Роль протеализина в бактериальной инвазии

Цаплина, Ольга Анатольевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль протеализина в бактериальной инвазии
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Роль протеализина в бактериальной инвазии"

ЦАПЛИНА Ольга Анатольевна

РОЛЬ ПРОТЕАЛИЗИНА В БАКТЕРИАЛЬНОЙ ИНВАЗИИ

03.03.04. - Клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических паук

2 7 ОКТ 2011

Санкт-Петербург - 2011

4858225

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Хайтлина София Юрьевна Институт цитологии РАН

доктор биологических наук Гамалей Ирина Акивовна Институт цитологии РАН

доктор биологических наук, профессор Мосевицкий Марк Исаакович Петербургский институт ядерной физики им. Б. П. Константинова РАН

Ведущая организация: Казанский (Приволжский) федеральный

университет, Биолого-почвенный факультет

Защита диссертации состоится «11» ноября 2011 года в 13 часов на заседании

Диссертационного совета Д 002.230.01 при Институте цитологии РАН по

адресу: 194064 Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д.4.

Адрес электронной почты Института: cellbio@mail.cvtspb.rssi.ru

Сайт: ЬНр//\у\т.су15рЬ.Г55!.п1

Факс: 8 (812) 297-35-41

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН

Автореферат разослан «октября 2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат биологических наук ^ (УДО^-С*-—> Е.В.Каминская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Актин вовлечен в большинство клеточных процессов, от перестроек хроматина и регуляции транскрипции до внутриклеточного транспорта, различных типов движения клеток и сокращения мышц. Поэтому не удивительно, что актиновый цитоскелет является мишенью для токсинов вирусов и болезнетворных бактерий, взаимодействующих с клетками эукариот. Проникновение бактерий в клетку-хозяина (инвазия) - это процесс, в котором взаимодействие бактериальных и клеточных факторов приводит к интернализации бактерий в клетки эукариот, которые в норме не фагоцитируют. Хотя бактерии разработали различные способы инфицирования клетки-хозяина, общими для всех видов инвазии являются активация сигнальной системы клетки и реорганизация ее цитоскелета. Патогенные бактерии попадают в клетку-хозяина с помощью одного из двух сигнальных путей. Один путь - это прямая интернализация бактерий, индуцированная , взаимодействием бактериального белка с поверхностным рецептором, вовлеченным в распластывание или подвижность клетки. Другой процесс напоминает макропиноцитоз, при котором образование выростов клеточной поверхности, захватывающих бактерию, индуцируется секрецией комплекса специфических бактериальных белков, встраивающихся в мембрану клеток эукариот и образующих пору, через которую бактериальные белки попадают в цитоплазму. Оба процесса связаны с реорганизацией цитоскелета, последовательной деполимеризацией и полимеризацией актина (Cossart, Sansonetti, 2004). Поэтому факторами вирулентности могут становиться бактериальные белки, влияющие на равновесие между G- и F-формами актина.

При исследовании свойств бактериальной металлопротеазы ЕСР32, ограниченно расщепляющей актин в единственном сайте, интенсивно вовлеченном в контакт между мономерами актина в полимере (Khaitlina et al., 1991), было показано, что непатогенные бактерии-продуценты протеазы ЕСР32 способны проникать в клетки эукариот и вызывать реорганизацию их цитоскелета (Efremova et al., 2001). Позднее было установлено, что бактерии-продуценты протеазы ЕСР32 - это Serratia grimesii (Bozhokina et al., 2008). Способность к инвазии после синтеза актин-специфической металлопротеазы была подтверждена на бактериях референтного штамма Serratia grimesii, а соответствующий белок был назван гримслизином (Bozhokina et al., 2008).

наиболее полно охарактеризованных термолизинподобных протеаз. Кроме того, геном S. proteamaculans полностью секвенирован (GenBank ID СР000826). Поэтому использование этих бактерий и протеализина является перспективным для исследования механизмов инвазии, связанных с перестройками актинового цитоскелета.

Цель и задачи исследования. Целью работы является исследование протеолитической активности металлопротеазы протеапизин из бактерий Serratia proteamaculans в связи с возможным участием этой протеазы в бактериальной инвазии.

Задачи настоящей работы:

1. Определить сайты протеолиза актина протеализином и исследовать свойства G- и F-актина, расщепленного протеализином.

2. Выяснить, способны ли бактерии S. proteamaculans проникать внутрь клеток эукариот.

3. Исследовать актиназную и инвазивную активность неинвазивных бактерии Е. coli после трансформации плазмидой, содержащей ген протеализина.

4. Исследовать актиназную и инвазивную активность бактерии S. proteamaculans после нокаута гена протеализина.

5. Определить локализацию протеализина при инкубации бактерий-продуцентов с клетками эукариот и исследовать возможные мишени действия протеализина.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Протеализин расщепляет актин не только в сайте Gly42-Val43, идентичном сайту расщепления актина протеазой ЕСР32, но и в сайтах Thr66-Leu67 и Gly63-Ile64, расположенных в нуклеотид-содержащей щели молекулы. Свойства актина, расщепленного протеализином, аналогичны свойствам актина, расщепленного ЕСР32. Кроме того, протеализин частично расщепляет фибриллярный актин, уменьшая степень его полимеризации и усиливая динамику полимера. Действие протеализина ингибируют факторы, стабилизирующие связи между мономерами при образовании полимера.

2. Бактерии S. proteamaculans 94, природные продуценты протеализина, способны к инвазии в клетки эукариот после появления в них активного протеализина, ограниченно расщепляющего актин.

3. Трансформация плазмидой, содержащей ген протеализина, придает неинвазивным бактериям Е. coli способность проникать в клетки эукариот.

4. Во время инвазии бактерий-продуцентов протеализин попадает во внеклеточную среду и в клетки эукариот. Однако присутствие протеализина во внеклеточной среде не приводит к проникновению неинвазивных бактерии Е. coli в клетки Нер-2.

5. Полученные данные позволяют предположить, что протеализин участвует в инвазии бактерий-продуцентов, будучи транслоцированным в клетки эукариот, и его наиболее вероятной мишенью во время бактериальной инвазии является актин.

Научная новизна. Показано, что протеализин расщепляет актин не только в сайте Gly42-Val43 в ДНКазной петле молекулы, но также и в сайтах Thr66-Leu67 и Gly63-Ile64, расположенных в нуклеотид-содержащей щели, с образованием фрагмента с молекулярной массой 33 кДа. Свойства G-актина, расщепленного протеализином, аналогичны свойствам актина, расщепленного ЕСР32. Расщепление G-актина протеализином в растворе обратимо препятствует полимеризации актина. Впервые показана способность условно-патогенных бактерий S. proteamaculans, синтезирующих протеализин, проникать в клетки эукариот. Показано, что неинвазивные бактерии Е. coli после трансформации плазмидой, несущей ген протеализина, приобретают способность проникать в клетки эукариот. Впервые показано, что в бактериях дикого штамма S. proteamaculans существует механизм инвазии, не зависящий от протеализина. Показано, что во время инвазии бактерий-продуцентов протеализина протеаза появляется во внеклеточной среде и в цитоплазме клеток эукариот. Кроме того показано, что протеализин во внеклеточной среде может быть активатором матриксной металлопротеазы ММР2, которая, по данным литературы, может способствовать инвазии. Однако присутствие протеализина во внеклеточной среде не приводит к проникновению неинвазивных Е. coli внутрь клеток эукариот. Впервые исследован протеолиз F-актина протеализином и показано, что расщепление протеализином приводит к ускорению обмена субъединиц в полимере, на которое влияют фториды алюминия и натрия. Эти данные являются первым экспериментальным подтверждением транслокации протеализина из бактерий в клетки эукариот и позволяют предполагать, что его мишенью является актин.

Теоретическое и практическое значение работы. Чувствительность клеток к инвазии может быть показателем физиологического состояния клетки при различных воздействиях и степени ее трансформированное™. Известно, что инвазия бактерий усиливается пролиферативной активностью и опухолевой трансформацией клеток (Velge et al., 1997). С другой стороны, чувствительность клеток эукариот к инвазии может быть уменьшена в экспериментальных условиях в результате воздействия антиоксидантов (Gamaley et al., 2006). Поэтому взаимодействие культивируемых клеток эукариот с условно-патогенными бактериями-продуцентами протеализина является хорошей моделью для выявления физиологического состояния клетки-хозяина.

В клинических изолятах обнаруживают бактерии S. proteamaculans так же, как и бактерии наиболее патогенного вида серрации Serratia marcescens, вызывающие пневмонию, инфекции мочевыводящих путей и хирургических ран. В свете данных о том, что условно-патогенные бактерии 5. proteamaculans проникают в клетки человека, важно изучение механизма инвазии бактерий и факторов, влияющих на их патогенность. Определение ферментов, обеспечивающих инвазию бактерий, их свойств и мишеней будет способствовать разработке способа борьбы с условно-патогенными бактериями вида Serratia.

Обнаруженная в работе способность протеализина расщеплять F-актин, может быть использована для изучения факторов, влияющих на полимеризацию и деполимеризацию актина, внутриклеточных функций актина и структуру полимеров актина. В работе представлены данные о стабилизации полимеров актина фторидом натрия, который в экспериментах на клетках используется как активатор малых ГТФаз и ингибитор фосфатаз (Bogatcheva et al., 2006; Wang et al., 2001; Jaconi et al., 1993). Фосфат натрия ингибирует расщепление F-актина протеализином и ускоряет полимеризацию расщепленного актина, по-видимому, стабилизируя межмономерные контакты и ускоряя нуклеацию. Таким образом, вызываемые им эффекты при воздействии на клетки эукариот могут возникать в результате прямого взаимодействия фторида натрия с актином, что следует учитывать при использовании фторида натрия в качестве активатора сигнальных каскадов.

Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ, в том числе 2 статьи и 14 тезисов. Основные положения работы представлены на Всероссийской межвузовской научно-технической конференции студентов и аспирантов «XXXV и XXXVI Неделя науки СПбГПУ» (Санкт-Петербург, 2006 и 2007), Международном симпозиуме «Biological Motility. Achievements and Perspectives» (Пущино, 2008), 12-й и 13-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века» (Пущино, 2008 и 2009), IV и V Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009 и Петрозаводск, 2011), 49-й ежегодной конференции Американского общества клеточных биологов (Сан Диего, 2009), III Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия» (Нижний Новгород, 2010), Международной школе молодых ученых по молекулярной генетике «Геномика и биология клетки» (Звенигород, 2010), XXIII Международной зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2011 ) и на научных семинарах Отдела клеточных культур Института цитологии РАН.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающих 134 ссылки. Диссертация изложена на 132 страницах и иллюстрирована 65 рисунками и 1 таблицей.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактерии и клеточные линии. Бактерии S. proíeamaculans 94 (Demidyuk et al., 2006) выращивали с аэрацией в среде LB (бульон Луриа) при 30 °С, S. proíeamaculans pin", несущие инактивированный ген протеализина в результате вставки 900 пар нуклеотидов по сайту рестрикции Kpnl, при 30 °С в присутствии 40 мкг/мл гснтамицина (Gm) в среде LB. Генноинженерные штаммы Е. coli BL21 (DE3) (pET23b), Е. coli BL21 DE3 (pProPlnHis6) и Е. coli BL21 DE3 (pProPlnHisc/A) выращивали без антибиотиков или в присутствии 100 мкг/мл ампициллина (Amp), соответственно, в среде LB при 37 °C(Gromova et al., 2009). Бактерии всех штаммов были получены из Лаборатории белковой инженерии ИМГ РАН. Клетки эпидермальной карциномы гортани человека Нер-2 и эмбриональные клетки мыши, трансформированные вирусом SV40, Balb ЗТЗ SV40 (Российская коллекция клеточных культур, Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург) выращивали на покровных стеклах в модифицированной Дальбекко среде Игла (DMEM) («Биолот», Россия), содержавшей 10% эмбриональной бычьей сыворотки («Sigma Chemical Co.») при 37 °С в атмосфере 5 % СО2 до образования монослоя (обычно ~ 48 ч).

Получение белков. Протеализин получали из клеточного экстракта Е. coli BL21 DE3 (pProPlnHis6), используя последовательно металл-хелатирующую афинную хроматографию на колонке Ni2+-NTA -agarose (Qiagen, USA) и гельпроникающую хроматографию на колонке Superdex 75 HR 10/30 («Amersham Biosciences»), как описано (Gromova et al., 2009). Протеализин хранили в 25 мМ Tris-HCl, pH 8.0 при 4 °С.

Актин скелетных мышц кролика выделяли стандартным методом (Spudich, Watt, 1971). Глобулярный актин (G-актин) хранили в буфере G (0.2 мМ АТР, 0.1 мМ СаС12, 5 мМ Tris-HCl, pH 7.5, 0.02 % NaN3) на льду в течение недели или замораживали 0.2 мл аликвоты раствора (0.5-1.0 мг/мл) при -20 °С для однократного использования. Для получения Mg-G-актина ион Ca замещали на ион Mg, инкубируя Ca-G-актин 3-5 мин с раствором 0.2 мМ EGT А/0.1 мМ MgCl2 при комнатной температуре. В актине предпоследний остаток полипептидной цепи Cys374 конъюгировали с N-(l-pyrenyl)iodoacetamide для измерения интенсивности флуоресценции и N-iodoacetyl-N'-(5-sulpho-l-naphthyl)ethylenediamine (IAEDANS) для визуализации фрагментов протеолиза в ультрафиолетовом свете (Kouyama, Mihashi, 1981; Strzelecka-Golaszewska et al., 1996). Для стабилизации актина фторидом алюминия актин инкубировали с

1 мМ АТФ и 5 мМ ЫаР 10 мин, затем добавляли 1 мМ А1С13 и инкубировали еще 10 мин (Р1уоуагоуа е1 а1., 2010). Концентрацию О-актина определяли спектрофотометрически, используя коэффициент поглощения 0.63 мл мг 1 см'1 при длине волны 290 нм или микробиуретовым методом (КгЬакч, С[11,1964).

Определение флуоресценции и светорассеяния. Измерения проводили на спектрофлуориметре Флюорат-02-Панорама. Интенсивность флуоресценции 5-20%-ного пиренил-меченного актина измеряли при длине волны возбуждения и испускания 365 нм и 407 нм соответственно. Интенсивности светорассеяния измеряли под углом 90°, при длине волны 350 нм. Для визуализации АЕОДомеченных фрагментов актина гель фотографировали в ультрафиолете.

Определение скорости гидролиза АТФ. С интервалом в 5 мин из раствора актина (1 мг/мл) отбирали аликвоты, останавливали реакцию добавлением равного объема 0.6 М НС104 во льду, удаляли денатурировавший белок центрифугированием и инкубировали супернатант с равным объемом раствора малахитового зеленого 35 мин при 25 °С, а затем измеряли интенсивность проходящего света при длине волны 650 нм (Кос1ата е1 а1., 1986).

Определение протеолитической активности. Актин в буфере в (1 мг/мл) инкубировали с протеализином (0.3 мг/мл в 25 мМ Тпз-НС1, рН 8.0) при разных соотношениях фермент/субстрат при 22 °С. Реакцию останавливали добавлением равного объема буфера, содержавшего 4% Бз-\та, 125 мМ Тпб-НС1, рН 6.8, с последующим кипячением проб в течение 3 мин. Продукты реакции анализировали с помощью Оз-Ка-ПААГ-электрофореза (ЬаеттП, 1970). О наличии актиназной активности судили по появлению специфических фрагментов актина.

Для определения способности бактериальных экстрактов расщеплять актин бактерии, выращенные в среде ЬВ, осаждали центрифугированием (9600 10 мин). Осадки суспензировали в буфере в, выравнивали концентрацию бактерий в суспензиях по поглощению при длине волны 600 нм и разрушали бактерии с помощью замораживания-оттаивания (пять циклов). Бактериальные экстракты осветляли центрифугированием (9600 10 мин). Актин в буфере в (1 мг/мл) смешивали с равным объемом осветленного бактериального экстракта и инкубировали 2 ч при комнатной температуре. Останавливали реакцию и анализировали продукты, как описано выше для протеолиза актина протеализином.

Для проверки чувствительности матриксной металлопротеазы ММР2 к протеализину использовали зимографию с желатином. Кондиционированную фибробластами среду, содержащую ММР2 в форме предшественника, инкубировали с протеализином в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем препараты выдерживали 30 мин с раствором для проб, содержавшим 62.5

мМ Tris-HCl, pH 6.8, 0.1 % Ds-Na, и анализировали при помощи Ds-Na-ПААГ-электрофореза, который отличался от стандартного присутствием 0.3 % желатина в разделяющем геле. По окончании электрофореза гель дважды отмывали 2.5%-ным тритоном Х-100 для удаления Ds-Na и инкубировали в буфере, содержавшем 5 мМ СаС12 и 50 мМ Tris-HCl, pH 7.2-7.4, 18 ч при 37 °С для ренатурации протеаз и протекания протеолитических реакций. После инкубации гель фиксировали в растворе, содержащем 25 % изопропанола и 10% уксусной кислоты, в течение 30 мин и окрашивали Кумасси G 250.

Определение сайтов расщепления актина. Фрагменты актина, полученные в результате протеолиза протеализином, разделяли Ds-Na-ПААГ-электрофорезом, переносили на PVDF-мембрану («Millipore», США) и анализировали их N-концевые аминокислотные остатки автоматической деградацией по Эдману на секвенаторе ABI Procise 491 («Proteome Factory AG», Германия).

Определение инвазивной активности. Бактерии выращивали в среде LB при 30 или 37 °С с аэрацией до появления актиназной активности. 210б бактерий осаждали центрифугированием (9600 g, 10 мин), осадок ресуспендировали в растворе красителя F ITC (1 мг/мл) и инкубировали в течение 15 мин при 37 °С. После окраски бактерии отмывали фосфатно-солевым буфером, ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере и добавляли к клеткам эукариот, предварительно сменив культуральную среду на свежую. Клетки эукариот и бактерии совместно культивировали в течение 2-3 ч при 37 °С в атмосфере 5%-ного С02.

Конфокальная микроскопия. Для визуализации актинового цитоскелета клетки отмывали фосфатно-солевым буфером, фиксировали 3.7%-ным формалином в течение 10 мин, инкубировали 5 мин с 0.1%-ным тритоном Х-100 и окрашивали родамин-фаллоидином 15 мин. Для визуализации протеализина препараты, обработанные тритоном Х-100 перед окраской цитоскелета родамин-фаллоидином, выдерживали 30 мин в 1%-ном BSA. Затем препараты инкубировали с поликлональными кроличьими антителами к протеализину в 1%-ном BSA, 18 ч при 4°С. После отмывки раствором 0.05%-ного Tween препараты инкубировали с антителами против IgG(H+L) кролика, конъюгированными с красителем Alexa 647 (Jackson ImmunoResearch Inc.), и отмывали 0.05%-ным Tween. Готовые препараты просматривали в микроскопе Leica TCS SL, используя систему аргонового (488 нм) и гелиево-неонового (532 нм и 634 нм) лазеров.

Электронная микроскопия. Клетки фиксировали 2.5%-ным раствором глутарового альдегида в фосфатно-солевом буфере в течение 40 мин, а затем 2%-ным раствором четырехокиси осмия в фосфатно-солевом буфере 30 мин. Препараты обезвоживали, проводя через спиртовые растворы возрастающей

концентрации, переводили в абсолютный ацетон и заливали в смесь эпон-аралдит. Ультратонкие срезы контрастировали цитратом свинца и 2%-ным раствором уранилацетата в 50%-ном этаноле и исследовали в электронном микроскопе 1ЕМ-100С при 80 кВ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Расщепление глобулярного актина протеализином

ЕСР32/гримелизин расщепляет актин только в одном сайте в1у42 - Уа143 с образованием двух фрагментов с мол. массой 36 и 5 кДа (КИаШпа е1 а1., 1991). Эту способность фермента к ограниченному протеолизу актина, при котором сохраняются функциональные свойства актина, мы в дальнейшем будем называть актиназной активностью. Протеализин при весовом отношении 1:100 через 30 мин инкубации полностью расщепляет глобулярный (в-актин) с образованием фрагмента с мол. массой 36 кДа, который не подвергается дальнейшему протеолизу (Рис. 1А). Определенная ТЯ-концевая аминокислотная последовательность этого фрагмента Уа1-Ме1-Уа1-01у-Ме1-С1п соответствует сайту расщепления актина С1у42-Уа143. При увеличении концентрации протеализина в десять раз происходит дальнейший протеолиз фрагмента с мол. массой 36 кДа с образованием дополнительного фрагмента с мол. массой 33 кДа (Рис. 1Б). При определении И-концевой последовательности этого фрагмента на каждом шаге было определено более одной аминокислоты. По-видимому, в результате протеолиза актина в двух близлежащих сайтах происходит образование двух фрагментов с мол. массой около 33 кДа, которые не различимы при электрофорезе. Белковые фрагменты с молекулярной массой 33 кДа имеют М-концевые последовательности Ьеи-Ьуз-Туг-Рго-Пе-С1и и Пе-Ьеи-ТЬг-Ьеи-ЬуБ-Туг. Эти последовательности соответствуют сайтам расщепления актина ТЬг66-Ьеи67 и С1у63-11е64 на расстоянии трех аминокислот друг от друга. Таким образом, протеализин расщепляет актин не только в сайте, идентичном сайту расщепления ЕСР32, но и в двух других сайтах, расположенных в нуклеотидной щели мономера. Возможно, это различие связано с аминокислотными заменами на поверхности фермента, которыми протеализин отличается от ЕСР32/гримелизина (Цаплина и др., 2009).

Многие протеазы имеют дополнительные сайты расщепления на чувствительном к протеолизу С-конце актина (Моте!, Це, 1984). Поэтому определяли чувствительности С-конца актина к протеализину. Для этого актин, в котором Суэ374 (предпоследний остаток полипептидной цепи) был конъюгирован с АЕОАМБ, инкубировали при весовом соотношении фермента к субстрату от 1:10 до 1:1000. Дополнительные фрагменты на СООН-конце не появлялись, и флуоресцентная метка сохранялась (Рис. 1В). Таким образом, протеализин не отщепляет С-концевой сегмент актина.

Рис. 1. Актиназная активность протеализина. Немеченый (А, Б) или AEDANS-меченный (В) G-актин инкубировали с протеализином при весовом соотношении 1:100 (А), 1:10 (Б) или указанном на рисунке (В) при 22 °С в течение времени, указанном на

2. Корреляция между актиназной и инвазивной активностью бактерий

2.1. Бактерии дикого штамма Serratia proteamaculans 94. Ранее было показано, что протеаза ЕСР32 появляется только на стационарной стадии роста бактериальной культуры (Khaitlina et al., 1988). Поэтому мы определили время роста культуры, необходимое для появления активного протеализина. Бактерии S. proteamaculans 94 не синтезируют активный фермент не только на логарифмической стадии роста, но и при выходе культуры на стационарную стадию роста. Способность экстрактов бактерий расщеплять актин появлялась только на поздней стационарной стадии роста через 49 ч роста культуры (Рис. 2).

Рис. 2. Актиназная активность экстрактов S. proteamaculans 94 на разных стадиях роста культуры. Цифры на рисунке соответствуют времени культивирования бактерий, взятых для определения актиназной активности в их экстрактах.

Синтез протеазы ЕСР32 коррелирует с инвазивной активностью бактерий-продуцентов, поэтому с помощью конфокальной микроскопии была проверена способность к инвазии бактерий S. proteamaculans 94. На ранней стационарной стадии роста (24-28 ч после посева), до появления активного протеализина, бактерии в клетки Нер-2 не проникали. После выявления активного протеализина в бактериальных экстрактах бактерии-продуценты были обнаружены в цитоплазме примерно 10 % клеток Нер-2 (Рис. 3). Клетки, не зараженные бактериями, содержат пучки актиновых микрофиламентов. В результате инкубации с бактериями в клетках происходит реорганизация актинового цитоскелета с образованием многочисленных выростов, нарушается монослой, изменяется форма клеток.

• -актин-=»= ч - актин - -ЗбкДа--ЗЗкДа-

А К 1:10 1:501:5<М

0 0.5 1 2 4

Б Жтт В

рисунке (А, Б) или 2 ч (В).

МИИИИМ*9^ - актин

• -ЗбкДа 0 6.5 24 25 26 27 29 30 32 49 ч

Рис. 3. Инвазия бактерий S. proteamaculans 94 в клетки Нер-2. Клетки Нер-2 инкубировали 3 ч с бактериями, взятыми через 49 ч роста. Контроль - клетки Нер-2, не зараженные бактериями.

Масштаб: 15 мкм.

Для подтверждения результатов конфокальной микроскопии после инкубации клеток Нер-2 с бактериями препараты анализировали с помощью электронной микроскопии. В препаратах были обнаружены бактерии, как прикрепившиеся к клеткам Нер-2 (Рис. 4А), так и внутри клеток Нер-2, в вакуолях (рис. 4Б). Таким образом, бактерии S. proteamaculans 94 способны проникать внутрь клеток Нер-2 только на поздней стационарной стадии роста, и эта способность коррелирует с синтезом зрелого протеализина (Цаплина и др., 2009).

Рис. 4. Разные стадии проникновения бактерий S. proteamaculans 94 в клетки Нер-2 по данным электронной микроскопии. А - контакт бактерии с клетками Нер-2; Б цитоплазматическая локализация бактерии.

2.2. Бактерии рекомбинантных штаммов Е. coli, синтезирующие протеализин. Чтобы показать, что синтеза протеализина достаточно для обеспечения инвазивной активности бактерий, были исследованы бактерии Е. coli, трансформированные плазмидой, несущей ген протеализина.

Способность расщеплять актин с образованием фрагмента с мол. массой 36 кДа была обнаружена в экстрактах бактерий Е. coli, синтезирующих протеализин, уже через 6.5 ч после посева на логарифмической стадии роста культуры. Помимо фрагмента с мол. массой 36 кДа образуется дополнительный фрагмент с мол. массой 33 кДа (Рис. 5).

Рис 5. Актиназная активность экстрактов на разных стадиях роста бактерий Е. coli, синтезирующих протеализин. Цифры на рисунке соответствуют времени

I — ЗбкДа ■ —ЗЗкДа

0 6.5 24 25 26 27 29 30 32 48

культивирования бактерий, взятых для проверки актиназной активности в их экстрактах.

По данным конфокальной и электронной микроскопии бактерии Е. coli, синтезирующие протеализин, активно проникают в клетки Нер-2. В цитоплазме клеток эукариот было обнаружено значительное количество бактерий. После инкубации с бактериями монослой становился более рыхлым (Рис. 6Б). Бактерии Е. coli, трансформированные плазмидой, не содержащей ген протеализина, были найдены только в межклеточном пространстве. Цитоскелет клеток Нер-2 был изменен незначительно (Рис. 6А). Таким образом, неинвазивные Е. coli после трансформации плазмидой, несущей ген протеализина, приобретают способность проникать в клетки эукариот (Bozhokina, Tsaplina et al., 2011).

Рис. 6. Инвазия бактерий Е. coli, синтезирующих протеализин, в клетки Нер-2 по результатам конфокальной (Б) и электронной (Г) микроскопии. Для контроля использовали бактерии Е. coli, трансформированные плазмидой без гена протеализина (А, В). Клетки Нер-2 инкубировали 3 ч с бактериями, взятыми через 22 ч после посева. Масштаб: 10 мкм.

Для подтверждения роли протеализина в инвазии были исследованы бактерии Е. coli, синтезирующие мутантный протеализин с точечной заменой глутаминовой кислоты на аланин в активном центре. Мутантный протеализин после замены глутаминовой кислоты, отвечающей за координацию молекулы воды в сайте связывания цинка (Matthews, 1988), должен был быть неактивным. И действительно, предшественник протеализина, несущий мутацию в каталитическом центре, полностью теряет способность самостоятельно отщеплять пропептид, что необходимо для активации фермента (Gromova et al., 2009). Однако экстракт бактерий Е. coli, синтезирующих мутантный протеализин, на стационарной стадии роста все же способен расщеплять актин с образованием фрагмента с мол. массой 36 кДа. Эта способность проявляется при увеличении срока инкубации актина с экстрактом бактерий до 24-48 ч. При этом бактерии Е. coli, синтезирующие мутантный протеализин, проникали в клетки Нер-2, вызывая перестройки актинового цитоскелета (Bozhokina,

Tsaplina et al., 2011). Таким образом, бактериям Е. coli, синтезирующим протеализин, недостаточно точечной мутации протеализина в активном центре для потери актиназной и инвазивной активности. Синтез протеализина, обладающего актиназной активностью, является достаточным фактором для того, чтобы рекомбинантные бактерии-продуценты проникали в клетки эукариот.

2.3. Бактерии S. proteamaculans pin" после нокаута гена протеализина.

Чтобы определить, является ли именно протеализин ключевым фактором инвазии бактерий, были исследованы бактерии S. proteamaculans pin", несущие дефектный ген протеализина.

Экстракт этих бактерий актин не расщеплял. Бактерии S. proteamaculans pin" не проникали в клетки эукариот на ранней стационарной стадии роста. Способность проникать в клетки эукариот появляется у бактерий дикого штамма S. proteamaculans 94 только на поздней стационарной стадии роста, когда в бактериях обнаруживается активный протеализин (Рис. 2-4). Поэтому мы сравнили инвазивную активность бактерий S. proteamaculans до и после инактивации гена протеализина на поздней стадии роста культуры. Бактерии S. proteamaculans pin", несущие дефектный ген протеализина, как и бактерии дикого штамма S. proteamaculans 94, были обнаружены в цитоплазме клеток Balb 3T3-SV40 (Рис. 7). Таким образом, бактерии S. proteamaculans после инактивации гена протеализина не теряют способности к инвазии (Цаплина и др., 2010). Появление инвазивной активности бактерий S. proteamaculans pin", несущих дефектный ген протеализина, совпадает с появлением инвазивной и актиназной активности бактерий дикого штамма 5. proteamaculans 94.

Рис. 7. Инвазивная активность бактерий S. proteamaculans pin" (В), несущих дефектный ген протеализина, и бактерий S. proteamaculans 94 (Б), синтезирующих активный протеализин, на поздней стационарной стадии роста. Клетки Balb 3T3-SV40 инкубировали 3 ч с бактериями, взятыми через 45 ч после посева. Для контроля (А) использовали клетки Balb 3T3-SV40, не зараженные бактериями. Масштаб: 15 мкм.

Таким образом, актиназной активности протеализина достаточно для

проявления бактериями-продуцентами инвазивной активности, в то время как инактивации гена протеализина не достаточно для потери бактериями инвазивной активности. Эти данные не исключают участия протеализина в инвазии, но указывают на существование в Serratia механизма инвазии, не зависящего (или слабо зависящего) от протеолиза актина протеализином. Вирулентным фактором инвазии при этом может быть порообразующий токсин (цитолизин) ShlA, экспрессия которого способствует инвазии S. marcescens, наиболее патогенного вида Serratia (Hertie, 2005). Известно, что геном S. proteamaculans содержит ген этого токсина, но экспрессируется ли он, неизвестно.

3. Возможные механизмы инвазии бактерий-продуцентов протеализина

Появление активного протеализина является достаточным фактором для инвазии бактерий-продуцентов, поэтому дальнейшая работа была направлена на поиск возможных механизмов инвазии бактерий, синтезирующих протеализин.

3.1. Локализация протеализина во время инвазии бактерий-продуцентов. Для определения локализации протеализина во время инвазии бактерий S. proteamaculans 94 и Е. coli, синтезирующих протеализин, в клетки Balb 3T3-SV40 препараты окрашивали антителами к протеализину. Фермент был обнаружен во внеклеточной среде и внутри клеток эукариот (Рис. 8) (Цаплина и др., 2011). Таким образом, несмотря на предварительные данные о том, что протеализин не секретируется во внеклеточную среду (И.В. Демидюк, личное сообщение), мишень действия протеазы может находиться как во внеклеточной среде, так и внутри клеток эукариот.

Рис. 8. Локализация протеализина во время бактериальной инвазии. Клетки Balb

3T3-SV40 инкубировали 2 ч с бактериями S. proteamaculans 94 и Е. coli, синтезирующими протеализин, взятыми через 45 ч и 18ч роста соответственно. Масштаб: 15 мкм.

3.2. Чувствительность матриксных металлопротеаз к протеализину.

Во внеклеточной среде протеазы могут запускать сигнальные каскады. В том числе известно, что некоторые бактерии секретируют протеазы, которые становятся вирулентными факторами, активируя или ингибируя матриксные металлопротеиназы (Okamoto et al., 2004). После активации матриксные металлопротеиназы расщепляют белки внеклеточного матрикса и другие субстраты, играя при этом ключевую роль в пролиферации, дифференцировке, миграции клеток, межклеточных взаимодействиях и других процессах жизнедеятельности организма в норме и при патологиях (Stetler-Stevenson, Yu, 2001).

Используя зимографию на желатине, мы проверили чувствительность матриксной металлопротеазы ММП2 к протеализину. Нативный протеализин расщепляет желатин (Demidyuk et al., 2006), но после SDS-электрофореза он эту способность утрачивает (Рис. 9). При добавлении протеализина к кондиционированной среде фибробластов, содержащей предшественник ММП2 с мол. массой 72 кДа, протеализин расщепляет ММП2 с образованием фрагмента с молекулярной массой около 66 кДа, что соответствует мол. массе активированной ММП2 (Цаплина и др., 2009).

Рис. 9. Чувствительность матриксной металлопротеазы ММП2 к протеализину. Кондиционированную среду

фибробластов, содержащую ММП2 в форме предшественника (72 кДа), инкубировали с протеализином в указанной внизу рисунка концентрации, 2 ч при 22 °С. Pin - препарат протеализина.

Таким образом, можно предположить, что ММП2 может быть мишенью действия протеализина во внеклеточной среде и способствовать инвазии бактерий, синтезирующих протеализин.

3.3. Проверка инвазивной активности неинвазивны.х бактерий Е. coli при добавлении протеализина во внеклеточную среду. Для проверки предположения о том, что протеализин обеспечивает инвазию бактерий-продуцентов, оказавшись во внеклеточной среде, клетки Нер-2 инкубировали с неинвазивными бактериями Е. coli, трансформированными плазмидой без гена протеализина, в присутствии в среде протеализина или экстрактов бактерий, синтезирующих протеализин. Оказалось, что к концу инкубации клеток Нер-2 с

бактериями протеализин не теряет свою способность расщеплять актин, однако неинвазивные бактерии Е. coli не были обнаружены в клетках Нер-2 (Рис. 10). Таким образом, протеализин, добавленный в среду, не способствует проникновению неинвазивных бактерий внутрь клеток Нер-2 ни сам по себе, ни совместно с бактериальными экстрактами, в которых могут быть бактериальные ферменты, способствующие инвазии после активации протеализином (Bozhokina, Tsaplina et al., 2011).

Рис. 10. Взаимодействие бактерий Е. coli, трансформированных плазмидой без гена протеализина, с клетками Нер-2 в присутствии протеализина. Клетки инкубировали 3 ч с неинвазивными бактериями Е. coli, взятыми через 22 ч после посева, в присутствии очищенного протеализина (А) или экстрактов бактерий S. proteamaculans 94 (Б) и Е. coli (В), синтезирующих протеализин. Масштаб: 15 мкм.

3.4. Расщепление фибриллярного актина протеализином. Исходя из того, что присутствие протеализина во внеклеточной среде не приводит к инвазивной активности бактерий, и данных о том, что при инвазии бактерий-продуцентов протеализин попадает в клетки эукариот, наиболее вероятно, что мишень действия протеализина находится внутри клеток эукариот. Протеаза ЕСР32 обладает узкой субстратной специфичностью по отношению к нативным белкам (Khaitlina et al., 1988). Одним из ее субстратов является актин, после ограниченного протеолиза протеазой ЕСР32 свойства актина меняются в направлении, благоприятном для инвазии (Хайтлина и др., 2003). Однако кортикальный цитоскелет состоит в основном из менее доступного для протеолиза фибриллярного актина (F-актина), который частично очищенный фермент ЕСР32 практически не расщеплял (Мантуленко и др., 1982). Протеализин за 2 ч, т.е. за время, примерно соответствующее времени проникновения бактерий в клетки, расщепляет от 20 до 40 % F-актина (Рис. 11). Хотя известно, что в Mg-F-актине, заполимеризованном MgCl2, ДНКазная петля более доступна для протеолиза (Strzelecka-Golaszewska et al., 1996), при расщеплении F-актина протеализином эффект соли проявляется слабо. Поэтому в дальнейшем для полимеризации Mg-G-актина использовали KCL

Рис. 11. Ограниченный протеолиз F-актина протеализином. Ca-G-актин, Са-F- и Mg-F-актин, заполимеризованные, как указано на рисунке, инкубировали с протеализином при весовом соотношении 1:50 и 1:5 в течение 2 ч при 22 °С.

Через 2 ч после расщепления Mg-F-актина (0.5 мг/мл) протеализином в соотношении 1:5 были исследованы свойства актина. После ультрацентрифугирования расщепленного F-актина в супернатанте оставалось около 90 % белка, в отличие от 10 % белка в супернатанте нерасщепленного F-актина в тех же условиях. Таким образом, расщепление протеализином F-актина, по-видимому, приводит к нарушению структуры F-актина, делая ее более чувствительной к повреждающему действию центробежных сил, что приводит к фракционированию нитей и препятствует их осаждению при ультрацентрифугировании.

Протеализин может влиять на свойства актина не только сам по себе, но и совместно с другими бактериальными белками. Поэтому мы проверили, что в бактериальных экстрактах не активируются протеазы, отщепляющие С-конец актина, и нет белков, влияющих на полимеризацию расщепленного актина (Рис. 12А). В ходе расщепления F-актина экстрактом бактерий интенсивность светорассеяния падает почти в 2 раза, а интенсивность флуоресценции - на 30 %, при этом основное расщепление F-актина происходит за первые 30 мин инкубации (Рис. 12Б) (Цаплина, Хайтлина, 2011).

протеализином. (А) В Са-в-актине (1 мг/мл) после расщепления протеализином при весовом соотношении 1:50 (1 на вставке) или экстрактом бактерий при объемном соотношении 1:300 в течение 20 ч при 4 °С (2 на вставке) замещали ионы Са на ионы и полимеризовали актин КС1. (Б) 1У^-Р-актин (1 мг/мл) инкубировали с экстрактом бактерий при объемном соотношении 1:100.

G CaF MgF MgF G CaF MuF MgF

+ + - + +" - 0.1MKCI - - +_- - + 2MM MgCb

Количество расщепленного актина контролировали с помощью электрофореза (вставка).

Когда полимеризация актина достигает равновесия, происходит обмен субъединиц на концах филаментов, при этом во вновь присоединенных мономерах происходит гидролиз АТФ, сопровождаемый высвобождением неорганического фосфата. Поэтому для определения влияния протеолиза F-актина протеализином на скорость обмена субъединиц в полимере определяли количество неорганического фосфата в растворе. АТФазная активность F-актина после расщепления на 30-40 % бактериальным экстрактом увеличивалась в среднем до 1.4 моль Р,/моль ч"', что значительно превышает АТФазную активность в растворе, содержащем нерасщепленный F-актин, 0.04 моль Р./моль ч'1 (Khaitlina, Strzelecka-Golaszewska, 2002). При этом величина АТФазной активности хорошо согласуется с величиной АТФазной активности в растворе F-актина, заполимеризованного из полностью расщепленных субъединиц, и равной 4 моль Р,/ моль ч"1 (Цаплина, Хайтлина, 2011).

3.5. Стабилизация расщепленного актина фторидами. Фторид алюминия (при образовании которого образуются активные ионы A1F4") связывается в нуклеотидпой щели молекулы и стабилизирует нить актина, имитируя ADP-P, или ATP (Combeau, Carlier 1988). Ранее было показано, что ионы A1F4" увеличивают термостабильность F-актина, заполимеризованного из субъединиц, расщепленных ЕСР32/гримелизином в сайте Gly42-Val43 (Pivovarova et al., 2010). Поэтому не удивительно, что в присутствии ионов A1F4 АТФазная активность F-актина из расщепленных протеализином субъединиц ингибируется. Поэтому можно предположить, что ионы A1F4 влияют на полимеризацию расщепленного актина.

Фторид алюминия нестабилен, поэтому приготовление раствора для взаимодействия с актином происходит в два этапа. Актин сначала инкубируют с 5 мМ NaF и 1 мМ АТФ, потом добавляют 1 мМ А1С13. Оказалось, что уже в присутствии фторида натрия уменьшается лаг-фаза кривой полимеризации расщепленного Mg-G-актина и полимеризация ускоряется примерно в 7 раз (Рис. 13А). По-видимому, это объясняется тем, что NaF стабилизирует латеральные межмономерные контакты вдоль нитей актина, тем самым ускоряя нуклеацию актина. Добавление ионов A1F4 к расщепленному актину после замещения ионов Са на ионы Mg приводило к полимеризации актина даже в отсутствие КС1, при этом добавление КС1 не приводило к усилению полимеризации (Mg, Al на рис. 13Б). Однако КС1 (Са, А1 на рис. 13Б) не полимеризует расщепленный Ca-G-актин даже после предварительной инкубации с ионами A1F4. Таким образом, фторид алюминия приводит к полимеризации только расщепленного Mg-G-актина.

Рис. 13. Влияние фторидов на полимеризацию расщепленного актина. В Ca-G-актине (1 мг/мл), расщепленном экстрактом бактерий при объемном соотношении 1:300 в течение 20 ч при 4 °С. (А) Mg-G-Актин полимеризовали добавлением KCl (черная стрелка) в присутствии (серая кривая) или отсутствие NaF (черная кривая). (Б) Mg, AI и Ca, AI - к Mg-G- и Ca-G-актину после предварительной инкубации с A1F4 (белая стрелка), добавляли KCl (черная стрелка). Mg - Mg-G-актин, заполимеризованный KCl (белая стрелка).

Известно, что связывание фторида бериллия приводит к изменению конформации актина, что препятствует протеолизу G-актина в нуклеотидной щели молекулы (Muhlrad et al.,1994). В согласии с этими данными NaF и A1F4 ингибируют протеолиз в нуклеотидной щели молекулы, и фрагмент с мол. массой 33 кДа не образуется. Кроме того, A1F4 ингибирует образование фрагмента с мол. массой 36 кДа, т.е. влияет на конформацию ДНКазной петли (Рис. 14А). Однако уменьшение степени расщепления актина в присутствии фторидов может быть обусловлено и полимеризацией актина, в результате чего сайты становятся менее доступными для протеолиза. Поэтому было проверено влияние фторидов на протеолиз F-актина. Оказалось, что и NaF, и A1F4 ингибируют протеолиз F-актина протеализином, хотя эффект NaF выражен значительно слабее (Рис. 14Б).

Рис. 14. Влияние фторидов на протеолиз актина. Ca-G-актин инкубировали 10 мин с экстрактом бактерий при объемном соотношении 1:10, а Mg-F-актин 1.5 ч при объемном соотношении 1:200 в присутствии ионов A1F4 или NaF. К - нерасщепленный актин, n/s — актин, расщепленный в отсутствие фторидов.

Таким образом, в растворе протеализин частично расщепляет F-актин, что приводит к деполимеризации и ускорению обмена субъединиц в полимере, и ограниченно расщепляет G-актин, препятствуя его полимеризации в растворе.

n/s A1F4 NaF n/s AIF4 NaF

•шт чтт щф фц^м»актии

щР^щ&Ш щш тшт ЗбкДа г-. шшш 3 3 К

и-актин Р-актин

Исходя из этих данных, можно полагать, что в клетках эукариот протеализин может сдвигать С-Р-равновесие в сторону глобулярной формы. При этом действие протеализина обратимо. Добавление ИаР и А1Р4" не только ингибирует обмен расщепленных мономеров в полимере, но и ускоряет полимеризацию расщепленного в-актина. Следовательно, факторы, стабилизирующие актин, могут сдвигать О-Р-равновесие расщепленного актина в сторону фибриллярной формы. Кроме того, расщепление актина протеализином может тормозиться после стабилизации актина с фторидами. Фториды ингибируют протеолиз Р-актина протеализином и способствуют полимеризации 1У^-С-актина, стабилизируя контакты между субъединицами в Р-актине и препятствуя его расщеплению. Следовательно, при стабилизации актина действие протеализина может быть заингибировано (Рис. 15). Полученные данные позволяют предположить, что после транслокации протеализина в клетки эукариот протеализин может обеспечить перестройки актинового цитоскелета,

Рис. 15. Схема, иллюстрирующая влияние протеализина на динамику Р-актина. При расщеплении Р-актина происходит деполимеризация

полимеров, а расщепление в-актина, препятствует полимеризации. Таким образом, протеализин обеспечивает

протеализин фториды -►активирует сдвиг равновесия в сторону мф ... ингибирует образования С-формы. Фториды могут

ингибировать действие протеализина, сдвигая равновесие в сторону образования Р-актина или снимая эффект протеализина.

необходимые для инвазии бактерий.

С-актин

°о°о°

|ССООООО< Р-актин

выводы

1. Свойства актина, расщепленного протеализином, аналогичны свойствам актина, расщепленного ЕСР32. Расщепляя G-актин в растворе, протеализин препятствует полимеризации актина. Полимеризацию расщепленного актина ускоряют факторы, стабилизирующие связи между мономерами при образовании полимера.

2. Протеализин частично расщепляет F-актин в растворе, уменьшая степень его полимеризации и усиливая динамику полимера. Протеолиз актина в растворе протеализином ингибируют факторы, стабилизирующие нить актина. Таким образом, протеализин может вызывать перераспределение между G- и F-формами актина в клетках эукариот, необходимое для инвазии бактерий.

3. Бактерии S. proteamaculans 94, природные продуценты протеализина, способны к инвазии в клетки эукариот после появления в них активного протеализина, ограниченно расщепляющего актин.

4. Неинвазивные бактерии Е. coli приобретают способность проникать в клетки эукариот после трансформации плазмидой, содержащей ген протеализина.

5. Нокаут гена протеализина не приводит к потере инвазивной активности бактерий S. proteamaculans, что указывает на существование механизма инвазии S. proteamaculans, в котором не задействован протеолиз актина.

6. Во время инвазии бактерий-продуцентов протеализин попадает во внеклеточную среду и в клетки эукариот. Во внеклеточной среде протеализин может быть активатором матриксной металлопротеазы ММР2. Однако присутствие протеализина во внеклеточной среде не приводит к проникновению неинвазивных бактерии Е. coli в клетки Нер-2.

7. Полученные данные позволяют предположить, что протеализин транслоцируется в клетки эукариот и его наиболее вероятной мишенью во время бактериальной инвазии является актин.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Список статей, опубликованных по теме диссертации

1. Цаплина O.A.. Ефремова Т.Н., Кевер Л.В., Комиссарчик Я.Ю., Демидюк И.В., Костров C.B., Хайтлина С.Ю. Выявление актиназной активности протеализина // Биохимия. 2009. Том 74, вып. 6. Стр. 797 - 804.

Tsaplina O.A.. Efremova T.N., Kever L.V., Komissarchik Ya.Yu., Demidyuk I.V., Kostrov S.V., Khaitlina S.Yu. Probing for Actinase Activity of Protealysin // Biochemistiy (Moscow), 2009, Vol. 74, No. 6, pp. 648-654. Published in Russian in Biokhimiya, 2009, Vol. 74, No. 6, pp. 797-804.

2. Bozhokina E.S. *, Tsaplina O.A. *. Efremova T.N., Kever L.V., Demidyuk I.V., Kostrov S.V., Adam T., Komissarchik Y.Y., Khaitlina S.Y. Bacterial invasion of eukaryotic

cells can be mediated by actin-hydrolyzing metalloproteases grimelysin and protealysin // Cell Biology International, 2011, Vol. 35, No. 2, pp. 111-118. * Bozhokina E.S. and Tsaplina O.A. contributed equally to this work.

Список тезисов, опубликованных по теме диссертации

1. Цаплина O.A., Хайтлипа С.Ю., 2006. Выявление актин-специфических протеаз в энтеробактериях. Материалы Всероссийской межвузовской научно-технической конференции студентов и аспирантов «XXXV Неделя науки СПбГПУ», Санкт-Петербург. Стр. 23-24.

2. Цаплина O.A.. Хайтлина С.Ю., 2007. Выявление актиназной активности протеализина, металлопротеазы семейства М4. Материалы Всероссийской межвузовской научно-технической конференции студентов и аспирантов «XXXVI Неделя науки СПбГПУ», Санкт-Петербург. Стр.28-30.

3. Khaitlina S.Yu., Efremova T.N., Bozhokina E.S., Tsaplina O.A.. Adam T., Demidyuk I.V., Kostrov S.V., Kever L.V., Komissarchik Y.Y., 2008. Specific actin proteolysis with bacterial matalloproteinases and its possible role in bacterial invasion. Biological Motility, achievements and perspectives, Pushchino. p. 219-220.

4. Цаплина O.A.. Ефремова Т.Н., Демидюк И.В., Хайтлина С.Ю., 2008. Протеализии - возможный фактор вирулентности бактерий штамма Serratia Proteamaculans. Материалы 12-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино. стр.113.

5. Цаплина O.A.. Божокина Е.С., Хайтлина С.Ю., 2009. Ограниченный протеолиз актина и ММП-2 металлопротсазами условно-патогенный бактерий. Материалы IV Российского симпозиума «Белки и пептиды», Казань. Стр. 381.

6. Божокина Е.С., Цаплина O.A.. Кевер Л.В., Комиссарчик Я.Ю., Хайтлина С.Ю., Ефремова Т.Н., 2009. Инвазивные свойства бактерий - продуцентов металлопротеиназ, ограниченно расщепляющих актин. Материалы IV Российского симпозиума «Белки и пептиды», Казань. Стр. 245.

7. Хайтлина С.Ю., Ефремова Т.Н., Божокина Е.С., Цаплина O.A.. Демидюк И.В., Костров C.B. Кевер JI.B., Комиссарчик Я.Ю., 2009. Актиназная активность термолизиноподобных металлопротеаз бактерий рода Serratia как возможный фактор их вирулентности. Материалы IV Российского симпозиума «Белки и пептиды», Казань. Стр. 90.

8. Цаплина O.A.. Ефремова Т.Н., Кевер Л.В., Комиссарчик Я.Ю., Демидюк И.В., Хайтлина С.Ю., 2009. Бактерии приобретают инвазивную активность после трансформации плазмидой, содержащей ген протеализина. Материалы 13-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология -наука XXI века», Пущино. стр.85.

9. Bozhokina E.S., Tsaplina O.A.. Demidyuk I.V., Kostrov S.V., Kever L.V., Komissarchik Y.Y., Efremova T.N., Khaitlina S.Y., 2009. Limited actin proteolysis mediates invasion of bacteria Serratia sp. in eukaryotic cells. 49th ASCB Annual Meeting, San Diego, CA.

10. Цаплина O.A.. Ефремова Т.Н., Хайтлина С.Ю., 2010. Ограниченный протеолиз Ф-актина протеализином может способствовать инвазии бактерий. Материалы III

Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2010», Нижний Новгород. Стр. 156.

11. Цаплина O.A.. Ефремова Т.Н., Громова Т.Ю., Демидюк И.В., Хайтлина С.Ю.,

2010. Инвазивная активность Serratia proteamaculans после инактивации гена протеализина. Материалы IV Международной школы молодых ученых по молекулярной генетики «Геномика и биология клетки», Москва-Звенигород. Стр. 211.

12. Цаплина O.A., Хайтлина С.Ю., 2011. Свойства актина, расщепленного протеализином. Материалы XXIII Международной зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва. Стр. 9.

13. Цаплина O.A., Ефремова Т.Н., Демидюк И.В., Хайтлина С.Ю., 2011. Локализация протеализина при инвазии бактерий-продуцентов в эукариотические клетки. Материалы V Российского симпозиума «Белки и пептиды», Петрозаводск. Стр. 408.

14. Хайтлина С.Ю., Божокина Е.С., Демидюк И.В., Цаплина O.A.. Ефремова Т.Н.,

2011. Молекулярные механизмы инвазии бактерий, синтезирующих гримелизин и протеализин, в эукариотические клетки. Материалы V Российского симпозиума «Белки и пептиды», Петрозаводск. Стр. 126.

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Мантуленко В.В., Хайтлина С.Ю., Шелудько Н.С. (1983) Биохимия, 48, 69-74. Хайтлина С.Ю., Ефремова Т.Н., Комиссарчик Я. Ю. (2003) Биологические мембраны, 20, 33-39 Цаплипа O.A., Хайтлина С.Ю. (2011) Материалы XXIII Международной зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва. Стр. 9. Цаплипа O.A., Ефремова Т.Н., Громова Т.Ю., Демидюк И.В., Хайтлина С.Ю. (2010) Материалы IV Международной школы молодых ученых по молекулярной генетики «Геномика и биология клетки», Москва-Звенигород. Стр. 211. Цаплина O.A., Ефремова Т.Н., Демидюк И.В., Хайтлина С.Ю. (2011) Материалы V Российского симпозиума «Белки и пептиды», Петрозаводск. Стр. 408. Цаплина O.A., Ефремова Т.Н., Кевер Л.В., Комиссарчик Я.Ю., Демидюк И.В., Костров C.B., Хайтлина С.Ю. (2009) Биохимия, 74(6), 797-804. Bogatcheva N.V., Wang P., Birukova A.A., Vérin A.D., Garcia J.G.N. (2006) Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol., 290, L1139-L1145. Bozhokina E.S. *, Tsaplina O.A.*, Efremova T.N., Kever L.V., Demidyuk I.V., Kostrov S.V., Adam T., Komissarchik Y.Y., Khaitlina S.Y. (2011) Cell Biol. Int., 35(2), 111-118. Bozhokina E.S., Khaitlina S.Yu., Adam T. (2008) Biochem. Biophys. Res. Commun., 367, 888-892. Combeau C., Carlier M.F. (1988) J. Biol. Chem., 263(33), 17429-17436. Cossart P., Sansonetti P.J. (2004) Science, 304, 242-248. Demidyuk I.V., Kalashnikov A. E., Gromova T. Y., Gasanov E. V., Saflna D.R., Zabolotskaya M.V., Rudenskaya G.N., Kostrov S.V. (2006) Protein Expr. Purif, 47, 551-561. Efremova T.N., Ender N.A., Brudnaja M.S., Komissarchik Y.Y., Khaitlina S.Y. (2001) Cell Biol. Int., 25, 557-561. Gamaley I., Efremova T., Kirpichnikova K., Kever L„ Komissarchik Y., Polozov Y., Khaitlina S. (2006) Cell. Biol. Int., 30(4), 319-25. Gromova T.Y., Demidyuk I.V., Kozlovskiy V.l., Kuranova I.P., Kostrov S.V. (2009) Biochimie, 91, 639-645. Hertie R. (2005) Curr. Protein Pept. Sei, 6(4), 313-325. Itzhaki R.F., Gill D.M. (1964) Anal. Biochem., 9, 401-410. Jaconi M.E., Lew D.P., Monod A., Krause K.H. (1993) J. Biol. Chem., 68, 26075-26078. Khaitlina S.Y., Smirnova T.D., Usmanova A.M. (1988) Limited proteolysis of actin by a specific bacterial protease. FEBS Lett., 228, 172-174. Khaitlina S.Y., Strzelecka-Golaszewska H. (2002) Biophys. J., 82, 321-334. Khaitlina S.Yu., Collins J.H., Kusnetsova I.M.,

Pershina V.P., Synakevich I.G., Turoverov K.K., Usmanova A.M. (1991) FEBS Lett., 279, 4951. Khan A.R., James M.N.G. (1998) Prorein Science., 7, 813-836. Kodama T., Fukui K., Kometani K. (1986) J. Biochem., 99, 1465-1472. Kouyama T., Mihashi K. (1981£ur. J. Biochem., 114, 33-48. Lacmmli U.K. (1970) Nature, 227, 680-685. Matthews B.W. (1988) Acc. Chem. Res., 21, 333-340. Mornct D., Ue K. (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81, 3680-3684. Mühlrad A., Cheung P., Phan B.C., Miller C., Reislcr E. (1994) J. Biol. Chem., 269, 1185211858. Okamoto T., Akuta T., Tamura F., van der Vliet A., Akaike T. (2004Biol. Chem., 385, 997-1006. Pivovarova A.V., Khaitlina S.Yu., Levitsky D.I. (2010) FEBS J., 277, 3812-3822. Spudich J.A., Watt S. (1971) J. Biol. Chem., 246, 4866-4871. Stetler-Stcvenson W.G., Yu A. E. (2001) Cancer Biology, 11, 143-152. Strzelccka-Golaszewska H., Wozniak A., Hult T., Lindberg U. (1996) Biochem. J., 316, 713-721. Van Wart U.E., Birkedal-Hansen II. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA., 87(14), 5578-82. Velge P., Bottreau E., Van-Langendonck N., Kaeffer B. (1997) J. Med. Microbiol., 46(8), 681-92. Wang P., Verin A.D., Birukova A., Gilbert-Mcclain L.I., Jacobs K., Garcia J.G.N. (2001) Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol., 281, L1472-L1483.

Подписано в печать 06.10.2011. Формат 60x90/16 Бумага офсетная.Усл. печ. л. 1,75 Тираж 100 экз. Заказ 454

Отпечатано в типографии ООО «Адмирал»

199048, Санкт-Петербург, В. О., 6-я линия, д. 59 кори. 1, оф. 40Н

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Цаплина, Ольга Анатольевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

СОДЕРЖАНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Роль цитоскелета во взаимодействие бактерий с клетками эукариот.

1.1. Бактерии, использующие актин для формирования пьедесталов на поверхности клетки-хозяина.

1.2. Бактерии, использующие актин для проникновения в клетку-хозяина и внутриклеткочного движения.

1.2.1. Бактериальные протеазы могут способствовать инвазии, активируя матриксные металлопротеазы (ММП).

1.2.2. Механизм входа типа «застежка - молния».

1.2.3. Триггерный механизм входа.

1.2.4. Стратегии выживания бактерий в клетке-хозяине.

1.2.5. Движение бактерий в цитоплазме клетки-хозяина.

2. Инвазивная активность бактерий рода Serratia.

2.1. Факторы вирулентности бактерий Serratia marcescens.

2.2. Корреляция инвазивной активности бактерий с синтезом протеазы ЕСР32/гримелизин.

2.3. Расщеплеиие актина протеазой ЕСР32/гримелизин.

3. Металлопротеаза S. proteamaculans протеализин.

МА ТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Бактериальные штаммы и условия культивирования.

2. Кривые роста бактерий.

3. Клеточные линии и условия культивирования.

4. Выделение актина.

5. Модификации актина.

6. Определение степени полимеризации и динамики актина.

7. Получение бактериальных экстрактов.

8. Выявление актиназной активности.

9. Электрофорез в полиакриламидном геле.

10. Зимография.

11. Окраска бактерий реактивом FITC.

12. Проточная цитофлуорометрия.

13. Заражение эукариотических клеток бактериями.

14. Окраска препаратов для конфокальной микроскопии.

15. Электронная микроскопия.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

1. Расщепление G-актина протеализином.

2. Корреляция между актиназной и инвазивной активностью бактерий.

2.1. Бактерии дикого штамма Serratia proteamaculans 94.

2.2. Бактерии рекомбинантных штаммов Е. coli, синтезирующих протеализин

2.2.1. Бактерий Е. coli, синтезирующие протеализин под управлением собственного промотора.

2.2.2. Бактерии Е. coli, синтезирующие протеализин под управлением промотора фага Т7.

2.2.3. Бактерии Е. coli, синтезирующие мутантный протеализин с точечной заменой глутаминовой кислоты на аланин в активном сайте.

2.3. Бактерии S. proteamaculans после инактивации гена протеализина.

3. Возможные механизмы инвазии бактерий-продуцентов протеализина.

3.1. Локализация протеализина во время инвазии бактерий-продуцентов.

3.2. Чувствительность матриксных металлопротеаз к протеализину.

3.3. Проверка инвазивной активности неинвазивных бактерий E.coli при добавлении протеализина во внеклеточную среду клеток эукариот.

3.4. Расщепление фибриллярного актина протеализином.

3.4. 1. Сравнение протеолиза актина протеализином и экстрактом бактерий, синтезирующих протеализин.

3.4.2. Скорость обмена субъединиц в F-актине, расщепленном экстрактом бактерий-продуцентов протеализина.

3.5. Стабилизация расщепленного актина фторидами.

ОБСУЖДЕНИЕ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль протеализина в бактериальной инвазии"

Актуальность проблемы. Актин вовлечен в большинство клеточных процессов, от перестроек хроматина и регуляции транскрипции до внутриклеточного транспорта, различных типов движения клеток и сокращения мышц. Поэтому не удивительно, что актиновый цитоскелет является мишенью для токсинов вирусов и болезнетворных бактерий, взаимодействующих с клетками эукариот. Проникновение бактерий в клетку-хозяина (инвазия) - это процесс, в котором взаимодействие бактериальных и клеточных факторов приводит к интернализации бактерий в клетки эукариот, которые в норме не фагоцитируют. Хотя бактерии разработали различные способы инфицирования клетки-хозяина, общими для всех видов инвазии являются активация сигнальной системы клетки и реорганизация ее цитоскелета. Патогенные бактерии попадают в клетку-хозяина с помощью одного из двух сигнальных путей. Один путь - это прямая интернализация бактерий, индуцированная взаимодействием бактериального белка с поверхностным рецептором, вовлеченным в распластывание или подвижность клетки. Другой процесс напоминает макропиноцитоз, при котором образование выростов клеточной поверхности, захватывающих бактерию, индуцируется секрецией комплекса специфических бактериальных белков, встраивающихся в мембрану клеток эукариот и образующих пору, через которую бактериальные белки попадают в цитоплазму. Оба процесса связаны с реорганизацией цитоскелета, последовательной деполимеризацией и полимеризацией актина (СоБзаг!, БашопеШ, 2004). Поэтому факторами вирулентности могут становиться бактериальные белки, влияющие на равновесие между в- и Р-формами актина.

При исследовании свойств бактериальной металлопротеазы ЕСР32, ограниченно расщепляющей актин в единственном сайте, интенсивно вовлеченном в контакт между мономерами актина в полимере (ЮшШпа е1 а1., 1991), было показано, что непатогенные бактерии-продуценты протеазы ЕСР32 способны проникать в клетки эукариот и вызывать реорганизацию их цитоскелета (Е&ешоуа е1 а!., 2001). Позднее было установлено, что бактериипродуценты протеазы ЕСР32 - это Serratia grimesii (Bozhokina et al., 2008). Способность к инвазии после синтеза актин-специфической металлопротеазы была подтверждена на бактериях референтного штамма Serratia grimesii, а соответствующий белок был назван гримелизином (Bozhokina et al., 2008).

В другом виде сераций, Serratia proteamaculans, была обнаружена новая металлопротеаза протеализин, сходная по свойствам активной формы с ЕСР32/гримелизином и отличающаяся от гримелизина на 8 аминокислотных замен, расположенных на поверхности активного фермента (Demidyuk et al., 2006; Bozhokina et al., 2008). В настоящее время протеализин является одной из наиболее полно охарактеризованных термолизинподобных протеаз. Кроме того, геном S. proteamaculans полностью секвенирован (GenBank Ю СР000826). Поэтому использование этих бактерий и протеализина является перспективным для исследования механизмов инвазии, связанных с перестройками актинового цитоскелета.

Цель и задачи исследования. Целью работы является исследование протеолитической активности металлопротеазы протеализин из бактерий Serratia proteamaculans в связи с возможным участием этой протеазы в бактериальной инвазии.

Задачи настоящей работы:

2. Выяснить, способны ли бактерии S. proteamaculans проникать внутрь клеток эукариот.

4. Исследовать актиназную и инвазивную активность бактерии S. proteamaculans после нокаута гена протеализина.

Основные положения, выносимые на защиту:

Научная новизна. Показано, что протеализин расщепляет актин не только в сайте Gly42-Val43 в ДНКазной петле молекулы, но также и в сайтах Thr66-Leu67 и Gly63-Ile64, расположенных в нуклеотид-содержащей щели, с образованием фрагмента с молекулярной массой 33 кДа. Свойства G-актина, расщепленного протеализином, аналогичны свойствам актина, расщепленного ЕСР32. Расщепление G-актина протеализином в растворе обратимо препятствует полимеризации актина. Впервые показана способность условно-патогенных бактерий S. proteamaculans, синтезирующих протеализин, проникать в клетки эукариот. Показано, что неинвазивные бактерии Е. coli после трансформации плазмидой, несущей ген протеализина, приобретают способность проникать в клетки эукариот. Впервые показано, что в бактериях дикого штамма S. proteamaculans существует механизм инвазии, не зависящий от протеализина. Показано, что во время инвазии бактерий-продуцентов протеализина протеаза появляется во внеклеточной среде и в цитоплазме клеток эукариот. Кроме того показано, что протеализин во внеклеточной среде может быть активатором матриксной металлопротеазы ММР2, которая, по данным литературы, может способствовать инвазии. Однако присутствие протеализина во внеклеточной среде не приводит к проникновению неинвазивных Е. coli внутрь* клеток эукариот. Впервые исследован протеолиз F-актина протеализином и показано, что расщепление протеализином приводит к ускорению обмена субъединиц в полимере, на которое влияют фториды алюминия и натрия. Эти данные являются первым экспериментальным подтверждением транслокации протеализина из бактерий в клетки эукариот и позволяют предполагать, что его мишенью является актин.

Теоретическое и практическое значение работы. Чувствительность клеток к инвазии может быть показателем физиологического состояния клетки при различных воздействиях и степени ее трансформированности. Известно, что инвазия бактерий усиливается пролиферативной активностью и опухолевой трансформацией клеток (Velge et al., 1997). С другой стороны, чувствительность клеток эукариот к инвазии может быть уменьшена в экспериментальных условиях в результате воздействия антиоксидантов (Gamaley et al., 2006). Поэтому взаимодействие культивируемых клеток эукариот с условно-патогенными бактериями-продуцентами протеализина является хорошей моделью для выявления физиологического состояния клетки-хозяина.

В клинических изолятах обнаруживают бактерии S. proteamaculans так же, как и бактерии наиболее патогенного вида серрации Serratia marcescens, вызывающие пневмонию, инфекции мочевыводящих путей и хирургических ран. В свете данных о том, что условно-патогенные бактерии S. proteamaculans проникают в клетки человека, важно изучение механизма инвазии бактерий и факторов, влияющих на их патогенность. Определение ферментов, обеспечивающих инвазию бактерий, их свойств и мишеней будет способствовать разработке способа борьбы с условно-патогенными бактериями вида Serratia.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Цаплина, Ольга Анатольевна

выводы

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проникновение бактерий в клетки эукариот, которые в норме не фагоцитируют, требует перестроек актинового цитоскелета. На первом этапе проникновения бактерий необходима деполимеризация актиновых филаментов клетки-мишени; затем происходит полимеризация актиновых филаментов, которые служат каркасом для мембранных выростов, захватывающих бактерию; а на конечной стадии необходима разборка актиновых структур, собранных для захвата бактерии. Патогенные бактерии управляют этими перестройками с помощью одного из двух механизмов. Один механизм - взаимодействие бактериального белка с поверхностным рецептором, вовлеченным в распластывание или подвижность клетки, и запуск сигнальных каскадов, приводящих к перестройке цитоскелета. В другом механизме бактериальные белки секретируются в цитоплазму клетки-мишени с помощью специфического аппарата секреции, встраивающегося в мембрану клеток эукариот (Cossart, Sansonetti, 2004). В этом случае бактериальные белки-эффекторы, оказавшись в цитоплазме клетки-хозяина, воздействуют на Rho-ГТФазы, актин-связывающие белки или непосредственно на актин, Поэтому факторами вирулентности могут становиться бактериальные белки, влияющие на равновесие между G- и F-формами актина.

Бактериальная металлопротеаза ЕСР32/гримелизин ограниченно расщепляет актин в единственном сайте между Gly42 и Val43 (Khaitlina et al., 1991), протеолиз актина приводит к обратимому сдвигу равновесия в растворе в сторону образования G-актина. При исследовании свойств этой протеазы было показано, что непатогенные бактерии-продуценты протеазы ЕСР32/гримелизин S. grimesii способны проникать в клетки эукариот и вызывать реорганизацию их цитоскелета (Efremova et al., 2001, Bozhokina et al., 2008). Бактерии рода Serratia являются факультативными патогенами, часто вызывающими больничные инфекции, механизм которых неизвестен. Поэтому обнаружение еще в одном виде Serratia, S. proteamaculans 94, металлопротеазы протеализин, отличающейся от ЕСР32/гримелизина на 8 аминокислотных замен (Demidyuk et al., 2006; Bozhokina et al., 2008), поставило вопрос о субстратной специфичности протеализина и его функциях в бактериях-продуцентах.

Оказалось, что бактерии S. proteamaculans способны проникать в клетки эукариот, но только на поздней стационарной стадии роста. При этом появление инвазивной активности совпадает с появлением активного протеализина в бактериальных экстрактах. Более того, неинвазивные бактерии Е. coli приобретали способность проникать в клетки эукариот после трансформации плазмидой, несущей ген протеализина. Для инвазии рекомбинантных Е. coli, продуцентов протеализина, достаточно даже синтеза мутантного протеализина с точечной мутацией в активном центре, который слабо расщепляет актин.

Однако инактивация гена протеализина в S. proteamaculans 94 pln" не привела к потере бактериями инвазивной активности. Это не отрицает участия протеализина в механизме инвазии S. proteamaculans 94. Известны случаи, когда при смене условий роста бактерий выключается один механизм инвазии и активируется другой механизм (Eitel, Dersch, 2002).

Следующим стал вопрос о локализации мишени действия протеализина во время инвазии бактерий-продуцентов. Оказалось, что за время инкубации клеток Balb ЗТЗ SV40 с бактериями протеализин попадает во внеклеточную среду и в клетку-хозяина. Во внеклеточной среде протеализин может быть активатором матриксной металлопротеазы, таким образом способствуя инвазии бактерий-продуцентов. Однако добавление фермента в среду во время инкубации неинвазивных Е. coli не приводит к проникновению бактерий в клетки эукариот. По-видимому, мишень действия протеализина расположена в клетке-хозяине, и наиболее вероятной мишенью протеализина в клетках эукариот является актин.

Протеализин, расщепляя актин, может сдвигать равновесие между G- и F-формами актина в сторону образования G-актина в растворе. Это воздействие могут ингибировать факторы, стабилизирующие актин. В растворе, расщепление актина ингибирует предварительная инкубация с фторидами, имитирующими неорганический фосфат, а инкубация расщепленного G-актина с фторидами способствует образованию F-актина. В клетке стабилизирующими факторами могут быть низкомолекулярные эффекторы или актин-связывающие белки. Таким образом, при проникновении в клетку-хозяина, протеализин может обеспечивать обратимые перестройки актинового цитоскелета, необходимые для бактериальной инвазии.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Цаплина, Ольга Анатольевна, Санкт-Петербург

1. Казанина Г.А., Миргородская O.A., Миргородская Е.А., Хайтлина С. Ю. (1995) Протеиназа ЕСР32. Характеристика фермента, исследование специфичности. Биоорганич. химия, 21(10), 761-766.

2. Мантуленко В.В., Хайтлина С.Ю., Шелудько Н.С. (1983) Большой фрвгмент актина, устойчивый к дальнейшему протеолизу. Биохимия, 48, 69-74

3. Морозова A.B., Сковородкнн И.Н., Хайтлина С.Ю., Малинин А.Ю. (2001) Бактериальная протеаза ЕСР32, специфически расщепляющая актин, и ее воздействие на цитоскелет in vivo. Биохимия, 66 (1), 105-113.

4. Морозова A.B., Хайтлина С.Ю., Малинин А.Ю. (2011) Белок теплового шока Dnak субстрат бактериальной протеазы ЕСР32, специфически расщепляющей актин. Биохимия, 76(4), 558-565.

5. Супотницкий М.В. (2005) Микроорганизмы, токсины и эпидемии. М.: «Вузовская книга»

6. Уикли Б. (1975) Электронная микроскопия для начинающих. М.: «Мир», 324 с.

7. Усманова A.M., Хайтлина С.Ю. (1989) Протеаза из штамма бактерий Е. coli А2, специфически расщепляющая актин. Биохимия, 54 (8), 1308-1314.

8. Хайтлина С.Ю., Ефремова Т.Н., Комиссарчик Я.Ю. (2003) Динамика актиновых филаментов при инвазии эукариотических клеток бактериями. Биол. мембраны, 20(1), 33-39.

9. Цаплина O.A., Хайтлина С.Ю. (2011) Свойства актина, расщепленного протеализином. Материалы XXIII Международной зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва. Стр. 9.

10. Цаплина О.А., Ефремова Т.Н., Демидюк И.В., Хайтлина С.Ю. (2011) Локализация протеализина при инвазии бактерий-продуцентов в эукариотические клетки. Материалы V Российского симпозиума «Белки и пептиды», Петрозаводск. Стр. 408.

11. Цаплина О.А., Ефремова Т.Н., Кевер Л.В., Комиссарчик Я.Ю., Демидюк И.В., Костров С.В., Хайтлина С.Ю. (2009) Выявление актиназной активности протеализина. Биохимия, 74(6), 797-804.

12. Alonso A., Garcia-del Portillo F. (2004) Hijacking of eukaryotic functions by intracellular bacterial pathogens. Int. Microbiol., 7(3), 181-191.

13. Antonny В., Bigay J., Chabre M. (1990) A novel magnesium-dependent mechanism for the activation of transducin by fluoride. FEBSLett., 268(1), 277-280.

14. Antonny В., Sukumar M., Bigay J., Chabre M., Higashijima T. (1993) The mechanism of aluminum-independent G-protein activation by fluoride and magnesium. 31P NMR spectroscopy and fluorescence kinetic studies. J. Biol. Chem., 268(4), 2393-2402.

15. Barth H., Aktories K. (2011) New insights into the mode of action of the actin ADP-ribosylating virulence factors Salmonella enterica SpvB and Clostridium botulinum C2 toxin. Eur. J. Cell Biol., 90(11), 944-950.

16. Barzu S., Benjelloun-Touimi Z., Phalipon A., Sansonetti P., Parsot. C. (1997) Functional analysis of the Shigella flexneri IpaC invasin by insertional mutagenesis. Infect. Immun., 65, 1599-1605.

17. Bierne H., Gouin E., Roux P., Caroni P., Yin H.L., Cossart P. (2001) A role for cofilin and LIM kinase in Listeria-induced phagocytosis. J. Cell Biology, 155, 101-112.

18. Bogatcheva N.V., Wang P., Birukova A.A., Verin A.D., Garcia J.G.N.2006) Mechanism of fluoride-induced MAP kinase activation in pulmonary artery endothelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol., 290, LI 139-L1145.

19. Bourdet-Sicard R., Rüdiger M., Jockusch B.M., Gounon P., Sansonetti P.J., Nhieu G.T. (1999) Binding of the Shigella protein IpaA to vinculin induces F-actin depolymerization. EMBOJ., 18(21), 5853-5862.

20. Boyle E.C., Finlay B.B. (2003) Bacterial pathogenesis: exploiting cellular adherence. Curr. Opin. Cell Biol., 15(5), 633-639.

21. Bozhokina E.S., Khaitlina S.Yu., Adam T. (2008) Grimelysin, a novel metalloprotease from Serratia grimesii, is similar to ECP32. Biochem. Biophys: Res. Commun., 367, 888-892.

22. Braun V., Neuss B., Ruan Y., Schiebel E., Schöffler H., Jander G. (1987) Identification of the Serratia marcescens hemolysin determinant by cloning into Escherichia coli. J. Bacteriol, 169(5), 2113-2120.

23. Cain R.J., Hayward R.D., Koronakis V. (2008) Deciphering interplay between Salmonella invasion effectors. PLoSPathog., 4(4), el000037.

24. Campellone K., Leong J. (2005) Nck-independent actin assembly ismediated by two phosphorylated tyrosines within enteropathogenic Escherichia coli Tir. Mol. Microbiol., 56, 416-432.

25. Campellone K.G., Rankin S., Pawson T., Kirschner M.W., Tipper D.J., Leong J.M. (2004) Clustering of Nek by a 12-residue Tir phosphopeptide is sufficient to trigger localized actin assembly. J. Cell Biol., 164(3), 407-416.

26. Chabra E.S., Higgs H.N. (2007) The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures. Nature Structural Biol, 9, 1110-1121.

27. Coburn B., Sekirov I., Finlay B.B. (2007) Type III secretion systems and disease. Clin. Microbiol Rev., 20(4), 535-549.

28. Combeau C., Carlier M.F. (1988) Probing the mechanism of ATP hydrolysis on F-actin using vanadate and the structural analogs of phosphate BeF-3 and A1F-4. J. Biol. Chem., 263(33), 17429-36.

29. Cossart P., Lecuit M. (1998) Interactions of Listeria monocytogenes with mammalian cells during entry and actin-based movement: bacterial factors, cellular ligands and signaling. EMBOJ., 17(14), 3797-3806.

30. Cossart P., Sansonetti P.J. (2004) Bacterial invasion: the paradigms of enteroinvasive pathogens. Science, 304, 242-248.

31. Dai S., Sarmiere P.D., Wiggan O., Bamburg J.R., Zhou D. (2004) Efficient Salmonella entry requires activity cycles of host ADF and cofilin: Cell Microbiol., 6, 459-471.

32. Dai S., Sarmiere P.D., Wiggan O., Bamburg J.R., Zhou D. (2004) Efficient Salmonella entry requires activity cycles of host ADF and cofilin. Cell Microbiol., 6(5), 459-71.

33. De Kreij A., Venema G., van den Burg B. (2000) Substrate specificity in the highly heterogeneous M4 peptidase family is determined by a small subset of amino acids. J. Biol. Chem., 275(40), 31115-31120.

34. Demidyuk I.V., Gromova T.Y., Polyakov K.M., Melik-Adamyan W.R., Kuranova I.P., Kostrov S.V. (2010) Crystal structure of the protealysin precursor: insights into propeptide function. J.Biol.Chem., 285(3), 2003-2013.

35. Duelos S., Desjardiris M. (2000) Subversion of a young phagosome: the survival strategies of intracellular pathogens. Cell Microbiol., 2, 365-377.

36. Efremova T.N., Ender N.A., Brudnaja M.S., Komissarchik Y.Y., Khaitlina S.Y. (2001) Specific invasion of transformed cells by Escherichia coli A2 strain. Cell Biol. Int., 25, 557-561.

37. Egelman E.H. (2003) Actin's prokaryotic homologs. Curr. Opin. Struct. Biol., 13, 244-248.

38. Eitel J., Dersch P. (2002) The YadA protein of Yersinia pseudotuberculosis mediates high-efficiency uptake into human cells under environmental conditions in which invasin is repressed. Infect Immun., 70(9), 4880-4891.

39. Fenteany G., Zhu S. (2003) Small-molecule inhibitors of actin dynamics and cell motility, Curr. Top Med. Chem., 3, 593-616.

40. Fu Y., Galán J.E. (1999) A Salmonella protein antagonizes Rac-1 and Cdc42 to mediate host-cell recovery after bacterial invasion. Nature., 401(6750), 293297.

41. Galán J.E., Cossart P. (2005) Host-pathogen interactions: a diversity of themes, a variety of molecular machines. Curr. Opin. Microbiol., 8(1), 1-3.

42. Galán J.E., Wolf-Watz H. (2006) Protein delivery into eukaryotic cells by type III secretion machines. Nature, 444(7119), 567-573.

43. Garmendia J., Frankel G., Crepin V.F. (2005) Enteropathogenic and ■enterohemorrhagic Escherichia coli infections: translocation, translocation,translocation. Infect. Immun., 73(5), 2573-2585.

44. Gouin E., Welch M.D., Cossart P. (2005) Actin-based motility of intracellular pathogens. Curr. Opin. Microbiol., 8(1), 35-45.

45. Gromova T.Y., Demidyuk I.V., Kozlovskiy V.l., Kuranova I.P., Kostrov S.V. (2009) Processing of protealysin precursor. Biochimie, 91, 639-645. .

46. Häse C.C., Finkelstein R.A. (1993) Bacterial extracellular zinc-containing metalloproteases. Microbiol. Rev., 57(4), 823-837.

47. Heckeis J.E., Blackett B., Everson J.S., Ward M.E. (1976) The influence of surface charge on the attachment of Neisseria gonorrhoeae to human cells. J. Gen. Microbiol., 96, 359-364.

48. Hejazi A., Falkiner F.R. (1997) Serratia marcescens. J. Med. Microbiol., 46(11), 903-912.

49. Hertie R. (2005) The family of Serratia type pore forming toxins. Curr. Protein Pept. Sei., 6(4), 313-325.

50. Hertie R., Schwarz H. (2004) Serratia marcescens internalization and replication in human bladder epithelial cells. BMC Infect. Dis., 4, 16.

51. High N., Mounier J., Prevost M.C., Sansonetti P.J. (1992) IpaB of Shigella flexneri causes entry into epithelial cells and escape from the phagocytic vacuole. EMBO J. 11, 1991-1999.

52. Hines D.A., Saurugger P.N., Ihler G.M., Benedik M.J. (1988) Genetic analysis of extracellular proteins of Serratia marcescens. J. Bacteriol., 170(9), 41414146.

53. Holmes K. C., Popp D., Gebhard W., Kabsch W. (1990) Atomic model of the actin filament. Nature, 347, 44-49.

54. Huang Z., Sutton S.E., Wallenfang A.J., Orchard R.C., Wu X., Feng Y., Chai J., Alto N.M. (2009) Structural insights into host GTPase isoform selection by a family of bacterial GEF mimics, Nat. Struct. Mol. Biol, 16, 853-860.

55. Jaconi M.E., Lew D.P., Monod A., Krause K.H. (1993) The regulation of store-dependent Ca2+ influx in HL-60 granulocytes involves GTP-sensitive elements. J. Biol. Chem., 68, 26075-26078.

56. Jonathan J.D., Gerben J.Z. (1998) Plasposons: Modular Self-Cloning Minitransposon Derivatives for Rapid Genetic Analysis of Gram-Negative Bacterial Genomes. Appl. Environ. Microbiol., 64(7), 2710-2715.

57. Khaitlina S. Yu., Hinssen H. (1997) Conformational changes in actin induced by its interaction with gelsolin. Biophys. J., 73, 929-937.

58. Khaitlina S. Yu., Moraczewska J., Strzelecka-Golaszewska H. (1993) The actin-actin interactions involving the N-terminal portion of the DNase I-binding loop are crucial for stabilisation of the actin filament. Eur. J. Biochem., 218, 911-920.

59. Khaitlina S. Yu., Smirnova T. D., Usmanova A. M. (1988) Limited proteolysis of actin by a specific bacterial protease. FEBS Lett., 228, 172-174.

60. Khaitlina S. Yu., Strzelecka-Golaszewska H. (2003) Effects of tropomyosin on dynamics of actin filaments. Biophys. J., 84(Pt 2), 480a.

61. Khaitlina S., Antropova O., Kuznetsova I., Turoverov K., Collins J. H. (1999) Correlation between polymerizability and conformation in scallop P-like actin and rabbit sceletal muscle a-actin. Arch. Biochem. Biophys., 368(1), 105-111.

62. Khaitlina S.Y., Strzelecka-Golaszewska H. (2002) Role of the DNase-I-binding loop in dynamic properties of actin filament. Biophys. J., 82, 321-334.

63. Khaitlina S.Yu., Collins J.H., Kusnetsova I.M., Pershina V.P., Synakevich I.G., Turoverov K.K., Usmanova A.M. (1991) Physico-chemical properties of actin cleaved with bacterial protease from E. coli A2 strain. FEBS Lett., 279, 49-51.

64. Khan A.R., James M.N.G. (1998) Molecular mechanisms for the conversion of zymogens to active proteolytic enzymes. Prorein Science., 7, 813-836.

65. Kida Y., Inoue H., Shimizu T., Kuwano K. (2007) Serratia marcescensserralysin induces inflammatory responses through protease-activated receptor 2. Infect. Immun., 75(1), 164-174.

66. Kodama T., Fukui K., Kometani K. (1986) The initial phosphate burst in ATP hydrolysis by myosin and subfragment-1 as studied by a modified Malachite Green method for determination of inorganic phosphate. J. Biochem., 99, 1465-1472.

67. König W., Faltin Y., Scheffer J., Schöffler H., Braun V. (1987) Role of cell-bound hemolysin as a pathogenicity factor for Serratia infections. Infect. Immun., 55(11), 2554-2561.

68. Kouyama T., Mihashi K. (1981) Fluorimetry study of N-(1-pyrenyl)iodoacetamide-labelled F-actin. Local structural change of actin protomer both on polymerization and on binding of heavy meromyosin. Eur. J. Biochem.;114(1), 33-38.

69. Kudryashov D.S., Cordero C.L., Reisler E., Satchell K.J. (2008) Characterization of the enzymatic activity of the actin cross-linking domain from the Vibrio cholerae MARTX Vc toxin. J. Biol. Chem., 283, 445-452.

70. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227, 680-685.

71. Lafont F., Tran Van Nhieu G., Hanada K., Sansonetti P. and van der Goot F. G. (2002) Initial steps of Shigella infection depend on the cholesterol/sphingolipid raft-mediated CD44-IpaB interaction. EMBO J., 21, 44494457.

72. Lambert M.A., Smith S.G. (2009) The PagN protein mediates invasion via interaction with proteoglycan. FEMS Microbiol. Lett., 297, 209-216.

73. Leranoz S., Orüs P., Berlanga M., Dalet F., Vinas M. (1997) New fimbrial adhesins of Serratia marcescens isolated from urinary tract infections: description and properties. J. Urol., 157(2), 694-698.

74. Lilie M., Galkin V.E., Orlova A., VanLoock M.S., Egelman E.H., Stebbins C.E. (2003) Salmonella SipA polymerizes actin by stapling filaments with nonglobular protein arms. Science, 301, 1918-1921.

75. Margarit S.M., Davidson W., Frego L., Stebbins C.E. (2006) A steric antagonism of actin polymerization by a salmonella virulence protein. Structure, 14, 1219-1229.

76. Marty KB., Williams C.L., Guynn L.J., Benedik M.J., Blanke S.R. (2002) Characterization of a cytotoxic factor in culture filtrates of Serratia marcescens. Infect. Immun., 70(3), 1121-1128.

77. Matthews B.W., (1988) Structural basis of the action of thermolysin and related zinc peptidases. Acc. Chem. Res., 21, 333-340.

78. Matveyev V.V., Usmanova A.M., Morozova A.B., Khaitlina S.Yu. (1996) Purification and characterization of the proteinase ECP32 from Escherichia coli A2 strain. Biochim. biophys. acta., 1296, 55-62.

79. McGhie E.J., Hayward R.D., Koronakis V. (2001) Cooperation between actin-binding proteins of invasive Salmonella-. SipA potentiates SipC nucleation and bundling of actin. EMBOJ., 20(9), 2131-2139.

80. Mornet D, Ue K. (1984) Proteolysis and structure of skeletal muscle actin. Proc Natl Acad Sei USA., 81(12), 3680-3684.

81. Morton W.M., Ayscough K.R., McLaughlin P.J. (2000) Latrunculin alters the actin-monomer subunit interface to prevent polymerization. Nat. Cell Biol., 2, 376378.

82. Mounier J., Laurent V., Hall A., Fort P., Carlier M.F., Sansonetti P.J., Egile C. (1999) Rho family GTPases control entry of Shigella flexneri into epithelial cells but not intracellular motility. J. Cell Sei., 112 (Pt 13), 2069-2080.

83. Mühlrad A., Cheung P., Phan B.C., Miller C., Reisler E. (1994) Dynamic properties of actin. Structural changes induced by beryllium fluoride. J. Biol. Chem., 269(16), 11852-11858.

84. Navarro-Garcia F, Sonnested M, Teter K. (2010) Host-Toxin Interactions Involving EspC and Pet, Two Serine Protease Autotransporters of the Enterobacteriaceae. Toxins (Basel), 2(5), 1134-1147.

85. Navarro-Garcia F., Sears C., Eslava C., Cravioto A., Nataro J.P. (1999) Cytoskeletal effects induced by Pet, the serine protease enterotoxin of enteroaggregative Escherichia coli. Infect. Immun., 67, 2184-2192.

86. Ogawa M, Sasakawa C. (2006) Shigella and autophagy. Autophagy., 2(3), 171-174.

87. Okamoto T., Akaike T., Suga M., Tañase S., Horie H., Miyajiina S., Ando M., Ichinose Y., Maeda H. (1997) Activation of human matrix metalloproteinases by various bacterial proteinases. J. Biol. Chem., 212(9), 6059-6066.

88. Pantaloni D., Clainche C. L., Carlier M.-F. (2001) Mechanism of actin-based motility. Science, 292, 1502-1506.

89. Patel J.C., Galán J.E. (2006) Differential activation and function of Rho GTPases during Salmonella-host cell interactions. J. Cell Biol., 175(3), 453-463.

90. Pentecost M., Kumaran J., Ghosh P., Amieva M.R. (2010) Listeria monocytogenes internalin B activates junctional endocytosis to accelerate intestinal invasion. PLoSPathog., 6(5), el000900.

91. Pivovarova A.V., Khaitlina S.Yu., Levitsky D.I. (2010) Specific cleavage of the DNase-I binding loop dramatically decreases the thermal stability of actin. FEBSJ., 277,3812-3822.

92. Poole K., Schiebel E., Braun V. (1988) Molecular characterization of the hemolysin determinant of Serratia marcescens. J. Bacteriol., 170(7), 3177-3188.

93. Rathman M., de Lanerolle P., Ohayon H., Gounon P., Sansonetti P. (2000) Myosin light chain kinase plays an essential role in S. flexneri dissemination. J. Cell Sci., 113,3375-3386.

94. Reisler E., Egelman E.H. (2007) Actin structure and function: what we still do not understand. J. Biol. Chem., 282, 36133-36137.

95. Rosqvist R., Forsberg A., Wolf-Watz H. (1991) Intracellular targeting of the Yersinia YopE cytotoxin in mammalian cells induces actin microfilament disruption. Infect. Immun., 59(12), 4562-4569.

96. Ruan Y., Braun V. (1990) Hemolysin as a marker for Serratia. Arch. Microbiol., 154(3), 221-225.

97. Sansonetti P.J. (2001) Microbes and microbial toxins: paradigms for microbial-mucosal interactions III. Shigellosis: from symptoms to molecular pathogenesis. Am. J. Physiol .Gastrointest. Liver Physiol., 280(3), G319-323.

98. Sansonetti P.J. (2001) Rupture, invasion and inflammatory destruction of the intestinal barrier by Shigella, making sense of prokaryote-eukaryote cross-talks. FEMS Microbiol. Rev., 25(1), 3-14.

99. Schroeder G.N., Hilbi H. (2008) Molecular pathogenesis of Shigella spp.: controlling host cell signaling, invasion, and death by type III secretion. Clin. Microbiol. Rev., 21(1), 134-156.

100. Schweizer H. (1992) Allelic exchange in Pseudomonas aeruginosa using novel ColEl-type vectors and a family of cassettes containing a portable oriT and the counter-selectable Bacillus subtilis sacB marker. Mol. Microbiol., 6, 1195-1204.

101. Selbach M., Backert S. (2005) Tyrosine-phosphorylated bacterial effector proteins: the enemies within. Trends Microbiol. 13, 181-189.

102. Shi J., Scita G., Casanova J.E. (2005) WAVE2 signaling mediates invasion of polarized epithelial cells by Salmonella typhimurium. J. Biol. Chem., 280(33), 29849-29855.

103. Spiering D., Hodgson L. (2011) Dynamics of the Rho-family small GTPases in actin regulation and motility. Cell Adh. Migr., 5(2), 170-180.

104. Stebbins C.E., Galan J.E. (2001) Structural mimicry in bacterial virulence, Nature, 412, 701-705.

105. Sternweis P.C., Gilman A.G. (1982) Aluminum: a requirement for activation of the regulatory component of adenylate cyclasc by fluoride. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 79(16), 4888-4891.

106. Stetler-Stevenson W.G., Yu A. E. (2001) Proteases in invasion: matrix metalloproteinases. Cancer Biol, 11, 143-152.

107. Stone C.B., Bulir D.C., Emdin C.A., Pirie R.M., Porfilio E.A., Slootstra J.W., Mahony J.B. (2011) Chlamydia pneumoniae CdsL regulates CdsN ATPase activity, and disruption with a peptide mimetic prevents bacterial invasion. Front. Microbiol., 2, 21.

108. Strzelecka-Golaszewska H. (2001) Divalent cations, nucleotides, and actin structure. In: Molecular interactions of actin. Berlin; Heidelberg: Springer Verlag. 23

109. Theriot J.A. (1995) The cell biology of infection by intracellular bacterial pathogens. Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 11, 213-239.

110. Tran Van Nhieu G., Caron E., Hall A., Sansonetti P. J. (1999) IpaC induces actin polymerization and filopodia formation during Shigella entry into epithelial cells. EMBO J., 18, 3249-3262.

111. Vallance B.A., Finlay B.B. (2000) Exploitation of host cells by enteropathogenic Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 97(16), 8799-8806.

112. Vavylonis D, Yang Q, O'Shaughnessy B. (2005) Actin polymerization kinetics, cap structure, and fluctuations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102(24), 85438548.

113. Velge P., Bottreau E., Van-Langendonck N., Kaeffer B. (1997) Cell proliferation enhances entry of Listeria monocytogenes into intestinal epithelial cells by two proliferation-dependent entry pathways. J. Med. Microbiol., 46(8), 681-92.

114. Watarai M., Funato S., Sasakawa C. (1996) Interaction of Ipa proteins of Shigella flexneri with a5(31 integrin promotes entry of the bacteria into mammalian cells. J. Exp. Med., 183, 991-999.

115. Wawro B., Khaitlina S.Yu., Galinska-Rakoczy A., Strzelecka

116. Golaszewska H. (2005) Role of DNase I-binding loop in myosin subfragment 1-induced actin polymerization. Implications to the polymerization mechanism. Biophys. J., 88, 2883-2896.

117. Zhou D., Mooseker M.S., Galán J.E. (1999) Role of the S. typhimurium actin-binding protein SipA in bacterial internalization. Science, 283, 2092-2095.

Информация о работе

Цаплина, Ольга Анатольевна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2011
ВАК 03.03.04

Диссертация

Роль протеализина в бактериальной инвазии - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы