергшихся действию фуразолидона

1.1. Инвазивные свойства непатогенного мутанта Shigella flexneri 5а2с, полученного под действием фуразолидона

1.2. Анализ клинических изолятов ZF3, ZF7, и ZF53, полученных от пациентов, длительно лечившихся фуразолидоном

2. Исследование распространения ЕСР-подобной протеолитической 72 активности в различных бактериях

2.1. Выявление ЕСР32-подобной активности в энтеробактериях

2.2. Количественная инвазия штаммов энтеробактерий, обладающих и не обладающих ЕСР32/гримелизин-подобным фенотипом

3. Клонирование гена протеазы и характеристика фермента 76 3.1. Идентификация штамма А2, продуцента протеазы ЕСР

3.2. Последовательность гена гримелизина из штаммов-продуцентов Serratia grimesii А2 и Serratia grimesii 30063 DZMO

3.3. Экспрессия рекомбинантного белка с последовательностью His6 на N-конце

3.4. Экспрессия рекомбинантного белка с последовательностью His6 на С-конце

3.5. Исследование ограниченного протеолиза актина рекомбинантным белком

3.6. Исследование ограниченного протеолиза актина рекомбинантным белком

3.7. Определение сайта расщепления актина рекомбинантным гримелизином

3.8. Очистка рекомбинантного гримелизина на Ni-содержащих аффинных носителях

3.9. Очистка рекомбинантного гримелизина в денатурирующих условиях

ЗЛО. Анализ ДНК энтеробактерий

4. Анализ инвазии рекомбинантных штаммов-продуцентов гримелизина

4.1. Анализ инвазии по данным конфокальной микроскопии

4.2. Количественная инвазия рекомбинантных штаммов 103 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 105 ВЫВОДЫ 110 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Термолизиноподобные металлопротеазы бактерий и их роль в инвазии эукариотических клеток"

Актуальность проблемы. Исследования последних лет показали, что протеолитические ферменты не только участвуют в обмене веществ, но и играют фундаментальную роль во внутриклеточной регуляции на посттрансляционном уровне. Для понимания этих процессов необходимо изучение внутриклеточных протеаз и тех реакций, которые они катализируют. Кроме того, протеолитические ферменты все более активно применяются в промышленности, медицине и в различных биохимических исследованиях. Особенно перспективным является применение ферментов бактерий, так как бактерии обладают широким набором различающихся по субстратной специфичности протеаз. С этой точки зрения особый интерес вызывают металлопротеазы, поскольку они обладают высокой субстратной специфичностью. В частности металлопротеазы внеклеточного матрикса участвуют в формировании иммунного ответа на инфекцию, привлечении лейкоцитов, процессинге цитокинов и хемокинов, модулировании внеклеточного матрикса. Металлопротеазы бактерий активируют экспрессию металлопротеаз внеклеточного матрикса хозяина и тем самым влияют на развитие инфекции в организме (Elkington et al., 2005). Металлопротеазы также участвуют в процессах ограниченного протеолитического расщепления; например, в образовании активных ферментов из их предшественников (Neurath, 1989), в процессинге секреторных и мембранных белков (Cheyance, Hughes, 2008), морфогенезе вирусов (Galloway et al., 2005), разрушении колицинов (Gillor et al., 2004), инактивации некоторых регуляторных белков (Bramkamp et al., 2006) и др.

Кроме того, подобные ферменты находят применение в структурно-функциональных исследованиях белков с помощью метода ограниченного протеолиза. Примером такого использования протеиназ может служить исследование структуры и функций актина, одного из основных сократительных белков клетки. Актин обладает несколькими функциональными центрами, локализованными в разных частях молекулы. Одним из возможных подходов к изучению локализации этих центров в молекуле актина является исследование функциональных свойств фрагментов молекулы, полученных с помощью разных протеиназ. В ходе такого исследования был обнаружен ограниченный протеолиз актина бактериальной протеазой ЕСР32 в единственном сайте между Гли42 и Вал43. Актин, расщепленный протеазой ЕСР32, обратимо теряет способность к полимеризации (Khaitlina et al., 1991), а бактерии-продуценты протеазы ЕСР32 оказались способными к инвазии в эукариотические клетки (Efremova et al., 2001). Аналогичная протеолитическая активность была обнаружена в мутантных штаммах Shigella flexneri, полученных в результате обработки патогенных Shigella flexneri фуразолидоном (Федорова, Хайтлина, 1990).

Поскольку прокариоты не содержат актина, функция протеазы в бактериях остается неясной, и выяснение этой функции актуально в свете широко развивающихся сегодня исследований внутриклеточной инвазии бактериальных патогенов. Известно, что воздействие энтеробактерий на эукариотическую клетку проявляется, в частности, в активной перестройке ее актинового цитоскелета. Можно предположить, что ЕСР32 вовлечена в механизмы, обусловливающие патогенность бактерий. Протеаза обладает высокой избирательностью к субстратам, очевидно являясь ферментом, чувствительным к их конформации. Более того, протеаза гидролизует в актине лишь одну, не затрагиваемую другими протеазами, связь, которая играет особую роль в функционировании актиновой молекулы. Широкое распространение актина в живых клетках и большое разнообразие и важность выполняемых им функций вызывают огромный интерес исследователей к этому белку, и продукт ЕСР32-протеолиза является уникальной моделью для исследования актина in vitro и in vivo. Таким образом, протеаза ЕСР32 важна и как объект, и как инструмент в исследованиях процессов в про- и эукариотической клетке и механизмов взаимодействия бактерия — эукариотическая клетка в патогенезе.

Задачами данной работы было:

1. Выяснить, содержат ли непатогенные мутанты Sh. flexneri 5а2с, полученные с помощью фуразолидона, известные вирулентные гены Sh. flexneri, и сохраняют ли они способность к инвазии.

2. Провести скрининг бактерий, выделенных из клинических изолятов, для выявления штаммов, способных к синтезу ЕСР32-подобных акгин-специфических протеаз.

3. Клонировать и экспрессировать ген протеазы ЕСР32.

4. Исследовать свойства рекомбинантного фермента ЕСР32.

5. Исследовать инвазивную активность природных и рекомбинантных бактерий, синтезирующих актин-специфические протеазы.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В референтном штамме Serratia grimesii 30063 DZMO обнаружена новая металлопротеаза - гримелизин, сходная по молекулярной массе, N-концевой последовательности, способности ограниченно расщеплять молекулу актина между Гли42 и Вал43 и чувствительности к действию хелаторов с протеазой ЕСР32. Таким образом, ЕСР32, по-видимому, является гримелизином.

2. Клонирован и экспрессирован ген гримелизина. Сравнение гримелизина с металлопротеазой протеализином из Serratia proteamaculans выявило различия по 8 аминокислотным остаткам, большинство из которых находится на N-конце молекулы фермента и, возможно, имеет функциональную значимость.

3. Скрининг бактерий из клинических изолятов выявил бактериальные штаммы, способные к ограниченному протеолизу актина, сходному с ограниченным протеолизом актина ЕСР32/гримелизином. Протеолиз актина термолизиноподобными металлопротеазами энтеробакгерий видов Serratia, Proteus и Pseudomonas может быть частью механизма инвазии этих бактериальных штаммов в эукариотические клетки.

Научная новизна. Впервые установлено точное систематическое положение штамма бактерий-продуцентов протеазы ЕСР32, специфически расщепляющей актин. Показано, что по данным 47 биохимических реакций и последовательности 16S-pPHK бактерии, определенные ранее как Eschericha coli А2, идентичны энтеробактериям Serratia grimesii А2. В референтном штамме Serratia grimesii 30063 DZMO впервые выявлена и охарактеризована протеаза гримелизин. Ген гримелизина клонирован и экспрессирован в штамме Е. coli К-12. Показано, что фермент является нейтральной термолизиноподобной металлопротеиназой семейства М4. Показано, что гримелизин и ЕСР32 - это один и тот же белок. Впервые выявлена ЕСР32/гримелизиноподобная актиназная активность в широком спектре бактериальных штаммов. Впервые показано, что бактерии S. grimesii 30063 DZMO способны к инвазии в эукариотические клетки. Впервые установлена корреляция между протеолитической активностью рекомбинантных штаммов, продуцентов ЕСР32/гримелизина и их инвазией в эукариотические клетки.

Теоретическое и практическое значение работы. Рекомбинантный гримелизин может быть использован для ораниченного протеолиза актина с целью изучения его свойств и процесса полимеризации, лежащего в основе функционирования актина в клетке, а также при исследовании внутриклеточных функций актина. Кроме того, возможно использование рекомбинантного гримелизина при изучении структуры и функций других белков.

Рекомбинантные бактерии-продуценты могут быть использованы для изучения инвазии бактерий в эукариотические клетки, а также для изучения функциональных особенностей клетки. Поскольку высокой чувствительностью к инвазии обладают только трансформированные клетки, инвазия рекомбинантных бактерий, экспрессирующих гримелизин, может использоваться в качестве физиологического теста при изучении факторов, связанных с трансформацией клеток, и фармакологических агентов, влияющих на трансформацию.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Божокина, Екатерина Сергеевна

выводы

1. Бактериальный штамм А2, продуцент протеазы ЕСР32, ранее определенный как Е. coli, сходен или идентичен Serratia grimesii.

2. В референтном штамме Serratia grimesii 30062 обнаружена новая металлопротеаза гримелизин. Гримелизин и ЕСР32 сходны по молекулярному весу, N-концевой последовательности, способности ограниченно расщеплять актин между Гли42-Вал43 и чувствительности к действию хелаторов. Таким образом, ЕСР32, по-видимому, является гримелизином.

3. Клонирован и секвенирован ген гримелизина, анализ его последовательности позволяет отнести протеазу гримелизин к семейству М4 термолизин-подобных металлопротеиназ. Гримелизин отличается от протеализина из бактерий S. proteamaculans восемью аминокислотными заменами, что, возможно, приводит к различиям в их субстратной специфичности.

4. Рекомбинантные штаммы Е. coli К-12, экспрессирующие ген гримелизина, приобретают способность к инвазии в эукариотические клетки.

5. В клинических изолятах выявлены штаммы бактерий Serratia marcesense, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirablis, способные к ограниченному протеолизу актина, и штаммы, которые этой способностью не обладают. Способность штаммов к ограниченному протеолизу актина коррелирует с инвазивной активностью этих бактерий.

6. Полученные данные позволяют предположить, что ограниченный протеолиз актина может быть частью механизма бактериальной инвазии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Ограниченный протеолиз является одним из важнейших регуляторных механизмов клетки. Большинство ферментов, гормонов и физиологически активных белков синтезируются в виде неактивных предшественников (зимогенов), которые затем превращаются в активную форму с помощью избирательного расщепления пептидных связей (ограниченного протеолиза). Каскады протеолитических реакций являются частью процессов коагуляции крови, оплодотворения, метаморфоза, иммунного ответа, апоптоза и многих других (Neurath, 1986; Groettrup et al., 1996; Khan, James 1998; Donepudi, Griitter, 2002; Goulet, Nepveu 2004). В частности, все ткани живого организма содержат матричные металлопротеиназы, которые расщепляют белки внеклеточного матрикса и другие субстраты, играя при этом ключевую роль в пролиферации, дифференцировке, миграции клеток, межклеточных взаимодействиях и других процессах жизнедеятельности организма в норме и при патологиях (Elkington et al., 2005; Mannello et al., 2006). Активация протеаз, как и других ферментов, может происходит с помощью разных механизмов, в том числе, регулируемого автолиза или ограниченного протеолиза другими протеазами (Van Wart, Birkedal-Hansen, 1990). Поэтому патологические состояния могут возникать в результате внедрения в этот механизм чужеродных протеаз. Так, некоторые бактерии секретируют протеазы, которые становятся вирулентными факторами, активируя или ингибируя матричные металлопротеиназы (Elkington et al., 2005). С другой стороны, бактериальные факторы могут взаимодействовать с белками клеточной поверхности и цитоскелета непосредственно, а не через компоненты внеклеточного матрикса (Cossart and Sansonetti, 2004). Изучение роли этих взаимодействий существенно не только для понимания механизмов вирулентности/инвазивности бактерий, но и для выявления лиганд-рецепторных связей, которые определяют чувствительность клетки к инфекции.

При исследовании свойств актина был обнаружен, выделен и частично охарактеризован новый фермент, бактериальная металлопротеиназа ЕСР 32 (ЕС 3.4.24), специфически расщепляющая актин (Khaitlina et al., 1988; Усманова,

Хайтлина, 1990; Matveyev et al., 1996). Кроме того, была выявлена корреляция между появлением протеолитической активности и способностью бактерий, синтезирующих протеазу ЕСР32, проникать в эукариотические клетки (Ефремова и др., 1998; Efremova et al., 2001). Протеаза ЕСР 32 - это внутриклеточный фермент непатогенного штамма бактерий, идентифицированного с помощью рутинных микробиологических тестов как атипичный штамм E.coli А2" (Хайтлина и др., 1989). В молекуле актина протеаза ЕСР 32 расщепляет только одну полипептидную связь между Gly 42 и Val 43 в ДНКазной петле субдомена 2, эта связь не расщепляется другими известными протеазами, а ее расщепление приводит к обратимой потере способности актина к полимеризации (Khaitlina et al., 1991; 1993). Поэтому протеаза EGP 32 успешно применяется для изучения структурно-функциональных связей в молекуле актина и механизмов его полимеризации (Khaitlina et al., 1993; Strzelecka-Golaszewska et al., 1993; 1996; Khaitlina and' Strzelecka-Golaszewska, 2002; Moraczewska et al., 2004). Очистка небольшого количества.фермента позволила определить его N-концевую последовательность AKTSSAGWIRDIFL (Matveyev et al, 1996). Однако фрагменты ДНК, соответствующие этой последовательности, не были найдены в полностью секвенированном геноме E.coli. С другой стороны, N-концевая последовательность и некоторые свойства активной формы протеализина, недавно охарактеризованной металлопротеазы из Serratia proteamaculans (Demidyuk et al. 2006); оказались сходными с N-концевой последовательностью и свойствами ЕСР 32. Поэтому существенным этапом' нашей работы было дополнительное исследование систематического положения штамма А2 с помощью автоматизированной системы.биохимических тестов VITEK-2 (BioMerieux) и секвенирования гена 16S-MPHK. Эти исследования1 показали, что штамм А2 сходен или идентичен энтеробактериям Serratia grimesii (Bozhokina et al., 2008).

Для обнаружения? гена протеазы в штамме А2 и в референтном штамме Serratia grimesii DMZO 30063 была использована последовательность гена протеализина (Demidyuk et al. 2006). Обнаруженный ген был клонирован, секвенирован и экспрессирован в E.coli К12. Белок, кодируемый обнаруженным геном, содержит 50-аминокислотный пропептид, идентичный пропептиду протеализина, однако различия в нуклеотидной последовательности основной части ферментов указывают на то, что белок Serratia grimesii не является протеализином. Лизаты бактерий, в которых экспрессировался ген, расщепляли актин с образованием 36 кДа-фрагмента, N-концевая последовательность которого Val-Met-Val-Gly-Met-Gln соответствует сайту расщепления актина Gly 42-Val 43 протеазой ЕСР 32 (Khaitlina et al., 1991). Аналогично расщепляют актин лизаты бактерий референтного штамма Serratia grimesii DMZO 30063. Протеолиз актина ингибируется ЭДТА и о-фенантролином, что — в сочетании с присутствием в первичной структуре белка Zn-связывающего мотива — позволяет отнести фермент к классу термолизиноподобных металлопротеиназ MEROPS М4. Таким образом, протеиназа, обнаруженная нами в Serratia grimesii и названная гримелизином, сходна с протеазой ЕСР 32 по ряду свойств, включая способность ограниченно расщеплять актин.

В свою очередь, последовательность гена гримелизина сходна с последовательностью гена протеализина, выделенного из Serratia proteamaculans (Demidyuk et al., 2006), что предполагает сходство этих белков, в том числе и по отношению к актину. Таким образом, существует несколько бактериальных металлопротеиназ, которые могут ограниченно расщеплять актин. Возможно, они представляют собой один и тот же белок или его изоформы. Эти белки отличаются на 8 а.к., которые образуют кластеры, расположенные на поверхности белковой глобулы гримелизина (И.В.Демидюк, личное сообщение). Возможно, эти замены существенны для взаимодействия фермента с субстратом. Протеализин расщепляет актин между Gly 42 и Val 43, т.е. в том же сайте, котором актин расщепляется гримелизином (Bozhokina et al., 2008). Для того, чтобы выяснить в какой мере эти различия связаны с различиями в структуре этих белов, необходимо сравнить очищенные белки в одинаковых соотношениях фермент: субстрат и исследовать рекомбинантный гримелизин с мутациями по различающимся аминокислотным остаткам.

Наиболее важным свойством протеазы ЕСР 32 является высокая субстратная специфичность фермента. Среди множества проверенных нативных белков субстратами протеазы, кроме актина, оказались только гистоны, белки бактерий HU и DnaK и мелиттин (Усманова, Хайтлина, 1989; Matveyev et al., 1996) С другой стороны, протеализин и другие металлопротеазы семейства М4 расщепляют множество различных белков, в том числе белки внеклеточного матрикса (Demidyuk et al., 2006). Поэтому нужно провести детальное сравнение субстратной специфичности гримелизина, протеализина и ЕСР 32 по отношению к актину и другим белкам.

Способность бактерий синтезировать протеазу ЕСР32 коррелирует со способностью этих бактерий проникать в эукариотические клетки, вызывая реорганизацию их цитоскелета (Efremova et al., 2001). Мы обнаружили такую же корреляцию мутантах дизентирийных бактерий Shigella flexneri, полученных с помощью фуразолидона (Ефремова и др., 2004), и бактериях, выделенных из линических изолятов пациентов, длительно принимаших фуразолидон (Божокина, Матвеев, 2005). По данным конфокальной "микроскопии и предварительным данным количественной инвазии, к инвазии способны также бактерии референтного штамма Serratia grimesii (Божокина и др., 2007).

Для того, чтобы подтвердить корреляцию между появлением активности протеазы ЕСР 32 в бактериях и их способностью проникать в эукариотические клетки, необходимо было выяснить, появляется ли способность к инвазии при введении гена протеазы в неинвазирующие бактерии. Полученные нами данные конфокальной микроскопии и количественный анализ показали, что введение гена гримелизина в неинвазивные бактерии E.coli К12 приводит к появлению в бактериях инвазивного фенотипа (Божокина и др., 2007)

Возникает вопрос о механизмах активации этих протеаз и их присутствии в разных бактериях. Ранее мы предполагали, что одним из таких механизмов может быть мутагенный эффект фуразолидона (Ефремова и др., 2004). Однако обработка фуразолидоном бактерий E.coli и Sh. flexneri in vitro с последующим пассированием полученных клонов с клетками Нер-2 или HeLa не привела к появлению в бактериях актин-расщепляющей активности. Эти результаты, хотя они и не исключают мутагенную роль фуразолидона в появлении специфической актин-расщепляющей активности бактерий, делают более перспективным поиск аналогичных протеаз в условно-патогенных бактериях, которые могут проявлять инвазивную активность (Божокина, Матвеев, 2005).

Микроинъекция протеазы ЕСР 32 в клетки амебы Amoeba proteus приводит к обратимой остановке двигательной активности амеб и локальным разрушениям цитоскелета (Морозова и др., 2001). В сочетании с литературными данными о роли цитоскелета в инвазии (Cossart, Sansonetti, 2004; Gouin et al., 2005), наши данные позволяют предположить, что актин является белком-мишенью, протеолиз которого способствует проникновению бактерий в клетки.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Божокина, Екатерина Сергеевна, Санкт-Петербург

1. Akiba S., Yamamoto К., Kumagai H., 1995. Effects of size of carbohydrate chain on protease digestion of Aspergillus niger endo-beta-l,4-glucanase. Biosci. Biotechnol. Biochem. 59:1048-51.

2. Askolin S., Nakari-Setala Т., Tenkanen M., 2001. Overproduction, purification, and characterization of the Trichoderma reesei hydrophobin HFBI. Appl. Microbiol. Biotechnol. 57:124-30.

3. Bayer M.G., Heinrichs J.H., Cheung A.L. 1996. The molecular architecture of the sar locus in Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 178:4563-4570.

4. Beaudet R., Saheb S.A., Drapeau G.R. 1974. Structural heterogenicity of the protease isolated from several strains of Staphylococcus aureus. J. Biol. Chem. 249:6468-6471.

5. Bond M. D., Van Wart H. E. 1984. Relationship between the individual collagenases of Clostridium histolyticum: evidence for evolution by gene duplication. Biochemistry. 23:3092-3099.

6. Bourdet-Sicard R., Rudiger M., Jockusch B.M., Gounon P., Sansonetti P.J., Nhieu G.T. 1999. Binding of the Shigella protein IpaA to vinculin induces F-actin depolymerization. EMBO J. 18:5853-5862.

7. Bozhokina E., Khaitlina S., Adam T. 2008. Grimelysin, a novel metalloprotease from Serratia grimesii, is similar to ECP32. Biochem. Biophys. Res. Commun. 367:888-92.

8. Braga V.M. 2002. Cell-cell adhesion and signalling. Curr. Opin. Cell. Biol. 14:546556.

9. Bramkamp M., Weston L., Daniel R.A., Errington J., 2006. Regulated intramembrane proteolysis of FtsL protein and the control of cell division in Bacillus subtilis. Mol. Microbiol. 62:580-91.

10. Braun P., de Groot A., Bitter W., Tommassen J. 1998. Secretion of elastolytic enzymes and their propeptides by Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol. 173:3467-3469.

11. Brinckerhoff C.E., Matrisian L.M. 2002. Matrix metalloproteinases: a tail of a frog that became a prince. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 3:207-14.

12. Burns E.H, Jr., Marciel A.M., Musser J.M., 1997. Structure-function and pathogenesis studies of Streptococcus pyogenes extracellular cysteine protease. Adv. Exp. Med. Biol. 418:589-92.

13. Carmona C., Gray G.L. 1987. Nucleotide sequence of the serine protease gene of Staphylococcus aureus, strain V8. Nucleic Acids. Res. 15: 6757.

14. Cheyance F.F., Hughes K.T., 2008. Coordinating assembly of a bacterial macromolecular machine. Nat. Rev. Microbiol. 6:455-65.

15. Clausen Т., Southan C., Ehrmann M. 2002. The HrtA family of proteases: implications for protein coposition and cell fate. Mol. Cell 10:443-455.

16. Colman P. M., Jansonius J. N., Matthews B. W., 1972. The structure of thermolysin: an electron density map at 2.3 A resolution. J. Mol. Biol. 70:701-724.

17. Cossart P., Pizarro-Cerda J., Lecuit M. 2003. Invasion of mammalian cells by Listeria monocytogenes: functional mimicry to subvert cellular functions. Trends Cell Biol. 13:23-31.

18. Cossart P., Sansonetti P.J. 2004. Bacterial invasion: the paradigms of enteroinvasive pathogens. Science. 304:242-248.

19. Croux C., Paquet V., Goma G., Soucallle P. 1990. Purification and characterization of acidolysin, an acidic metalloprotease produced by Clostnidium acetobutylicum ATCC 824. Appl. Environ. Microbiol. 56:3634-3642.

20. DasGupta B. R., Tepp W. 1993. Protease activity of botulinum neurotoxin type E and its light chain: cleavage of actin. Biochem. Biophys. Res. Commun. 190:470474.

21. Ding L., Becker A.B., Suzuki A., Roth R.A., 1992. Comparison of the enzymatic and biochemical properties of human insulin-degrading enzyme and Escherichia coli protease III. J. Biol. Chem. 267:2414-20.

22. Donepudi M., Griitter M.G. 2002. Structure and zymogen activation of caspases. Biophys. Chem. 101-102:145-153.

23. Drapeau G.R. 1978. Role of a metalloprotease in activation of the precursor of staphylococcal protease. J. Bacteriol. 136:607-613.

24. Dubin G., Krajewski M., Popowicz G., Stec-Niemczyk J., Bochtler M., Potempa J., Dubin A., Holak T.A. 2003. A novel class of cysteine protease inhibitors: solution. structure of staphostatin A from Staphylococcus aureus. Biochemistry 42:13449-13456.

25. Duong F., Lazdunski A., Cami В., Murgier M. 1992. Sequence of a cluster of genes controlling synthesis and secretion of alkaline proteinase in Pseudomonas aeruginosa: relationships to other secretory pathways. Gene 121:47-54.

26. Efremova Т., Ender N., Brudnaja M., Komissarchik Y., Khaitlina S. 2001. Specific invasion of transformed cells by Escherichia coli A2 strain. Cell Biol. Int. 25:557-561.

27. Elkington P.T., O'Kane C.M., Friedland J.S., 2005. The paradox of matrix metalloproteinases in infectious disease. Clin. Exp. Immunol. 142:12-20.

28. Elzinga M., Collins J.H., Kuehl W.M., Adelstein R.S. 1973. Complete amino-acid sequence of actin of rabbit skeletal muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. 70:2687-2691.

29. Ergin A., Biissow K., Sieper J., Thiel A., Duchmann R., Adam Т., 2007. Homologous high-throughput expression and purification of highly conserved E coli proteins. FEBS Lett. 242:211-4.

30. Foisner R. 1997. Dynamic organisation of intermediate filaments and associated proteins during the cell cycle. Bioessays. 19(4):297-305.

31. Fontana A. 1988. Structure and stability of thermophilic enzymes. Studies on thermolysin. Biophys. Chem. 29:181-193.

32. Galloway C.S., Wang P., Winstanley D., Jones I.M., 2005. Comparison of the bacterial Enhancin-like proteins from Yersinia and Bacillus spp. with a baculovirus Enhancin. J. Invertebr. Pathol. 90:134-7.

33. Gambello M.J., Kaye S., Iglewski B.H. 1993. LasR of Pseudomonas aeruginosa is a transcriptional activator of the alkaline protease gene (apr) and an enhancer of exotoxin A expression. Infect. Immun. 61:1180-1184.

34. Giles N.M., Watts A.B., Giles G.I., Fry F.H., Littlechild J.A., Jacob C. 2000. Metal and redox modulation of cysteine protein function. Chem. Biol. 10:3677-1093.

35. Gillor O, Kirkup B.C., Riley M.A., 2004. Colicins and microcins: the next generation antimicrobials. Adv. Appl. Microbiol. 54:129-46.

36. Goldberg M.B. 2001. Actin-based motility of intracellular microbial pathogens. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 65:595-626.

37. Gouin S.G., Pilgrim W., Porter R.K., Murphy P.V. 2005. Synthesis of a glycolipid for studying mechanisms of mitochondrial uncoupling proteins. Carbohydr. Res. 340:15471552.

38. Goulet В., Nepveu A. 2004. Complete and limited proteolysis in cell cycle progression. Cell Cycle. 3:986-989.

39. Heiburger N., 1974. Bayer-Symposium V. Proteinase Ingibitors, eds. Fritz, H. Tschesche H., Greese L.J., Truescheit E. (Springer-Verlag, New York) pp 14-22.

40. Hertle R., Sehwarz H. 2004. Serratia marcescens internalization and replication in human bladder epithelial cells. BMC. Infect. Dis. 4:16.

41. Herwald H., Collin M., Muller-Esterl W., Bjorck L. 1996. Streptococcal cysteine proteinase releases kinins: a virulence mechanism. J. Exp. Med. 184:665-673.

42. Higaki J. N., Fletterick R. J., Craik C. S., 1992. Engineered metalloregulation in enzymes. Trends. Biochem. Sci. 17:100-104.

43. Holmes M. A., Matthews B. W., 1982. Structure of thermolysin refined at 1.6 A resolution. J. Mol. Biol. 160:623-639.

44. Hueck C.J. 1998. Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:379-433.

45. Ireton K., Cossart P. 1998. Interaction of invasive bacteria with host signalingpathways. Curr. Opin. Cell. Biol. 10:276-283. 57.1sberg R.R., Barnes P. 2001. Subversion of integrins by enteropathogenic Yersinia. J. Cell Sci. 114:21-28.

46. Jacobson G.R., Rosenbusch J.P. 1976. ATP binding to a protease-resistant core of actin. Proc. Natl. Acad. Sci. 73:2742-2746.

47. Janmey P.A., Chaponnier C. 1995. Medical aspects of the actin cytoskeleton. Curr. Opin. Cell. Biol. 7:111-117.

48. Jany K.D., Mayer В., 1985. Proteinase К from Tritirachium album limber. I. Molecular mass and sequence around the active site serine residue. Biol. Chem. Hoppe. Seyler. 366:485-92.

49. Ji G., Beavis R.C., Novick R.P. 1995. Cell density control of staphylococcal virulence mediated by an octapeptide pheromone. Proc. Natl. Acad. Sci. 92:12055-12059.

50. Jongeneel С. V., Bouvier J., Bairoch A. 1989. A unique signature identifies a family of zinc-dependent metallopeptidases. FEBS Lett. 242:211-214.

51. Kagawa T.F., O'Toole P.W., Cooney J.C. 2005. SpeB-Spi: a novel protease inhibitor pair from Streptococcus pyogenes. Mol. Microbiol. 57:650-666.

52. Karakiulakis G., Papadimitriu E., Missirlis E., Maragoudakis M. E. 1991. Effect of divalent metal ions on collagenase from Clostridium histolyticum. Biochem. Int. 24:397404.

53. Kenny J., 1993.Endopeptidase-24.ll: putative substrates and possible roles. Biochem. Soc. Trans. 3:663-668.

54. Khaitlina S., Hinssen H. 1997. Conformational changes in actin induced by its interaction with gelsolin. Biophys. J. 73:929-37.

55. Khaitlina S.Y., Moraczewska J., Strzelecka-Goiaszewska H. 1993. The actin/actin interactions involving the N-terminus of the DNase-I-binding loop are crucial for stabilization of the actin filament. Eur. J. Biochem. 218:911-920.

56. Khaitlina S.Y., Strzelecka-Goiaszewska H. 2002. Role of the DNase-I-binding loop in dynamic properties of actin filament. Biophys. J. 82:321-34.

57. Khaitlina S.Yu. 1986. Polymerization of beta-like actin from scallop adductor muscle. FEBS Lett. 198:221-224.

58. Khaitlina S.Yu. Polymerization of beta-like actin from scallop adductor muscle. FEBS Lett. 1988. 198:221-224.

59. Khaitlina S.Yu., Collins J.H., Kuznetsova I.M., Pershina V.P., Synakevich I.G., Turoverov K.K., Usmanova A.M., 1991. Physico-chemical properties of actin cleaved with bacterial protease from E.coli A2 strain. Biochim. Biophys. Acta. 279: 49-51

60. Khan A.R., James M.N. 1998. Molecular mechanisms for the conversion of zymogens to active proteolytic enzymes. Protein Sci. 7:815-836.

61. Kubori Т., Galan J.E. 2003. Temporal regulations of salmonella virulence effector function by proteasome-dependent protein degradation. Cell. 115:333-342.

62. Kumaran S., Datta D., Roy R.P. 1997. ConformationalIy driven protease-catalyzed splicing of peptide segments: V8 protease-mediated synthesis of fragments derived from thermolysin and ribonuclease A. Protein Sci. 6:2233-2241.

63. Laemmli U.K. 1970. Cleavage of the structural proteins during the assembly of the head of bacteriophag T4. Nature. 227: 680-685.

64. Lecuit M., Hurme R., Pizarro-Cerda J., Ohayon H., Geiger В., Cossart P. 2000. A role for alpha-and beta-catenins in bacterial uptake. Proc. Natl. Acad. Sci. 97:10008-10013.

65. Lin X., Tang J., 1990. Purification, characterization, and gene cloning of thermopsin, a thermostable acid protease from Sulfolobus acidocaldarius. J. Biol. Chem. 265:1490-5.

66. Lindsay J., Foster S. 1999. Interactive regulatory pathways control virulence determinant production and stability in response to the environment in Staphylococcus aureus. Mol. Gen. Genet. 262:323-331.

67. Lowther W.T., Matthews B.W. 2000. Structure and function of the methionine aminopeptidases. Biochim. Biophys. Acta. 1477:157-167.

68. MacArthur M.W., Driscoll P.C., Thornton J.M. 1994. NMR and crystallography-complementary approaches to structure determination. Trends Biotechnol. 12:149-53.

69. MacfarIane G. Т., Macdarlane S. 1992. Physiological and nutritional factors affecting synthesis of extracellular metalloproteases by Clostridium bifermentans NCTC 2914. Appl. Environ. Microbiol. 58:1195-1200.

70. Maeda S., Molla Т., Oda A., Katsuki T. 1987. Internalization of serratial protease into cells as an enzyme-inhibitor complex with a2-macroglobulin and regeneration of protease activity and cytotoxicity. J. Biol. Chem. 262:10946-10950.

71. Massimi I., Park E., Rice K., Muller-Esterl W., Sauder D., McGavin M.J. 2002. Identification of a novel maturation mechanism and restricted substrate specificity for the SspB cysteine protease of Staphylococcus aureus. J. Biol. Chem. 277: 41770-41777.

72. Matsumoto K. 2004. Role of bacterial proteases in pseudomonal and serratial keratitis. Biol. Chem. 385:1007-1016.

73. Matveyev V.V., Usmanova A.M., Morozova A.V., Collins J.H., Khaitlina S.Y. 1996. Purification and characterization of the proteinase ECP 32 from Escherichia coli A2 strain. Biochim. Biophys. Acta. 1296:55-62.

74. McGee K., Holmfeldt P., Fallman M. 2003. Microtubule-dependent regulation of Rho GTPases during internalisation of Yersinia pseudotuberculosis. FEBS Lett. 533:35-41.

75. McKerrow J. H. 1987. Human fibroblast collagenase contains an amino acid sequence homologous to the zinc-binding site of Serratia protease. J. Biol. Chem. 262:5943.

76. Menard R., Sansonetti P.J., Parsot C. 1993. Nonpolar mutagenesis of the ipa genes defines IpaB, IpaC, and IpaD as effectors of Shigella flexneri entry into epithelial cells. J. Bacteriol. 175:5899-906.

77. Miyoshi S., Shinoda S. 2000. Microbal metalloproteases and pathogenesis. Microbes. Infect. 2: 91-98.

78. Miyoshi S., Wakae H., Tomochika K., Shinoda, S. 1997. Functional domains of a zinc metalloprotease from Vibrio vulnificus. Infect. Immun. 179:7606-7609.

79. Mizusawa S., Gottesman S. 1983. Protein degradation in Escherichia coli: the Ion gene controls the stability of sulA protein. Proc. Natl. Acad. Sci. 80:358-62.

80. Molla A., Tanase S., Hong Y.M., Maeda H. 1989. Interdomain cleavage of plasma fibronectin by zinc-metalloproteinase from Serratia marcescens. Biochim. Biophys. Acta. 955:77-85.

81. Mornet D., Ue K. 1984. Proteolysis and structure of skeletal muscle actin. Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3680-3684.

82. Mosher D.F. 1995. Organization of the provisional fibronectin matrix: control by products of blood coagulation. Thromb. Haemost. 74:529-533.

83. Nakai Т., Yamauchi D., Kubota K., 2005. Enhancement of linear gramicidin expression from Bacillus brevis ATCC 8185 by casein peptide. Biosci. Biotechnol. Biochem. 69:700-4.

84. Neurath H. 1986. The versatility of proteolytic enzymes. J. Cell Biochem. 32:35-49.

85. Neurath H., 1989. Proteolytic processing and physiological regulation. Trends Biochem. Sci. 14:268-71.

86. Niemann H. 1991. Molecular biology of clostridial neurotoxins, p. 303-348. In J. E. Alouf and J. H. Freer (ed.), A source book of bacterial protein toxins. Academic Press Ltd., London.

87. Novick R.P., Projan S.J., Kumar C.C., Carleton S., Gruss A., Highlander S.K., Kornblum J. 1985. Replication control for pT181, an indirectly regulated plasmid. Basic Life Sci. 30:299-320.

88. Nyberg P., Rasmussen M., Bjorck L. 2004. a2-macroglobulin-proteinase complexes protect Streptococcus pyogenes from killing by the antimicrobal peptide LL-37. J. Biol. Chem. 279:52820-52823.

89. Parsot C., Hamiaux C., Page A.L. 2003. The various and varying roles of specific chaperones in type III secretion systems. Curr Opin Microbiol. 6:7-14.

90. Passador L., Cook J.M., Gambello M.J., Rust L., Iglewski B.H. 1993. Expression of Pseudomonas aeruginosa virulence genes requires cell-to-cell communication. Science 260:1127-1130.

91. Pessi A., Bianchi E., Crameri A., Venturini S., Tramontano A., Sollazzo M., 1993. A designed metal-binding protein with a novel fold. Nature 362:367-369.

92. Potempa J., Golonka E., Filipek R., Shaw L.N. 2005. Fighting an enemy within: cytoplasmic inhibitors of bacterial cysteine proteases. Mol. Microbiol. 57:605-610.

93. Potempa J., Pike R.N., 2005. Bacterial peptidases Consents in Bacterial Virulence (Russell, W., Herward, H. Eds.) Contrib. Microbiol. 12:132-180.

94. Potempa J., Porwit-Bobr Z., Travis J. 1989. Stabilization vs. degradation of Staphylococcus aureus metalloproteinase. Biochim. Biophys. Acta. 993:301-304.

95. Rasmussen M., Bjorck L. 2002. Proteolysis and its regulation at the surface of Streptococcus pyogenes. Mol. Microbiol. 43:537-544.

96. Reed S.B., Wesson C.A., Liou L.E., Trumble W.R., Schlievert P.M., Bohach G.A., Bayles K.W., 2001. Molecular characterization of a novel Staphylococcus aureus serine protease operon. Infect. Immun. 69:1521-7.

97. Rice K., Peralta R., Bast D., De Azavedo J., McGavin M.J. 2001. Description of staphylococcus serine protease (ssp) operon in Staphylococcus aureus and nonpolar inactivation of sspA-encoded serine protease. Infect. Immun. 69:159-169.

98. Richards F.M., Vithayathil P.J. 1959. The preparation of subtilisn-modified ribonuclease and the separation of the peptide and protein components. J. Biol. Chem. 234:1459-65.

99. Rosenshine I., Finlay B.B. 1993. Salmonella's deceiving signals. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutrl. 7:453-454.

100. Sabat A., Kosowska K., Poulsen K., Kasprowicz A., Sekowska A., Van der Burg В., Travis J., Potempa J. 2000. Two allelic forms of the aureolysin gene (aur) within Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 68:973-976.

101. Sambrook J., Fritch E.F., Maniatis T. 1989. Molecular cloning: A laboratory Manual, second ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor NY.

102. Sansonetti P. 2001. Phagocytosis of bacterial pathogens: implications in the host response. Semin. Immunol. 13:381-90.

103. Schiavo G., Poulain В., Rossetto 0., Benfenati F., Tauc L., Montecucco C. 1992. Tetanus toxin is a zinc protein and its inhibition of neurotransmitter release and protease activity depend on zinc. EMBO J. 11:3577-3583.

104. Schimke R.T., Doyle D., 1970. Control of enzyme levels in animal tissues Anuu. Rev. Biochem 39. 929-976.

105. Schuch R, Maurelli A.T. 1997. Virulence plasmid instability in Shigella flexneri 2a is induced by virulence gene expression. Infect. Immun. 65:3686-3692.

106. Shaw L., Golonka E., Potempa J., Foster S.J. 2004. The role and regulation of the extracellular proteases of Staphylococcus aureus. Microbiology 150:217-228.

107. Sottrup-Jensen L., Sand O., Kristensen L., Fey G.FI. 1989. The a-macroglobulin bait region. Sequence diversity and localization of cleavage sites for proteinases in five mammalian a-macroglobulins. J. Biol. Chem. 264:15781-15789.

108. Spiess C., Beil A., Ehrmann M. 1999. A temperature-dependent switch from chaperon to protease in widely conserved heat shock protein. Cell 97:339-347.

109. Spudich J.A., Pardee J.D., Simpson P.A., Yamamoto K., Kuczmarski E.R., Slryer L. 1982. Actin and myosin: control of filament assembly. B. Biol. Sci. 299:247-261.

110. Stark W., Pauptit R. A., Wilson K. S., Jansonius J. N. 1992. The structure of neutral protease from Bacillus cereus at 0.2-nm resolution. Eur. J. Biochem. 207:781-791.

111. Starkey P.M., Barrett A.J. 1973. Inhibition by a-macroglobulin and other serum proteins. Biochem. J. 131:823-831.

112. Steiner D.F., Kemmler W., Tager H.S., Rubenstein A.H., Lernmark A., Zuhlke H. 1975. Proteases and Biological Control, edc. Reich E., Rifkin D.B., Shaw (Cold Spring Harbor aboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.) 12: 683-706.

113. Strzelecka-Golaszewska H., Mossakowska Mi, Wozniak A., Moraczewska J., Nakayama H. 1993. Long-range conformational effects of proteolytic removal of the last three residues of actin. Biochem. J. 307:527-534.

114. Sun Q.Y, Schatten H. 2006. Regulation of dynamic events by microfilaments during oocyte maturation and fertilization.» Reproduction: 131:193-205.

115. Svendsen I, Jensen B.R., Ottesen M., 1989. Complete amino acid sequence of alpha-acetolactate decarboxylase from Bacillus brevis. Carlsberg Res Commun. 54:157-63.

116. Szabova L., Yamada S.S., Birkedal-Hansen H., Holmbeck K. 2005. Expression pattern of four membrane-type matrix metalloproteinases in the normal and diseased mouse mammary gland. J. Cell. Physiol. 205:123-32.

117. Takahashi'M., Tezuka Т., Katunuma N., 1994. Inhibition-of growth and cysteine proteinase activity of Staphylococcus aureus V8 by phosphorylated cystatin alpha in skin cornified envelope: FEBS Lett. 355:275-8.

118. Takeuchi S., Kinoshita Т., Kaidoh Т., Hashizume N. 1999. Purification and characterization of protease produced by Staphylococcus aureus isolated , from a diseased chcken. Vet. Microbiol. 67:195-202.

119. Takeuchi S., Matsunaga K., Inubushi S., Higuchi H., Imaizumi K., Kaidoh T. 2002. Structural gene and. strain specificity of a novel cysteine protease produced by Staphylococcus aureus isolated from a diseased chicken. Vet. Microbiol. 89: 201-210.

120. Teplyakov A.V., Kuranova I.P., Harutyunyan E.H., Vainshtein BtK., Frommel C., Hohne W.E., Wilson K.S., 1990. Crystal structure of thermitase at* 1.4 A resolution. J. Mol. Biol. 214:261-79.

121. Thayer M. M., Flaherty К. M., McKay D. В. 1991. Three-dimensional structure of the elastase of Pseudomonas aeruginosa at 1.5-A resolution. J. Biol. Chem. 266:28642871.

122. Theriot J.A. 1995. The cell biology of infection by intracellular bacterial pathogens. Annu. Rev. Cell. Biol. 11:213-239.

123. Tsujibo H., Miyamoto K., Hasegawa Т., Inamori Y., 1990. Purification and characterization* of two types of alkaline serine proteases produced by an alkalophilic actinomycete. J. Appl. Bacterid. 69:520-9.

124. Tuteja R. 2005. Type I signal1 peptidase: an overview. Arch. Biochem. Biophys. 44:107-111.

125. Vallee B. L., Auld D. S., 1990. Zinc coordination, function, and structure of zinc enzymes and other proteins. Biochemistry 29:5647-5659.

126. Van Wart H.E., Birkedal-Hansen H. 1990. The cysteine switch: a principle of regulation of metalloproteinase activity with potential applicability to the entire matrix metalloproteinase gene family. Proc. Natl. Acad. Sci. 87:5578-5582.

127. Vargaftig B.B., Lefort J., Giroux E.L. 1976. Haemorrhagic and inflammatory properties of collagenase from C. histolyticum. Agents Actions. 6(5):627-35.

128. Velge P, Kaeffer B, Bottreau E, Van Langendonck N. 1995. The loss of contact inhibition and anchorage-dependent growth are key steps in the acquisition of Listeria monocytogenes susceptibility phenotype by non-phagocytic cells. Biol. Cell. 85:55-66.

129. Velge P., Bottreau E., Kaeffer В., Yurdusev N., Pardon P., Van Langendonck N. 1994. Protein tyrosine kinase inhibitors block the entries of Listeria monocytogenes and Listeria ivanovii into epithelial cells. Microb. Pathog. 17:37-50.

130. Verma R.P., Hansch C. 2007. Matrix metalloproteinases (MMPs): chemical-biological functions and (Q) SARs. Bioorg. Med. Chem. 15:2223-68.

131. Wang C.C., Tsou C.L. 1998. Enzymes as chaperones and chaperones as enzymes. FEBSLett. 425:382-4.

132. Wasylewski Z., Stryjewski W., Wasniowska A., Potempa J., Baran K. 1986. Effect of calcium binding on conformational changes of staphylococcal metalloproteinase measured by means of intrinsic protein fluorescence. Biochim. Biophys. Acta. 871:177181.

133. Wladyka В., Puzia K., Dubin A. 2005. Efficient co-expression of a recombinant staphopain A and its inhibitor staphostatin A in Escherichia coli. Biochem. J. 385:181187.

134. Yamaguchi Т., Hayashi Т., Takami H., Nakasone K., Ohnishi M., Nakayama K., Yamada S., Komatsuzawa H., Sugai M. 2000. Phage conversion of exfoliative toxin A production in Staphylococcus aureus. Mol. Microbiol. 38: 694-705.

135. Zhou D., Mooseker M.S., Galan J.E. 1999. An invasion-associated Salmonella protein modulates the actin-bundling activity of plastin. Proc. Natl. Acad. Sci. 96:1017610181.

136. Zhu X., Ohta Y., Jordan F., Inouye M. 1989. Pro-sequence of subtilisin can guide the refolding of denatured subtilisin in an intermolecular process. Nature 339:483-484.

137. Ефремова Т.Н., Эндер Н.А., Брудная М.С., Комиссарчик Я.Ю., Хайтлина С.Ю. 1998. Инвазия Escherichia coli А2 вызывает реорганизация актиновых микрофиламентов в клетках Нер-2. Цитология 40:524-8.

138. Мантуленко В.В., Хайтлина С.Ю., Шелудько Н.С.1983. Большой фрагмент актина, устойчивый к дальнейшему протеолизу. Биохимия 48:69-74.

139. Миргородская Е.П., Казанина Г.А., Миргородская О.А., Хайтлина С.Ю. 1995. Протеаза ЕСР32, характеристика фермента, изучение специфичности. Биоорг. Хим. 21(10):761-766.

140. Усманова, Хайтлина, 1989 Протеаза бактерий Е. coli А2, специфически расщепляющая актин. Биохимия. 54:1308-1314.

141. Федорова З.Ф. 1982. L-трансформирующий эффект фуразолидона на клетки Shigella flexneri. Антибиотики. 27:527-530.

142. Федорова З.Ф., Хайтлина С.Ю., 1990. Обнаружение протеазы, спцифически расщепляющей актин у ревертантах L-форм Shigella flexneri. Бюлл. Эксп. Мед. 110:46-8.

Информация о работе

Божокина, Екатерина Сергеевна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2008
ВАК 03.00.03

Диссертация

Термолизиноподобные металлопротеазы бактерий и их роль в инвазии эукариотических клеток - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы