Протеализин - новая протеиназа Serratia proteamaculans 94: структура, свойства и перспективы практического использования

Громова, Татьяна Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Протеализин - новая протеиназа Serratia proteamaculans 94: структура, свойства и перспективы практического использования
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Протеализин - новая протеиназа Serratia proteamaculans 94: структура, свойства и перспективы практического использования"

На правах рукописи

ГРОМОВА Татьяна Юрьевна

ПРОТЕАЛИЗИН — НОВАЯ ПРОТЕИНАЗА SERRATIA PROTEAMACULANS 94: СТРУКТУРА, СВОЙСТВА И ПЕРСПЕКТИВЫ ПРАКТИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

Специальность 03.00 23 — «Биотехнология»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

□□3449433

Москва 2008

003449433

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Московской государственной академии тонкой химической технологии им М.В Ломоносова и в лаборатории белковой инженерии Института молекулярной генетики РАН

Научный руководитель: кандидат химических наук

Демидюк Илья Валерьевич

Официальные оппоненты: доктор химических наук

профессор Готтих Марина Борисовна

доктор химических наук профессор, член-корреспондент РАМН Северин Сергей Евгеньевич

Ведущая организация:

Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Защита состоится 10 ноября 2008 г. на заседании Диссертационного совета Д 212.120 01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В Ломоносова по адресу 117571, Москва, проспект Вернадского, 86

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке МИТХТ им М.В Ломоносова, 117571, Москва, проспект Вернадского, 86

С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте www mitht.ru

Автореферат разослан «л_» октября 2008 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук

Лютик А.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Одним из наиболее активно развивающихся направлений современной биотехнологии является использование широкого круга ферментов в технологических процессах. Среди таких ферментов важную роль играют протеиназы Они используются в медицине, косметологии, индустрии моющих средств, пищевой и кожевенной промышленности, а также для ферментативного синтеза пептидов Однако, несмотря на большое разнообразие природных ферментов, их свойства часто не оптимальны для технологических процессов. Для решения этой проблемы могут быть использованы два основных подхода. Первый заключается в поиске новых природных ферментов с подходящими характеристиками, а второй - в направленной модификации уже известных и хорошо охарактеризованных белков. Второй подход кажется более привлекательным, поскольку позволяет конструировать ферменты оптимальные для данного биотехнологического процесса. Фундаментом для реализации этого подхода является изучение структурно-функциональной организации белков

В лаборатории белковой инженерии Института молекулярной генетики РАН в результате широкомасштабного скрининга микроорганизмов, добытых из необычных природных и промышленных источников, был отобран штамм Serratia proteamaculans 94, который способен с высокой эффективностью гидролизовать нативный коллаген при низких положительных температурах Ферменты, которые определяют такую способность данного штамма, перспективны для использования в пищевой промышленности, так как могут избирательно разрушать соединительную ткань в составе мясного сырья. С целью клонирования генов протеолитических ферментов была создана геномная библиотека Serratia proteamaculans 94, при анализе которой был охарактеризован ген новой металлопротеиназы (протеализина), относящейся к семейству пептидаз М4 - термолизинподобных протеиназ. Изучение структурно-функциональной организации протеализина представляет интерес как с прикладной, так и с фундаментальной точки зрения С одной стороны, этот фермент перспективен для использования в мясоперерабатывающей промышленности для улучшения качества низкосортного мясного сырья А с другой стороны, структурные особенности предшественника протеализина делают его удобной моделью для изучения механизмов действия пропептидов пептидаз семейства М4.

Работа поддержана грантами РФФИ № 03-04-48754-а «Структурные основы низкотемпературной активности ферментов. Новая психрофильная коллагеназа», №06-04-48678-а «Пропептиды как модуляторы функциональной активности белков» и № 06-04-08123-офи «Создание активного при пониженных температурах коллагенолитического ферментного препарата для мясной промышленности».

Цели исследования. Целями данной работы являются исследование структуры и свойств протеализина, а также оценка возможности применения рекомбинантного фермента в пищевой промышленности для улучшения качества мясного сырья.

Научная новизна. В ходе данной работы впервые очищен и охарактеризован протеализин - новая протеиназа Serratia proteamaculans Проведен анализ первичной структуры протеализина и показано, что протеиназы, имеющие структуру, сходную с предшественником протеализина, образуют отдельную группу внутри семейства термолизинподобных протеиназ. Впервые детально изучен механизм созревания предшественника фермента, относящегося к этой группе Получены кристаллы предшественника протеализина и впервые решена пространственная структура предшественника ТПП.

Практическая значимость. Данные, полученные в ходе работы, показали, что на основе протеализина может быть создан препарат для улучшения качества низкосортного мясного сырья. Эти результаты позволяют перейти к конструированию промышленных продуцентов протеализина

Информация о структурно-функциональной организации предшественника протеализина может быть использована для создания на основе этого белка ферментов с направленно модифицированными свойствами Положения, выносимые на защиту

1. Анализ первичной структуры, очистка и изучение свойств рекомбинантного протеализина.

2. Оценка возможности использования рекомбинантного протеализина в пищевой промышленности для улучшения качества низкосортного мясного сырья.

3 Изучение механизма созревания предшественника протеализина

4. Кристаллизация предшественника протеализина и установление его пространственной

структуры

5 Анализ пространственной структуры предшественника протеализина.

Апробация работы. По результатам работы опубликовано три статьи в научных рецензируемых журналах. Результаты работы были представлены на конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2004), на 9, 10 и 11-ой международных Пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI» (Пущино, 2005, 2006 и 2007), на Международной школе - конференции молодых ученых «Биотехнология будущего» (Санкт-Петербург, 2006), на VI симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 2007), на Международной конференции «Протеолиз, механизмы его регуляции и роль в физиологии и патологии клетки» (Минск, 2007), на VI Национальной конференции по применению рентгеновского синхротронного излучения нейтронов и электронов для исследования материалов (Москва, 2007). А также на семинаре

лаборатории белковой инженерии Института молекулярной генетики РАН и на заседании кафедры биотехнологии Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М В Ломоносова.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, списка сокращений, обзора литературы, посвященного структурно-функциональной организации термолизинподобных протеиназ, материалов и методов исследования, обсуждения результатов, выводов и списка используемой литературы. Диссертация изложена на С^ страницах, содержит^/ рисунков и таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Анализ аминокислотной последовательности протеализина

Ранее в лаборатории белковой инженерии ИМГ РАН был идентифицирован штамм S proteamaculans 94 и создана его геномная библиотека. В результате скрининга данной библиотеки отобрана плазмида, введение которой в клетки Е. coli TGI придает последним способность гидролизовать желатин. При анализе клонированного фрагмента хромосомной ДНК, был обнаружен и секвенирован ген протеиназы, названной протеализином и принадлежащей к структурному семейству термолизина.

Сравнение аминокислотной последовательности протеализина с первичными структурами термолизинподобных протеиназ (ТПП) показало, что фермент имеет выраженную гомологию с последовательностью термолизина (Tin) (37% идентичности и 54% сходства) и других хорошо охарактеризованных белков семейства М4. Причем наибольшее количество совпадающих аминокислотных остатков наблюдается в функционально существенных участках молекулы. Проведенный анализ позволил идентифицировать остатки каталитического центра протеализина типичные для ТПП (рис. 1)

-5 0 MPTLTARSVIPPYMLRRIIEHGSLPQRDCALHTLNHVQSLLGNKPLRAPGAKTSTGGEVIRDIYDAENST 2 0 21 QLPGKQVRNEGQASNHDVAVDEAYDYLGVTYDFFWQAFKRNSLDNQGLPLTGSVHYGKEYQNAFWNGQQM 90 91 VFGDGDGEI^NR|^IAID^GjHEIAi^GVTESEAGLIYFOQAGALNESLSDVFGSLVKQFHLKQTADKADW 160 161 LIGEGLLAKGIHGKGQRSMSAPGTAYDDPLLGKDPQP&SMKDXIQTKEDNGGVHLNSSIPNRAFYLAATA 2 30 231 LGGYAWEKAGYIWYDTLCDKALPQDADFATFARTTVKHAEQRFDSKVAQKVQQAWHQVGVA 2 97

Рис. 1. Аминокислотная последовательность полноразмерного предшественника протеализина, выведенная из нуклеотидной последовательности гена Установленная амино-концевая последовательность зрелого протеализина подчеркнута Аминокислотные остатки, формирующие каталитический центр фермента, показаны черным на сером, остатки, формирующие субстратсвязывающий Sl'-субсайт, выделены белым на черном. Последовательность НЕХХН, характерная для Zn-зависимых металлопротеиназ, выделена рамкой. PPL-мотив подчеркнут двойной линией Позиция 1 в аминокислотной последовательности соответствует первой аминокислоте зрелого протеализина.

60 140 170 180 190 200

■ I .... I........I .... I . . I .... I .... I........I .... I .... I .... I . . . . I .

Ein KQVRNEGBäSN А^КПЛс fflvras^KQFHLKQTADKA^L^gGLLAKBSNgKG^^ra

Tin LWADADNgFFA - ШиЯ'' 0i^t8¡efyankn----pIÍheHSSdvyt pBisMDsWaafla

♦ ♦♦ t • • • • • AA А A

Рис. 2. Сравнение аминокислотных последовательностей протеализина и термолизина в областях сайтов связывания ионов кальция. Нумерация по последовательности термолизина. Инвариантные остатки выделены черным на белом. Аминокислотные остатки, которые являются лигандами сайта связывания Cal,2 отмечены •, СаЗ - ♦ и Са4 - А. Tin - термолизин, Pin - протеализии.

Характерной особенностью ТПП является наличие ионов кальция в молекуле фермента. Представители семейства М4 содержат от одного до трех кальций-связывающих участков, которые важны для обеспечения стабильности фермента. Сравнение аминокислотных последовательностей протеализина и термолизина в областях формирующих сайты связывания ионов кальция демонстрирует, что все три сайта протеализина изменены по сравнению с аналогичными регионами термолизина (рис. 2).

При этом сайты СаЗ и Са4, по-видимому, полностью нарушены. В двойном сайте Ca 1,2 большая часть взаимодействующих с кальцием остатков сохранена, однако присутствует драматическая замена Glul77rin—»Lys (нумерация по последовательности зрелого протеализина) и вставка четырех аминокислотных остатков между 183-пп и 184цп позицией. Эти данные позволяют предположить, что, по-видимому, молекула протеализина не может эффективно связывать ионы кальция.

Структура амино-концевого региона (АКР) предшественника протеализина абсолютно не похожа на структуру АКР термолизина и большинства других ТПП (длинные АКР). В тоже время, проведенный нами анализ известных аминокислотных последовательностей термолизинподобных протеиназ показал, что примерно 1/3 ТПП имеет структуру пропептида сходную с пропептидом протеализина. Амино-концевые регионы, подобные пропоследовательности протеализина, содержат около 50 аминокислотных остатков (короткие АКР) и не содержат классических секреторных лидеров, но, в отличие от пропептидов большинства ТПП, включают впервые обнаруженный нами консервативный гидрофобный кластер, PPL-мотив, в области близкой к стартовому метионину. Этот кластер (XXPP(Y/H)XL) представляет собой последовательность из семи гидрофобных аминокислотных остатков и содержит три инвариантных остатка: два следующих друг за другом Pro и расположенный через два остатка за ними Leu. Непосредственно за Pro-Pro сайтом расположен ароматический аминокислотный остаток Туг или His. Таким образом, протеализинподобные протеиназы (ППП) могут быть выделены в отдельную группу внутри семейства М4, характеризующуюся наличием коротких АКР.

Таблица 1. Ход очистки протеализина из клеточного лизата штамма Е. coli BL-21 (DE3) (pSIT20)

Стадии очистки Общий белок, мг Удельная активность, ОЕ/мг Выход по активности, % Степень очистки

Клеточный лизат* 168 8,3 100 1

Анионообменная хроматография на колонке Econo-Pac High Q Cartridge и концентрирование 21,1 29,3 44,2 3,5

Гидрофобная хроматография на колонке Phenyl Sepharose CL 4В и концентрирование 6,0 37,3 15,9 4,5

Гель-проникающая хроматография на колонке Superdex 75 HR 10/30 4,1 41,0 12,1 4,9

* Очистку проводили из 210 мл клеточной суспензии.

2. Очистка зрелого протеализина

Для получения препарата очищенного протеализина был использован ранее

полученный на основе коммерческой экспрессионной системы штамм-продуцент Е. coli BL-21(DE3) (pSIT20). Культивирование штамма-продуцента проводили по стандартной схеме, используя в качестве индуктора негидролизуемый аналог лактозы - изопропил-ß-D-тиогалактопиранозид (ИПТГ). Электрофоретический анализ различных клеточных фракций показал, что значительная часть белка накапливается в клетках Е. coli в растворимой форме в виде предшественника. Необходимо отметить, что растворимый предшественник (размером приблизительно 37 кДа) самопроизвольно процессировался с образованием активной зрелой формы фермента (32 кДа) после разрушения клеток (рис. 3).

Для выделения рекомбинатного зрелого протеализина нами была разработана трехстадийная схема очистки, включающая анионообменную, гидрофобную и гель-проникающую хроматографию. Ход очистки протеализина из клеточного лизата представлен в таблице 1. Использованная схема позволила получить электрофоретически гомогенный белок в количестве 19,5 мг на литр культуральной суспензии с выходом по активности 12 % и очисткой около 5 раз (рис. 3).

кДа 94.6 66.0

45.0

29.0 — ЧИР

20.1 14.4

12 3 4

Рис. 3. Электрофоретический анализ образцов протеализина. I - стандарты молекулярных масс, 2,3 - лизаты Е. coli BL-21(DE3) (pSIT20) сразу после разрушения и после 24 часов инкубации при 4°С, соответственно, 4 - зрелый очищенный протеализин.

3. Характеристика протеализина

3.1. Амино-концевая последовательность и молекулярная масса зрелого протеализина

После получения злектрофоретически гомогенного зрелого протеализина была определена его Ы-концевая последовательность (АКТ8Т), что позволило точно локализовать место процессинга протеиназы при сопоставлении этой последовательности с выведенной из гена первичной структурой полноразмерного предшественника (рис. 1) Таким образом, при созревании белка удаляется 50 аминокислотных остатков, находящихся на Ы-конце предшественника.

Молекулярная масса зрелого белка составила, по данным масс-спектрометрии -31817 Да, определенная посредством гель-проникающей хроматографии - около 31,5 кДа и установленная при электрофоретическом анализе - около 32 кДа. Экспериментальные значения близки к величине молекулярной массы зрелого белка, рассчитанной по аминокислотной последовательности (31894 Да) Совпадение молекулярных масс, определенных при электрофоретическом анализе (денатурированная форма) и при помощи гель-проникающей хроматографии (активная форма), указывает на то, что активной формой протеализина является мономер

3.2. Влияние рН, температуры, ионов кальция и ингибиторов на активность и стабильность протеализина

Нами было показано, что протеализин стабилен в широком диапазоне рН. Он не теряет активности при рН 5,5-9,5 в течение 20 ч при 4°С Протеиназа имеет рН-оптимум гидролиза азоказеина, соответствующий 6,5-7,0, что характерно для ТПП. Такой результат не является неожиданными, поскольку рН-оптимум работы фермента, определяется структурой его активного центра, а, как показал анализ первичной последовательности, у протеализина участки, формирующие каталитический центр, в целом имеют структуру характерную для пептидаз семейства М4

Протеализин не является высокотермостабильным ферментом. При инкубации в течение 2 ч при 40°С фермент не теряет активности, инкубация в течение 2 ч при 50°С приводит к потере 45% активности После воздействия температуры 55°С в течение 1 ч остаточная активность составляет 14%, а 15 мин инкубации при 60°С приводят к практически полной инактивации протеиназы. Умеренная термостабильность протеализина определяет температурный оптимум функционирования фермента, который при рН 7,1 в присутствии 1 мМ СаСЬ наблюдается при 50-55°С.

Обычно термостабильность акцепцией ионов

для ТПП

связывают с кальция. Как

120

3 ä *100

1 I £ «о

И 60

SS 3 i s я Е 40 5 s."

в 20

i f-1- -j

-i

10 20 30 40 50 60 Концентрация Ca1*, мМ

Рис. 4. Влияние концентрации ионов кальция на термостабильность протеализина Остаточная активность после инкубации 20 мин при 37°С - ■ и 55°С - ♦.

упомянуто выше, анализ первичнои структуры показал, что сайты связывания Са2+ в протеапизине значительно изменены, что может препятствовать эффективному

связыванию ионов кальция. Мы показали, что термостабильность протеализина снижается с увеличением

концентрации ионов Са2+ (рис. 4) В то время как для ряда ТПП продемонстрирован обратный эффект - увеличение термостабильности с увеличением концентрации ионов кальция Можно предположить, что при увеличении концентрации Са2+ происходит низкоаффинное связывание молекулой протеализина ионов этого металла, что приводит к усилению автолитичекой деградации.

Обработка фермента групповым ингибитором цистеиновых протеиназ - хлоридом ртути (II) и групповым ингибитором сериновых протеиназ - ФМСФ в концентрации 0,1 и 1 мМ, соответственно, не влияет на активность фермента В то же время фермент ингибируется хелатирующими агентами, которые являются групповыми ингибиторами металлопротеиназ. Так, протеализин полностью ингибируется о-фенантролином в концентрации 1 мМ. Таким образом, по характеру ингибирования исследуемый фермент является типичным представителем металлопротеиназ

3.3. Изучение кинетики гидролиза ФАГЛА

Для первичной характеристики каталитических свойств протеализина был выбран 3-(2-фурил)акрилоил-глицил-Ь-лейцинамид (ФАГЛА), который является стандартным субстратом для ТПП. Нами было установлено отношение констант kcat/Km при гидролизе ФАГЛА протеализином, которое составляет (2,52 ± 0,02) * 102 М"1 * с"1. Для сравнения укажем, что соответствующее отношение для термолизина равно (2,0 ± 0,1) х 104 М"' х с"1. Такая разница может свидетельствовать о том, что фермент либо неэффективно гидролизует, либо неэффективно связывает субстрат. Возможно, низкое значение kcal/FCm связано с тем, что ФАГЛА не оптимальный субстрат для этого фермента Это соображение подтверждается тем, что для большинства ТПП, имеющих подобно протеализину РЬе133т1П в субстратсвязывающем сайте, остаток Leu в PI' положении субстрата (как в случае ФАГЛА) не является предпочтительным

Таким образом, данные, полученные нами при анализе первичной структуры протеализина и установленные нами свойства этого белка, позволяют утверждать, что

фермент принадлежит к семейству пептидаз М4. В то же время протеализин имеет ряд структурных отличий от классических ТПП.

4. Оценка возможности использования рекомбинантного протеализина в пищевой промышленности

Одной из основных задач данной работы было изучение возможности использования протеализина в пищевой промышленности для улучшения качества мясного сырья. Для этого на первом этапе мы разработали схему получения ферментного препарата на основе штамма Е. coli BL-21(DE3) (pSIT20) в лабораторных условиях. Препарат, полученный с использованием этой схемы был применен для исследования инактивации фермента в ходе тепловой обработки мясных продуктов. Оценку степени инактивации протеализина в готовой продукции проводили совместно с сотрудниками лаборатории гигиены производства и микробиологии ГНУ ВНИИ мясной промышленности им. В.М. Горбатова Россельхозакадемии, где была выработана опытная партия колбасных изделий с использованием ферментного препарата. Полученные данные показали, что протеолитическая активность в готовой продукции не детектируется, и, таким образом, протеализин удовлетворяет одному из главных условий для использования фермента в пищевой промышленности.

Полученные результаты позволили перейти к исследованию действия протеализина на мясное сырье в опытно-промышленных условиях. Совместно с коллегами из Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН им. Г.К. Скрябина (г. Пущино) был разработан технологический регламент получения препарата протеализина. С использованием этого регламента был получен ферментный препарат, с помощью которого на ЗАО «Микояновский мясокомбинат» выпущена опытная партия варено-копченой колбасы, и совместно с сотрудниками ГНУ ВНИИ мясной промышленности им. В.М. Горбатова изучены микроструктурные характеристики готового продукта.

Рис. 5. Микрофотографии варено-копченой колбасы. А - выработанной с использованием ферментного препарата; Б - выработанной без ферментного препарата.

Анализ полученных данных показывает, что степень деструкции мышечных волокон существенно не отличается от контрольных образцов, а наиболее существенные изменения по сравнению с контрольными образцами происходят в структуре соединительнотканных фрагментов При этом соединительнотканные фрагменты характеризовались разрыхлением компоновки коллагеновых волокон в пучках, что способствовало более глубоким изменениям в структуре коллагена при термической обработке (рис. 5). Отмеченные морфологические изменения в структуре опытных образцов, по сравнению с контрольными, способствуют формированию более высоких качественных показателей готового продукта' повышают его пищевую ценность и улучшают органолептические свойства.

Таким образом, полученные данные позволяют заключить, что на основе протеализина может быть создан препарат для улучшения качества мясного сырья, пригодный для применения в пищевой промышленности

5. Процессинг предшественника протеализина

Как было упомянуто выше, протеализин является прототипом нового подсемейства ТПП, представители которого отличаются структурной организацией предшественника. Эта особенность протеализина представляет значительный интерес с фундаментальной точки зрения. Известно, что многие белки синтезируются в виде предшественников, которые кроме доменов, соответствующим зрелым белкам, включают элементы, удаляемые в ходе созревания - пропептиды (или пропоследовательности). По имеющимся в настоящее время представлениям, пропептиды являются посттрансляционными модуляторами функции белков. Данные, опубликованные на сегодняшний момент, позволяют думать, что две группы белков внутри семейства М4, представители которых имеют различную организацию предшественника, отличаются по биологическим функциям Поскольку каталитические части ферментов обеих групп имеют высокую степень сходства, по-видимому, эти различия определяются пропептидами, и, таким образом, ТПП являются хорошей моделью для исследования механизмов функционирования пропоследовательностей. Принципы функционирования и механизмы удаления пропептидов ТПП изучались ранее, в основном, для белков с пропептидами термолизинового типа (длинные пропептиды) Механизмы функционирования коротких пропептидов и процесс созревания предшественников протеализинподобных протеиназ до настоящего времени не изучались детально. Поэтому нами проведено исследование пути процессинга предшественника протеализина т vitro. Для этого мы использовали стандартные подходы модификацию каталитического центра и изучение созревания предшественника в иммобилизованном состоянии.

5.1. Конструирование и экспрессия модифицированных генов протеализина

Для получения рекомбинантных предшественника протеализина и зрелого протеализина (proPlnHis6 и PlnHiss, соответственно), несущих шесть остатков гистидина в С-концевой области, мы сконструировали экспрессионный вектор pPlnHis^ на основе плазмиды pSIT20. Конструкция pPlnHiSü была использована для создания pPlnHis^A - вектора для экспрессии предшественника протеализина, имеющего, помимо шести гистидинов в С-концевой области, мутацию Glu 113—>А1а (нумерация по последовательности зрелого протеализина) в активном центре фермента (proPlnHiss/A). Остаток Glul 13 (Glul43n„) играет ключевую роль в катализе ТПП, и, как было показано ранее на других моделях, его замена приводит к образованию неактивного фермента. Для экспрессии модифицированных генов протеализина векторы pPInHiSô и pPlnHis^/A были введены в клетки Е. coli BL-21 (DE3). Оба белка накапливались внутри клеток в растворимом виде в форме предшественников, как и в случае фермента дикого типа.

5.2. Очистка и некоторые свойства зрелого протеализина, несущего шестигистидиновую последовательность на С-конце молекулы

После разрушения клеток Е. coli BL 21 (DE 3) (pPlnHiSö), как и в случае белка дикого типа, предшественник протеализина (proPlnHiSö) переходил в зрелую форму при инкубации при 4°С в течении 24 - 72 часов (рис. 6). Этот процесс сопровождался увеличением протеолитической активности клеточного лизата.

Зрелый протеализин (PlnHiSö) был очищен до электрофоретического гомогенного состояния (рис. 6, дорожка -очищенный PlnHisö) с использованием металлохелат аффинной и гель-проникающей хроматографии. Амино-концевая последовательность полученного белка (AKTST) совпадала с определенной ранее N-концевой последовательностью немодифицированного зрелого протеализина. Также как белок дикого типа, PlnHisö проявлял оптимум активности при гидролизе азоказеина при pH около 7 и полностью ингибировался 1 мМ о-фенантролина.

Рис. 6. Электрофоретический анализ образцов протеализина. Дорожка proPlnHis6 - лизат клеток Е. coli BL-21 (DE3) (pPlnHis6) сразу же после лизиса, дорожка PlnHis6 - лизат клеток Е. coli BL-21 (DE3) (pPlnHis6) после 24 часов инкубации при 4°С; предшественник протеализина - pro, зрелый протеализин - mat.

Рис. 7. Созревание предшественника протеализина (proPinHis6) в растворе. Предшественник протеализина - pro, промежуточная форма - int, зрелый протеализин - mat

Рис. 8. Созревание мутантного предшественника протеализина (proPlnHis6/A) под действием активного протеализина.

Предшественник протеализина - pro, промежуточная форма - int, зрелый протеализин - mat.

5.3. Процессинг предшественника протеализина

Для предотвращения процессинга proPlnHiS6 все манипуляции при очистке этого белка проводили при рН 11. В этих условиях протеализин, подобно другим пептидазам семейства М4, не проявляет протеолитической активности и, следовательно, не способен автопроцессироваться. Предшественник протеализина был очищен до электрофоретического гомогенного состояния (рис. 7, дорожка proPlnHise) с использованием металлохелат аффинной и гель-проникающей хроматографии. Мы определили амино-концевую последовательность этого белка - VIPPY, таким образом, proPlnHisi не содержит восьми N-концевых аминокислотных остатков, кодируемых геном.

Очищенный proPlnHis6 стабилен в растворе при рН 11 и 4°С в течение 30 дней. При переводе в буфер с рН 7,3 белок полностью переходит в зрелую форму. При этом наблюдается образование интермедиата (intPlnHise) с молекулярной массой около 34 кДа (рис. 7). Скорость процессинга proPlnHisi завит от рН, и кривая этой зависимости совпадает с кривой зависимости от рН протеолитической активности зрелого протеализина. Созревание proPlnHis6 полностью подавляется 2 мМ о - фенантролина, группового ингибитора ТПП, в то же время 2 мМ ФМСФ не оказывает влияния на этот процесс. Таким образом, можно предположить, что процессинг протеализина зависит от его собственной протеолитической активности.

Для исследования влияния собственной протеолитической активности на процесс созревания фермента мы сконструировали предшественник протеализина с мутацией в активном центре (proPlnHise/A). Мутантный предшественник протеализина был очищен до электрофоретически гомогенного состояния (рис. 8, дорожка proPlnHiS6/A) с использованием металлохелат аффинной и гель-проникающей хроматографии. Амино-концевая последовательность (PTLTA) и молекулярная масса proPlnHis6/A (38103 Да), определенная

Время инкубации, мин

о. 0.25 5

15 20 25

Время инкубации, мин

(Ч ц->

методом маее-спектрометрии, соответствуют белку без стартового метионина, с заменой в активном центре Glul 13—»Ala и шестью гистидинами в С - концевой области

Очищенный proPlnHiS6/A стабилен в растворе при рН 8,0 и 4°С в течение 30 суток, а также при рН 7,3 и 37°С в течение 24 часов. Таким образом, модификация ключевого остатка активного центра протеапизина, Glul 13—»Ala, привела к прекращению созревания предшественника, что свидетельствует об автокаталитическом процессинге Аналогичные результаты опубликованы для ряда пептидаз семейства М4, имеющих длинные пропептиды, а также для протеиназы PrtS Photorhabdus luminescens, относящейся к группе протеализина Таким образом, совокупность имеющихся данных позволяет заключить, что, вне зависимости от структуры предшественника, удаление пропептидов протеиназ семейства М4 может происходить автокаталитически

Кроме того, нами было показано, что при действии активного протеализина proPlnHiSf/A может переходить в зрелую форму (PlnHis^A) (рис. 8) Этот процесс сопровождается образованием интермедиата (intPlnHise/A), который по молекулярной массе (около 34 кДа) совпадает с промежуточной формой, образующейся при созревании proPlnHisé Амино-концевая последовательность PlnHis^A (AKTST) идентична N-концевой последовательности PlnHiS6. Мы определили амино-концевую последовательность промежуточной формы - LLGNK, таким образом, интермедиат содержит 11 дополнительных N-концевых аминокислотных остатков по сравнению со зрелым белком. Мутантный предшественник протеализина также способен переходить в зрелую форму при обработке субтилизином и термолизином Как и при действии активного протеализина, процессинг идет с образованием промежуточной формы. По данным электрофоретического анализа зрелые и промежуточные формы, образующиеся при действии всех трех ферментов, близки по молекулярным массам

Таким образом, удаление пропептида протеализина может происходить межмолекулярно, как авто-, так и гетерокаталитически.

Чтобы исследовать возможность внутримолекулярного процессинга протеализина, мы иммобилизовали proPlnHise на Ni2+-HTK агарозе через шестигистидиновую последовательность с целью исключить межмолекулярные взаимодействия Иммобилизацию проводили при рН 11. При этом значении рН ТПП не проявляют активности, а, следовательно, не способны автопроцессироваться Для осуществления процессинга

Рис. 9. Электрофоретический анализ образцов предшественника протеализина (proPlnHiSí)

иммобилизованного на Ni -НТК агарозе S - раствор, в котором инкубировалась Nr'-НТК агароза с иммобилизованным proPlnHis6, Im - proPlnHis6 после инкубации на Ni +-НТК агарозе, предшественник протеализина - pro, зрелый протеализин - mat

Время инкубации, ч м 0 4 ®

S Im S Im E

pro mat

иммобилизованный белок переводили в буфер с рН 8,4 и инкубировали при 37°С. Как видно из рис. 9, через 4 часа после начала инкубации детектировать промежуточную и зрелую формы фермента не удавалось.

Полученные нами данные о поведении предшественника протеализина в иммобилизованном состоянии демонстрируют его неспособность к внутримолекулярному созреванию. Это впервые показывает, что свойства предшественника протеализина и, по-видимому, предшественников других протеализинподобных протеиназ отличаются от свойств предшественников ферментов с длинными пропептидами, для которых на модели термолизина и металлопротеиназы L. monocytogenes показано, что отщепление пропептида происходит только внутримолекулярно.

Полученные данные демонстрируют, что созревание предшественника протеализина происходит ступенчато (рис. 10). Первая стадия процессинга сопровождается отщеплением восьми лидерных аминокислотных остатков, и, таким образом, немодифицированный предшественник протеализина, выделенный из клеток Е. coli, содержит на N-конце последовательность PPL-мотива. Следовательно, PPL-мотив взаимодействует с S' субстратсвязывающим субсайтом процессирующего фермента. В том случае, если гидролиз на этой стадии осуществляется автокаталитически, то взаимодействие происходит с собственным субстратсвязывающим участком. По-видимому, именно с этим связан консерватизм данного мотива у протеализинподобных протеиназ. На второй стадии происходит удаление большей части пропептида, что приводит к образованию промежуточной формы, которая в случае автопроцессинга содержит 11 дополнительных N-концевых аминокислотных остатков по сравнению со зрелым белком. (Возможно, через образование интермедиата созревают не все молекулы белка.) Третья стадия процессинга приводит к образованию зрелого фермента. Необходимо отметить, что молекулярные массы промежуточных и зрелых форм, полученных при действии протеализина, субтилизина и термолизина, совпадают по результатам электрофореза.

IPTLT.VIPPYML........LLGNK..IMSI I ProPlnHis,/A

^ Внутримолекулярный автопроцессинг?

[VIPPYML........ШЖ, JAKTST I proPlnHis,

\ Межмолекулярный авто- или гетеропроцессинг

ШШ ' 1 InSIf

^ Межмолекулярный авто- или гетеропроцессинг

т ' I Kif

Рис. 10. Схема созревания предшественника протеализина. Мутантный предшественник протеализина - ргоРЫШзб/А; предшественник протеализина - ргоР1п№8б; промежуточная форма, образующаяся при автоактивации предшественника протеализина или при действии активного протеализина на мутантный предшественник - ЫРШШвб, ЫР^ЬНзб/А, соответственно; зрелый протеализин, образующийся при автоактивации предшественника протеализина или при действии активного протеализина на мутантный предшественник - Р1пШз6, Р1пШ$6/А, соответственно.

Этот факт позволяет думать, что место, в котором происходит гидролиз предшественника на второй и третьей стадии, определяется, в первую очередь, пространственной структурой процессируемого белка, в частности, доступностью для действия протеиназ района Leu(-1 lpin)-Alalpin. Расщепление предшественника на второй и третьей стадии процессинга, по-видимому, может происходить только межмолекулярно, так как иммобилизованный предшественник протеализина процессироваться не способен.

Таким образом, наши результаты впервые демонстрируют, что два типа пропоследовательностей пептидаз семейства М4 заметно отличаются не только структурно, но и функционально. Можно полагать, что такая ситуация определяется различной биологической ролью соответствующих ферментов.

6. Пространственная организация предшественника протеализина

Для выяснения механизмов взаимодействия пропептида и зрелой части протеализина, а также выяснения функциональной роли пропептидов протеализинового типа нами установлена пространственная структура предшественника протеализина - первая пространственная структура предшественника ТПП

Кристаллизация и решение пространственной структуры предшественника протеализина проводились совместно с сотрудниками Лаборатории белковой кристаллографии Института кристаллографии РАН (г. Москва)

6.1. Получение кристаллов предшественника протеализина

Для получения кристаллов мы использовали предшественник протеализина, имеющий мутацию в активном центре Glul 13—»Ala и не способный к автокаталитической активации (proPlnHiSé/A). Кристаллы proPlnHise/A получали методом диффузии растворителя через газовую фазу в висячих каплях при комнатной температуре Определенные нами оптимальные условия роста кристаллов приведены в таблице 2. В результате были получены два типа кристаллов, различающихся по морфологии' одни - в виде плоских четырехугольных пластин со средними размерами 0,3x0,3x0,03 мм, форма 1 (рис 11А), другие - в виде треугольных клиньев со средними размерами 0,5x0,3x0,05 мм, форма 2 (рис 11Б)

Таблица 2. Условия роста кристаллов предшественника протеализина

Конц белка, мг/мл Состав осадителя, используемого как резервуарный раствор Состав раствора-осадителя, добавляемого в каплю с белком Соотношение объемов растворов белка и осадителя Объем капли, мкл

10 (NH4)2S04 0,2 М CHjCOONa 0,1 М ПЭГ ММЭ 2000 15% рН 4,6 (NH4)2S04 0,2 М CH3COONa 0,1 М O-GL 0,06 % ПЭГ ММЭ 2000 20 % рН 4,6 2:1 4,5

А Б

Рис. 11. Фотографии кристаллов предшественника протеализина. А - кристаллическая форма 1, Б - кристаллическая форма 2.

Предварительный рентгеноструктурный анализ показал, что кристаллические формы различаются по рентгенографическим характеристикам. Четырехугольные кристаллические пластины (рис. 11 А) относятся к моноклинной сингонии и имеют следующие параметры элементарной ячейки: а=64,13А; Ь=77,29 А; с=69,85 А, угол моноклинности ¡3=105,88°. Более изометричные клиновидные кристаллы (рис. 11 Б) относятся к ромбоэдрической сингонии и имеют размеры элементарной ячейки а=59,28 А; Ь=70,76 А; с=78,65 А, углы а=(3=у=90°.

Оценка числа белковых молекул и содержания растворителя в элементарной ячейке по Меттьюсу показала, что в обеих кристаллических формах содержание растворителя составляет 43 % от объема ячейки, при этом в независимой части элементарной ячейки в моноклинных кристаллах содержится две, а в ромбоэдрических - одна молекула белка. ¡-

Дифракционные рефлексы от моноклинных кристаллов достигали разрешения 2,2 А, а от ромбоэдрических - разрешения 1,8 А, поэтому обе формы пригодны для рентгеноструктурного исследования, однако ромбоэдрические кристаллы предпочтительны, поскольку они рассеивают до более высокого разрешения, более изометричны и содержат только одну молекулу в независимой части элементарной ячейки. Эти кристаллы были использованы для дальнейшей работы.

Дифракционные рефлексы от ромбоэдрических кристаллов были собраны в Курчатовском центре синхротронного излучения и нанотехнологий (г. Москва). Обработка г-

дифракционных данных и построение модели пространственной структуры предшественника протеализина были выполнены в Лаборатории белковой кристаллографии Института кристаллографии РАН (Москва).

Рис. 12. Пространственная структура Рис. 13. Сравнение двойного сайта связывания

предшественника протеализина. Зрелая кальция у протеализина и термолизина. Главная цепь

часть показана коричневым, пропептид - протеализина показана зеленым цветом, термолизина -

голубым. Цинк каталитического центра голубым цветом. Ионы кальция в молекуле

показан зеленой сферой. термолизина показаны сферами зеленого цвета.

6.2. Анализ пространственной структуры предшественника протеализина

Анализ пространственной структуры предшественника протеализина показал, что пропептид в молекуле протеализина представляет собой отдельный домен, взаимодействующий с каталитической частью. Пропептид имеет выраженную вторичную структуру и содержит две а-спирали. Зрелая часть протеализина имеет двухдоменную организацию, характерную для ТПП. С - концевой домен состоит преимущественно из а-спиралей. Кроме этого, в структуре этого домена имеются две протяженные петли, каждая из которых содержит короткую антипараллельную Р-шпильку. М-концевой домен состоит из двух а-спиралей и (3-листа, сформированного пятью участками полипептидной цепи. Каталитический центр включает ион цинка (рис. 12). Таким образом, в целом пространственная организация зрелой части протеализина типична для ТПП. В тоже время, молекула протеализина имеет ряд существенных отличий, которые детально обсуждаются ниже.

Одно из отличий заключается в том, что молекула протеализина не содержит ионов кальция. Все ранее охарактеризованные ТПП с известными пространственными структурами включают от одного до четырех ионов кальция. Анализ сайтов связывания ионов кальция в протеализина показал, что все сайты значительно изменены по сравнению с аналогичными регионами других петидаз семейства М4.

6.2.1. Анализ сайтов связывания кальция

Сравнение пространственной структуры зрелой части протеализина со структурами термолизина Bacillus thermoproteolyticus, протеиназы Bacillus cereus, эластазы Pseudomonas aeruginosa и ауролизина Staphylococcus aureus показало, что N-концевая область протеализина короче, чем у других ТПП приблизительно на 30 аминокислотных остатков. Отсутствие N-концевой области приводит к разной структуре участков 55т1П-60т1п (нумерация по последовательности зрелого термолизина) и 77pin-85pi„ (нумерация по последовательности предшественника протеализина) Этот регион в молекуле термолизина содержит сайт СаЗ, образованный Asp57Ti„, Asp59ri„ и Gluölxin В протеализине СаЗ, по-видимому, отсутствует, так как основные лиганды кальция заменены, а пространственная структура нарушена

Структура региона, соответствующего у других ТПП двойному (Ca 1,2) сайту связывания кальция, в протеализине также изменена. Отличие заключается в том, что петля, образующая двойной кальций-связывающий сайт в других ТПП, в протеализине удлинена на четыре аминокислотных остатка (Ala205pin-Ala208pi„) по сравнению с термолизином и нейтральной протеиназой Bacillus cereus (рис 13) Появление этих четырех аминокислотных остатков обуславливает возникновение взаимодействий, которые изменяют и стабилизируют иное положение петли.

В структуре данного региона протеализина сохранена большая часть остатков, непосредственно взаимодействующих с ионами кальция в молекуле термолизина' Glu214P|n (Glul90Tin), Aspl58pi„ (Aspl38Ti„), Asp209Pi„ (Aspl85Tin), Leu211pi„ (G1u187ti„). В тоже время, имеется существенная замена одного из ключевых остатков сайта Glu 187пп на Lys 197pi„ Не смотря на сохранение большинства остатков, связывающих кальций, наличие положительно-заряженного остатка (Lysl 97р|п), вероятно, приводит к тому, что данный регион не способен связывать ионы кальция. Однако наличие Lysl97pi„ приводит к возникновению ионного взаимодействия между аминогруппой Lysl97pin и карбоксильными группами Glu214pi„ и Asp209pi„, которое, вероятно выполняет стабилизирующую функцию Таким образом, двойной кальций-связывающий сайт в молекуле протеализина отсутствует. Поскольку этой сайт важен для стабильности структуры фермента, то его потеря, вероятно, компенсируется ионным взаимодействием Lysl97pi„ с Glu214pin и Asp209Pi„ Важно отметить, что такая ситуация, по-видимому, не уникальна для протеализина. Сравнение аминокислотных последовательностей ферментов с короткими пропептидами демонстрирует высокий консерватизм остатка Lysl97pi„.

Участок Leu216pi„-Lys224pin, соответствующий сайту Са4 в молекулах термолизина, ауреолизина и нейтральной протеиназы Bacillus cereus, в протеализине также значительно изменен. Имеются замены ключевых лигандов кальция и значительное смещение петли 220pin-223pi„. Вероятно, эти изменения приводят к тому, что Са4 в молекуле протеализина отсутствует. Положение петли 220pi„-223pi„ стабилизируется образованием трех водородных

Субстратсвязывающая область

Рис. 14. Субстратсвязывающая область в молекулах протеализина (А) и термолизина (Б). АУИО-шпилька в молекуле протеализина показана розовым цветом.

связей с остатками Азр237р|„ и А8р238р1П, которые включены в последовательность АУОО-шпильки - структурного элемента, который будет обсуждаться ниже.

Таким образом, можно полагать, что в структуре протеализина нет сайтов связывания кальция. Интересно отметить, что нами был продемонстрирован эффект влияния концентрации ионов кальция на термостабильность зрелого протеализина. Было показано, что концентрация ионов кальция выше 10 мМ приводит к снижению термостабильности, что нехарактерно для большинства ТИП. Вероятно, на роль низкоаффинного сайта, который отвечает за дестабилизацию зрелого протеализина кальцием, может претендовать область, соответствующая двойному кальций-связывающему сайту в молекуле термолизина. В данном регионе молекулы протеализина сохранено большинство остатков, которые отвечают за связывание ионов кальция. Кроме этого, положительный заряд Ьу8197р|„ компенсирован благодаря ионным взаимодействиям с С1и214р1П и Азр209р1„, а карбоксильная группа А8р158р1„ и карбонильная группа 1_еи211р1„ могли бы служить акцепторами иона кальция. Но поскольку подобная организация кальций связывающего сайта является нехарактерной для ТПП, то акцепция ионов кальция вероятно приводит в дестабилизации структуры.

6.2.2. АУОО-шпилька

АУОО-шпилька (А1а235р|п-Азр244р1„) является еще одним ключевым элементом, который отличает структуру протеализина от всех известных пространственных структур ТПП. Она включает короткую Р-структуру, сформированную двумя участками полипептидной цепи (Туг236р|„-Азр238р1П и 01у242р|„-Азр244р1П), и поворот Рго239р|п-Ьеи241р1„. АУОО-шпилька стабилизируется набором водородных связей внутри р-структуры, а также образованием трех водородных связей с петлей С1у220р|п-01у223р1„. Кроме этого,

внутри шпильки образуется ионная пара между карбоксильной группой Asp237pi„ и аминогруппой Lys243pin Помимо полярных взаимодействий AYDD-шпилька стабилизирована гидрофобными взаимодействиями боковых радикалов Leu240pi„ и Leu241pi„ с боковыми радикалами Ilel49pi„, Phel50pi„, Leu217pi„ и Ile221pi„. Боковая группа Tyr236pi„ формирует область связывания с Tyrl3pin и Metl4pin. По-видимому, Туг236р|„ существенен для взаимодействия с пропептидом. Важно отметить, что появление AYDD-шпильки в структуре протеализина приводит к изменению геометрии его субстратсвязывающего участка по сравнению с таковыми у термолизина и других ТПП, для которых известна пространственная структура (рис 14).

Анализ первичных структур ТПП показывает, что AYDD-шпилька, также как и PPL-мотив, консервативна у пептидаз семейства М4 с короткими, протеализинподобными пропептидами и, таким образом, этот элемент является общей структурной особенностью ферментов данной группы

6.2.3. Структурная организация пропептида и его взаимодействие со зрелой частью

Пропептид протеализина имеет размер 50 аминокислотных остатков Однако, в результате рентгеноструктурного анализа кристаллов предшественника протеализина нам удалось детектировать только часть пропептида (участок Ala6nn-Val37pin) протяженностью 32 аминокислотных остатка В тоже время предшественник протеализина, который мы использовали для кристаллизации, имеет молекулярную массу 38103 кДа и N-концевую последовательность - PTLTA. Эти данные указывают на то, что белок имеет ненарушенную первичную структуру и соответствует полноразмерному предшественнику без стартового метионина и с заменой Glul 13—»Ala. Поэтому, можно полагать, что недетектируемые участки Pro2pi„-Thr5pi„ и Asp38pi„-Ala51pin присутствуют в молекуле протеализина и обладают повышенной подвижностью

Детектируемая часть пропептида состоит из двух а-спирапей (Prol2pi„-Gly22pm и Ser23pin-His36pin), а также N-концевого участка (Ala6pi„-Prol 1 pin), который вовлечен в формирование антипараллельной Р-структуры с участком Alal33pin-Trpl35pin зрелой части. Остатки Arg7pi„-Leul5pi л пропептида взаимодействуют с предполагаемым субстратсвязывающим сайтом фермента.

Между двумя a-спиралями пропептида осуществляется гидрофобное взаимодействие, в которое вовлечены боковые радикалы Leul5Pi„, Ilel9pm и Ala30pi„, Leu31pi„, Leu34pi„. Со зрелой частью спирали Prol2pin-His21pin и Leu24p]n-Asn35pi„ взаимодействуют по-разному. Спираль Prol2pi„-His21pi„ - в основном посредством гидрофобного взаимодействия между Ilel8pi„ и Ilel49pin, Phel50pi„, а также между Metl4pi„ и Leu217Pi„, Tyr236pi„, Leu241Pi„ Остатки Tyr236pi„ и Leu241pi„ входят в состав AYDD-шпильки А спираль Leu24pi„-Asn35pin взаимодействует со зрелой частью посредством водородных связей, в образование которых

вовлечены С1п26р|„ и С1и148р]„, ТЬгЗЗр|„ и С1п131Р1„. Таким образом, две а-спирали в комплексе со зрелой частью представляют собой жесткую структуру, стабилизированную взаимодействиями как между самими спиралями, так и между спиралями и зрелой частью.

Анализ пространственной структуры предшественника протеализина, неспособного к автопроцессингу, продемонстрировал, что РРЬ-мотив взаимодействует с субстратсвязывающим участком фермента, занимая 8'-субсайт в молекуле протеализина. Таким образом, по-видимому, пропептид выполняет функцию ингибитора, а консерватизм РРЬ-мотива в ТПП с короткими пропептидами обусловлен тем, что этот элемент связывается с активным центром. Это наблюдение хорошо согласуется с результатами, полученными в ходе изучения процессинга предшественника протеализина. Нами было показано, что немодифицированный предшественник, выделенный из клеток Е. соИ не содержит восьми 14-концевых аминокислотных остатков, кодируемых геном, и начинается с последовательности Уа1-11е-Рго-Рго-Туг, то есть с последовательности РРЬ-мотива. Таким образом, вероятно, гидролиз связи 8ег8р|„-Уа19р1п осуществляется автокаталитически и внутримолекулярно. По-видимому, взаимодействие пропептида со зрелой частью подобно взаимодействию субстрата со зрелым протеализином (рис. 15). Взаимодействия пропептида с 81, Б Г, субсайтами протеализина похожи на описанные ранее взаимодействия различных ингибиторов с термолизином. В тоже время, полученные нами результаты впервые содержат информацию о взаимодействии лигандов с молекулой ТПП в субсайте 82. Для взаимодействия зрелой части протеализина с его пропептидом важны области за 82'субсайтом (ЭЗ', 85', Эб', 87' субсайты), которые, вероятно, также существенны для взаимодействия с субстратом. В термолизине ЭЗ', Э5', 86', 87' субсайты отсутствуют. Это различие объясняется тем, что структурная организация субстратсвязывающего участка в протеализине значительно отличается от таковой в термолизине. Если для ТПП с длинными пропептидами субстратсвязывающая область представляет собой достаточно узкую щель на поверхности молекулы, то в протеализине субстратсвязывающая область — это углубление крестообразной формы (рис. 14). Изменение

Рис. 15.

Положение остатков А1абр|„-Ьеи15р|„ пропептида в субстратсвязывающей области

протеализина. ЛУОО-шпилька в молекуле протеализина показана розовым цветом. Цинк каталитического центра показан сиреневой сферой.

субстратсвязывающей области происходит за счет появления в структуре протеализина AYDD-шпильки, которая включает остатки, формирующие S5' и S6' субсайты (Tyr236pin и Leu217p]„, Tyr236pi„, Leu241Pi„, соответственно). Подобная организация субстратсвязывающей области, вероятно, накладывает ограничения на структуру гидролизуемого субстрата Так, например, остатки Pro 11 pin и Prol2Pi„, формально занимающие S3' и S4' субсайты, не имеют специфических взаимодействий со зрелой частью, но они обеспечивают подъем полипептидной цепи пропеследовательности из субстратсвязывающей области В связи с этим, вероятно, зрелый протеализин проявляет предпочтение к субстратам с Gly и Pro в положениях РЗ' и Р4', что обеспечивает изгиб пептидной цепи.

Таким образом, анализ пространственной структуры предшественника протеализина показал, что фермент имеет ряд существенных отличий по сравнению с ТПП, имеющими длинные пропептиды. Первое отличие заключается в том, что N-концевая область протеализина короче, чем у пептидаз семейства М4 с известной пространственной структурой приблизительно на 30 аминокислотных остатков. Еще одно важное отличие заключается в отсутствии сайтов связывания ионов кальция и перестройке регионов, соответствующих сайтам связывания кальция в других ТПП Кроме того, субстратсвязывающая область протеализина отличается от таковой в термолизине и других ТПП с длинными пропептидами.

ВЫВОДЫ

1. По структуре и свойствам протеализин, новая протеиназа Serratia proteamaculans, относится к семейству пептидаз М4, более известному как термолизинподобные протеиназы

2. На модели протеализина впервые проведено исследование механизма удаления нового типа пропептидов пептидаз семейства М4 Установлено, что пропептиды протеализинового типа, в отличие от классических пропоследовательностей ферментов семейства, могут быть удалены только межмолекулярно, но при этом как авто-, так и гетерокаталитически

3. Получен препарат протеализина и в опытно-промышленных условиях изучено его действие на мясное сырье. Продемонстрировано, что протеализин перспективен для использования в пищевой промышленности как агент для улучшения качества мясного сырья

4. Получены кристаллы, пригодные для рентгеноструктурного анализа, и установлена пространственная структура предшественника протеализина - первая пространственная структура предшественника пептидазы семейства М4.

5. Консервативный структурный элемент пропептидов протеализинового типа, PPL-мотив, непосредственно взаимодействует с субстратсвязывающим районом фермента.

6 В структуре протеализина не содержится ионов кальция Пептидаза семейства М4 с такой структурной особенностью обнаружена впервые.

7. Активный центр протеализина содержит, отсутствующий в других пептидазах семейства М4 с известными пространственными структурами, дополнительный структурный элемент, который изменяет организацию субстратсвязывающего региона и участвует во взаимодействии с лигандом

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ

1. Т.Ю. Громова, И.В. Демидюк, C.B. Костров, Н.И. Сосфенов, В.Р. Мелик-Адамян, И.П. Куранова. Кристаллизация и предварительные рентгеновские исследования кристаллов предшественника пептидазы семейства М4 - протеализина // Кристаллография, 2008, Т. 53, № 5: 840-842.

2. Велишаева Н.С., Гасанов Е.В., Громова Т.Ю., Демидюк И.В. Влияние модификации сайта процессинга глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius на продукцию активного фермента клетками Bacillus subtilis. II Биоорганическая химия, 2008. Т. 34, №6: 786-791.

3. I.V. Demidyuk, А.Е. Kalashnikov, T.Yu Gromova, E.V Gasanov, D R. Safina, M.V. Zabolotskaya, G.N Rudenskaya, S.V. Kostrov. Protealysin — a novel metalloproteinase from Serratia proteamaculans 94 containing a conserved protein motif in the N-terminal region of the precursor // Protein expression and purification, 2006, T. 47, № 2: 551 -561.

4. Т.Ю. Громова, И.В. Демидюк, C.B. Костров, K.M. Поляков, В.Р. Мелик-Адамян, И.П. Куранова. Кристаллизация и предварительные рентгеновские исследования кристаллов протеализина из Serratia proteamalulans. II VI Национальная конференция по применению рентгеновского синхротронного излучения нейтронов и электронов для исследования материалов Сборник тезисов. Москва, 12-17 ноября 2007 г. С. 98.

5. A.B. Шубин, Т Ю. Громова, И В. Демидюк Тепловая денатурация предшественника протеализина. // 11-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI». Сборник тезисов Пущино, 29 октября-2 ноября 2007 г С 123.

6. Т Ю. Громова, Е В Гасанов, Э.В Шардакова, И.В. Демидюк Изучения процессинга предшественника протеализина // 11-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI». Сборник тезисов. Пущино, 29 октября-2 ноября 2007 г. С. 137.

7. И.В. Демидюк, Е.В. Гасанов, Т.Ю. Громова, Д.Р. Сафина, C.B. Костров Пропептиды как модуляторы функциональной активности термолизинподобных протеиназ. // Международная конференция «Протеолиз, механизмы его регуляции и роль в физиологии и патологии клетки». Тезисы докладов Минск, 2007. С. 8.

8. Т.Ю. Громова, Е В. Гасанов, И В. Демидюк, C.B. Костров Процессинг предшественника протеализина. // VI симпозиум «Химия протеолитических ферментов». Тезисы докладов и стендовых сообщений Москва, 23-25 апреля 2007 года С. 106.

9. Т Ю Громова, С В. Костров Протеализин - от фундаментальных исследований к биотехнологии. // Международная школа - конференция молодых ученых «Биотехнология будущего» в рамках Международного Симпозиума «ЕС - Россия, перспективы сотрудничества в области биотехноглогии в 7-ой Рамочной Программе» Сборник статей. Санкт-Петербург, 5-9 июня 2006 г. С. 21-23

10 Т Ю. Громова, А Е Калашников, И В. Демидюк, С В. Костров. Протеапизин -протеиназа Serratia proteamaculans 94, представляющая новую группу пептидаз семейства М4. // 10-я международная Путинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI». Сборник тезисов Пущино, 16-21 апреля 2006 г. С. 72.

11. А.Е. Калашников, ТЮ Громова, MB Заболотская, ИВ Демидюк. Новая металлопротеиназа Serratia proteamaculans 94. // 9-я международная Путинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI» Сборник тезисов Пущино, 18-22 апреля 2005 г С 27

12. И.В. Демидюк, А.Е.Калашников, Т.Ю Громова, O.A. Бурмистрова, Г.Н. Руденская, С В Костров. Коллагенолитические ферменты Serratia proteamaculans 94 адаптированные к действию при низких температурах. // Материалы научной конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» Казань, 1718 июня 2004 г. С. 12-13

Подписано в печать 02.10.2008 г Печать лазерная цифровая Тираж 100 экз

Типография Aegis-Print 115230, Москва, Варшавское шоссе, д. 42 Тел.:(495)785-00-38 www.autoref.webstolica.ru

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Громова, Татьяна Юрьевна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность работы.

Цели исследования.».!.

Научная новизна.

Практическая значимость.

Положения, выносимые на защиту.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ТЕРМОЛИЗИНПОДОБНЫХ ПРОТЕИНАЗ.

1.1. Организация каталитических доменов.

1.1.1. Организация сайтов связывания ионов кальция.

1.1.1.1. Первый двойной сайт связывания ионов кальция (Cal ,2).

1.1.1.2. Третий сайт связывания ионов кальция (СаЗ).

1.1.1.3. Четвертый сайт связывания ионов (Са4).

1.1.2. Организация каталитического центра.

1.1.3. Организация субстратсвязывающей области.

1.1.4. Открытая и закрытая конформация молекул ТПП.

1.2. Структура предшественников термолизинподобных протеина*.

1.2.1. Структура и функции длинных АКР предшественников ТПП.

1.2.2. Структура и функции коротких АКР предшественников ТПП.

1.2.3. Функции С-концевых регионов предшественников ТПП.

1.3. Механизмы удаления N-концевых пропептидов термолизинподобных протеинах.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы.

2.2. Общие методы.

2.2.1. Состав питательных сред.

2.2.2. Трансформация бактериального штамма Escherichia coli.

2.2.3. Выделение плазмидной ДНК.

2.2.4. Определение нуклеотидной последовательности ДНК.

2.2.5. Электрофоретический анализ нуклеиновых кислот.

2.2.6. Полимеразная цепная реакция.

2.2.7. Генно-инженерные манипуляции с ДНК.

2.2.8. Электрофоретический анализ белков.

2.2.9. Определение протеолитической активности ферментов.

2.2.10. Количественное определение белка.

2.2.11. Масс-спектрометрический анализ.

2.2.12. Определение N-концевой аминокислотной последовательности.

2.2.13. Расчет изоэлектрической точки.

2.2.14. Анализ аминокислотных последовательностей и пространственных структур.

2.3. Очистка зрелого протеализина.

2.4. Влияние рН на стабильность протеализина.

2.5. рН Оптимум протеолитической активности.

2.6. Влияние температуры на стабильность протеализина.

2.7. Температурный оптимум протеолитической активности.

2.8. Влияние ионов кальция на стабильность фермента.

2.9. Влияние ингибиторов.

2.10. Определение константы гидролиза ФАГЛА протеализином.

2.11. Аналитическая гель-проникающая хроматография.

2.12. Оценка возможности использования рекомбинантного протеализина в пищевой промышленности.

2.12.1. Получение ферментного препарата в колбах.

2.12.2. Оценка термоинактивации протеализина в ферментном препарате.

2.12.3. Получение ферментного препарата в ферментере на 100 л.

2.12.4. Технологическая схема выработки варено-копченой колбасы с использованием ферментного препарата, полученного из генно-инженерного штамма.

2.13. Конструирование векторов для экспрессии генов модифицированных предшественников протеализина.

2.14. Очистка зрелого протеализина с шестью гистидинами на С-конце молекулы (Р1пШ86).

2.15. Очистка предшественника протеализина (ргоР1пН1«6).

2.16. Очистка предшественника протеализина с мутацией в активном центре (ргоР1пШ56/А).

2.17. Ингибирование активности протеализина (Р1пШ56).

2.18. Процессинг предшественника протеализина (ргоР1пН156).

2.19. Процессинг предшественника протеализина (ргоР1пШ$6) при различных рН.

2.20. Процессинг предшественника протеализина (ргоР1пШ«6) на 1Ч12<-НТК-агарозе.

2.21. Ингибирование процессинга предшественника протеализина (ргоР1пШ«6).

2.22. Процессинг мутантного предшественника протеализина активными протеиназами (ргоР^ШЯб/А).

2.23. Кристаллизация и рентгеновские исследования кристаллов мутантного предшественника протеализина.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Анализ аминокислотной последовательности протеализина.

3.2. Очистка зрелого протеализина.

3.3. Характеристика протеализина.

3.3.1. Амино-концевая последовательность зрелого протеализина.

3.3.2. Молекулярная масса зрелого протеализина.

3.3.3. Влияние рН, температуры и ионов кальция на активность протеализина.

3.3.4. Влияние ингибиторов на активность протеализина.

3.3.5. Изучение кинетики гидролиза ФАГЛА.

3.4 Оценка возможности использования рекомбинантного протеализина в пищевой промышленности.

3.5. Процессинг предшественника протеализина.

3.5.1 Конструирование и экспрессия модифицированных генов протеализина.

3.5.2. Очистка и некоторые свойства зрелого протеализина, несущего шестигистидиновую последовательность на С-конце молекулы.

3.5.3. Процессинг предшественника протеализина.

3.6. Пространственная организация предшественника протеализина.

3.6.1. Получение кристаллов предшественника протеализина.

3.6.2. Анализ пространственной структуры предшественника протеализина.

3.6.2.1. Анализ сайтов связывания кальция.

3.6.2.2. АУБО-шпилька.

3.6.2.3. Структурная организация пропептида и его взаимодействие со зрелой частью.

ВЫВОДЫ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИИ

ТПП термолизинподобные протеиназы

ПГТП протеализинподобные протеиназы sp. species

ККР карбокси-концевой регион

АКР амино-концевой регион

ИПТГ изопропил-р-О-тиогалактопиранозид трис трис-(гидроксиметил)-аминометан

ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота

SDS додецилсульфат натрия

ТХУ трихлоруксусная кислота

ФАГЛА 3-(2-фурил)акрилоил-глицил-Ь-лейцинамид

ФМСФ фенилметилсульфонилфторид

ПЦР полимеразная цепная реакция proPln предшественник протеализина

Pin зрелый протеализин proPlnHisó предшественник протеализина с шестью гистидинами в С-концевой области

PlnHiSé зрелый протеализин с шестью гистидинами в С-концевой области proPlnHis6/A предшественник протеализина с мутацией в активном центре и с шестью гистидинами в С-концевой области

PlnHisr/A зрелый протеализин с мутацией в активном центре и с шестью гистидинами в С-концевой области

АК аминокислота

АО аминокислотный остаток

АОХ анионообменная хроматография

ГХ гидрофобная хроматография

ГПХ гель-проникающая хроматография

Мш молекулярная масса

Введение Диссертация по биологии, на тему "Протеализин - новая протеиназа Serratia proteamaculans 94: структура, свойства и перспективы практического использования"

Актуальность работы

Одним из наиболее активно развивающихся направлений современной биотехнологии является использование широкого круга ферментов в технологических процессах. Среди таких ферментов важную роль играют протеиназы. Они используются в медицине, косметологии, индустрии моющих средств, пищевой и кожевенной промышленности, а также для ферментативного синтеза пептидов [1]. Однако, несмотря на большое разнообразие природных ферментов, их свойства часто не оптимальны для технологических процессов. Для решения этой проблемы могут быть использованы два основных подхода. Первый заключается в поиске новых природных ферментов с подходящими характеристиками, а второй - в направленной модификации уже известных и хорошо охарактеризованных белков. Второй подход кажется более привлекательным, поскольку позволяет конструировать ферменты оптимальные для данного биотехнологического процесса. Фундаментом для реализации этого подхода является изучение структурно-функциональной организации белков.

В лаборатории белковой инженерии Института молекулярной генетики РАН в результате широкомасштабного скрининга микроорганизмов, добытых из необычных природных и промышленных источников, был отобран штамм Serratia proteamaculans 94, который способен с высокой эффективностью гидролизовать нативный коллаген при низких положительных температурах. Ферменты, которые определяют такую способность данного штамма, перспективны для использования в пищевой промышленности, так как могут избирательно разрушать соединительную ткань в составе мясного сырья. С целью клонирования генов протеолитических ферментов была создана геномная библиотека Serratia proteamaculans 94, при анализе которой был охарактеризован ген новой металлопротеиназы (протеализина), относящейся к семейству пептидаз М4 - термолизинподобных протеиназ. Изучение структурно-функциональной организации протеализина представляет интерес как с прикладной, так и с фундаментальной точки зрения. С одной стороны, этот фермент перспективен для использования в мясоперерабатывающей промышленности для улучшения качества низкосортного мясного сырья. А с другой стороны, структурные особенности предшественника протеализина делают его удобной моделью для изучения механизмов действия пропептидов пептидаз семейства М4.

Цели исследования

Целями данной работы являются исследование структуры и свойств протеализина, а таюке оценка возможности применения рекомбинантного фермента в пищевой промышленности для улучшения качества мясного сырья.

Научная новизна

В ходе данной работы впервые очищен и охарактеризован протеализин -новая протеиназа Serratia proteamaculans. Проведен анализ первичной структуры протеализина и показано, что протеиназы, имеющие структуру схожую с предшественником протеализина, образуют отдельную группу внутри семейства термолизинподобных протеиназ. Впервые детально изучен механизм созревания предшественника фермента, относящегося к этой группе. Получены кристаллы предшественника протеализина и впервые решена пространственная структура предшественника ТПП.

Практическая значимость

Данные, полученные в ходе работы, показали, что на основе протеализина может быть создан препарат для улучшения качества низкосортного мясного сырья. Эти результаты позволяют перейти к конструированию промышленных продуцентов протеализина.

Положения, выносимые на защиту

1. Анализ первичной структуры, очистка и изучение свойств рекомбинантного протеализина.

3. Изучение механизма созревания предшественника протеализина.

4. Кристаллизация предшественника протеализина и установление его пространственной структуры.

5. Анализ пространственной структуры предшественника протеализина.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Громова, Татьяна Юрьевна

выводы

1. По структуре и свойствам протеализин, новая протеиназа Serratia proteamaculans, относится к семейству пептидаз М4, более известному как термолизинподобные протеиназы.

2. На модели протеализина впервые проведено исследование механизма удаления нового типа пропептидов пептидаз семейства М4. Установлено, что пропептиды протеализинового типа, в отличие от классических пропоследовательностей ферментов семейства, могут быть удалены только межмолекулярно, но при этом как авто-, так и гетерокаталитически.

6. В структуре протеализина не содержится ионов кальция. Пептидаза семейства М4 с такой структурной особенностью обнаружена впервые.

7. Активный центр протеализина содержит, отсутствующий в других пептидазах семейства М4 с известными пространственными структурами, дополнительный структурный элемент, который изменяет организацию субстратевязывающего региона и участвует во взаимодействии с лигандом.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Громова, Татьяна Юрьевна, Москва

1. Березин И.В., Клячко H.JT., Левашов А.В., Мартинек К., Можаев В.В., Хмельницкий Л. Биотехнология. Иммобилизованные ферменты. 1987, Москва: Высшая школа.

2. Rawlings N.D., Tolle D.P., Barrett A.J. MEROPS: the peptidase database. // Nucleic Acids Res., 2004. 32(Database issue): p. 160-164.

3. Schechter I., Berger A. On the size of the active site in proteases. I. Papain. // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1967. 27(2): p. 157-162.

4. Thayer M.M., Flaherty K.M., McKay D.B. Three-dimensional structure of the elastase of Pseudomonas aeruginosa at 1.5-A resolution. // J. Biol. Chem., 1991. 266(5): p. 2864-2871.

5. Серкина А.В., Шевелев А.Б., Честухина Г.Г. Структура и функции предшественников бактериальных протеиназ. // Биорг. хим., 2001. 27(5): с. 323-346.

6. Mclver K.S., Kessler E., Olson J.C., Ohman D.E. The elastase propeptide functions as an intramolecular chaperone required for elastase activity and secretion in Pseudomonas aeruginosa. II Mol. Microbiol., 1995. 18(5): p. 877-89.

7. Braun-P., Tommassen J., Filloux A. Role of the propeptide in folding and secretion of elastase of Pseudomonas aeruginosa. II Mol. Microbiol., 1996. 19(2): p. 297 306.

8. Marie-Claire C., Ruffet E., Beaumont A., Roques B.P. The prosequence of thermolysin acts as an intramolecular chaperone when expressed in trans with the mature sequence in Escherichia coli. II J. Mol. Biol., 1999. 285(5): p. 1911-1915.

9. Serkina A.V., Gorozhankina T.F., Shevelev A.B., Chestukhina G.G. Propeptide of the metalloprotease of Brevibacillus brevis 7882 is a strong inhibitor of the mature enzyme. II FEBS Lett., 1999. 456(1): p. 215-219.

10. O'Donohue M.J., Beaumont A. The roles of the prosequence of thermolysin in enzyme inhibition and folding in vitro. // J. Biol. Chem., 1996. 271(43): p. 26477-26481.

11. Kessler E., Safrin M. The propeptide of Pseudomonas aeruginosa elastase acts an elastase inhibitor. II J. Biol. Chem., 1994. 269(36): p. 22726-22731.

12. Kearns D.B., Bonner P.J., Smith D.R., Shimkets L.J. An extracellular matrix-associated zinc metalloprotease is required for dilauroyl phosphatidylethanolamine chemotactic excitation in Myxococcus xanthus. II J. Bacteriol., 2002. 184(6): p. 1678-1684.

13. Miyoshi S., Kawata K., Tomochika K., Shinoda S., Yamamoto S. The C-terminal domain promotes the hemorrhagic damage caused by Vibrio vulnificus metalloprotease. // Toxicon, 2001. 39(12): p. 1883-1886.

14. Miyoshi S., Wakae H., Tomochika K., Shinoda S. Functional domains of a zinc metalloprotease from Vibrio vulnificus. II J. Bacteriol., 1997. 179(23): p. 7606-7609.

15. Miyamoto K., Nukui E., Hirose M., Nagai F., Sato T., Inamori Y., Tsujibo H. A metalloprotease (Mprlll) involved in the chitinolytic system of a marine bacterium, Alteromonas sp. strain 0-7. // Appl. Environ. Microbiol., 2002. 68(11): p. 5563-5570.

16. Wetmore D.R., Wong S.L., Roche R.S. The role of the pro-sequence in the processing and secretion of the thermolysin-like neutral protease from Bacillus cereus. II Mol. Microbiol., 1992. 6(12): p. 1593-1604.

17. Toma S., Campagnoli S., De Gregoriis E., Gianna R., Margarit I., Zamai M., Grandi G. Effect of Glu-143 and His-231 substitutions on the catalytic activity and secretion of Bacillus subtilis neutral protease. // Protein Eng., 1989. 2(5): p. 359-364.

18. Bitar A.P., Cao M., Marquis H. The metalloprotease of Listeria monocytogenes is activated by intramolecular autocatalysis. II J. Bacteriol., 2008. 190(1): p. 107-111.

19. Marie-Claire C., Roques B.P., Beaumont A. Intramolecular processing of prothermolysin. H J. Biol. Chem., 1998. 273(10): p. 5697-5701.

20. Veltman O.R., Vriend G., Hardy F., Mansfeld J., van den Burg B., Venema G., Eijsink V.G. Mutational analysis of a surface area that is critical for the thermal stability of thermolysin-like proteases. // Eur. J. Biochem., 1997. 248(2): p. 433-440.

21. Voordouw G., Milo C., Roche R.S. Role of bound calcium ions in thermostable, proteolytic enzymes. Separation of intrinsic and calcium ion contributions to the kinetic thermal stability. II Biochemistry, 1976. 15(17): p. 3716-3724.

22. Coolbear T., Whittaker J.M., Daniel R.M. The effect of metal ions on the activity and thermostability of the extracellular proteinase from a thermophilic Bacillus, strain EA.l. II Biochem. J., 1992. 287 ( Pt 2): p. 367-374.

23. Corbett R.J., Ahmad F., Roche R.S. Domain unfolding and the stability of thermolysin in guanidine hydrochloride. // Biochem. Cell. Biol., 1986. 64(10): p. 953-961.

24. Hausrath A.C., Matthews B.W. Redetermination and refinement of the complex of benzyl succinic acid with thermolysin and its relation to the complex with carboxypeptidase A. II J. Biol. Chem., 1994. 269(29): p. 18839-18842.

25. Holmes M.A., Tronrud D.E., Matthews B.W. Structural analysis of the inhibition of thermolysin by an active-site-directed irreversible inhibitor. // Biochemistry, 1983. 22(1): p. 236-240.

26. Jin Y., Kim D.H. Inhibition stereochemistry of hydroxamate inhibitors for thermolysin. II Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998. 8(24): p. 3515-3518.

27. Kester W.R., Matthews B.W. Crystallographic study of the binding of dipeptide inhibitors to thermolysin: implications for the mechanism of catalysis. // Biochemistry, 1977. 16(11): p. 2506-2516.

28. Mock W.L., Aksamawati M. Binding to thermolysin of phenolate-containing inhibitors necessitates a revised mechanism of catalysis. // Biochem J., 1994. 302 ( Pt 1): p. 57-68.

29. Matthews B.W. Structural basis of the action of thermolysin and related zinc peptidases. // Acc. Chem. Res., 1988. 21: p. 333-340.

30. Hangauer D.G., Monzingo A.F., Matthews B.W. An interactive computer graphics study of thermolysin-catalyzed peptide cleavage and inhibition by N-carboxymethyl dipeptides. II Biochemistry, 1984. 23(24): p. 5730-5741.

31. Feder J., Lewis C., Jr. Studies on the specificity of Bacillus subtilis neutral protease with insulin B-chain. // Biochem Biophys Res Commun, 1967. 28(3): p. 318-323.

32. Mei H.C., Liaw Y.C., Li Y.C., Wang D.C., Takagi H., Tsai Y.C. Engineering subtilisin YaB: restriction of substrate specificity by the substitution of Glyl24 and Glyl51 with Ala. II Protein Eng., 1998. 11(2): p. 109-117.

33. Bech L.M., Sorensen S.B., Breddam K. Mutational replacements in subtilisin 309. Vail04 has a modulating effect on the P4 substrate preference. // Eur. J. Biochem., 1992. 209(3): p. 869-874.

34. McKay D.B., Thayer M.M., Flaherty K.M., Pley H., Benvegnu D. Crystallographic structures of the elastase of Pseudomonas aeruginosa. II Matrix Suppl., 1992. 1: p. 112-115.

35. Hausrath A.C., Matthews B.W. Thermolysin in the absence of substrate has an open conformation. // Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr., 2002. 58(Pt 6 Pt 2): p. 1002-1007.

36. Veltman O.R., Eijsink V.G., Vriend G., de Kreij A., Venema G., Van den Burg B. Probing catalytic hinge bending motions in thermolysin-like proteases by glycine—»alanine mutations. II Biochemistry, 1998. 37(15): p. 5305-5311.

37. Monzingo A.F., Matthews B.W. Structure of a mercaptan-thermolysin complex illustrates mode of inhibition of zinc proteases by substrate-analogue mercaptans. // Biochemistry, 1982. 21(14): p. 3390-3394.

38. Bolognesi M.C., Matthews B.W. Binding of the biproduct analog L-benzylsuccinic acid to thermolysin determined by X-ray crystallography. // J. Biol. Chem., 1979. 254(3): p. 634-639.

39. Демидкж И.В., Заволотская M.B., Велишаева H.C., Сафина Д.Р., Костров C.B. Про-зависимый фолдинг микробных протеолитических ферментов. // Мол. ген. Микробиол. Вирусол., 2003. 4(4): с. 11-15.

40. Demidyuk I.V., Gasanov E.V., Safina D.R., Kostrov S.V. Structural Organization of Precursors of Thermolysin-like Proteinases. // Protein J., 2008. 27: p. DOI: 10.1007/s 10930-008-9143-2.

41. Bendtsen J.D., Nielsen H., von Heijne G., Brunak S. Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0. II J. Mol. Biol., 2004. 340(4): p. 783-795.

42. Kyostio S.R., Cramer C.L., Lacy G.H. Erwinia carotovora subsp. carotovora extracellular protease: characterization and nucleotide sequence of the gene. // J. Bacteriol., 1991. 173(20): p. 6537-6546.

43. Kwon Y.T., Lee H.H., Rho H.M. Cloning, sequencing, and expression of a minor protease-encoding gene from Serratia marcescens ATCC21074. // Gene, 1993. 125(1): p. 75-80.

44. Bozhokina E., Khaitlina S., Adam T. Grimelysin, a novel metalloprotease from Serratia grimesii, is similar to ECP32. // Biochem.Biophys. Res. Commun., 2008. 367(4): p. 888-892.

45. Held K.G., LaRock C.N., D'Argenio D.A., Berg C.A., Collins C.M. A metalloprotease secreted by the insect pathogen Photorhabdus luminescens induces melanization. H Appl. Environ. Microbiol., 2007. 73(23): p. 7622-7628.

46. Tang B., Nirasawa S., Kitaoka M., Hayashi K. In vitro stepwise autoprocessing of the proform of pro-aminopeptidase processing protease from Aeromonas caviae T-64. // Biochim. Biophys. Acta., 2002. 1596(1): p. 16-27.

47. Tang B., Nirasawa S., Kitaoka M., Hayashi K. The role of the N-terminal propeptide of the pro-aminopeptidase processing protease: refolding, processing, and enzyme inhibition. // Biochem. Biophys. Res. Commun., 2002. 296(1): p. 78-84.

48. Chang A.K., Park J.W., Lee E.H., Lee J.S. The N-terminal propeptide of Vibrio vulnificus extracellular metalloprotease is both an inhibitor and substrate for the enzyme. II J. Bacteriol., 2007. 189(19): p. 6832-6838.

49. Mclver K.S., Kessler E., Ohman D.E. Identification of residues in the Pseudomonas aeruginosa elastase propeptide required for chaperone and secretion activities. II Microbiology, 2004. 150(Pt 12): p. 3969-3977.

50. Zabolotskaya M.V., Demidyuk I.V., Akimkina T.V., Kostrov S.V. A novel neutral protease from Thermoactinomyces species 27a: sequencing of the gene, purification, and characterization of the enzyme. // Protein J., 2004. 23(7): p. 483-492.

51. Hase C.C., Finkelstein R.A. Comparison of the Vibrio cholerae hemagglutinin/protease and the Pseudomonas aeruginosa elastase. // Infect. Immun., 1990. 58(12): p. 4011-4015.

52. Norqvist A., Norrman B., Wolf-Watz H. Identification and characterization of a zinc metalloprotease associated with invasion by the fish pathogen Vibrio anguillarum. II Infect. Immun., 1990. 58(11): p. 3731-3736.

53. Oda K., Okayama K., Okutomi K., Shimada M., Sato R., Takahashi S. A novel alcohol resistant metalloproteinase, vimelysin, from vibrio sp. T1800: purification and characterization. II Biosci. Biotechnol. Biochem., 1996. 60(3): p. 463-467.

54. Nirasawa S., Nakajima Y., Zhang Z.Z., Yoshida M., Hayashi K. Intramolecular chaperone and inhibitor activities of a propeptide from a bacterial zinc aminopeptidase. // Biochem. J., 1999. 341 (Pt 1): p. 25-31.

55. Miyoshi N., Shimizu C., Miyoshi S., Shinoda S. Purification and characterization of Vibrio vulnificus protease. II Microbiol. Immunol., 1987. 31(1): p. 13-25.

56. David V.A., Deutch A.H., Sloma A., Pawlyk D., Ally A., Durham D.R. Cloning, sequencing and expression of the gene encoding the extracellular neutral protease, vibnolysin, of Vibrio proteolytics. // Gene, 1992. 112(1): p. 107-112.

57. Teo J.W., Zhang L.H., Poh C.L. Cloning and characterization of a metalloprotease from Vibrio harveyi strain AP6. // Gene, 2003. 303: p'j 147-156'.' , ' ' f 'ч- ■'li

58. Austin В., Austin D.A., Bacterial fish pathogens: diseases in farmed and wild fish. 1999, London: Springer.

59. Zhang F., Chen J., Chi Z., Wu L.F. Expression and processing of Vibrio anguillarum zinc-metalloprotease in Escherichia' coli. II Arch. Microbiol., 2006. 186(1): p. 11-20.1

60. Staroscik A.M., Denkin S.M., Nelson D.R. Regulation of the Vibrio anguillarum metalloprotease lEmpA by posttranslational modification. II J. Bacteriol., 2005. 187(7): p. 2257-2260.

61. Балабан Н.П., Марданова A.M., Шарипова' 'M.P'., i Габдрахманова JI.A., Соколова Е.А., Руденская'Г.Н.,'Лёщйнская Й. Б.КП о лужение !и 'характеристика тиолзависимой сериновой протеиназы 2 Bacillus intermedins 3-19. II Биохимия, 2004. 69(4): с. 420-426.

62. Maniatis Т., Fritsch E.F., Sambrook J., Molecular cloning. A laboratory manual. 1982, NY: Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor.

63. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. II Nature, 1970. 227(5259): p. 680-685.

64. Charney J., Tomarelli R.M. Determination of the proteolytic activity of duodenal juice. II J. Biochem., 1947. 177: p. 501-505.

65. Bredford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dge binding. // Anal. Biochem., 1976. 72(1-2): p. 248-254.

66. Гаспаров C.B., Дактярь В.П. Определение по связыванию с красителем кумасси бриллянтовым голубым G-250. II Биохимия, 1994. 59(6): р. 763-777.

67. Feder J. A spectrophotometry assay for neutral protease. // Biochem Biophys Res Commun, 1968. 32(2): p. 326-332.

68. Inouye K. Effects of salts on thermolysin: activation of hydrolysis and synthesis of N-carbobenzoxy-L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester, and a unique change in the absorption spectrum of thermolysia // J. Biochem. (Tokyo), 1992. 112: p. 335-340.

69. Батаева Д.С. Создание и использование коллагенолитического препарата микробного происхождения для улючшения качества мясных продуктов. Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук. ВНИИМП, 2001.

70. Gobinda S., Sommer S.S. The "megaprimer" mehtod of site-directed mutagenesis. // Biotechniques, 1990. 8(4): p. 404-407.

71. Костенко Ю.Г., Спицина Д.Н., Батаева Д.С., Костров С.В., Носовская Е.А., Штамм Serratia proteamaculans 94 продуцент коллагеназы. // 2001. Пат. Россия No 2175350.

72. O'Donohue M.J., Roques В.Р., Beaumont A. Cloning and expression in Bacillus subtilis of the npr gene from Bacillus thermoproteolyticus Rokko coding for the thermostable metalloprotease thermolysin. // Biochem J., 1994. 300 ( Pt 2): p. 599-603.

73. Jongeneel C.V., Bouvier J., Bairoch A. A unique signature identifies a family of zinc-dependent metallopeptidases. // FEBSLett., 1989. 242(2): p. 211-214.

74. Антонов B.K., Химия протеолиза. 1991, Москва: Наука.

75. Novagen, рЕТsystem manual. 2002.

76. Sohoni S.S., Joshi P.N. Isolation end characterization of a protease from Bacillus subtilis. II Indian J. Biochem. Biophys., 1982. 19(6): p. 399-402.

77. Amersham pharmacia biotech AB. Protein purification. Handbook. 1999.

78. Feder J., Keay L., Garrett L.R., Cirulis N. Moseley M.H., Wildi B.S. Bacillus cereus neutral protease. // Biochim Biophys Acta, 1971. 251(1): p. 74-78.

79. Шагинян K.A., Изотова JI.C., Йомантас В., Строгин А.Я., Степанов В.М. Металлопротеиназа из Bacillus subtilis внеклеочный и внутриклеточный ферменты. II Биохимия, 1980. 45(11): с. 2083-2095.

80. Паберит II., Панк М.С., Лийдере М.А., Ванаталу К.П. Очистка и свойства нейтральной металлопротеиназы из термофильной бактерии Bacillus brevis. II Биохимия, 1984. 49(2): с. 275-284.

81. Silder W., Kumpf В., Peterhaus В., Zuber Н. A neutral proteinase produced by Bacillus cereus with hith sequence homology to thermolysin: production, isolation and characterization. // Appl. Microbiol, and Biotechnol., 1986. 25(1): p. 18-24.

82. Морозова И.П., Честухина Г.Г., Борматова М.Е., Гололобов М., Иванова Н.М., Лысогорская Е.Н., Филиппова И., Ходова О.М., Тимохина Е.А. Выделение и характеристика металлопротеиназы из Bacillus megaterium. II Биохимия, 1993. 58(6): с. 896-907.

83. Чумаков В.Н., Азимова М.И., Зайцев Д.А., Габриэлян А.Э., Костров С.В. Анализ структурных основ термостабильности секреторных металлопротеиназ на модели химерных ферментов. // Молекулярная биология, 1995.29(5): р. 992-1000.

84. Toma S., Campagnoli S., Margarit I., Gianna R., Grandi G., Bolognesi M., De Filippis V., Fontana A. Grafting of a calcium-binding loop of thermolysin to Bacillus subtilis neutral protease. // Biochemistry, 1991. 30(1): p. 97-106.

85. Dahlquist F.W., Long J.W., Bigbee W.L. Role of Calcium in the thermal stability of thermolysin. II Biochemistry, 1976. 15(5): p. 1103-1111.

86. Khan S.M., Darnall D.W. The hydrolysis of 3-(2-furylacryloyl)-glycyl-l-leucine amide by thermolysin. II Anal Biochem., 1978. 86(1): p. 332-336.

Информация о работе

Громова, Татьяна Юрьевна
кандидата химических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.23

Диссертация

Протеализин - новая протеиназа Serratia proteamaculans 94: структура, свойства и перспективы практического использования - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы