Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новая психрофильная протеиназа Serratia proteamaculans

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Новая психрофильная протеиназа Serratia proteamaculans"

Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

На правах рукописи

ХАЙРУЛЛИН РАФИЛЬ ФИДАИЛЕВИЧ

НОВАЯ ПСИХРОФИЛЬНАЯ ПРОТЕИНАЗА ИЗ БЕШ1АТ1А РМТЕАМАСиЬАт

03.00.04 —Биохимия

ии3402772

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2009

003482772

Работа выполнена в лаборатории химии протеолитических ферментов Учреждения Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Научный руководитель:

кандидат химических наук Михайлова Анна Григорьевна

Официальные оппоненты:

доктор химических наук Еремеев Николай Леонидович

кандидат химических наук Зинченко Алексей Алексеевич

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н.Ореховича РАМН

Защита состоится « 25 » ноября 2009 года в 10-00 часов на заседании специализированного совета Д 002.019.01 при Учреждении Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН по адресу: ГСП-7, Москва В-437, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Автореферат разослан «23 » октября 2009 г.

Ученый секретарь

специализированного совета _

доктор физико-математических наук

Олейников В.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В последнее время психрофилы и их ферменты привлекают к себе все большее внимание исследователей вследствие своей специфической способности функционировать в условиях низкой температуры окружающей среды. Психрофильными называются организмы, способные выживать и успешно развиваться в условиях пониженной температуры. Психрофилы широко представлены в живом мире и включают представителей как про-, так и эукариот. На сегодняшний день в эту группу включены многие бактерии, грибы, растения и некоторые виды животных (насекомые и позвоночные). Несмотря на чрезвычайно широкое распространение и разнообразие, психрофилы сравнительно мало изучены. Благодаря повышенной каталитической эффективности адаптированные к пониженным температурам ферменты рассматриваются в качестве ценных инструментов для биотехнологических целей, медицинской и пищевой промышленности.

Помимо практической значимости использования психрофильных ферментов в практических целях следует отметить важность проведения фундаментальных исследований, связанных с изучением структурных основ повышенной каталитической эффективности ферментов организмов, обитающих при пониженных температурах.

Молекулярные основы функционирования психрофильных ферментов к настоящему моменту неизвестны. Сравнение первичных структур ферментов-гомологов показывает, что аминокислотные остатки, формирующие их активные центры и субстрат-связывающие районы, высоко консервативны. Этот факт, в совокупности с данными о том, что ферменты психрофилов характеризуются, как правило, заметно сниженной термостабильностью, позволил выдвинуть и отчасти подтвердить гипотезу, объясняющую их высокую удельную активность повышенной гибкостью молекулы. Однако данная гипотеза является весьма общей, и, по-видимому, неприложима к ряду конкретных случаев.

В этом смысле чрезвычайно большой интерес для исследователей представляют адаптированные к пониженным температурам трипсины и трипсиноподобные ферменты. Трипсины позвоночных - одни из наиболее изученных представителей сериновых протеиназ, и поэтому сравнительный анализ аминокислотных последовательностей, третичной структуры, кинетических параметров, физико-химических свойств мезофильных и психрофильных ферментов и их мутантных форм может пролить свет на механизм адаптации к пониженным температурам.

В результате проведенного недавно широкомасштабного скрининга психрофильных микроорганизмов был обнаружен и идентифицирован штамм Бегггайа рго1еотаси1ат, продуцирующий разнообразные протеиназы, в том числе, активные при пониженной температуре (Костенко Ю.Г. и др. 2001. Патент РФ № 2175350). Результаты проведенных медико-биологических

1

испытаний показали, что данный штамм не патогенен для теплокровных животных и удовлетворяет требованиям, предъявляемым к промышленным микроорганизмам.

Объектом исследования настоящей работы является обнаруженная и выделенная нами ранее неизвестная протеиназа из психрофильного грамотрицательного микроорганизма Serratia proteamaculans.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы является выделение, очистка и структурно-функциональная характеристика новой психрофильной протеиназы из S. proteamaculans (PSP). Для выполнения работы были поставлены следующие задачи:

1. Разработка методики выделения и очистки PSP.

2. Установление N-концевой последовательности фермента и определение полной аминокислотной последовательности PSP.

3. Получение рекомбинантного фермента.

4. Исследование физико-химических и энзиматических свойств PSP.

Научная новизна и практическая значимость работы

Впервые выделена и очищена до гомогенного состояния ранее не описанная сериновая протеиназа с трипсиновой специфичностью из грамотрицательного психротолерантного микроорганизма S. proteamaculans. Установлена первичная структура фермента, определено, что новая протеиназа относится к семейству олигопептидаз В (клан SC, семейство S9A по номенклатуре MEROPS).

Показано, что PSP является первой описанной психрофильной олигопептидазой В. Получен рекомбинантный фермент, проведен субстратно-ингибиторный анализ, исследованы физико-химические свойства PSP. Выявлено, что по своим субстратно-ингибиторным свойствам PSP заметно отличается от ранее описанных олигопептидаз.

Обнаружена высокая гомология аминокислотной последовательности PSP с последовательностями олигопептидаз В патогенов человека и животных - Yersinia pestis, Salmonella enterica, Trypanosoma cruzi, Klebsiella pneumoniae, Leishmania amazonensi, рыб и земноводных - Aeromonas hydrophila, растений - Erwinia carotovora. В настоящее время большинство бактериальных олигопептидаз В известны лишь по нуклеотидным последовательностям. Высокая гомология PSP с олигопептидазами из других источников позволяет использовать PSP в качестве модели для поиска лекарственных препаратов против бактериальных и протозойных патогенов.

Апробация работы и публикации

Основные материалы диссертации были представлены на VIII чтениях, посвященных памяти академика Ю. А. Овчинникова (Москва-Пущино, 2006), XIV, XV, XVI международной конференции и дискуссионном научном клубе

«Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Ялта-Гурзуф, Украина, 2006, 2007, 2009), Итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2008 год в рамках приоритетного направления «Живые системы», ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России 2007-2012 годы» (Москва, 2008), IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009). Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова (Москва-Пущино, 2009).

По теме диссертации опубликовано 3 работы в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего наименований. Работа изложена на \0) страницах, содержит рисунков и таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Выделение и очистка трипсипоподобпой протсиназы из психротолерантного грамотрицательного микроорганизма

S. proteamaculans

Культивирование психротолерантного штамма S. proteamaculans 94 (любезно предоставленным C.B. Костровым, ИМГ РАН) производилось при 4 °С при непрерывном перемешивании в течение 5 суток (до достижения А6оо = 1,2). После наработки биомассы клетки осаждали центрифугированием и подвергали обработке лизоцимом и ультразвуковой деградации. Гомогенат клеток центрифугировали, наносили на колонку с Q-сефарозой в 0,1 M Трис-НС1, 50 мМ СаС12, 1мМ MgCl2; рН 8,0. Элюирование проводили в градиенте NaCl 0-0,2 M в том же буфере (рис. 1).

Рис. 1. Ионообменная хроматография суммарного белкового препарата из 5'. рго1еатаси1ат на О-сефарозс. Объем фракции 5 мл

1 - активный фермент;

2 - Агзо;

3 - градиент КаС1; И = 0,2 мМ

10 20 30 40 50 60 70 80 Номера фракций

В процессе очистки активность РБР определяли с помощью стандартного трипсинового субстрата п-нитроанилида Л^-бензоил-В!,-аргинина (BAPNA). Так как ВАРЫА является субстратом не только сериновых трипсиноподобных, но также метало- и цистеиновых протеиназ, для определения типовой принадлежности РБР на частично очищенном препарате фермента был проведен ингибиторный анализ (табл. 1).

Необратимые группоспецифические ингибиторы сериновых протеиназ ДФФ и ТЬСК полностью инактивировали фермент. Другой специфический ингибитор сериновых протеиназ - РМББ также значительно ингибировал РБР. Как видно из табл. 1, ВРТ1 является эффективным ингибитором трипсиноподобного фермента из 5. рго1еатаси\ат, что позволило проводить очистку РБР методом аффинной хроматографии на ВРТ1-сефарозе.

Таблица 1. Изучение влияния ингибиторов и некоторых других реагентов на активность фермента. [РБР] = 0,3 нМ; [ВАРЫА] = 0,2 мМ, 0,1 М Трис, рН 8,0; 2% ДМСО, 25 °С

Реагент Концентрация реагента, M Остаточная активность, %

ДТДП 2,0-10"4 100

Йодацетамид 1,0-10"3 100

Меркаптоэтанол 1,6-10"2 50

ДФФ 1,3-Ю-4 0

ФМСФ 2,3-10'3 19,4

ТЛХК 3,0-10"3 0

ЭДТА 5,0-Ю'3 61,5

о-Фенантролин 5,0-Ю"3 0

Zn(AcO)2 1,0-10"3 0

CdCl2, CuCl2 1,0-10"3 0

MgCl2 1,0-10"3 1,0-10"2 100 87

BPTI 1,8-10"7 50

ДТДП - 4,4'-дитиодипиридин; ВРТ1 - основной панкреатический ингибитор трипсина быка; ТЛХК - хлорметилкетон Л"-л-точил-1-лизина; ФМСФ - фенилметилсульфоннлфторнд; ДФФ - диизопропилфторфосфат, ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

Активные фракции после (^-сефарозы обессоливали, переводили в 10 мМ Нереэ, 1мМ 1У^С12, рН 7,5 и наносили на колонку с ВРТ1-сефарозой. Элюцию проводили 0,1 М №-ацетатным буфером рН 5, содержащим 0,1 М ЫаС1 и 1 мМ М§С12. Так как Р8Р инактивировался при низких значениях рН, фракции собирали в пробирки, содержащие 1 М Трис-НС1 рН 8,0 (рис. 2).

5 10 15

Номера фракций

Рис. 2. Аффинная хроматография Р8Р на ВРТ1-сефарозе Объем фракции 2 мл

1 - активный фермент;

2 -

Использование ионообменной и аффинной хроматографии позволили получить практически гомогенный по данным ПААГ белковый препарат с молекулярной массой 60 кДа (рис. 3).

Рис. 3. Фракции РЭР после аффинной хроматографии на ВРТТсефарозе (£>л--,№г-электрофорез в 10% ПААГ)

1 - фракция после ВРТ1-сефарозы;

2 - маркеры молекулярной массы

Однако К-копиевая последовательность этого белка оказалась практически идентичной соответствующей последовательности 60-кДа субъединицы шаперонина СгоЕ1, состоящего из 14 идентичных субъединиц (рис. 4).

(К) (Е)

ААКБУЕРетЛЭАЕУУУ- (белковая полоса 60 кДа)

МААКБУКГСЫБАКУКМ- (ОгоЕ1)

Рис. 4. М-концевые последовательности основной белковой полосы после ионообменной и аффинной хроматографии и шаперонина вгоЕ!

Таким образом, ОгоЕ1 являлся основным компонентом полученного нами препарата РБР; в денатурирующем ПААГ-электрофорезе самой протеиназе соответствует минорная белковая полоса 78 кДа (рис. 3).

Присутствие в препаратах РБР после аффинной хроматографии шаперонина навело нас на мысль об образовании прочного комплекса Р8Р-ОгоЕ1, который не разрушается даже при взаимодействии фермента с аффинным лигандом. При этом комплекс обладает ферментативной активностью - гидролизует специфический субстрат (ВАРЫА) и взаимодействует с ингибиторами.

По литературным данным, для разрушения комплекса ОгоЕЬ с белками-лигандами применяется обработка метанолом [\Veissman й а!., 1995]. Для разрушения комплекса Р8Р с шаперонином мы ввели стадию инкубирования частично очищенного препарата после С)-сефарозы в 20%-ном метаноле. При этом происходит частичная денатурация ОгоЕЬ, а также, по-видимому, и других примесных белков с образованием осадка; активность РБР практически не изменяется. Осадок отделяли центрифугированием и супернатант подвергали ультрафильтрации через мембрану с пределом исключения 100 кДа. При этом в фильтрате оказывается не менее 50-60% активности РБР, а концентрат содержит высокомолекулярный шаперонин СгоЕЬ, распадающийся при электрофорезе на 60-кДа субъединицы (рис. 5).

Рис. 5. Отделение РЭР от комплекса ОгоЕ1 ультрафильтрацией после обработки метанолом фэ-Ш-электрофорез в 10% ПААГ)

1 - фильтрат,

2 - концентрат;

3 - маркеры молекулярной массы

Активный фильтрат наносили на колонку с ВРТ1-сефарозой и проводили аффинную хроматографию по методике, описанной выше. Таким образом, применение метанола для разрушения комплекса с шаперонином в сочетании с аффинной хроматографией на ВРТ1-сефарозе позволило нам разработать методику получения Р8Р в гомогенном состоянии. Профиль белков на различных стадиях очистки представлен на рис. 6.

12 3 4 5 6

кДа

Рис. 6. Препараты PSP на разных стадиях очистки из S. proteamaculans (Ds-Na-электрофорез в 10% ПААГ). 1 - Суммарный белковый препарат после разрушения клеток; 2 - ионообменная хроматография на Q-сефарозе; 3 - инкубация с 20%-ным МеОН и ультрафильтрация (Ultracel 100k), концентрат; 4-инкубация с 20%-ным МеОН и ультрафильтрация, фильтрат; 5 - аффинная хроматография на BPTI-сефарозв фильтрата после Ultracel 100k; б - маркеры молекулярной массы

Как видно из таблицы 2, в результате очистки удельная активность возросла в 3300 раз, выход составил 25%. Из 100 г исходной биомассы S. proteamaculans 94 получают 0,26 мг PSP.

После получения гомогенного по данным Ds-Na-электрофореза препарата PSP была определена N-концевая аминокислотная последовательность 1-10 этого фермента: MMTPPKAEKR-. Проведен масс-спектральный анализ (MALDI-TOF, Ultraflex-TOF/TOF, «Bruker», Германия) пептидов трипсинолиза препарата PSP с использованием белковой базы данных NCBlnr и поисковой программы MASCOT (www.matrixscience.com). Эти данные позволили идентифицировать PSP как ранее неизвестную олигопептидазу В.

Для определения первичной структуры PSP соответствующий ген олигопептидазы В (OpdB) S. proteamaculans 94 был секвенирован с использованием праймеров на основании последовательности гена OpdB из геномной библиотеки S. proteamaculans 568 в Институте молекулярной генетике РАН (С.В.Костров, И.В.Демидюк).

Стадия очистки Активный фермент, нмоль PSP Белок, мг Содержание PSP, нмоль/мг белка Степень очистки Выход, %

Бесклеточный экстракт 3,46 920,3 0,0038 1 100

Ионообменная хроматография на О-сефарозе 1,93 5,25 0,37 97,4 55,8

Ультрафильтрация в 20%-ном МеОН; фильтрат 1,21 1,48 0,82 215,8 35,0

Аффинная хроматография на ВРТ1-сефарозе 0,88 0,07 12,57 3307,9 25,4

Первичная структура PSP. Сравнение аминокислотных последовательностей OpdB из различных источников

Аминокислотная последовательность PSP (рис. 7) имеет одиннадцать замен (Thr34, А1а52, Thrll3, Gln220, Thr260, Glu299, Asp396, Ser439, Ala441, Glu547, Gln585) по сравнению с OpdB из S. proteamaculans 568 (Ala34, Val52, Ilel 13, Lys220, Lys260, Asp299, Gly396, Lys439, Thr441, Arg547, Glu585).

Аминокислотная последовательность OpdB из S. proteamaculans (PSP) имеет высокую степень гомологии с последовательностями OpdB из Е. coli и S. enterica (68%; для С-концевого каталитического домена - 85%). PSP имеет характерную для OpdB из других источников каталитическую триаду (Ser532, His652 и Asp617) и первичный субстрат-связывающий центр (Glu576 и Asp578). В числе интересных особенностей первичной структуры OpdB из S. proteamaculans является отсутствие одного из пары остатков Asp/Glu, контролирующих Р2-специфичность фермента - остаток Asp462 заменен на Ala. В случае трипаносомных и некоторых бактериальных олигопептидаз В пара Asp/Glu в положениях 460 и 462 является обязательной. Однако в соответствующих ферментах из L. major и L. amazonensis второй из этих остатков также заменен на незаряженный [Guedes et. al., 2007]; данные о специфичности ферментов из лейшманий отсутствуют. Наиболее близки аминокислотные последовательности PSP и (определенной по гену) OpdB Y. pestis (возбудителя чумы), где также отсутствует отрицательно заряженный остаток в положении 462. В этом случае степень идентичности достигает 87%; для более консервативного С-концевого каталитического домена - 90%.

Одна из трипаносомных OpdB, а именно из Т. brucei, является одновременно сериновой и SH-зависимой: ее активность контролируется остатком Cys256 N-концевого домена, а также остаками Cys559 и Cys597, близких к Ser активного центра [Morty et. al., 2005]. В случае PSP ингибиторный анализ показал, что фермент не является SH-зависимым; определенная по гену аминокислотная последовательность OpdB из S. proteamaculans (рис. 7) продемонстрировала, что, в отличие от соответствующих ферментов других грамотрицательных бактерий, остатки цистеина в этом белке вообще отсутствуют. Отсутствие дисульфидных связей является характерным признаком психрофильных ферментов и может быть ответственным за их низкий температурный оптимум.

1 MMTPPKAEKR PYPITTHGDT RVDDYYWLRD DERTDPQVLD YLQAENAFTD AALKPQQALR SP94 —MLPKAARI PHAMTT.HGDT RIDNYYWLRD DTRSQPEVLD YLQQENSYGH RVMASQQALQ ЕС —MLEKANRI PYAMTVHGDT RIDNYYWLRD DTRSQPEVLD YLHQENEYGR KVMSSQQALQ SE MMTPPKADKR PYPMTRHGDT RVDDYYWLRD DERTDADVLN YLQAENAFTA AVLKPQQQLR YP

61 ETLYEEMVAR IPQQEHSVPY VRHGYRYQTR FEPGNEYAIY VRQPQAESEH —WDTLIDGN SP94

DRILKEIIDR IPQREVSAPY IKNGYRYRHI YEPGCEYAIY QRQSAFSEEW DEWEILLDAN ЕС

DRILKEIIDR IPPREVSAPY VKNGYRYRYI YEPGCEYAIY QRQSALSEEW NVWETLLDAN SE

ETLYQEMVGR IPPQEESVPY VRNGYRYQTR FEPGNEYAIY VRQPVSTDSD —WETLLDGN YP

119 QRAEQREFYT LGGLEVSPDN QKLAVAEDFL SRRQYDIRFK NLSDDSWTDE VLENTSGSFE SP94

KRAAHSEFYS MGGMAITPDN TIMALAEDFL SRRQYGIRFR NLETGNWYPE LLDNVEPSFV ЕС

QRAAHSEFYT LGGLAITPDN TIMALAEDYL SRRQYGLRFR NLESGNWYPE LLDNVAPEFV SE

QRAEGHEFYT LGGLDVSPDN QLLAVAEDYL SRRQYDIRIK NLSSGGWHDE VISNTSGGFE YP

179 WANDSATVYY VRKHAKTLLP YQVYRHWGT DPQLDELIYE EQDDTFYVGL EKTTSDRFIL SP94

WANDSWTFYY VRKHPVTLLP YQVWRHñIGT PASQDKLIYE EKDDTYYVSL HKTTSKHYW ЕС

WANDSLTLYY VRKHKKTLLP YQVWRHTIGT PSSQDELVYE EKDDTFYVSL HKTTSQHYW SE

WANDSKTLYY VRKHEKTLLP YQVYRHWGT DPEQDKLIYQ ESDDTFYVSL EKTTSERFIL YP

239 IHLSSTTTSE ILLLDADRAD STPQMFVPRR KDHEYGIDHY HQHFYIRSNK DGKNFGLYQS SP94

IHLASATTSE VRLLDAEMAD AEPFVFLPRR KDHEYSLDHY QHRFYLRSNR NGKNFGLYRT ЕС

IHLASATTSE VLLLDAELAD AEPFSFLPRR KDHEYSLDHY QHKFYLRSNR NGKNFGLYRT SE

IHLSSTTTSE ILLLDADLPE PVPQVFAPRR KDHEYGVDHY KQHFYIRSNK EGKNFGLYKI YP

299 EQ-------A DEAQWQTLIA PRIEVMLEGF SLFRDWLWE ERSEGLTQLR QIHWQSGEVK SP94

RMR-------DEQQWEELIP PRENIMLEGF TLFTDWLWE ERQRGLTSLR QINRKTREVI ЕС

RVR------- NENAWEELIP PREHIMLEGF TLFTDWLVVE ERQRGLTSLR QINRKTREVI SE

EDSQGCSDFA DESQWALLIA PRTDVMLEGF SLFRDWLWE ERSEGLTHLR QIHWSTGEEK YP

352 RIAFDDPTYT ----TWLAYN PEPETELLRY GYSSMTTPTT LYELNLDSDE RVMLKQQEVK SP94

GIAFDDPAYV ----TWIAYN PESETARLRY GYSSMTTPDT LFELDMDTGE RRVLKQTEVP ЕС

GIAFDDPAYV ----TWLAYN PEPETSRLRY GYSSMTTPDT LFELDMDTGE RRVLKQTEVP SE

SITFDDPTFD DPTYTWLAYN PEPETALLRY GYSSMTTPSS MFEINMDSGE RQLLKQQEVK YP

408 NFTPENYRSE RVWVKARDGV EVPVSLVYRH DSFARGTNPL MVYGYGSYGS SMSPAFSASR SP94

GFDAAKYRSE HLWIVARDGV EVPVSLVYHR KHFRKGHNPL LVYGYGSYGA SI@A0FSFSR ЕС

GFDSGCYQSE HLWITARDGV EVPVSLVYHQ KYFRKGQNPL LVYGYGSYGS SIHAgFSSSR SE

DFTPEKYRSE RIWVTASDGV KIPVSLVYHR DYFVSGSNPL LVYAYGSYGS SMgPVFSSSR YP

468 LSLLDRGFVF VLAHIRGGGE LGQLWYEDGK LFKKQNTFND FIDVTEALIA QGYGDAKRVF SP94

LSLLDRGFVY AIVHVRGGGE LGQQWYEDGK FLKKKNTFND YLDACDALLK LGYGSPSLCY ЕС

LSLLDRGFVY AIVHVRGGGE LGQQWYEDGK FLKKRNTFND YLDACDALLK LGYGSPSLCY SE

LSLLDRGFVF ALAHIRGGGE LGQQWYEDGK LLNKLNTFSD FTDVTKALVN EGYGDAQRVF YP

528 AMGG0AGGLL MGAVINQAP.E LFNGIVÄQVP FVDVVTTMLD ESIPLTTG0Y 0EWGNPN03A SP94 AMGGSAGGML MGVAINARPE LFHGVIAQVP FVDVVTTMLD ESIPLTTGjF 3EWGNPQDPQ ЕС GMGGSAGGML MGVAINERPE LFHGVIAQVP FVDVLTTMLD ESIPLTTGjF sEWGNPQDIE SE

AMGGSAGGLL MGVIVNQAPE LYKAWAQVP FVDVVTTMLD ESIPLTTGgY gEWGNPNDKV YP

*

588 YYDYILQYSP YDQVKAQDYP HMLVTTGLHB YYEYMKSYSP YDNVTAQAYP HLLVTTGLH D YYDYMKSYSP YDNVKAQDYP HLLVTTGLHD

YYDYIKQYSP YDQVKAQDYP HMLVTTGLHg *

64 8 MDSG0GGKSG RFKAYEDIAL EYAFILALAE------------------SP94

MDSGH GGKSG RFKSYEGVAM EYAFLVALAQ GTLPATPAD EC

MDSGSGGKSG RFKSYEGVAL EFAFLIGLAQ GTLHSA------SE

MDSGjHjGGKSG RFKAYEDIAL EYAFILSLI-------------------YP

Рис. 7. Сравнение аминокислотных последовательностей OpdB S. proteamaculans 94 (SP94), E. coli (ЕС), 5. enterica (SE) и Y. pestis (YP). Курсивом выделены 11 аминокислотных остатков OpdB S. proteamaculans 94, отличающихся от соответствующих остатков OpdB S. proteamaculans 568; серой заливкой выделены фрагменты, совпадающие для PSP S. proteamaculans и хотя бы одного аналогичного фермента из трех других источников; остатки Asp/Glu субстрат-связывающих центров S1 и S2 выделены черной заливкой; помечены звездочками и взяты в рамки остатки аминокислотные остатки (Ser, His, Asp) каталитической триады

Получение рекомбинантного PSP (His6-PSP)

На основе коммерческой экспрессионной системы, включающей штамм Е. coli BL-21 (DE3) и вектор рЕТ23Ь+ был получен продуцент олигопептидазы В S. proteamaculans 94 - Е. coli BL-21 (DE3) [pOpdB]. Рекомбинантный фермент содержал N-концевую гексагистидиновую

Рис. 8. Препараты Швб-РЭР на разных стадиях очистки (Оз-№-электрофорез в 10% ПААГ)

1 - Суммарный белковый препарат после разрушения клеток;

2 - хроматография на №-1ЧТА-агарозе;

3 - ионообменная хроматография на

0-сефарозе;

4 - маркеры молекулярных масс

SQVQYWEPAK WVAKLRELKT DDRQLLLYTD SP94

SQVQYWEPAK WVAKLRELKT DDHLLLLCTD ЕС

SQVQYWEPAK WVAKLRELKT DQRLLLLCTD SE

SQVQYWEPAK WVAKLREMKT DDHQLLLYTD YP

последовательность.

12 3 4

Наработка биомассы производилась при 37 °С, индукцию осуществляли при 25 °С. Клетки собирали центрифугированием и разрушали обработкой лизоцимом и ультразвуком. Бесклеточный экстракт наносили на колонку с №-МТА-агарозой и после промывки элюировали линейным градиентом имидазола 10-100 мМ. Степень чистоты после аффинной хроматографии на

№-ЫТА-агарозе составляла примерно 90%; гомогенный препарат получен дополнительной хроматографией на Р-сефарозе. Результаты очистки Ивб-РБР представлены на рис. 8 и в табл. 3.

Таблица 3. Очистка Швб-РЗР

Стадия очистки Активный фермент, нмоль PSP Белок, мг Содержание PSP, нмоль/мг белка Степень очистки Выход, %

Бесклеточный экстракт 163,1 2616 0,062 1 100

Аффинная хроматография на №-ЫТА-агарозе 68 13,9 4,9 78,9 41,7

Ионообменная хроматография на С2-сефарозе 61,6 5,1 12,1 194,1 37,7

Выход экспрессированного Hise-PSP составил 150 мг из 100 г биомассы.

Исследование рН- и температурной зависимости активности PSP

Изучено влияние рН на гидролиз стандартного трипсинового субстрата BAPNA. рН-зависимость гидролиза имеет стандартную для сериновых протеиназ и, в частности, OpdB, колоколообразную форму (рис. 9). Рассчитанные методом нелинейной аппроксимации экспериментальных данных величины р (6,96 ± 0,06 и 9,89 ± 0,10) аналогичны соответствующим данным для OpdB из Е. coli\ показано, что нижнее значение р/Са (~7) соответствует ионизации остатка имидазола активного центра, а верхнее рК„ (-9-10) - неидентифицированной аминокислоты (Lys или Туг), контролирующей активную конформацию фермента [Juhasz et al., 2002].

Рис. 9. Влияние рН на активность PSP; [PSP] = 8,96 нМ, [BAPNA] = 0,03 мМ, [Са2+] = 50 мМ

рН 4,8-5,20 - 0,1 M ацетатный буфер; рН 6,0-9,45 - 0,1 M Трис-НС1-буфер

Исследовано влияние температуры на стабильность (рис. 10) и активность (рис. 11) Р8Р. Показано, что фермент достаточно быстро инактивируется: инкубация в течение 15 мин при 43 °С приводит к 90%-ной инактивации; даже при 30 °С через 30 мин сохраняется лишь 50-60% активности. В то же время олигопептидаза В из Е. соИ обладает значительно более высокой термостабильностью, сохраняя активность вплоть до 50 °С [Уап й а1., 2006].

Рис. 10. Термостабильность PSP в сравнении с мезофильным ферментом

1 - PSP;

2 - OpdB из Е. coli [Yan, et al., 2006]). Прединкубации в 0,1 M Трис pH 8,0 при соответствующей температуре в течение 15 мин. Активность измеряли по BAPNA (0,2 мМ)

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Температура, °С

10080

.о

| 60-

ш

5

| 40 20 0

Рис. 11. Влияние температуры на активность PSP в сравнении с мезофильным ферментом

1 - AcLKR-pNa (30,6 мкМ); PSP (0,53 нМ); 0,1 М Трис pH 8,0

2 - OpdB из Т. cruzi [da Silva-Lopez et al., 2008]

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Температура, °C

Кажущийся температурный оптимум PSP находится при 25 °С; при 10 °С активность составляет более 60% максимальной. Температурные характеристики PSP (рис. 10 и 11) -высокая активность при низких температурах и инактивация фермента при температуре выше 25 °С характерны для психрофильных ферментов.

Субстратно-ингибиторный анализ PSP

Проведен субстратный анализ PSP с использованием серии п-нитроанилидных субстратов (pNA) и высокоффективного для протеиназ трипсинового типа тиобензилового эфира Ка-бензилоксикарбонил-Ь-лизина (Z-Lys-S-Bzl). Показано, что рекомбинантный фермент (His6-PSP) не

отличается по специфичности и активности от природного фермента (PSP) (табл. 4). В отличие от трипсина, свободный N-конец не является необходимым условием ферментативной активности олигопептидазы В [Yan et al., 2006; Morty et al., 2002]. Для олигопептидазы В из S. proteamaculans (PSP) мы впервые провели более или менее систематический анализ вторичной специфичности как в отсутствие, так и в присутствии (50 мМ) Са2+.

Первичная специфичность. PSP, подобно другим олигопептидазам В, обладает трипсиноподобной первичной специфичностью, гидролизуя субстраты, содержащие в Р1-положении остатки Arg и Lys. Как следует из табл. 4, очевидно, что PSP проявляет в основном аргиназную активность. При сравнении эффективности гидролиза лизиновых субстратов с соответствующими аргининовыми (особенно в случае пары Suc-AAPR-pNA и Suc-AAPK-pNA) очевидно 10-кратное предпочтение аргининовых субстратов над лизиновыми, как в присутствии, так и в отсутствие ионов кальция. По литературным данным, для олигопептидаз В из других источников (трипаносом, Е. coli, S. enterica) это предпочтение остатка аргинина над лизином значительно менее выражено (<2); в некоторых случаях аргининовые и лизиновые субстраты вообще не отличаются по эффективности гидролиза [Morty et al., 2002; 2005; Kanatani et al., 1991].

Вторичная специфичность. В числе интересных особенностей первичной структуры PSP является отсутствие одного из пары остатков Asp/Glu, контролирующих Р2-специфичность OpdB - остаток Asp462 заменен на А1а. Однако оба субстрат-связывающих центра PSP остаются отрицательно заряженными, что способствует эффективному гидролизу пептидов с положительно заряженными остатками в Р1 и Р2-положениях. Действительно, Ac-LKR-pNA (в отсутствие Са2+) является самым эффективным в ряду исследованных нами субстратов (табл. 4). Эффективность гидролиза субстрата с положительно заряженным Р2-остатком в присутствии Са2+, способного блокировать карбоксильные группы Asp/Glu SI и S2-uempoB, понижается на порядок за счет ухудшения связывания субстрата.

Ухудшение связывания в присутствии ионов кальция наблюдается также для более коротких субстратов - сложных эфиров и амидов N-ацил-аргинина (или лизина). В случае Z-Lys-S-Bzl Са2+ (50 мМ) вызывает 3-х кратное увеличение К.т, не влияя на kcaобщее падение эффективности гидролиза Z-Lys-S-Bzl в присутствии Са2+3-кратное против 10-кратного для Ac-LKR-pNA (табл. 4). Для амидного субстрата BAPNA обнаружено аналогичное 3-х кратное повышение величины Кт в присутствии Са2+, однако оно сопровождается также повышением (2-кратным) величины ксм. Одновременное одинаковое изменение двух этих констант обычно объясняют непродуктивным связыванием [Juhasz et al., 2002].

Таблица 4. Кинетические константы гидролиза субстратов олигопептидазой В из рго1еатаси1ат (РБР); 0,1 М Трис, рН 8,0; 2% ДМСО; 25 °С. Ошибка эксперимента не превышает 20%

Субстрат мин" Кт; мМ ксм!Кт\ мкМ"1 мин"'

[Са2+] = 0 [Са2+] = 50 мМ [Са2+] = 0 [Са2+] = 50 мМ [Са2+] = 0 [Са2+] = 50 мМ

'Ас-ЬКЯ-рЫА 1463,24 1917,59 0,0226 0,265 64,77 7,2

2Ас-ЬКЛ-рЫА 1429,46 - 0,0196 - 72,93 -

'Ас-ЬЬЯ-рМА - 1013,08 - 0,559 - 1,8

2Ас-ЬЬЯ^А 457,15 834,14 0,224 0,457 2,04 1,83

1г-РК- pNA 1682,26 2112,84 0,0578 0,0513 29,13 41,2

2г-РЯ- pNA - 3455,9 - 0,0732 - 47,2

'Вг-РРЯ-рЫА - 1094,0 - 0,062 - 17,6

2Вг-РРК-рЫА 12120 1265,8 0,537 0,084 22,57 15,07

'ВАРЫА 869,09 2263,13 0,09 0,302 9,65 7,5

2ВАРЫА - 2213,50 - 0,309 - 7,2

'г-Ьув-З-Вг! 3331,9 - 0,0956 - 34,95 9,09

22-ЬУ8-8-Вг1 - 3233 - 0,3215 - 10,4

'Бис-ЛАРЯ-рЫЛ - 72,04 0,323 0,22

^ис-ААРЯ-рЫА 30,26 62,5 1,05 0,306 0,029 0,205

'Зис-ААРК-рЫА - - - - - 0,018

28ис-ААРК-рНА - 56,14 - 2,2 0,004 0,0255

'г-ААЯ-рЬ'А - - - - - 0,79

'Бис-ОРК-рЫА - - - - - 0,067

1 Р8Р "Швб-РБР

Классический случай непродуктивного связывания в отсутствие Са2+ наблюдается для Ac-LLR-pNA: введение 50 мМ Са2+ приводит к одновременному 2-кратному увеличению значений ксЛ и Кт\ общая эффективность гидролиза (kcJKm при этом не меняется (табл. 4). По-видимому, при наличии двух карбоксильных аминокислотных остатков (Glu576 и Glu578) в Sl-центре и третьего (Asp460) в 82-центре PSP, вероятность непродуктивного связывания для субстратов, содержащих лишь один положительно заряженный остаток Arg, достаточно велика, а Са2+ эту возможность понижает.

Субстраты Suc-AAPR-pNA и Suc-AAPK-pNA, содержащие отрицательно заряженную сукцинильную группу, являются наименее эффективными из исследованных (табл. 4). Сукцинильная группа достаточно удалена (на три аминокислотных остатка) от гидролизуемой связи, однако при этом очевидно ее негативное влияние на субстрат-связывающие центры PSP - наблюдается не только плохое связывание субстрата (высокие значения Кт), но и низкая каталитическая эффективность - величины A:cat Suc-AAPR-pNA и Suc-AAPK-pNA почти на два порядка ниже соответствующих констант всех остальных субстратов (табл. 4). В противоположность Ac-LKR-pNA, введение ионов кальция, блокирующих карбоксильные группы фермента и/или субстрата, на порядок повышает эффективность гидролиза Suc-AAPR-pNA и Suc-AAPK-pNA; эффект складывается из повышения величины ксм и уменьшения величины Кт (табл. 4).

Таким образом, величина кинетических констант гидролиза всех изученных нами субстратов PSP оказалась в ярко выраженной зависимости от наличия или отсутствия ионов кальция в инкубационной среде, причем для субстратов с разной вторичной специфичностью эффект часто носит противоположный характер (табл. 4, рис. 12). Поэтому ряд специфичности гидролиза субстратов выглядит по-разному при [Са2+ ] = 0 и 50 мМ.

Для ряда субстратов PSP (табл. 4) можно отметить практически одинаковую величину Кт (-0,3 мМ) в присутствии 50 мМ Са2+. К таким субстратам относятся как наилучший - Ac-LKR-pNA, так и наихудший -Suc-AAPR-pNA из исследованных, а также BAPNA. Исходя из этого, можно предположить, что эта величина характеризует связывание остатка Arg в первичном субстрат-связывающем центре (Sl) PSP, а вторичный (S2) центр блокирован ионами кальция. В отсутствие Са2+ в связывании субстрата принимают участие оба центра-S1 и S2, что приводит к повышению эффективности гидролиза на порядок в случае Ac-LKR-pNA, и, наоборот, понижению - в случае Suc-AAPR-pNA; при гидролизе BAPNA и Ac-LLR-pNA наблюдается непродуктивное связывание.

Сравнение эффективности гидролиза субстратной пары Ac-LKR-pNA и Ac-LLR-pNA демонстрирует, что остаток лейцина в Р2-положении субстрата неблагоприятен для PSP (табл. 4). Эффективность гидролиза наилучшего субстрата PSP - Ac-LKR-pNA, по отношению к Ac-LLR-pNA изменяется от 30-кратной в отсутствие Са2+ до 4-х кратной в присутствии 50 мМ Са2+.

Нами было обнаружено, что по эффективности гидролиза в отсутствие ионов кальция, на втором месте после субстрата с двумя положительно заряженными остатками находится 7-РК-рЫА, субстрат с гидрофобным остатком в Р2-положении, а в присутствии таковых, величина кгЛ/Кт Z-FR-рЫА является наивысшей для исследованных нами субстратов (табл. 4, рис. 12).

При этом как величина &саь так и Кт практически не зависит от присутствия или отсутствия ионов кальция, и величина &са|/Кт, характеризующая эффективность гидролиза этого субстрата, в присутствии 50 мМ Са2+ лишь незначительно выше соответствующей величины в их отсутствие. Величина Кт, характеризующая эффективность связывания субстрата с ферментом, в случае г-БЯ-рЫЛ значительно ниже Кт для других аргининовых субстратов (табл. 4). Поэтому нами было выдвинуто предположение, что РБР содержит еще один дополнительный, гидрофобный связывающий центр, ответственный за связывание ароматических остатков субстрата. В случае другого субстрата с ароматическим Р2-остатком, Вх-PFR-pNA, содержащего в РЗ - положении остаток пролина, гидролиз характеризует сильное непродуктивное связывание - величины ксгь и Кт параллельно изменяются на порядок в зависимости от наличия Са2+ (табл. 4). Однако, в противоположность рассмотренному выше случаю непродуктивного связывания Ас-Ш1-рЫА и ВАРЫА, Са2+ способствует непродуктивному связыванию Вг-РР11-р^.

Наиболее интересным свойством субстратов с ароматическим аминокислотным остатком в Р2-положении является обнаруженное нами ингибирование субстратом в области их высоких концентраций, причем эффект этот значительно более выражен в отсутствие ионов кальция (рис. 13, табл. 5). Такое ингибирование для субстратов с ароматическим остатком в Р2 положении не было обнаружено ни для одной из Орс1В из других источников.

Кинетика субстратного ингибирования гидролиза г-БЯ-рИА и Вг-РРЛ-рЫА РБР не соответствует кинетике классического субстратного ингибирования, когда присоединение второй молекулы субстрата к продуктивному фермент-субстратному комплексу ЕБ приводит к

во

г

Рис. 12. Активность РЭР в отсутствие и в присутствии ионов Са2+

образованию непродуктивного комплекса ES2. Мы предположили, что наблюдаемое резкое падение начальной скорости гидролиза Z-FR-pNA и Bz-PFR-pNA при повышении [S] может быть вызвано присоединением к комплексу ES не одной дополнительной молекулы субстрата, а нескольких (п). Показано [Бресткин и др., 1961], что начальная скорость такого гидролиза может быть рассчитана по формуле:

v = ксл[Е] [S]/{(Km+ [S] + [S]n+1/(Ks')n}

где предполагается, что каждая из п дополнительных молекул субстрата присоединяется независимо от других с одной и той же константой Ks'.

На рис. 13 приведены теоретические кривые зависимостей v/[E] от [S] для Z-FR-pNA и Bz-PFR-pNA, соответствующие приведенной выше формуле.

Рис. 13. Различный характер зависимостей начальных скоростей гидролиза некоторых субстратов Р8Р от их концентрации и присутствия ионов кальция. Для корректного сравнения скорости нормированы по концентрации фермента

Результаты расчета показали, что при отсутствии ионов кальция в фермент-субстратном комплексе РБР с Bz-PFR-pNA п = 2,55, то есть фермент способен дополнительно сорбировать 2-3 молекулы этого субстрата, что приводит к неактивному комплексу. Число дополнительных молекул Z-FR-pNA еще больше: 4-5 (табл. 5). Величины кинетических констант гидролиза этих субстратов ксЛ и Кт практически совпадают с их значениями в табл. 4, полученными по обычному уравнению Михаэлиса-Ментен в области низких концентраций. Способность РБР сорбировать большое число молекул аргинин-содержащих ди- и трипептидов с остатком РЬе в Р2-положении указывает на то, что наше предположение о наличии в молекуле этой олигопептидазы В гидрофобного субстрат-связывающего центра не только подтверждается, но и что этот гидрофобный центр является достаточно объемным. Более того, ингибиторный анализ подтверждает наличие такого центра, способного сорбировать не только молекулы субстратов, но и ароматических ингибиторов (см. раздел «Ингибиторный анализ»).

В присутствии 50 мМ Са2+ эффект субстратного ингибирования значительно менее выражен (рис. 13). Величины констант субстратного ингибирования К5' 2-РЯ-рЫА и Вг-РБЯ-рЫЛ в присутствии ионов кальция значительно выше, чем в их отсутствие; однако число дополнительных молекул субстрата, присоединяющихся к фермент-субстратному комплексу, не изменяется (табл. 5).

Таблица 5. Субстратное ингибирование PSP; 0,1 M Трис, pH 8,0; 2% ДМСО; 25 °С

Субстрат Эффектор п Ks'

мкМ

Ac-LKR-pNA - 1,0±0,2 409±204

Z-FR-pNA - 5,2±0,8 45,1 ±4,4

'Z-FR-pNA - 5,9±0,4 126±4

Bz-PFR- pNA - 2,7±0,1 26,9±1,8

'Bz-PFR- pNA - 2,0±0,4 192±50

Ac-LLR-pNA ти-фенантролин; 2,28 мМ 1,6±0,4 86±41

о-фенантролин; 1,2 мМ 2,0±0,6 100±20

BAPNA .м-фенантролин; 2,28 мМ 2,0±0,5 126±30

о-фенантролин; 1,2 мМ 2,0±0,6 223±48

[Са2+] = 50 мМ

Для изучения действия PSP на олигопептиды мы выбрали в качестве субстрата 26-членный пептид - мелиттин GIGAVLK7-VLTTGLPALISWIK-R22-KRQQ, содержащий несколько потенциальных сайтов гидролиза этим ферментом - остаток Lys7 и последовательность 21-24 из четырех положительно заряженных аминокислотных остатков -KRKR-. Обнаружено, что первоначально практически одновременно образуются два фрагмента: 122 и 8-22, соответствующие гидролизу мелиттина после остатков Arg22 и Lys7; очевидно, что фрагмент 8-22 образуется путем дополнительного гидролиза фрагмента 1-22, и скорость гидролиза полипептидной цепи после остатка лизина как минимум в 2 раза меньше, чем после остатка аргинина; продукты гидролиза после остатков Lys23 и Arg24 не обнаружены. Таким образом, по отношению к олигопептидам PSP, также как по отношению к п-нитроанилидным субстратам, проявляет преимущественно аргиназную активность.

При дальнейшей инкубации наряду с фрагментами 1-22 и 8-22 обнаруживаются нарастающие количества фрагментов 1-21 и 8-21 (рис 14). Ранее для трипаносомных олигопептидаз В была обнаружена необычная карбоксипептидазная активность - удаление С-концевых остатков Arg (удаления других аминокислотных остатков, включая Lys, не обнаружено) [Hemerly et al., 2003; Morty et al., 2005], однако только если в Р2-положении находится Arg или Lys.

a mV

б

2.0

1.В

0,50

1.6

0.6

1.4

1.2

0.2

1.0

0.4

Рис. 14. Хроматограмма гидролиза мелиттина PSP; [S] = 90 мкМ, [Е] = 105 нМ; 0,1 M Трис, рН 8,0, 25 °С; инкубация 3 ч. Условия хроматографии: колонка Luna С8 2x250 мм («Phenomenex», США); элюцию проводили в 0,1%-ной TFA с градиентом ацетонитрила (95%) 0-100% за 60 мин.; скорость элюции 0,3 мл/мин. а - исходный препарат мелиттина, б - продукты гидролиза гидролиза мелиттина PSP; 1 - мелиттин; 2 - фрагмент 1-7 (657,4 Да); 3 - фрагмент 8-22 (1668 Да); 4 - фрагмент 8-21 (1512,2 Да); 5 - фрагмент 1-22 (2308 Да); 6 - фрагмент 1-21 (2151,8 Да)

Фрагменты мелиттина 1-21 и 8-21 являются продуктами такого удаления С-концевых остатков Arg из фрагментов 1-22 и 8-22; таким образом, PSP также обладает свойственной олигопептидазам В из других источников узкоспецифической карбоксипептидазной активностью.

Ингибиторный анализ. Предварительный ингибиторный анализ PSP мы провели с использованием частично очищенных препаратов (табл. 1). После получения гомогенных препаратов этого фермента (природного и рекомбинантного) был проведен детальный ингибиторный анализ наиболее важных из обнаруженных в предварительном исследовании ингибиторов с определением типа и констант ингибирования (табл.6).

В отличие от всех ранее известных олигопептидаз В из других источников, PSP достаточно эффективно ингибируется основным панкреатическим трипсиновым ингибитором быка (BPTI). BPTI является конкурентным ингибитором PSP, как в отсутствие ионов кальция, так и в присутствии 50 мМ Са2+, где эффект ингибирования более чем на два порядка ниже (табл. 6). Характер ингибирания BPTI трипсина и других трипсиноподобных сериновых протеиназ (тромбина, калликреина, энтеропептидазы и др.) также конкурентный.

Предварительный ингибиторный анализ показал, что препараты PSP эффективно ингибируются ионами Zn (табл.1). Оказалось, что

Zn2+ является неконкурентным ингибитором этого фермента (табл. 6). Также мы обнаружили ингибирование PSP о-фенантролином (табл.1), известным комплексоном и стандартным ингибитором цинк-зависимых ферментов [Stocker et al., 1988, Park et al., 2002]. Это привело нас к предположению, что PSP является сериновым и одновременно Zn-зависимым ферментом.

Таблица 6. Ингибирование РБР некоторыми соединениями. Субстрат ВАРЫА; 0,1 М Тш-НС1-буфер, рН 8,0; 25 °С. Ошибка эксперимента не превышает 20%

Ингибитор Характер ингибирования к,

BPTI конкурентный 34, 5 нМ '7,35 мкМ

ZnCl2 неконкурентный 24,4 мкМ

о-фенантролин антиконкурентный 1,59 мМ 20,82 мМ

.м-фенантролин антиконкурентный 0,31 мМ 20, 44 мМ

1 [Са2+] = 50 мМ

2 субстрат Ac-LLR-pNA

Для решения задачи, содержит ли PSP ионы цинка или нет, был использован метод атомной абсорбционной спектрометрии. Ионы цинка в составе белковой молекулы PSP обнаружены не были. Достаточно эффективное (К-, = 24,4 мкМ) ингибирование активности этого фермента при внесении ионов цинка можно по- видимому объяснить связыванием их с поли-Шв-кластером -277HYHQH281-. Такой кластер отсутствует в молекулах всех ранее исследованных олигопептидаз В из других источников.

Из литературных данных известно, что ингибирование ферментов о-фенантролином может объяснятся не комплексообразованием с ионами металлов, а гидрофобными взаимодействиями с самой белковой молекулой [Drum et al., 1970]. Для решения задачи, носит ли ингибирование о-фенантролином гидрофобный характер, нами был использован его нехелатирующий аналог, д/-фенантролин. Оказалось, что д<-фенантролин ингибирует PSP более эффективно. При этом в присутствии 50 мМ Са2+ эффект ингибирования почти полностью снимается, не только в случае комплексона - о-фенантролина, но и его нехелатирующего мета-аналога. При детальном изучении кинетики ингибирования PSP о- и .«-фенантролином было выяснено, что ингибирование носит антиконкурентный характер, когда ингибитор взаимодействует только с фермент-субстратным комплексом. При варьировании концентраций как ингибитора, так и субстрата, в координатах Лайнуивера-Берка (1/v от 1/[S]) и Диксона (1/v от [I]) получены серии параллельных прямых (рис. 15), что является характерным признаком антиконкурентного ингибирования:

1/ v= l/(fccat [E])(l+[I]/A^i)+ (КJ &cat [E])1/[S].

С ферментом связывается одна молекула ингибитора; соответствующие величины констант ингибирования приведены в табл. 6.

Однако из рис. 15 очевидно, что параллельность серий прямых как в случае графиков Лайнуивера-Берка, так и Диксона, имеет место лишь при низких концентрациях и субстратов, и ингибиторов.

. о-фенантролин

12 о-фенантролин

| 10

"з в * о ▲//у

4

г • »0

, ■ / О 2 3,2 мМ

1/1Э] .10' м

10- м-фенантролин

X } 8

»О 6-

г 4-

О 0,033 мМ ■ 0,050 нМ А 0.067 мМ • 0,100 мМ • 0,200 мм

2

•10 12 1/р] хЮ" м

[I], мМ

Рис. 15. Ингибирование .к-фенантролипом и о-фенантролином гидролиза Ас-ЬЬЯ-рКА. [Н1зб-Р8Р] = 2,58 нМ; 0,1 М Трис-НС1-буфер рН 8,0; 25 "С

При высоких же [8] и [I], что особенно наглядно демонстрируют зависимости 1/у от 1/[8], наблюдается отклонение кинетики гидролиза от линейной зависимости, аналогичное отклонению от кинетики Михаэлиса-Ментен в случае ингибирования субстратом. Таким образом, комплекс РБР с субстратом способен не только связывать объемные гидрофобные молекулы о- и .«-фенантролина, но в результате образовавшиеся тройные комплексы фермент-субстрат-фенантролин сорбируют еще одну молекулу субстрата с образованием четверного комплекса. Субстраты BAPNA и Ас-ЬЬЯ-рЫА, кинетика гидролиза которых в отсутствие о- и л/-фенантролина не отклоняется в области высоких концентраций от уравнения Михаэлиса-Ментен, в присутствии гидрофобных ароматических ингибиторов (присоединяющихся к фермент-субстратному комплексу) приобретают характерное для субстратов, содержащих в Р2-положении ароматический аминокислотный остаток, свойство субстратного ингибирования. Константы такого ингибирования для некоторых концентраций фенантролинов приведены в табл. 5.

В заключении можно отметить, что обнаруженная нами регуляция ферментативной активности PSP с помощью гидрофобных эффекторов может быть направлена как на предотвращение гидролиза определенных нежелательных субстратов, так и на промотирование гидролиза какого-либо природного субстрата, содержащего специфический гидрофобный центр.

Влияние ионов кальция на активность PSP настолько велико, что практически PSP при [Са2+] = 0 и PSP при [Са2+] = 50 мМ - это два разных фермента, различающихся по ряду эффективности гидролиза субстратов (табл. 4, рис. 12) и эффективности ингибирования как самими субстратами, так и собственно ингибиторами (табл. 5, 6, рис. 13). Можно предположить, что комплекс PSP с Са2+ имеет другую конформацию, чем свободный фермент. Из наших экспериментальных данных следует также, что при связывании одной молекулы субстрата в субстрат-связывающих центрах S1 и S2 молекула PSP также подвергается значительной конформационной перестройке, так как не свободный фермент, а комплекс ES становится способным сорбировать дополнительные молекулы ароматических субстратов и ингибиторов. Однако в настоящее время трехмерная структура ни одной из олигопептидаз В не известна, и делать какие-либо предположения как о природе такого изменения структуры белка, так и о локализации потенциального гидрофобного центра затруднительно.

Выводы

1. Разработана методика выделения и очистки новой психрофильной протеиназы из S. proteamaculans (PSP).

2. Определена полная аминокислотная последовательности PSP и установлена принадлежность PSP к семейству олигопептидаз В. Обнаружена высокая гомология аминокислотной последовательности PSP с последовательностями олигопептидаз В патогенов человека и животных - Yersinia pestis, Salmonella enterica, Trypanosoma cruzi, Klebsiella pneumoniae, Leishmania amazonensi, рыб и земноводных-Aeromonas hydrophila, растений - Erwinia carotovora.

3. На основе коммерческой экспрессионной системы, включающей штамм Е. coli BL-21 (DE3) и вектор рЕТ23Ь+, получен продуцент олигопептидазы В S. proteamaculans 94 - Е. coli BL-21 (DE3) [pOpdB], Разработана методика выделения и очистки рекомбинантного фермента (His6-PSP), позволяющая получать до 150 мг гомогенного по электрофорезу препарата фермента из 100 г биомассы.

4. Проведен субстратно-ингибиторный анализ PSP. Показана принадлежность его к протеиназам трипсинового типа. Исследована вторичная специфичность фермента. Исследована температурная стабильность фермента; определены температурный и рН-оптимумы.

Список публикаций с основными результатами работы

1. Михайлова А.Г., Лихарева В.В., Хайруллин Р.Ф.. Лубенец Н.Л., Румш Л.Д., Демидюк И.В., Костров C.B. Новая психрофильная трипсиноподобная протеиназа из Serratiaproteamaculans II Биохимия-2006.- T. 71.- С. 563-570.

2. Хайруллин Р.Ф.. Михайлова А.Г., Себякина Т.Ю., Лубенец Н.Л., Румш Л.Д., Зиганшин Р.Х., Демидюк И.В., Костров C.B. Олигопептидаза В из Serratia proteamaculans. I. Определение первичной структуры. Выделение и очистка природного и рекомбинантного фермента // Биохимия-2009.-Т. 74,-С. 1427 - 1437.

3. Михайлова А.Г., Хайруллин Р.Ф.. Себякина Т.Ю., Зиганшин Р.Х., Демидюк И.В., Громова Т.Ю., Костров C.B., Румш Л.Д. Структурно-функциональная характеристика природной и рекомбинантной олигопептидазы В из Serratia proteamaculans. Вестник новых медицинских технологий // Вестник новых медицинских технологий.-2009.- Т. XVI,- С. 271-272.

4. Хайруллин Р.Ф.. Лихарева В.В., Михайлова А.Г., Румш Л.Д., Демидюк И. В., Костров C.B. Новая психрофильная протеиназа // Тез. докл. VIII чтений, посвящ. памяти акад. Ю. А. Овчинникова, Москва, 25 - 27 октября 2006 г., С. 96.

5. Лихарева В.В., Михайлова А.Г., Хайруллин Р.Ф.. Румш Л.Д., Демидюк И.В., Костров C.B. Новая психрофильная трипсиноподобная протеиназа из Serratia proteamaculans II Материалы XIV международной конференции и дискуссионного научного клуба «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии». Тезисы докладов. Украина, Ялта-Гурзуф, 31 мая - 9 июня 2006 г., С. 278-279.

6. Михайлова А.Г., Лихарева В.В., Хайруллин Р.Ф.. Румш Л.Д., Демидюк И. В., Костров C.B. Психрофильная трипсиноподобная протеиназа из Serratia proteamaculans // Материалы XV Международной конференции и дискуссионный научный клуб «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии. Сателлитный симпозиум «Достижения современной биоорганической химии и перспективы их применения». Тезисы докладов. Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, 31 мая-9 июня 2007 г., С. 279-280.

7. Габибов А.Г., Колесников A.B., Мельников Э.Э., Михайлова А.Г., Калиберда E.H., Козырь, A.B., Кнорре В.Д., Белогуров A.A., Смирнов И.В., Захарова М.Ю., Хайруллин Р.Ф.. Румш Л.Д. Комбинаторные подходы к созданию ингибиторов ключевых протеиназ развития нейродегенеративных и инфекционных заболеваний. Итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2008 год в рамках приоритетного направления «Живые системы», ФЦП

«Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России 2007-2012 годы». Сборник тезисов. Москва. 2008, С. 98-99.

8. Хайруллин Р.Ф.. Себякина Т.Ю., Михайлова А.Г., Румш Л.Д. Олигопептидаза В из Serratia proteamaculans. Выделение, очистка и характеристика природного и рекомбинантного фермента // IV Российский симпозиум «Белки и пептиды». Тезисы докладов. Казань, 23-27 июня 2009 г., С. 119.

9. Хайруллин Р.Ф.. Себякина Т.Ю., Михайлова А.Г., Румш Л.Д. Выделение, очистка и характеристика новой олигопептидазы в из психротолерантного микроорганизма Serratia proteamaculans // Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова. Тезисы докладов, Т.1 Устные доклады и стендовые сообщения. Москва-Пущино, 28 cei " - - —>09 г., С. 385.

Принято к исполнению 15.10.09 Исполнено 15.10.09 Заказ № 948 Тираж 100 экз. Рекламно-производственная компания "ДипГрин" Москва, Миклухо-Маклая 16/10

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Хайруллин, Рафиль Фидаилевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Serratia proteamaculans — представитель психротолерантных 7 грамотрицательных бактерий

1.2. Адаптация психрофильных ферментов к катализу при низкой 8 температуре

1.3. Олигопептидазы В. Структура, функция

1.3.1. Классификация

1.3.2. Распространение в природе

1.3.3. Структура олигопептидазы В

1.3.4. Каталитический домен

1.3.5. (З-Пропеллерный домен

1.3.6. Энзимологическая характеристика олигопептидазы В. 25 Особенности олигопептидазного катализа

1.3.7 рН-Зависимость; рН- и температурная стабильность OpdB

1.3.8. Субстратная специфичность олигопептидаз В

1.3.9. Ингибиторы олигопептидазы В

1.3.10. Влияние реагентов на SH-группы на активность олигопептидаз В

1.3.11. Физиологическая функция олигопептидаз В и роль в патогенезе

II. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Выделение и очистка трипсиноподобной протеиназы из 50 психротолерантного грамотрицательного микроорганизма S. proteamaculans.

2.2 Первичная структура PSP. Сравнение аминокислотных 57 последовательностей OpdB из различных источников.

2.3. Получение рекомбинантного PSP (His6-PSP)

2.4. Исследование рН-и температурной зависимости активности PSP

2.5. Субстратный анализ

2.6. Ингибиторный анализ

Ill ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1. МАТЕРИАЛЫ, РЕАКТИВЫ

3.2. МЕТОДЫ

3.2.1. Определение концентрации белка

3.2.2. Электрофорез

3.2.3. Приготовление образцов для масс-спектрометрии

3.2.4. Определение активности препаратов PSP

3.2.5. Титрование активных центров

3.2.6. Определение химотрипсиновой активности

3.2.7. ВЭЖХ

3.2.8. Получение BPTI-сефарозы

3.2.9. Процедуры, использованные при работе с клетками

3.2.10. Выделение и очистка трипсиноподобной протеиназы из психротолерантного грамотрицательного микроорганизма S. proteamaculans

3.2.11. Выделение и очистка рекомбинантного His6-PSP

3.2.12. Определение кинетических параметров гидролиза субстратов PSP

3.2.13. Определение температурной и рН-стабильности PSP

3.2.14. Определение рН-зависимости

3.2.15. Определение температурного оптимума PSP

3.2.16. Гидролиз мелиттина

3.2.17. Определение содержания Zn2+ в PSP ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Новая психрофильная протеиназа Serratia proteamaculans"

В последнее время психрофилы и их ферменты привлекают к себе все большее внимание исследователей вследствие своей специфической особенности функционировать в условиях низкой температуры окружающей среды. Организмы, способные выживать и успешно развиваться в условиях постоянно пониженной температуры, называются психрофильными. В настоящее время к истинными психрофилам относятся организмы, для которых оптимальными условиями их функционирования является температура ниже 15 °С. Психрофилы широко представлены в живом мире и встречаются как среди про-, так и эукариот. На сегодняшний день в эту группу включены многие бактерии, грибы, растения и некоторые виды животных (насекомые и позвоночные) [1-4]. Несмотря на чрезвычайно широкое распространение и разнообразие, психрофилы к настоящему времени сравнительно мало изучены.

Психрофильные организмы продуцируют специфические ферменты, которые способны компенсировать снижение скорости реакций, вызванное понижением температуры, повышением их ферментативной активности. Многочисленные работы по сравнительной характеристике гомологичных ферментов психрофильных, мезофильных и термофильных организмов показали, что их удельные активности в условиях температурного оптимума функционирования, как правило, близки. Таким образом, эффективность психрофильных ферментов весьма велика. Молекулярные основы данного явления в настоящее время неизвестны. Сравнение первичных последовательностей ферментов-гомологов показывает, что аминокислотные остатки их активных центров и субстрат-связывающих областей высоко консервативны. Этот факт, в совокупности с данными о том, что ферменты психрофилов, как правило, отличаются заметно сниженной термостабильностью, позволил выдвинуть гипотезу, объясняющую их высокую удельную активность повышенной подвижностью молекулы [1, 5-7]. Однако однозначно связь между стабильностью и активностью психрофильных ферментов не установлена, и более того в ряде случаев получены противоречащие этой гипотезе результаты.

В то же время наличие повышенной подвижности не всегда подтверждается кристаллографическими данными. Возможно, что определяющую роль играет не повышенная лабильность молекулы белка в целом, а лишь ее отдельных районов. В пользу этой гипотезы говорит тот факт, что сравнение аминокислотных последовательностей изученных психрофильных ферментов показывает наличие минимальных перестановок и изменений в первичной структуре по сравнению с мезофильными и термофильными гомологами. Предполагается, однако, что этих структурных факторов достаточно для усиления локальной подвижности за счет изменения слабых взаимодействий, участвующих в стабилизации структуры белка.

Чрезвычайно большой интерес для исследователей представляют адаптированные к пониженным температурам трипсины и трипсиноподобные ферменты. Трипсины позвоночных - одни из наиболее изученных представителей сериновых протеиназ, и поэтому сравнительный анализ аминокислотных последовательностей, третичной структуры и кинетических параметров мезофильных, психрофильных и мутантных ферментов может пролить свет на механизм адаптации к пониженным температурам.

В результате проведенного недавно широкомасштабного скрининга психрофильных микроорганизмов был обнаружен и идентифицирован штамм Serratia proteamaculans, продуцирующий разнообразные протеиназы, в том числе, активные при пониженной температуре [8]. Результаты проведенных медико-биологических испытаний показали, что данный штамм не патогенен для теплокровных животных и удовлетворяет требованиям, предъявляемым к промышленным микроорганизмам.

Объект данного исследования — трипсиноподобная протеиназа из S. proteamaculans, представляющая интерес не только как психрофильный фермент, но также как фермент бактериального происхождения. Мы показали, что этот фермент является олигопептидазой В, первым психрофильным представителем данного семейства.

В заключение следует отметить, что благодаря повышенной каталитической эффективности адаптированные к пониженным температурам ферменты рассматриваются в качестве ценных инструментов для биотехнологических целей, медицинской и пищевой промышленности. Помимо большого значения использования психрофильных ферментов в практических целях следует отметить важность проведения фундаментальных исследований, связанных с изучением структурных основ повышенной каталитической эффективности ферментов организмов, обитающих при пониженных температурах.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Хайруллин, Рафиль Фидаилевич

Выводы

1. Разработана методика выделения и очистки новой психрофильной протеиназы из S. proteamaculans (PSP).

2. Определена полная аминокислотная последовательности PSP и установлена принадлежность PSP к семейству олигопептидаз В. Обнаружена высокая гомология аминокислотной последовательности PSP с последовательностями олигопептидаз В патогенов человека и животных — Y. pestis, S. enterica, Trypanosoma cruzi, Klebsiella pneumoniae, Leishmania amazonensi, рыб и земноводных — Aeromonas hydrophila, растений — Erwinia carotovora.

3. На основе коммерческой экспрессионной системы, включающей штамм Е. coli BL-21 (DE3) и вектор рЕТ23Ь+ получен продуцент олигопептидазы В S. proteamaculans 94 — Е. coli BL-21 (DE3) [pOpdB]. Разработана методика выделения и очистки рекомбинантного фермента (His6-PSP), позволяющая получать до 150 мг гомогенного по электрофорезу препарата фермента из 100 г биомассы.

4. Проведен субстратно-ингибиторный анализ PSP. Показана принадлежность его к протеиназам трипсинового типа. Исследована вторичная специфичность фермента. Исследована температурная стабильность фермента; определены температурный и рН-оптимумы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Хайруллин, Рафиль Фидаилевич, Москва

1. D'amico S., Claverie P., Collins Т., Georlette D., Gratia E., Hoyonx A., Meuwis M.A., Feller G., Gerday C. Molecular basis of cold adaptation // Philos.Trans.R.Soc.Lond В Biol.Sci.— 2002.— V. 357 —Pp. 917-925.

2. Feller G., Gerday C. Psychrophilic enzymes: molecular basis of cold adaptation // Cell MoLLife Sci.— 1997,—V. 53,—Pp. 830-841.

3. Deegenaars M.L., Watson K. Heat shock response in psychrophilic and psychrotrophic yeast from Antarctica // Extremophiles.— 1998.— V. 2.— Pp. 41-49.

4. Leiros H.K., Willassen N.P., Smalas A.O. Structural comparison of psychrophilic and mesophilic trypsins. Elucidating the molecular basis of cold-adaptation// Eur.J.Biochem.— 2000.— V. 267.—Pp. 1039-1049.

5. Paine S.G.H.S. Studies in bacteriosis. A bacterial leaf spot disease of Protea cynaroides,exhibiting a host reaction of possibly bacteriolytic nature // Annals of Applied Biology.— 1919.— V. 6.— Pp. 27-39.

6. Grimont F G.P. The Genus Serratia // Proteobacteria: Gamma Subclass.— New York, 2006,—Pp. 219-244.

7. Janda J., Abbot S. The Enterobacteria // Washington: ASM Press, 2006.— 138-142 p.

8. Bollet C., Grimont P., Gainnier M., Geissler A., Sainty J.M., De M.P. Fatal pneumonia due to Serratia proteamaculans subsp. quinovora // J.Clin.Microbiol.— 1993.— V. 31.— Pp. 444-445.

9. Grimont' F., Grimont P. Genus XXXIV. Serratia // Bergey's Manual of Systematic Bacteriology.—New York, 2005,— Pp. 799-811.

10. Fleisch F., Zimmermann-Baer U., Zbinden R., Bischoff G., Arlettaz R., Waldvogel K., Nadal D., Ruef C. Three consecutive outbreaks of Serratia marcescens in a neonatal intensive care unit // CIin.Infect.Dis — 2002.— V. 34.— Pp. 767-773.

11. Bennett J.W., Bentley R. Seeing red: the story of prodigiosin // Adv.Appl.Microbiol.— 2000.— V. 47:1-32.— Pp. 1 -32.

12. Zhang F., Dashti N., Hynes R., Smith D. Plant Growth Promoting Rhizobacteria and Soybean Glycine max (L.) Merr. Nodulation and Nitrogen Fixation at Suboptimal Root Zone Temperatures 11 Annals of Botany.— 1996,— V. 77.— Pp. 453-460.

13. Schmidt-Nielsen S. Ueber einige psychrophile Mikroorganismen und ihr Vorkommen // Zentr. Bakteriol. Parasitenkd Infektionsk .Hyg.Abt—1902.—V. 9.—Pp. 145-147.

14. Morita R.Y. Psychrophilic bacteria// Bacteriol.Rev.— 1975.—V. 39.—Pp. 144-167.19.22.