Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Активность матриксных металлопротеаз при развитии экспериментальных опухолей у мышей

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Активность матриксных металлопротеаз при развитии экспериментальных опухолей у мышей"

На правах рукописи

005014692

КИСАРОВА Яна Анатольевна

АКТИВНОСТЬ МАТРИКСНЫХ МЕТАЛЛОПРОТЕАЗ ПРИ РАЗВИТИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ОПУХОЛЕЙ У МЫШЕЙ

03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 5 мдр Ж1

Новосибирск - 2012

005014692

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении "Научно-исследовательский институт физиологии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Научный руководитель

доктор медицинских наук,

профессор КОРОЛЕНКО Татьяна Александровна

Официальные оппоненты:

КОЛПАКОВ Аркадий Ростиславович доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ "НИИ биохимии" СО РАМН, в.н.с.

БЕЛИЧЕНКО Виктор Михайлович доктор биологических наук, ФГБУ "НИИ физиологии" СО РАМН, в.н.с.

Ведущая организация Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт онкологии" СО РАМН

Защита состоится -3 луии**? 2012 г. в '-^"^часов на заседании диссертационного совета Д 001.034.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении "Научно-исследовательский институт биохимии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2; тел.: 8-383333-54-81).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения "Научно-исследовательский институт биохимии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2).

Автореферат разослан ^иц^п^ 2012 г. Ученый секретарь

диссертационного совета Русских Галина Сергеевна

Общая характеристика диссертации Актуальность темы

Злокачественные новообразования - одна из основных причин смертности во всем мире. В России ежегодно выявляются почти полмиллиона новых случаев раковых заболеваний. Из каждых 10 онкологических больных у 6 человек заболевание обнаруживается на поздней стадии [Чиссов и соавт., 2011].

Лечение и реабилитация больных раком требует значительных финансовых затрат и в ряде случаев не приносит желаемых результатов. В связи с этим, диагностика рака на начальной стадии является одним из приоритетных направлений медицины, а механизмы развития злокачественных новообразований являются одной из интенсивно изучаемых проблем в современной науке, привлекающей внимание ученых различных специальностей.

Формирование злокачественных новообразований и опухолевая прогрессия неразрывно связаны с процессом ремоделирования ткани, при котором нормальная ткань замещается малигнизированной [Diaz et al., 2005]. При этом большое значение имеет протеолитическая деградация внеклеточного матрикса (ВКМ) — сложно устроенной сети коллагенов различного типа, фибриллярных гликопротеинов и про-геогликанов, которые определяют архитектуру ткани и модулируют различные виды активности клеток [Zuckerand Сао., 2010].

Матриксные металлопротеазы (ММП) относятся к семейству цинковых кальций-зависимых ферментов, функция которых связана с расщеплением белков внеклеточного матрикса (ВКМ). Эти ферменты способны гидролизовать практически все компоненты ВКМ [Visse and Nagase, 2003]. Особое место отводится ММП в развитии процессов инвазии и метастазирования опухолей [Gialeli et al., 2010].

Показано, что ММП способствуют инвазии и диссеминации опухолевых клеток, а также развитию метастазов за счет деградации компонентов ВКМ [Lynch and Matrisian 2002; Diaz et al., 2005]. Кроме того, ММП определяют взаимоотношения ВКМ и клеток опухоли, влияя на миграцию, пролиферацию, апоптоз опухолевых клеток, нео-ангиогенез и реакцию иммунной системы [Sternlicht and Werb, 2001; Lynch and Matrisian, 2002; Kessenbrock et al., 2010]

Исследования на различных моделях опухолей у экспериментальных животных и при различных типах рака у людей показали,

з

что прогрессирование рака (инвазия и метастазирование) положительно коррелирует с увеличенной экспрессией, секрецией и активностью ММП в опухолевых и/или стромальных клетках [Pavlaki and Zucker, 2003; Mason and Joyce, 2011]. В некоторых работах показано снижение опухолевого роста и количества метастазов in vivo при использовании натуральных тканевых ингибиторов матриксных метал-лопротеаз (ТИМП) и синтетических протеазных ингибиторов [Gomis-Rüth et al., 1997; Pavlaki and Zucker, 2003; Zucker and Cao., 2010].

В связи с этим, различные ММП и ТИМП рассматриваются в качестве возможных биологических маркеров прогноза и лекарственной чувствительности злокачественных опухолей [Watson et al., 1999; Yonemura et al., 2001].

Несмотря на многочисленные исследования изменений экспрессии и концентрации ММП и ТИМП при различных опухолях у человека и животных, остается не выясненной зависимость активности ММП от конкретной нозологии, не описана динамика этих показателей в ходе опухолевой прогрессии, не определены изменения активности ММП в организме, происходящие при лечении опухолей. Также отсутствуют данные об изменениях латентных форм ММП (проММП), в виде которых они секретируются в ВКМ, и активных форм ММП в динамике развития и метастазирования опухолей.

В связи с этим, исследование изменений активности ММП (с учетом соотношения проММП и активных форм ММП) и концентрации ТИМП в динамике развития и метастазирования экспериментальных опухолей у мышей является важным и перспективным.

Для более детальной оценки роли матриксных металлопротеаз в патогенезе экспериментальных опухолей представляется целесообразным использование экспериментальной метастазирующей и неме-тастазирующей опухолей, позволяющих оценить активность ММП в динамике развития и метастазирования опухолевого процесса, а также при лечении этого злокачественного процесса.

Цель работы

Изучить изменения активности матриксных металлопротеаз с учетом соотношения проММП и активных форм ММП при развитии метастазирующей и неметастазирующей опухолей у мышей.

Задачи исследования

1. Исследовать изменения активности ММП с учетом соотношения проММП и активных форм ММП в гомогенатах опухоли и органов (легкие, селезёнка, печень) и в сыворотке крови мышей в динамике развития неметастазирующей опухоли Кребс-2.

2. Изучить изменения активности ММП с учетом соотношения проММП и активных форм ММП в гомогенатах опухоли и органов (легкие, селезёнка, печень) и в сыворотке крови мышей в динамике развития аденокарциномы легких Льюис (АЛЛ), которая метастази-рует в легкие.

3. Оценить изменения активности ММП с учетом соотношения проММП и активных форм ММП в ткани опухоли и легких с метастазами при проведении цитостатической и иммуномодулирующей терапии.

4. Исследовать концентрацию тканевых ингибиторов матриксных металлопротеаз (ТИМП-1 и ТИМП-2) в сыворотке крови и легких с метастазами в динамике развития опухоли аденокарциномы легких Льюис.

Научная новизна

Впервые показано, что у мышей в динамике развития как мега-стазирующей (аденокарцинома легких Льюис), так и неметастазирующей (Кребс-2) опухолей происходит повышение проММП в ткани опухоли. При формировании и развитии метастазов в легких при аде-нокарциноме легких Лыоис наблюдается увеличение активности активных форм ММП в ткани легких. В легких и печени без метастазов у мышей с экспериментальными опухолями (Кребс-2 и аденокарцинома легких Лыоис) изменения как проММП, так и активных форм ММП не обнаружены.

Впервые обнаружено, что опухоленосительство сопровождается увеличением как проММП, так и активных форм ММП в селезёнке мышей с Кребс-2 и аденокарциномой легких Льюис, которое коррелирует с весом селезёнки.

Показано, что при лечении цитостатическим препаратом цик-лофосфаном (ЦФ, 100 мг/кг) мышей с аденокарциномой легких Лыоис происходит снижение проММП и активных форм ММП как в тка-

ни опухоли, так и в легких с метастазами. Однократное введение им-муномодулятора карбоксиметилированного р-( 1 —>3)-гликана (КМГ, 25 мг/кг) мышам с аденокарциномой легких Льюис приводит к повышению проММП и активных форм ММП в ткани опухоли и снижению активных форм ММП в легких с метастазами. Комбинированное лечение ЦФ (100 мг/кг) и КМГ (25 мг/кг) мышей с аденокарциномой легких Льюис характеризуется снижением проММП и активных форм ММП в легких.

Научно-практическая значимость

Данные об изменениях активности ММП при развитии адено-карциномы легких Льюис (метастазирует в легкие) и Кребс-2 (не метастазирует), подтверждают вовлечение ММП в развитие опухолевого процесса и метастазов.

Установленный факт увеличения активности ММП при развитии и метастазировании экспериментальных опухолей в ткани опухоли и легких с метастазами является основой дальнейшего изучения изменений активности ММП в качестве диагностического критерия развития и метастазирования злокачественного процесса. Наличие корреляционной зависимости между активностью ММП в селезёнке и весом опухоли свидетельствует об активном вовлечении селезёнки в опухолевый процесс и требует дальнейшего исследования.

Повышение концентрации ТИМП-1 в сыворотке крови с ранних сроков развития аденокарциномы легких Лыоис может служить показателем развития данной опухоли.

Полученные результаты работы могут быть использованы в учебно-методическом процессе на биологических и медицинских факультетах ВУЗов.

Положения, выносимые на защиту

1. Матриксные металлопротеазы являются показателем развития опухолевого процесса при неметастазирующей опухоли Кребс-2 и метастазирующей опухоли аденокарциноме легких Лыоис у мышей. Появление проформ матриксных металлопротеаз и увеличение активных форм матриксных металлопротеаз в опухолевой ткани в ди-

намике развития экспериментальных опухолей указывает на продукцию матриксных металлопротеаз в ткани опухоли.

2. Активные формы матриксных металлопротеаз вовлечены в формирование и развитие метастазов в легких у мышей с аденокар-циномой легких Лыоис. В легких и печени без метастазов у мышей с экспериментальными опухолями (Кребс-2 и аденокарцинома легких Льюис) отсутствуют изменения как проформ матриксных металлопротеаз, так и активных форм матриксных металлопротеаз.

3. Увеличение концентрации тканевого ингибитора матриксных металлопротеаз 1-го типа в сыворотке крови, начиная с ранних сроков развития аденокарциномы легких Лыоис, позволяет использовать его в качестве возможного показателя развития аденокарциномы легких Льюис, в то время как содержание тканевого ингибитора матриксных металлопротеаз 2-го типа не является таким показателем.

Апробация работы

Материалы, изложенные в диссертации, представлены на V Региональной конференции молодых ученых им. академика Н.В.Васильева "Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии" (г. Томск, 23 апреля 2010 г.), на XXI съезде Физиологического общества им. И.ПЛавлова (г. Калуга, 19-25 сентября 2010 г.), на конференции "Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия" (г. Санкт-Петербург, 21-22 декабря 2010 г.), на VI Региональной конференции молодых ученых им. академика Н.В.Васильева "Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии" (г. Томск, 28 апреля 2011 г.), на 12th Bratislava Symposium on Saccharides (г. Братислава, 19-23 июня 2011 г.).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ (из них - 2 статьи в центральной печати). Статья "Тканевые ингибиторы матриксных металлопротеаз 1-го и 2-го типов и активность матриксных металлопротеаз в сыворотке крови и легких мышей с аденокар-циномой легких Льюис" принята в печать в Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.

Объем и структура диссертации

Материал диссертации изложен на 142 страницах машинописного текста, содержит разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследования, обсуждение, выводы, список литературы. Диссертация содержит 4 таблицы и 27 рисунков. Список цитируемой литературы включает 273 источника, в том числе 20 отечественных и 253 зарубежных авторов.

Материалы и методы исследования

Эксперименты проведены на половозрелых мышах самцах линии С57В1/6.1, массой 23-27 г (виварий НИИ физиологии СО РАМН, виварий ИЦиГ СО РАН, г. Новосибирск). В качестве экспериментальных опухолей использовали неметастазирующую опухоль Кребс-2 [А1уатк1па е1 а1., 2009] и аденокарциному легких Льюис, которая метастазирует в легкие [Золотарева и соавт., 1989]. Криоконсервиро-ванную взвесь опухолевых клеток Кребс-2 и АЛЛ, размораживали и перевивали внутримышечно самцам мышей линии С57В1/6Д (около 100-200 тыс. клеток на мышь для Кребс-2 и около 1 х 106 клеток на мышь для АЛЛ). Забой животных осуществляли декапнтацией на 7-е (начало развития метастазов при АЛЛ), 15-е (прогрессирование опухолевого процесса) и 20-е сутки (максимальное развитие опухоли и метастазов) после трансплантации опухоли.

Для оценки влияния противоопухолевого лечения на активность1 ММП при АЛЛ в работе использовали цитостатический препарат циклофосфан(100 мг/кг), а также иммуномодулятор - карбоксимети-лированный р-(1-3)-0-гликан (КМГ, 25 мг/кг). В эксперименте изучали изменения активности ММП при изолированном и комбинированном введении ЦФ и КМГ. Введение препаратов всем животным производилось внутрибрюшинно на 11-е сутки развития АЛЛ. Контрольным животным (без лечения) вводили соответствующий объем физиологического раствора. ЦФ и КМГ растворяли в физиологическом растворе и вводили внутрибрюшинно в объеме 1 мл на 100 г массы мышей. Забой животных осуществляли на 14-е сутки после трансплантации опухоли.

Морфологическое исследование органов (легкие, селезёнка, печень) мышей для определения отсутствия или наличия метастазов в

органах выполнено на базе Государственного областного онкологического диспансера совместно с к.м.н. Исаковой Н.Б.

Активность ММП определяли флюориметрическим методом (Knight et al., 1992), используя субстрат MCA-Pro-Leu-Gly~Leu-Dpa-Ala-Arg-NH2 (APC Inc., США) на спектрофлюорофотометре "RF-5301 PC" (Shimadzu, Япония) в гомогенатах опухоли, легких, селезёнки, печени и в сыворотке крови. Влияние сериновых протеаз исключали добавлением их специфического ингибитора ФМСФ, 0,5 ммоль/л (Boehringer Mannhein, Германия).

Для активации проММП использовали специфический активатор ММП - АФМА, 1 ммоль/л. Условную активность проММП в образце рассчитывали по разнице общей активности ММП (с АФМА) и активной ММП (без АФМА).

В отдельном эксперименте использовали специфический ингибитор ММП - маримастат ВВ2516 (Tocris Bioscience, Англия). Показано, что при добавлении маримастата в конечной концентрации 24,5 мкмоль/л в инкубационную смесь, наблюдалось снижение скорости гидролиза используемого субстрата (на 90%). Это свидетельствует о том, что в расщеплении данного флюоресцентного субстрата участвуют ММП.

Концентрацию ТИМП-1 и ТИМП-2 в сыворотке крови и легких определяли с помощью коммерческих наборов ИФА для мышей (Ray Biotech, Mouse TIMP-1 ELISA kit, Mouse TIMP-2 ELISA kit, США).

Статистический анализ полученных данных выполняли с помощью пакета Statistiea 10.0. Форму распределения оценивали критерием Колмогорова-Смирнова, значимость различий средних - однофак-торным дисперсионным анализом (ANOVA) с post-hoc сравнением. При ненормальном распределении данных использовали непараметрический однофакторный дисперсионный анализ с post-hoc сравнением. Уровень значимости а принимали равным 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Характеристика роста экспериментальных опухолей у мышей

Вес опухоли (как при Кребс-2, так и при АЛЛ) увеличивался с момента перевивки до пальпируемого образования в течение 11-12 суток, объем опухоли увеличивался по мере развития солидного узла и к терминальной стадии (на 20-е сутки) составлял около 3,06±0,05 см3. На 20-е сутки опухолевого процесса вес опухоли был выше на 72-78% по сравнению с 15-ми сутками развития опухоли. В процессе развития как метастазирующей, так и неметастазиругощей опухолей отмечено значимое увеличение относительной массы селезёнки в 3 раза).

При морфологическом исследовании легких, селезёнки и печени мышей С57В1/61 с опухолью Кребс-2 метастазы не обнаружены, тогда как при АЛЛ выявлены метастазы в легких, что подтверждает данные литературы [Золотарева и соавт., 1989; СЫшку еХ а1., 2005]

Активность ММП в ткани опухоли мышей С57В1№ в динамике развития экспериментальных опухолей

В данной работе мы исследовали изменения активности ММП в опухолевой ткани в сравнении со здоровой гистологически неизмененной окружающей тканью (мышечная ткань бедра). Здоровая ткань имела ничтожно низкую активность ММП, причем после инкубации образцов ткани с АФМА (специфический активатор ММП) не наблюдалось увеличения активности ММП в образцах, что свидетельствовало об отсутствии проММП в исследованной здоровой ткани.

Рост опухолевого узла (при Кребс-2 и АЛЛ) характеризовался значительным увеличением активности активных форм ММП и появлением проММП в опухолевой ткани в отличие от здоровой ткани.

В динамике развития неметастазирующей опухоли Кребс-2 увеличивались проММП, а активность активных форм ММП снижалась (рис. 1а). Развитие метастазирующей опухоли АЛЛ характеризовалось увеличением проММП, активность активных форм не изменялась (рис. 16). Выявлена положительная корреляционная связь между весом опухоли и проММП в ткани опухоли мышей с АЛЛ (г=0,68, р<0,05).

Появление проММП в опухолевой ткани, вероятно, является результатом увеличенной экспрессии и секреции проММП опухолевыми и стромальными клетками. Известно, что развитие опухоли характеризуется пролиферацией опухолевых клеток и увеличением их количества, а также активацией фибробластов и иммунных клеток, которые способны продуцировать ММП [Zucker and Cao, 2010]. Повышение экспрессии ММП в опухолевой ткани показано при развитии различных типов опухолей у человека по сравнению со здоровыми донорами [Zucker et ah, 2004; Клишо и соавт., 2005; Щербаков и соавт., 2007; Asano et al., 2008], а также у животных при экспериментальных опухолях [Osinsky et al., 2005; Acuff et al., 2006].

а) Кребс-2 б) Аденокарцинома легких Льюис

I I Активные формы МММ ÜS проММП I 1 Активные формы МАШ |Ц ироММП

Рис. 1 Активные формы и проММП в ткани опухоли мышей C57B1/6J с Кребс-2 и АЛЛ, М±т

Примечание: Статистическая значимость различий с активностью ММП на 15-е сут развития опухоли обозначена: ** - р<0,01, *** -р<0,001. Количество животных в каждой группе равно 10-12.

Активность ММП в ткани легких мышей C57BI/6J в динамике развития экспериментальных опухолей

В легких мышей с неметастазирующей опухолью Кребс-2 общая активность ММП (проММП + активные формы ММП) не отличалась от соответствующих показателей ММП в легких интактных животных и не имела изменений ММП в динамике развития данной опухоли (рис. 2а).

В легких мышей с метастазирующей опухолью АЛЛ общая активность ММП (проММП + активные формы ММП) выше по сравне-

нию с интактными легкими. В динамике развития АЛЛ на всех исследованных сроках наблюдалось увеличение общей активности ММП в легких, при этом происходило увеличение активности ММП (активные формы) и снижение проММП (рис.2б).

Мы полагаем, что увеличение активности ММП в ткани легких мышей в динамике развития АЛЛ обусловлено развитием метастазов в легких. Ранее в работах нашей лаборатории было показано, что развитие АЛЛ характеризуется увеличением количества метастазов в легких, начиная с 8-х суток и достигая максимума на 20-е сутки развития опухолевого процесса [Фаламеева и соавт., 2001]. Роль ММП в развитии метастазов показана во многих экспериментах in vivo и in vitro [Chambers and Matrisian, 1997; Bergers et al., 2000; Diaz et al., 2005; Kaplan et al., 2005; Zucker and Cao, 2010; Gialleii et al., 2011]. Например, Osinsky et al. показали, что развитие опухоли АЛЛ у мышей C57B1/6J коррелирует с количеством метастазов в легких и активностью ММП-2 и ММП-9 в ткани опухоли [Osinsky et al, 2005].

Рис. 2 Активные формы и проММП в легких мышей C57B1/6J с Кребс-2 и АЛЛ, М±т

Примечание: Статистическая значимость различий с активностью ММП в легких иитактных мышей обозначена: * - р<0,05. Количество животных в каждой группе равно 10-12.

Активность ММП в селезёнке мышей C57BI/6J в динамике развития экспериментальных опухолей

При обеих экспериментальных опухолях (неметастазирующей опухоли Кребс-2 и метастазирующей в легкие АЛЛ) общая активность ММП выше по сравнению с интактными животными.

а) Кребс-2 0,18:.

Интактные 7 сут 15 сут 20 сут ■ Акшвкые формы ММП - проММП

б) Аденокарцинома легких Льюис

15 сут 20 сут

' проММП

ä Ц 0,09 •fc is £ 0,0

* 0,03

0,00-

Интактные 7 сут

\KÏïtini.M,'- формы ММП

В динамике развития опухоли Кребс-2 общая активность ММП в селезёнке увеличивалась, при этом наблюдалось увеличение активности ММП (активные формы) на 7-е, 15-е и 20-е сутки после трансплантации опухоли. Выявлена положительная корреляционная связь между активными формами ММП в селезёнке и весом опухоли (г=0,75, р<0,05). Активность проММП повышалась на 7-е сутки и далее не изменялись (рис. За).

В динамике развития АЛЛ активность ММП (активные формы) увеличивалась при прогрессировании опухоли, на 20-е сутки была выше, чем у интактных мышей, но не отличалась от активности ММП на 15-е сутки. Увеличение проММП отмечено на 20-е сутки опухолевого процесса (рис.Зб). Выявлена положительная корреляционная связь между весом селезёнки и активными ММП (г=0,55, р<0,05) и проММП (г=0,47, р<0,05).

а) Кребс-2

0,00-

Интактные 7 сут Активные формы ММП

б) Аденокарцинома легких Лыоис

15 сут 20 сут

-— проММП

0,08 0,06 0,04 0,02

0,00------

Интактные 7 сут

Активные формы ММП

15 сут 20 сут - = - проММП

Рис. 3. Активные формы и проММП в селезёнке мышей C57B1/6J в динамике развития опухоли Кребс-2 и АЛЛ, М±т. Примечание: Статистическая значимость различий с показателями интактных мышей обозначена: * - р<0,05, ** - р<0,01. Количество животных в каждой группе равно 10-12.

йопасНо et а1. изучали экспрессию и активность ММП-2 и М.МП-9 в ткани опухоли и селезёнке крыс со спонтанно метастазируюшеч опухолью. Выявлено, что уровень ММП-9 повышен в селезёнке крыс-опухоленосителей в сравнении с контрольными животными. ПроММП-9 выше по сравнению с проММП-2 в селезёнке крыс с ме-

тастазами [Donadío et al., 2008]. В селезёнке содержится большое количество антигенпрезентирующих клеток (макрофаги, дендритные клетки, В-клетки) и уровень их функциональной активности достаточно высок, особенно при развитии патологических процессов. ММП секретируются различными клетками, включая макрофаги, фибробласты, нейтрофилы, эндотелиалыше клетки и др. Васильев и соавт. показали, что при трансплантации клеток АЛЛ мышам C57BI/6J на 3-й сут развития опухоли отмечен пик естественной активности клеток селезёнки и костного мозга [Васильев и соавт., 2005]. Вероятно, повышение активности ММП в селезёнке мышей с экспериментальными опухолями обусловлено повышенной секрецией ММП антигенпрезентирующими клетками, локализованными в селезёнке.

Активность ММП в печени мышей C57BI/6J в динамике развития экспериментальных опухолей

В печени и сыворотке крови мышей определяли только активные формы ММП (без учета проММП). Определение проММП было невозможно, т.к. при добавлении АФМА в инкубационную смесь в пробирке наблюдали появление преципитатов. В литературе отсутствуют данные об определении проММП в сыворотке крови и печени флюориметрическим методом. Однако определение проММП в сыворотке крови и печени возможно при использовании других методов исследования ММП, например, желатиновой зимографии или ИФА [Descamps et al., 2002].

В динамике развития как неметастазирующей опухоли Кребс-2, так и метастазирующей опухоли АЛЛ в печени без метастазов у мышей не наблюдалось изменений активности ММП на всех исследованных сроках (7-е, 15-е и 20-е сутки развития опухолей).

Активность ММП в сыворотке крови мышей C57BI/6J в динамике развития экспериментальных опухолей

В сыворотке крови, как и в печени, определяли лишь активные формы ММП (без учета проММП). Развитие Кребс-2 и АЛЛ характеризовалось повышением активности ММП (активные формы) в сыворотке крови мышей на 7-е сутки после перевивки опухолевых клеток, на 15-е сутки активность ММП снижалась. Далее развитие неметастазирующей опухоли характеризовалось снижением активности ММП

ниже показателей интактных животных, а метастазирующей опухоли увеличением активности ММП в сравнении с предыдущим сроком (с 15-ми сутками).

Увеличение активности ММП в сыворотке крови на 7-е сутки развития опухолевого процесса по сравнению с интактными животными согласуется с результатами работ, посвященных изучению изменений ММП в сыворотке крови при различных опухолях. Так, показано повышение ММП-9 в сыворотке крови при раке желудка [Ъикюгетсг^щяс с1 а!., 2011] и поджелудочной железы [Мгосгко е1 а1., 2009], а также увеличение ММП-2 при раке предстательной железы (при развитии опухоли по сравнению со здоровыми донорами) [СоИ^ а а1., 1998]. В терминальной стадии развития Кребс-2 выявлена положительная корреляционная связь между активностью активных форм ММП в ткани опухоли (|) и сыворотке крови (|) мышей с Кребс-2 (г-0,7, р<0,05). Многочисленные работы показали, что при развитии рака происходит повышение концентрации ТИМП в сыворотке крови [Ыи'(к е[ а1., 2003; Мгосгко е1 а1., 2010; 2а»оип е1 а1., 2011]. Исходя из этого, можно предположить, что на 20-е сут опухолевого процесса, ТИМП связываются с активными формами ММП как в сыворотке крови, так и в ткани опухоли.

Активность ММП в опухолевой ткани мышей С57В1/6,/ при лечении аденокарциномы легких Льюис

Нами показано, что в ткани опухоли АЛЛ происходит снижение активности активных форм ММП и проММП при изолированном однократном введении ЦФ (100 мг/кг). При этом отмечено торможение роста опухоли на 21% по сравнению с контрольной группой. Это подтверждает вовлечение ММП в развитие опухолевого процесса.

Изолированное введение КМГ (25 мг/кг) на 11-е сутки развития опухоли сопровождается увеличением активности как активных форм ММП, так и проММП в ткани опухоли (рис. 4 а, б). При этом не отмечено значимого торможения роста опухоли (6%). Эти изменения могут быть обусловлены активацией КМГ опухоль-ассоциированных макрофагов (М2), которые продуцируют ММП [Ьата§па е1 а1., 2006].

Добавление в схему лечения цитостатиком КМГ приводило к торможению роста опухоли на 52%, активность ММП в ткани опухоли при этом не изменялась (рис. 4 а, б). Эти результаты согласуются с данными других авторов. Так, ранее показано, что добавление КМГ

(25 мг/кг) в схему лечения ЦФ (100мг/кг) мышей с АЛЛ приводит к усиленшо противоопухолевого и аитиметастатического эффекта [Фа-ламеева и соавт., 2001].

а) Активные формы ММП

3 0,12 d о.1о = 0,08

1 0,06

2 ; ^ 0.04!

i

2 0,02!

0,(

Без лечения ЦФ

КНГ ЦФ + I

б) проММП

г °'12 I 0,10

= 0,08

I 0,06 <

I 0,04 | 0,02 Ё

0,00

Без печения ЦФ

ШГ ЦФ + КМГ

Рис.4. Изменение активности активных форм ММП (а) и проММП (б) в такни опухоли мышей C57B1/6J с АЛЛ при лечении, М±ш. Примечание: а, б) Статистическая значимость различий с данными группы мышей без лечения обозначена: - р<0,01. Количество животных в каждой группе равно 11.

Активность ММП в легких мышей C57BI/6J при лечении адено-карциномы легких Льюис

Однократное изолированное введение ЦФ (100 мг/кг), как и комбинированное лечение ЦФ (100 мг/кг) и КМГ (25 мг/кг) приводило к снижению активности активных форм ММП и проММП в легких с метастазами (рис. 5 а, б). Изолированное введение КМГ (25 мг/кг) снижало активность активных форм ММП и не оказывало влияния на проММП в легких мышей с АЛЛ (рис.5 а, б). Эти результаты подтверждают участие ММП в формировании и прогрессировании метастазов, развитие которых сопровождается увеличением активной формы ММП в легких мышей с АЛЛ. Этот факт также подтверждает эксперимент Фаламеевой и соавт., проведенный на мышах с АЛЛ, где изолированное введение КМГ (25 мг/кг) не влияло на рост опухоли, но снижало количество метастазов в легких мышей с АЛЛ [Фаламее-ва и соавт., 2001].

а) Активные формы ММП

Я 'Л 1 ?! 0,18 0,15

5 0,12

J S£ 0,09

л 0,06

3 0.03

* 0,00

Без лечения ЦФ

"Зп

КМГ ЦФ + кмг

б)проММП

Я 0,08

'л

S т

а °'06

I 0,04

Без лечения ЦФ

Aft

ШГ ЦФ + кмг

|Ш

? -X;

5 s

й 0,02

3 г •i

* nnn

йд

\г. 1

Рис. 5. Изменение активности активных форм ММП (а) и проММП (б) в легких мышей C57B1/6J с АЛЛ при лечении, М±ш. Примечание: а, б) Статистическая значимость различий с данными группы мышей без лечения обозначена: - р<0,01. Количество животных в каждой группе равно 11.

Концентрация ТИМП-1 и ТИМП-2 в легких мышей C57BI/6J в динамике развития АЛЛ

Выявлено, что в легких при развитии метастазов изменения ТИМП-1 и ТИМП-2 имеют разнонаправленный характер. Концентрация ТИМП-1 в ткани легких ниже у мышей с АЛЛ (на 7-е сутки) по сравнению с легкими интактных животных (рис. 6а). Garcia et al. показали, что при раке молочной железы происходит увеличение экспрессии ТИМП-1 и ТИМП-3 в центральной части опухоли по сравнению с инвазивным фронтом опухоли или с лимфатическими узлами с метастазами [Garcia et al., 2010]. Hewitt et al. продемонстрировали повышение ТИМП-1 в опухолевой ткани по сравнению со здоровой тканью при опухолях кишечника [Hewitt et al., 2000]. Содержание ТИМП-2 в ткани легких выше на 7-е и 20-е сутки развития опухоле вого процесса по сравнению с интактными мышами (рис 66). Роль ТИМП-2 при опухолях связывают с усилением ангиогенеза и ингиби-рованием инвазии опухолевых клеток.

а) ТИМП-

4 FÜ

б) ТИМП-2

я з;

'X

S I i2

1

-Т- 50

40

»

I30

1 20

10

0

7суг

20сут

Рис. 6. Концентрация ТИМП-1 и ТИМП-2 в легких мышей C57B1/6J в динамике развития АЛЛ, М±т.

Примечание: а, б) Статистическая значимость различий с данными группы интактных мышей обозначена: * - р<0,05. Количество животных в каждой группе равно 11-12.

Считается, что ТИМП, ингибируя активность ММП, могут снижать опухолевый рост и метастазирование. Однако в ряде исследований демонстрируется парадоксальная роль ингибиторов в прогрессии опухоли [Jiang et al., 2002; Pavlaki and Zucker, 2003].

Концентрация ТИМП-1 и ТИМП-2 в сыворотке крови мышей C57BI/6J в динамике развития АЛЛ

Содержание ТИМП-1 в сыворотке крови мышей с опухолью выше по сравнению с ТИМП-1 у интактных животных (рис. 7а). Очевидно, на представленной модели АЛЛ увеличение уровня ТИМП-1 в сыворотке крови связано с ростом опухоли и воздействием различных факторов роста. Показано, что у пациентов с раком желудка, имеющих метастазы в отдаленные органы повышен уровень ТИМП-1 в сыворотке крови [Mroczko et al., 2009; Lukaszewicz-Zajac et al., 2011]. Изменения концентрации ТИМП-2 в сыворотке крови отличаются от выявленных выше нарушений ТИМП-1 (рис. 76). Концентрация ТИМП-2 в сыворотке крови увеличивается на поздней стадии развития опухолевого процесса (на 20-е сутки) по сравнению с сывороткой крови интактных животных и мышей с АЛЛ на более ранних сроках (на 7-е и 15-е сутки) (рис. 76).

Рис. 7. Концентрация ТИМП-1 и ТИМП-2 в сыворотке крови мышей в динамике развития АЛЛ, М±т.

Примечание: а, б) Статистическая значимость различий с данными группы интактных мышей обозначена: * - р<0,05. Количество животных в каждой группе равно 11-12.

Выводы

1. Неметасгазирутощая (Кребс-2) и метастазирующая (АЛЛ) опухоли характеризуются появлением проММП и увеличением активных форм ММП в ткани опухоли по сравнению с прилежащей мышечной тканыо и в динамике развития обеих опухолей, что свидетельствует об усиленной продукции ММП в опухолевой ткани.

2. Развитие и рост метастазов в легких при АЛЛ характеризуются увеличением активных форм ММ П в ткани легких. В легких и печени без метастазов у мышей при экспериментальных опухолях не наблюдается изменений активности ММП. Эти данные указывают о вовлечении активных форм ММП в формирование и развитие метастазов в легких.

3. Снижение активности ММП (активных форм и проММП) в ткани опухоли и легких после введения циклофосфана (100 мг/кг), оказывающего выраженный противоопухолевый и антиметастатический эффект, подтверждает вовлечение ММП в развитие опухолевого процесса и метастазов. Введение иммуномодулятора (КМГ, 25 мг/кг) имеет разнонаправленное действие на активность ММП в ткани опухоли и легких мышей с АЛЛ.

4. Увеличение концентрации ТИМП-1 в сыворотке крови мышей с АЛЛ свидетельствует о возможном использовании данного показате-

ля в качестве маркера раннего развития АЛЛ. Уровень ТИМП-2 в сыворотке крови повышен лишь в терминальной стадии развития АЛЛ и не является маркером развития опухоли.

Список работ, опубликованных но теме диссертации

1. Кисарова Я.А., Короленко Т.А. Роль изменений активности ММП при опухолевом росте и метастазировании аденокарциномы легких Льюис // V Региональная конференция молодых ученых-онкологов, посвященная памяти академика РАМН Н.В. Васильева "Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии" // Сибирский онкологический журнал. Приложение № 1. - Томск. -2010. -С.57-58.

2. Кисарова Я.А., Короленко Т.А. Активность матриксных метал-лопротеаз в ткани легких интактных животных и при метастазировании аденокарциномы Льюис у мышей // Тезисы докл. XX съезда физиолог. об-ва им. И. П. Павлова. - Калуга. - 2010. - С. 271-272.

3. Кисарова Я.А., Короленко Т.А. Матриксные металлопротеиназы в динамике развития и метаетазирования аденокарциномы легких Льюис // Медицинский академический журнал. - 2010. Т. 10. №5. -С.16-17.

4. Кисарова Я.А. Активность матриксных металлонротеаз у мышей при развитии и метастазировании аденокарциномы легких Льюис // Бюл. СО РАМН. - 2010. - Т. 30, №4. - С. 154-157.

5. Кисарова Я.А., Короленко Т.А. Матриксные металлопротеазы и их тканевые ингибиторы при опухолевом росте и метастазировании аденокарциномы легких Льюис // VI Региональная конференция молодых ученых-онкологов, посвященная памяти академика РАМН Н.В. Васильева "Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии". Сибирский онкологический журнал, приложение № 1. Томск.-2011.-С.60-61.

6. Kisarova Ya.A., Korolenko Т.А. MMPs as a possible target for im-munomodulating effect of p-(l,3)-glucan in tumors // 12th Bratislava Symposium on Saccharides. - Bratislava. - 2011. - P.51.

7. Кисарова Я.А. Соотношение проформ и активных форм ММП-2, -7 в ткани опухоли и легких с метастазами в динамике развития аденокарционмы легких Льюис // Бюл. СО РАМН. - 2011. - Т. 31, №2. -С. 138-141.

8. Korolenko T.A., Kisarova Ya.A., Filjushina E.E., Dergunova M.A. and Machova E. Macrophage Stimulation and p-D-Glucans as Biological Response Modifiers: the Role in Experimental Tumor Development // Handbook of Macrophages: Life cycle, Functions and Diseases. 2012. In press.

9. Кисарова Я.А., Короленко T.A. Тканевые ингибиторы матрикс-ных металлопротеаз // Принята в печать в Бюл. эксперим. биол и мед.

АЛЛ - аденокарцинома легких Льюис

АФМА - аминофенилмеркурий ацетат

В КМ - внеклеточный матрикс

ИФА - иммуноферментный анализ

КМГ - карбоксиметилированный р-(1—>3)- гликан

МКА - метилкумариламид

ММП - матриксные металлопротеазы

ТИМП - тканевые ингибиторы матриксных металлопротеаз

ФМСФ - фенилметилсульфонилфторид

ЦФ - циклофосфан

Список сокращений

Соискатель

Кисарова Я.А.

Подписано в печать 02.03.2012. Бумага "SvetoCopy". Ризография. Формат 60x84/16. Тираж 100 экз. Зак. 104. Отпечатано в Срочная полиграфия ИП Малыгин A.M. 630090. Новосибирск, Лаврентьева 6/1