Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль ингибирования матриксной металлопротеиназы-9 в реализации противоопухолевого эффекта в клетках меланомы кожи

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Роль ингибирования матриксной металлопротеиназы-9 в реализации противоопухолевого эффекта в клетках меланомы кожи"

На правах рукописи

005013077 АКСЕНЕНКО

Мария Борисовна

РОЛЬ ИНГИБИРОВАНИЯ МАТРИКСНОЙ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗЫ-9 В РЕАЛИЗАЦИИ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ЭФФЕКТА В КЛЕТКАХ МЕЛАНОМЫ

КОЖИ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология 14.03.02 - патологическая анатомия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 2 ид? Ш

Новосибирск- 2012

005013077

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации »

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Рукша Татьяна Геннадьевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

ФГБУ Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН, руководитель группы свободнорадикальных процессов, ведущий научный сотрудник Меньшикова Елена Брониславовна

доктор медицинских наук, профессор,

ГБОУ ВПО НГМУ Мйнздравсоцразвития России, кафедра патологической анатомии, профессор Агеева Татьяна Августовна

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (Новосибирск)

Защита состоится «10» апреля 2012 г. в_13 часов на заседании диссертационного совета Д 001.048.01 при Научном центре клинической и экспериментальной медицины СО РАМН по адресу: ул. Тимакова, 2, г. Новосибирск, 630117 Тел/факс: 8(383) 333-64-56

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НЦКЭМ СО РАМН

Автореферат разослан «

Учёный секретарь диссертационного совета д.б.н.

'¡¡й^Л^- Пальчикова Н.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Меланома кожи является новообразованием, развивающимся в результате злокачественной трансформации меланоцитов и меланобластов (Goodson A.G. et al., 2009). Несмотря на то, что меланома относится к числу визуально диагностируемых опухолей, количество случаев позднего обращения за медицинской помощью остаётся по-прежнему высоким.

По гистогенезу, биологическим особенностям возникновения и роста, тяжести клинического течения, иногда непредсказуемому исходу опухолевого процесса меланома существенно отличается от новообразований другого генеза (Гилязутдинов И.А. и др., 2010). В связи с чем в последние годы неуклонно растёт интерес исследователей к изучению данного заболевания.

Исследования последних лет в области эпидемиологии меланомы кожи установили чёткий рост заболеваемости меланомой в разных странах мира, в том числе и в России, что делает чрезвычайно актуальной проблему повышения эффективности её лечения (Закурдяева И.Г. и др., 2010). Ранняя диагностика и своевременное удаление первичной меланомы кожи являются основными составляющими успешной терапии данного заболевания. Подавляющее большинство больных меланомой кожи - это взрослые люди, в основном трудоспособного возраста, что делает эту проблему социально значимой (Garbe С. et al., 2011). Более чем у половины больных меланома кожи развивается на фоне приобретенных или, реже, врожденных невусов (Menzies S.W., 2011).

Для этой злокачественной опухоли, независимо от степени местной распространенности, характерно частое развитие отдаленных метастазов (Канлан М.А. и др., 2011). Несмотря на применение различных видов комбинированного лечения метастатической меланомы: монохимиотерапии, полихимиотерапии, иммунотерапии, иммунохимиотерапии, результаты остаются неутешительными. Причиной тому является слабая чувствительность опухоли к химиотерапевтическим препаратам, многообразие путей метастазирования и стремительная скорость диссеминации (Kee D. et al., 2011).

Вышеуказанное подтверждает необходимость дальнейшего изучения механизмов развития, инвазии и метастазирования меланомы кожи. Известно, что важную роль в развитии злокачественных опухолей играют протеолитические ферменты, которые могут наделять опухолевые клетки способностью к инвазии и метастазированию (Keller U.et al., 2007). Большое значение в реализации данных функций отводится семейству матриксных металлопротеиназ (ММП). Основной функциональной ролью матриксных металлопротеиназ является деградация внеклеточного матрикса. Кроме того, ММП регулируют функции биологически активных молекул, таких как факторы роста, молекулы клеточной адгезии (Linch С.С., 2002). Благодаря

всем этим характеристикам ММП реализуются такие свойства опухолевых клеток как инвазивный рост, метастазирование. Увеличенная продукция ММП клетками стромальной популяции способствует опухолевой инвазии и ангиогенезу (Кондакова И.В. и др., 2011).

В этой связи является актуальным дальнейшее уточнение роли ММП в патогенезе злокачественных новообразований кожи и в частности меланомы кожи.

Цель исследования - изучить роль матриксной металлопротеиназы-9 в реализации и регуляции процессов пролиферации и апоптоза клеток меланомы и эффекты её ингибирования для достижения противоопухолевого эффекта.

Задачи исследования:

1. Определить содержание матриксной металлопротеиназы-9 в клетках меланомы, в невусных клетках, а также в клетках метастазов меланомы кожи у больных с меланоцитарными новообразованиями кожи;

2. Определить взаимосвязь между экспрессией матриксной металлопротеиназы-9 в клетках меланомы и невусов и содержанием дермального коллагена в данных новообразованиях, выявляемых методом прижизненного интрадермального анализа;

3. Оценить эффект ингибирования матриксной металлопротеиназы-9 на регуляцию пролиферации и апоптоза клеток меланомы и экспрессию в них N-кадгерина, индуцированного трансфекцией малых интерферирующих РНК к матриксной металлопрогеиназе -9;

4. Оценить причастность ингибирования матриксной металлопротеиназы-9 к реализации противоопухолевой активности клеток меланомы кожи in vivo;

5. Методом морфометрии изучить количество и структурную организацию сосудов, характер и размеры зон некроза в первичной опухоли, а также количество и характер метастазов опухоли на модели меланомы кожи in vivo, в условиях ингибирования матриксной металлопротеиназы-9.

Научная новизна.

1. Впервые в условиях in vitro установлено, что трансфекция малых интерферирующих РНК к матриксной металлопротеиназе-9 в клетки меланомы кожи снижает экспрессию в них ядерного антигена пролиферирующих клеток и N-кадгерина, не оказывая воздействия на выраженность апоптоза.

2. Обнаружен факт экспрессии лимфоцитами матриксной металлопротеиназы-9 в метастазах меланомы кожи, что может быть связано с усилением продукции клетками меланомы кожи индукторов синтеза матриксной металлопротеиназы-9, действующих паракринным путём.

3. Установлено, что при селективном ингибировании матриксной металлопротеиназы-9 на биомодели меланомы кожи происходит снижение экспрессии ядерного антигена пролиферирующих клеток и количества сосудов в опухоли, уменьшение процесса изъязвления первичной опухоли,

увеличение продолжительности жизни животных, снижение количества метастазов в печень и селезёнку.

4. Установлена отрицательная корреляционная связь между экспрессией матриксной металлопротеиназы-9 и содержанием дермалыюго коллагена при меланоме кожи, что подтверждает факт участия матриксной металлопротеиназы-9 в деградации внеклеточного матрикса и реализации инвазивных характеристик опухоли.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные о характере и выраженности изменений противоопухолевого эффекта в клетках меланомы кожи при ингибировании матриксной металлопротеиназы-9 могут быть использованы для уточнения патогенеза меланомы кожи, при разработке перспективных молекулярных мишеней для терапии данного заболевания.

Внедрение результатов исследования. Результаты работы внедрены в учебный процесс на кафедре патологической физиологии ГБОУ ВПО Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф.Войно-Ясенецкого. Технология блокирования ММП-9 в клетках меланомы кожи in vivo и in vitro внедрена в лаборатории биохимии опухолей НИИ Онкологии СО РАМН (г. Томск).

Апробацпя работы. Материалы исследований доложены и обсуждены на VI региональной конференции молодых учёных онкологов «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2011); на открытой межрегиональной научно-практической конференции молодых учёных и студентов «Молодежь и медицинская наука в XXI веке» (Киров, 2011); на всероссийской конференции «Актуальные вопросы онкологии» (Красноярск 2010); на 17 научно-практической конференции «Актуальные проблемы клинической онкологии и преканцерогенеза» (Якутск, 2010); на научно-практической конференции «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (Новосибирск, 2011); на заседании проблемной комиссии «Фундаментальная медицина» (Красноярск, 2011), на 36 Международном конгрессе «The 36 th Annual Meeting of the Japanese Society for Investigative Dermatology» (Киото, 201 \).)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ, из них 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикаций материалов диссертационных исследований.

Положения, выносимые на защиту:

1. С увеличением уровня инвазии по Кларку у больных с меланомой кожи увеличивается экспрессия матриксной металлопротеиназы-9 как в опухолевых клетках, так и в клетках окружающей стромы. Имеется отрицательная корреляция между экспрессией матриксной металлопротеиназы-9 и содержанием дермального коллагена при меланоме кожи (г=-0,87 р<0,05).

2. Особенностями биологического поведения клеток меланомы кожи в условиях ингибирования матриксной металлопротеиназы-9 является снижение их пролиферативной активности и способности к инвазивному

росту, опосредованной изменением уровня N-кадгерина и уменьшением неоаншогенеза.

3. При селективном ингибировании матриксной металлопротеиназы-9 на биомодели меланомы кожи достигается выраженный антиметастатический эффект, проявляющийся увеличением продолжительности жизни животных, снижением количества метастазов в печени и селезёнке, а также уменьшением их размеров. Происходит снижение пролиферативной активности клеток меланомы, а также уменьшение количества сосудов в опухоли.

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, главы собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы, включающего 191 работу, из них -11 отечественных и 180 зарубежных, работа иллюстрирована 5 таблицами и 33 рисунками.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проводились на кафедре патологической физиологии с курсом клинической патофизиологии Государственного бюджетного учреждения высшего профессионального образования «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В. Ф. Войно -Ясенецкого» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации. Проведение спектрофотометрического интрадермального анализа (СИАскопии) осуществлялось на базе ООО «Омекс» Институт Медицинской Косметологии (г. Красноярск). В работе с обследуемыми лицами соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинкской Декларацией Всемирной Медицинской Ассоциации (World Médical Association Déclaration of Helsinki 1964, 2000 ред.). При работе с экспериментальными животными соблюдались основные принципы, изложенные в «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных», (2007), а также в приказе МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 «Об утверждении правил лабораторной практики».

В исследовании приняли участие 198 человек с меланоцитарными новообразованиями кожи (МНК). Из них 93 мужчины и 105 женщин. Средний возраст обследуемых составил 52,16±4,02 у мужчин и 42,12±3,53 у женщин. Исследуемые пациенты были разделены на 8 групп: 1 группу составили пациенты с меланомой кожи с I-II уровнем инвазии по Кларку (п=18); 2 группу пациенты с меланомой кожи с III уровнем инвазии по Кларку (п=25); 3 группу пациенты с меланомой кожи с IV-V уровнем инвазии по Кларку (п=17); 4 группу пациенты с метастатической меланомой (п=14); 5 группу пациенты с пограничными меланоцитарными невусами (п=30); 6 группу пациенты со сложными невусами (п=29); 7 группу пациенты с интрадермальными невусами (п=47); 8 группу составили условно здоровые добровольцы с отсутствием кожных заболеваний в анамнезе (п=18).

Дальнейшие исследования были продолжены на 20 мышах самках линии С57В1/6 8-недельного возраста, массой 19,2±0,5г. Животные были получены из Научного центра биомедицинских технологий РАМН, филиал «Столбовая». Культура клеток меланомы В16 была получена в РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН (г. Москва). Животные содержались в соответствии с требованиями Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей (Страсбург, 1985), при температуре 18-22 С ° со свободным доступом к воде и пище. Для устранения влияния естественного освещения на опухолевый процесс (Анисимов В.Н., Жукова О.В. 1994; Bartsch С. et al., 2001) в виварии был обеспечен искусственный режим с 12-ти часовой сменой света и темноты. Животные были разделены на 2 группы: 1 группу составили контрольные животные с трансплантированной меланомой, не получавшие ингибитор ММП-9 (Matrix Metalloprotease- 9 Inhibitor I, Calbiochem), (n=10), 2 группу составили опытные животные с трансплантированной меланомой, которым на протяжении 7 дней вводили селективный ингибитор ММП-9 в концентрации 5пМ (п=10), в/м 1 раз в сутки.

Культура клеток меланомы SK-MEL-1 (American Type Cells Collection) была предоставлена ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды имени А.Н. Сысина РАМН. Клетки меланомы кожи культивировали в 12-луночных планшетах в среде RPMI 1640 с 10% содержанием фетального бычьего сывороточного альбумина с добавлением глутамина, пенициллина, стрептомицина и амфотерицина при 37°С в С02 инкубаторе (5% С02).

Дизайн настоящего исследования представлен на (рис.1).

Иммуногистохимическое исследование

Иммуногистохимическое выявление экспрессии ММП-9 проводили в срезах фиксированной в формалин и залитой в парафин ткани согласно стандартной методике. Использовались моноклональные антитела к ММП-9 (Abeam, разведение 1:100). Была использована система детекции Ready-to-Use («Novocastra»), Для визуализации продукта реакции применяли DAB («Novolink» Polymer Detection System, Novocastra ™) в качестве хромогена. В дальнейшем срезы докрашивали гематоксилином. Подсчёт положительно окрашенных клеток производили при ув.600 с помощью микроскопа «Olympus ВХ-41». Подсчёт результатов иммуногистохимического анализа проводили с использованием следующих критериев: оценивали количество положительно окрашенных клеток отдельно в опухолевых и в здоровых клетках эпидермиса и дермы при меланоме кожи, в случае с доброкачественными меланоцитарными невусами определялась экспрессия ММП-9 в невусных клетках. Выраженность экспрессии оценивали в баллах от 0 до 300 по шкале Н-счёта, используя следующую формулу: Н=ЗхА+2хВ+1хС, где А-доля сильно окрашенных клеток (в %), В-доля умеренно окрашенных клеток, С-доля слабо окрашенных клеток.

Пациенты с меланоц. новообр. кожи (п=198)

Сиаскопия (п=92)

Иммуногисто-химия(п=106)

ММП-9 в новообразован

11

Деструкция коллагена в новообразова ниях

Культура клеток меланомы 8К-Ме1-1

Контроль

Скрамбли-

рованные

РНК

24 часа

X/

Мыши линии С57В1/6 (п=20)

Меланома В16 (п=10)

\7

Меланома В16+ингибитор ММП-9 (п=10)

М-

1. Торможение роста опухоли

2.Увеличение продолжительности жизни

3. Экспрессия РСКА в тканях опухолевого узла

4. Количество и диаметр сосудов в опухоли

5. Некротизация опухолевого узла

6. Метастазирование

7. Токсическое воздействие ингибитора

1. Экспрессия РСЫА, ММП-9, Ы-кадгерина иммуноцитохимия

2. Выраженность апоптоза (акридиновый оранжевый/бромистый этидий).

Рис. 1 Дизайн исследования.

Прижизненный интрадермальный анализ

Оценка концентрации коллагена у пациентов с меланоцитарными новообразованиями кожи, производилась методом спектрофотометрического интрадермального анализа (СИАскопии) при помощи диагностического сканера для контактной сиаскопии SIAscope V в комплекте Mole View (Astron Clínica, Cambridge, UK). В результате проводилась оценка концентрации и однородности распределения дермального коллагена: области светлого цвета представляют собой участки с большей концентрацией коллагеновых волокон, участки тёмного цвета наоборот представляют собой зоны с меньшей концентрацией коллагеновых волокон. Таким образом, определялись зоны с высоким содержанием коллагеновых волокон (участки белого цвета), с незначительным содержанием коллагеновых волокон (участки тёмного цвета), с умеренным содержанием коллагеновых волокон (участки зеленого цвета). Последующий анализ полученных изображений основывался на определении площади зон определенного цвета, при помощи программы AutoCAD 2009 с последующим подсчётом % площади, который занимает каждая зона, по отношению ко всему новообразованию. В последующем определяли взаимосвязь между экспрессией ММП-9 в клетках меланомы и невусов и содержанием дермального коллагена в новообразованиях. Таким образом, средние показатели содержания дермального коллагена в каждой группе были умножены на коэффициент интенсивности: - выраженное содержание коллагена в новообразован™ X 0,3; -умеренное содержание коллагена в новообразовании X 0,2; -незначительное содержание коллагена в новообразовании X 0,1. После чего полученная сумма подвергалась сравнению с уровнем экспрессии ММП-9. Выраженность экспрессии ММП-9 была представлена в виде ИГХ-коэффициента.

Трансфекция в культуру клеток меланомы малых интерферирующих РНК (siRNA) к ММП-9

По достижении концентрации культуры клеток меланомы

концентрации 1.5 х 105 клеток мл-1 в клетки осуществлялась трансфекция малых интерферирующих РНК (siRNA) с помощью Lipofectamine 2000 (Invitrogen), siRNA были изготовлены в ООО «Синтол» в соответствии с последовательностями, указанными (Meyer Е. et.al, 2005). Также в отдельной серии экспериментов использовались скрамблированные последовательности РНК.

Иммуноцитохимическое исследование

Через 24 часа после трансфекции клетки подвергались центрифугированию в течение 10 минут со скоростью 1,5 тыс./об., промывались в холодном PBS. Цитологические мазки наносились на стекло и фиксировались в парах 10% формалина. Иммуноцитохимическое окрашивание производилось по стандартным протоколам, с использованием моноклональных антител к ММП-9 (Abeam, разведение 1:100), к ядерному антигену пролиферирующих клеток (proliferating cell nuclear antigen)-PCNA (разведение 1:200, Novocastra),

к N-кадгерину (разведение 1:400, Novocastra). Отрицательный контроль проводился без инкубации с первичными антителами для исключения неспецифического окрашивания клеток. Была использована система детекции Ready-to-Use («Novocastra»). Для визуализации продукта реакции применяли DAB («Novolink» Polymer Detection System, Novocastra ™) в качестве хромогена. Подсчёт положительно окрашенных клеток производился при увеличении х 600 с помощью микроскопа Olympus ВХ-41. Интенсивность окрашивания клеток оценивалась в баллах аналогично иммуногистохимическому окрашиванию. Результаты интерпретировались аналогично результатам иммуногистохимического исследования.

Оценка выраженности апоптоза

Через 24 часа после трансфекции клетки подвергались центрифугированию в течение 10 минут со скоростью 1,5 тыс./об., промывались в холодном PBS. Цитологические мазки наносились на стекло и фиксировались в парах 10% формалина. Оценивалась выраженность апоптоза с помощью окраски клеток акридиновым оранжевым/бромистым этидием (Rible D. et al., 2005). Определялся процент апоптотических клеток, с ядром, окрашенным (полностью или фрагментарно) в оранжевый цвет. Живые клетки имели нормальное зеленое ядро. Визуализация проводилась с помощью флуоресцентного микроскопа, подсчет проводился на 100 клеток.

Экспериментальное моделирование меланомы кожи и селективное иигибирование ММП-9

Перевивка опухоли животным производилась путём подкожного введения 0,5 мл взвеси опухолевой ткани в растворе Хенкса (1:10) по стандартным методикам. На 10 сутки после трансплантации опухоли животным опытной группы было начато введение селективного ингибитора ММР-9 I (Calbiochem) в концентрации 5нМ, внутримышечно, ежедневно, в течение 7 дней. Животные контрольной группы оставались без лечения. В данной работе был использован селективный ингибитор ММП-9 -Inhibitor ММР-9 I (Calbiochem Biochemicals, США). Молекулярная формула данного ингибитора C27H33N305S, в используемой концентрации он оказывает селективное ингибирование ММП-9.

Оценка динамики роста опухоли

В ходе эксперимента регистрировали число животных, у которых развилась опухоль. Линейные размеры опухоли измеряли в двух взаимно перпендикулярных направлениях. Объём опухоли рассчитывали по формуле: V = А(В)2 где А - больший, а В - меньший линейный размер узла. Торможение роста опухоли (ТРО, %) вычисляли по формуле: TPO=(Vo-Vk) / Vk х 100 %, где VK-средний объём опухоли в контрольной группе на определённый срок измерения (mm2);Vo - средний объём опухоли в опытной группе на определённый срок измерения (мм2). В качестве положительного эффекта учитывалось торможение роста опухоли более 50 %. Расчёт

увеличения продолжительности жизни производился по формуле: УПЖ = СПЖо-СПЖк / СПЖк х 100 %, где СПЖо и СПЖк это средняя продолжительность жизни животных опытной и контрольной групп. Эффект в отношении продолжительности жизни считался значимым при УПЖ >25%.

Определение нролнферативнон активности клеток опухоли in vivo

Оценка пролиферативной активности тканей опухолевого узла животных осуществлялась методом иммуногистохимнческого окрашивания с применением антител к PCNA (разведение 1:200, Novocastra) согласно протоколам описанным выше.

Оценка интенсивности нсоангногенсза

Для оценки выраженности неоангиогенеза в опухоли животных образцы опухолевой ткани фиксировали в 10 % нейтральном забуференном формалине. Срезы толщиной до 5 мкм подвергали окрашиванию по Ван-Гизону по стандартной методике. Визуализацию производили при помощи микроскопа «Olympus ВХ-41» при помощи программы «Infinity Capture», камера (Lumenera Corporation) с программным обеспечением V.4.6.O. Вначале был произведён подсчёт количества сосудов. Подсчеты проводили в 10 рандомизированных полях зрения при увеличении*400. Затем при помощи окуляр-микрометра производили расчёт среднего диаметра сосудов у животных опытной и контрольной групп, для чего осуществлялись измерения продольного размера исследуемых сосудов.

Оценка метастазнрования

При вскрытии все внутренние органы животных подвергались визуальному осмотру. Подсчёт количества метастазов в лёгких, печени, селезенке животных, проводился при помощи лампы-лупы. После чего препараты фиксировались в 10 % забуференном формалине, затем заключались в парафин. Далее с каждого органа была получена серия гистологических срезов толщиной 4-5 мкм, которые в последствии окрашивались гематоксилин-эозином. Микропрепараты оценивались под микроскопом Olympus ВХ 41. при ув. на 200-400-600 программа «Infinity Capture», камера (Lumenera Corporation) и software V.4.6.0. Подсчёт метастазов производился в основных органах метастазнрования: лёгких, печени, селезёнки. Определялось количество метастатических очагов на микропрепарате, при подсчёте парные органы рассматривались как единый органокомплекс и для них рассчитывалось среднее значение.

Оценка токсического эффекта ингибитора ММП-9 на организм

животных

Токсический эффект оценивался по изменению массы тела мышей, а также их внешнему виду (поведению, потреблению пищи и воды, виду шерстяного покрова, их двигательной активности). Изменение внешних признаков производилось ежедневно путем бальной оценки изменения

окраса шерсти и волосяного покрова. Изменение двигательной активности производилось путем бальной оценки, где учитывались: степень двигательной активности животных, тонус мышц, реакция на болевые и тактильные раздражители. Оценка изменений массы животных путём взвешивания животных проводилась каждые 3 суток.

Статистическая обработка материала. Результаты исследования были оценены с использованием методов статистического анализа. Результаты исследования проверялись на нормальность распределения с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. В случае нормального распределения был использован критерий Стьюдента, в случаях, где распределение полученных статистических показателей отличалось от нормального, сравнение двух независимых групп осуществляли непараметрическим методом при помощи ¿У-критерии Манна-Уитни. Для количественных признаков общее межгрупповое различие оценивалось при помощи критерия Крускала - Уоллиса. Для оценки качественных признаков применялся точный односторонний критерий Фишера. Для оценки факта наличия корреляционных связей их силы и направленности был использован коэффициент ранговой корреляции Пирсона. Данные в таблицах приведены в виде М±т, где М-среднее арифметическое, т-ошибка среднего. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Иммуногистохимическое исследование показало, что ММП-9" клетки определялись в эпидермисе и дерме у пациентов с меланомой кожи и меланоцитарными невусами. Во всех образцах при микроскопическом исследовании наблюдали цитоплазматическое окрашивание ММП-91 клеток (рис.2,3).

Рис. 2

Рис.3

Рис. 2. Экспрессия ММП-9 в клетках меланомы кожи: характерное цитоплазматическое окрашивание. Ув. х 400.

Рис. 3. Экспрессия ММП-9 при внутридермальном невусе. Ув х 400.

В опухолевых комплексах ММП-9 определялась диффузно, как в эпидермисе, так и в клетках дермы. Интересным является факт обнаружения в метастазах меланомы в лимфатических узлах ММП-9+ окрашенных лимфоцитов, в то время как в первичной опухоли и в коже больных с доброкачественными невусами таковых не определялось. Это может быть объяснено усиленной продукцией клетками меланомы индукторов синтеза ММП-9 действующих паракринным путём.

В проведённом исследовании было выявлено значимое увеличение экспрессии ММП-9 в опухолевых комплексах пациентов с меланомой кожи по мере прогрессирования уровня инвазии по Кларку, (р<0,05) наиболее высокие значения ИГХ коэффициентов отмечались в группе меланом с IV -V уровнем инвазии по Кларку, а также в группе метастазов меланомы кожи (табл.1).

Таблица 1

Экспрессия ММП-9 в коже больных меланоцитарными новообразованиями кожи (М±т)_

Патоморфологический диагноз новообразований Непораженная кожа, показатель ИГХ индекса Опухолевые комплексы, показатель ИГХ индекса

Меланома 1-11 уровень инвазии по Ктарку (п=16) 61±5,3** 117,6±10,2*,**

Меланома III уровень инвазии по Кларку (п=23) 66,6±5,5 177,2±12,3*,**

Меланома ІУ-У уровень инвазии по Кларку (п=17) 76,5±6,2** 259,7±15,2*,**

Метастазы меланомы в кожу и лимфатические узлы (п=14) 80±б,5** 267,7±15,5*,**

Пограничные невусы (п=15) 20±1,5** 24±2,5**

Интрадермальные и сложные невусы (п=15) 5±0,5** 15±3,2*,**

Здоровая кожа (п=18) 2±0,5

Примечание. Различия статистически значимы: *- р <0,05 при сравнении экспрессии в опухолевых комплексах и невусных очагах по сравнению с непоражённой кожей; ** - р <0,05 ** - при сравнении экспрессии между группами обследуемых с различными пагоморфологическими диагнозами.

Экспрессия ММП-9 в невусных клетках была выше, чем в здоровой коже (р<0,05) и в 3 раза ниже, чем в клетках меланомы кожи. Аналогичная тенденция отмечалась в непораженной коже у больных меланомой кожи и доброкачественными меланоцитарными новообразованиями: по мере прогрессирования опухоли повышается содержание в клетках фермента (р<0,05). Исключения составила группа пограничных невусов, в которой не было выявлено, статистически значимых различий (р>0,05). Кроме того, были выявлены значимые различия (р<0,05) между экспрессией ММП-9 в опухолевых клетках и клетками непораженной кожи с увеличением экспрессии в последних более чем в 2 раза.

Полученные изменения экспрессии ММП-9 при меланоме кожи могут быть связаны в первую очередь с увеличением способности клеток к деградации внеклеточного матрикса, необходимой для дальнейшего инвазивного роста и последующего метастазирования. Повышение содержания ММП-9 в невусах с пролиферативной активностью может являться подтверждением роли ММП-9 не только в регуляции инвазии опухоли, индукции неоангиогенеза, но также и в регуляции клеточной пролиферации, дифференцировки, апоптоза в коже посредством паракринных механизмов.

При оценке содержания дермального коллагена у пациентов с меланомой кожи было выявлено наличие участков деструкции коллагена по сравнению с доброкачественными МНК (р<0,05). У пациентов с невусами подобные изменения не определялись. Напротив, при доброкачественных МНК отмечалось увеличение содержания дермального коллагена, наряду с нормальным его содержанием.

При последующей оценке взаимосвязи между содержанием дермального коллагена и экспрессией ММП-9 была выявлена наиболее сильная обратная связь между экспрессией ММП-9 и содержанием дермального коллагена в новообразованиях в группе меланомы кожи (г=-0,87). В остальных группах наблюдалась средняя и слабая прямая корреляционная связь (в группе пограничных невусов (г=0,62) и в группе здоровой кожи (г=0,58).

Таким образом, с увеличением экспрессии ММП-9 уменьшается содержание дермального коллагена, что может быть связано с деструкцией коллагена в участках опухолевой инвазии (Moncrieff M.et al., 2002). Наличие деградации коллагена является необходимым звеном для дальнейшего инвазивного роста самой опухоли, а также прогрессии окружающих её сосудов и дальнейшей реализации функции неоангиогенеза.

При проведении эксперимента с использованием метода РНК-интерференции были получены следующие результаты (рис.4)

Выявленные изменения интенсивности окраски ММП-9+ клеток при добавлении интерферирующих и скрамблированных РЖ свидетельствуют о реализации эффектов интерферирующих РНК. Для оценки интенсивности клеточной пролиферации нами исследовался PCNA - ядерный антиген пролиферирующих клеток, являющийся кофактором ДНК полимеразы -5.

Уровень PCNA достоверно увеличивается во время S-фазы и коррелирует со степенью инкорпорации бромодезоксиуридина, что позволяет расценивать PCNA в качестве адекватного маркера клеточной пролиферации (Conolly К. М., et al., 1993, Dietrich D. R. et al., 1993). Ингибирование ММП-9 вызывало значимое снижение экспрессии PCNA. Возможным механизмом, приводящим к изменению уровня клеток меланомы при блокировании ММП-9, может быть угнетение (3-катенин сигнального механизма, а также нарушение адгезионных контактов между клетками. Ингибирование функциональной активности ММП-9 привело также к снижению уровня N-кадгерина. В частности, хорошо известно, что р-катенин и цитоплазматические домены N-кадгерина образуют комплексы, необходимые для осуществления N-кадгерином адгезионных контактов (Nakamura Т., et al, 2008.).

Рис. 4 Уровни ММП-9, PCNA, N-кадгерина в клетках меланомы кожи после инкубации с siRNA к ММП-9

* - различия статистически значимы по отношению к контролю (р < 0,05), (М±т). Результаты представлены в виде иммуноцитохимических коэффициентов.

Не смотря на то, что трансфекция к ММП-9 в клетки

индуцировала апоптоз при раке лёгкого (8а]аш Ь., е1 а1., 2006), а также в клеточной культуре кератиноцитов (Хие М., 2008) нами не было выявлено значимых различий при оценке выраженности апоптоза после проведения блокирования синтеза ММП-9 путём трансфекции малых интерферирующих РНК к ММП-9 в клетки меланомы кожи (рис.5). Известно, что клетки меланомы обладают низкой чувствительностью к апоптоз-индуцирующим стимулам.

Контроль siRNA Скрамблир.РНК

12

10 |

I

8 6 4

2

0 '•.....ш

Контр«

5 ¡ИМ А Скрамб.РНК

□ % (+) клеток

Рис. 5 Процент апоптоз положительных клеток при ингибировании ММП-9.

При проведении экспериментального моделирования меланомы кожи на мышах линии С57В1 с последующим введением селективного ингибитора ММП-9 были получены следующие результаты (табл.2).

Таблица 2

Показатели противоопухолевого воздействия

Группы животных Масса опухоли, г Средняя продолжительность жизни, дни Увеличение продолжительности жизни, % Торможение роста опухоли,% Некротические язвы, п

Контроль 4,8±1,13 23,8 ± 2,6 100

Опыт 3,69±0,95 32,6±6,3* 37 42,8±2,2 10*

Примечание.*- различия статистически значимы (р < 0,05) по отношению к

контролю.

Помимо увеличения продолжительности жизни у животных опытной группы вплоть до гибели в 10 % случаев визуально отмечалась некротизация первичной опухоли, в то время как в контрольной группе данное изменение регистрировалось в 100% случаев. Известно, что изъязвление меланомы кожи является неблагоприятным прогностическим признаком. Не было выявлено значимых различий в массе опухоли животных в изучаемых группах (р>0,05).

При оценке экспрессии РСКА в тканях опухолевого узла экспериментальных животных с помощью иммуногистохимического метода, было выявлено значимое уменьшение количества РСИА-положительных клеток в 2,2 раза. Данный факт является свидетельством снижения пролиферативной активности клеток меланомы, что согласуется с другими клинико-патоморфологическими изменениями, в том числе с увеличением

продолжительности жизни экспериментальных животных опытной группы (рис.6) 1201-------------------------------------------------------------------------,

X

Время после трансплантации опухали (сутки)

Рис.6 Выживаемость экспериментальных животных опухоленосителей в сравниваемых группах.

При оценке некротизации опухолевого узла животных визуальному осмотру подвергались макропрепараты опухолевого узла животных (рис.7), а также микропрепараты опухолевого узла экспериментальных животных, где изучались размер и взаиморасположение некротических зон. Таким образом, были выявлены следующие изменения: у животных контрольной группы зоны некроза образовывали между собой крупные сливные очаги (рис.8),в опытной группе животных очаги некроза были мелкими и множественными (рис. 9). Не было выявлено значимых различий в размерах зон некроза в зависимости от сроков гибели животных после перевивки опухоли (р>0,05).

Рис. 7

Рис. 8

Рис. 7. Макролрепарат опухолевого узла у животного контрольной группы.

Рис. 8. Микропрепарат опухолевого узла у животного контрольной группы. Окраска гематоксилин&эозин. Ув. х400.

Рис. 9. Микропрепарат опухолевого узла у животного опытной группы. Окраска гематоксилин&эозин. Ув. х400

Рис.9

При проведении оценки выраженности неоангиогенеза у экспериментальных животных отмечалось значимое уменьшение количества сосудов в опытной группе на 53,4 % (рис.10). При оценке средних диаметров сосудов в контрольной и опытной группах не было найдено статистически значимых различий (р>0,05). Стоит отметить, что неоангиогенез является важнейшим патогенетическим звеном, поддерживающим такие свойства опухолей как неограниченный инвазивный рост и метастазирование.

Рис.10. Изменения количества сосудов в опухоли животных после иншбирования ММП-9.

Примечание.*-р < 0,05 различия статистически значимы по отношению к контролю.

После проведенной трансплантации культуры клеток меланомы В16 опухоль развилась у всех животных опытной и контрольной групп. В ходе исследования было выявлено наличие метастазов в лёгких, печени и селезёнки. На микропрепарате у животных контрольной группы метастазы были обширными и носили сливной характер, в опытной группе они были менее обширными, носили очаговый характер, расположение

метастатических очагов в печени имело аналогичную тенденцию, характер метастазирования в селезёнке не изменился в изучаемых группах.

При оценке токсических эффектов ингибитора ММП-9 на организм животных регистрировалось отсутствие изменений окраски шерсти и состояния волосяных покровов, усиление двигательной активности, и не происходило снижение массы животных опытной группы во время введения селективного ингибитора ММП-9.

Наличие статистически значимого увеличения продолжительности жизни животных, наряду с улучшением внешнего вида животных (состояние шерсти и др.), улучшением аппетита, увеличением их двигательной активности после введения ингибитора ММП-9 может свидетельствовать о наличии антиметастатического эффекта у животных. Кроме того, в проведённом исследовании было выявлено уменьшение числа РСЛЧА+ клеток почти в 2 раза, по уменьшению данного маркера можно судить об уменьшении уровня пролиферативной активности у животных опытной группы. Цитостатический эффект был не значимым, поскольку показатель ТРО не достиг 50 % и сохранялся менее 7 дней, что говорит о том, что эффект был не стойким. Отсутствие цитостатического эффекта при ингибировании данного фермента при меланоме кожи может также подтверждать тот факт, что при проведении эксперимента с блокированием синтеза ММП-9 на культуре клеток меланомы, не привело к ожидаемой индукции апоптоза. В эксперименте с биомоделью меланомы кожи в процессе селективного ннгибирования ММП-9 нами был выявлен факт значимого снижения некротического изъязвления в опытной группе. Хотелось бы отметить, что площадь некротизации в опухолевом узле экспериментальных животных значимо не изменилась, но изменился характер некротических очагов, их расположение стало носить очаговый характер, в отличие от сливного характера расположения некротических очагов, наблюдаемого в контрольной группе.

ММП-9 играет важную роль во всех этапах опухолевой прогрессии, осуществляя деградацию структурных компонентов внеклеточного матрикса, а также регулирует такие процессы как, клеточная пролиферация, миграция и неоангиогенез. В связи с чем следует отметить, что ММП-9 является адекватной мишенью для терапии и диагностики меланомы кожи. Фармакологическое вмешательство, способное модулировать действие ММП-9, может иметь значительное влияние на способность опухолевых клеток к инвазии и метастазированию, тем самым значительно повысить общий результат лечения. ММП-9 может быть использована не только с целью диагностики, но и в качестве прогностического маркера глубины инвазии, риска развития метастазирования и, как следствие, исхода заболевания, что имеет большое значение в решении прикладных задач медицины.

выводы

1. Содержание ММП-9 в клетках меланомы кожи увеличивается по мере прогрессирования уровня инвазии по Кларку с максимальными значениями при IV-V уровне, а также в клетках метастазов меланомы кожи. Увеличение содержания ММП-9 происходит как в опухолевых клетках, так и в клетках окружающей стромы. В невусных клетках экспрессия ММП-9 в 3 раза ниже, чем в клетках меланомы кожи.

2. Экспрессия ММП-9 при меланоме кожи имеет обратную корреляцию (г = -0,87,р < 0,05) с концентрацией дермального коллагена в новообразовании, что свидетельствует о роли данного фермента в деструкции дермального коллагена и инвазивном росте самой опухоли.

3. Пролиферативная активность, а также способность клеток меланомы к инвазии снижается при ингибировашш ММП-9, что проявляется уменьшением экспрессии ядерного антигена пролиферирующих клеток и N-кадгерина в 2,5 и 3,5 раза соответственно; регистрируется уменьшение частоты и масштабов изъязвлений первичной опухоли в 10 раз. Это является свидетельством участия ММП-9 в регуляции процессов пролиферации и инвазивного роста.

4. Ингибирование ММП-9 в условиях in vivo приводит к развитию антиметастатического эффекта в экспериментальной модели меланомы кожи, что проявляется увеличением продолжительности жизни животных на 37%, снижением метастазирования в печень и селезёнку.

5. Количество сосудов в опухоли при ингибировании активности ММП-9 на биомодели меланомы кожи по данным морфометрического исследования снижается на 53,4 % по сравнению с контролем, тем самым, подтверждая участие ММП-9 в процессе неоангиогенеза, что может быть обусловлено прямым эффектом ММП-9 на пролиферацию эндотелиоцитов, с последующим уменьшением трофики. Регистрировалось изменение характера метастазирования в печени и селезёнке, где данный процесс стал носить очаговый характер.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Аксененко М.Б. Использование снаскоппи для современной дифференциальной диагностики меланоцитарных новообразований кожи / М.Б. Аксененко, Т.Г. Рукша, Н.Б. Толстихина, С.Р. Кузнецов // Сибирский журнал дерматологии и венерологии,- 2010 - № 11,- С. 6971.

2. Рукша Т.Г. Злокачественные новообразования кожи: анализ заболеваемости в Красноярском крае, проблемы профилактики и совершенствования ранней диагностики / Т.Г. Рукша, М.Б.Аксененко, С.Н. Гырылова // Вестник дерматологии и венерологии. - 2010. - №4,-С.4-9. ( Из списка ВАК)

3. Аксененко М.Б. Использование иммуногистохимического метода для оценки уровня экспрессии матриксной металлопроте1шазы-9 у пациентов с меланомой кожи / М.Б. Аксененко, Т.Г. Рукша // Актуальные проблемы клинической онкологии и преканцерогенеза: сбор, матер. 17-й науч. - практ,-Якутск.-2010,-С.159-161.

4. Аксененко М.Б. Моделирование меланомы кожи in vivo на инбредной линии мышей С57 В16 / М.Б. Аксененко, Т. Г. Рукша // Актуальные вопросы онкологии: сбор, матер, всеросс. научн. - практ. конф,- Красноярск,- 2010.- С.14-16.

5. Аксененко М.Б. Использование ингибитора матриксной металлопротеиназы-9 в качестве терапии меланомы кожи in vivo / М.Б. Аксененко, Т. Г. Рукша // Сибирский журнал дерматологии и венерологии,- 2011 -№ 12,- С. 76-77.

6. Аксененко М.Б. Применение ингибитора матриксной металлопротеиназы-9 в качестве экспериментальной терапии на модели меланомы кожи in vivo / М.Б. Аксененко, Т. Г. Рукша // Вопросы патогенеза типовых патологических процессов: сбор. ст. научн. - практ. конф.- Новосибирск.- 2011.- С.23-27.

7. Аксененко М.Б. Оценка уровня клеточной пролиферации после ингибирования матриксной металлопротеиназы-9 при меланоме кожи в эксперименте / М.Б. Аксененко // Материалы открытой межрегиональной научно-практической конференции молодых учёных и студентов с международным участием «Молодежь и медицинская наука в XXI веке»,- Киров,- 2011.- С. 123.

8. Аксененко М.Б. Матриксная металлопротеиназа-9 как потенциальная молекулярная мишень для терапии меланомы кожи / М.Б.Аксененко // Сибирский онкологический журнал.- 2011 .-Прил.№. 1.- С.8-9.

9. Сергиенко Т.Ф. Влияние ингибирования матриксной металлопротеиназы-9 на активность ферментов антиоксидантной системы в гомогенатах опухолевой ткани меланомы кожи / Т.Ф.

Сергиенко, Р.Н. Белоногов, М.Б. Аксененко // XVII межгородская конференция молодых учёных «Актуальные проблемы патофизиологии»: сб. материалов,- Санкт-Петербург, СГ16ГМУ.-2011,- С.146-148.

10. Аксененко М.Б. Особенности экспрессии матриксной металлопротеиназы-9 при меланоцитарных новообразованиях кожи / М.Б.Аксененко, Т.Г. Рукша, В.Д. Соколов, Т.В. Максимова // Российский журнал кожных и венерических болезней.-2011.-№4,-С.10-13. С Из списка ВАК)

11. Белоногов Р.Н. Изменение активности ферментов антиоксидантной системы, под воздействием ингибитора ММП-9 в биомодели меланомы кожи / Р.Н. Белоногов, М.Б. Аксененко, Т.Г. Рукша // Сборник статей юбилейной научно-практической конференции, посвященной 70-летию доктора медицинских наук, профессора Захарова Геннадия Алексеевича, «Актуальные проблемы патофизиологии».- Бишкек,- 2011.- С.131-135.

12. Аксененко М.Б. Использование спектрофотометрического интрадермального анализа для оценки состояния межклеточного матрикса у пациентов с доброкачественными меланоцитарными заболеваниями кожи / М.Б. Аксененко, Т.Г. Рукша // Научно-практическая конференция дерматовенерологов Центрального федерального округа РФ.: сб. материалов,- Москва,- 2011,- С. 37-40.

13. Аксененко М.Б. Применение сиаскопии для оценки выраженности патологических изменений в коже при развитии меланоцитарных новообразований / М.Б. Аксененко, Т.Г. Рукша, Н.Б. Толстихина, С.Р. Кузнецов // Вестник дерматологии и венерологии,- 2011.-№ 4,- С.31-36. ( Из списка ВАК)

14. Aksenenko М.В. Matrix metalloproteinase-9 inhibition application in melanoma cells/ M.B. Aksenenko, T.G.Ruksha //The 36 th Annual Meeting of the Japanese Society for Investigative Dermatology (December 9-11, 2011). - Kyoto, Japan,-2011 .-P. 196.

15. Аксененко М.Б. Изменение уровня N-кадгерина и PCNA клеток меланомы кожи опосредуется матриксной металлопротеиназой-9/ Аксененко М.Б., Гырылова С.Н., Рукша Т.Г.// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.-2012.-Т.153.-№3.-С.343-346. (Из списка ВАК)

16. Аксененко М.Б. Особенности метастазирования перевиваемой меланомы В16 после ингибирования активности ММП-9/Аксененко М.Б., Шестакова Л.А., Рукша Т.Г.// Сибирский онкологический журнал.-2012.-№1.-С.31-35. ( Из списка ВАК)

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В РАБОТЕ СОКРАЩЕНИЙ

ИГХ - иммуногистохимнческий МНК - меланоцитарные новообразования кожи ММП - матриксные металлопротеиназы ММП-9- матриксная металлопротеиназа-9

PCNA (proliferating cell nuclear ап(|'уеп)-ядернын антиген пролиферирующих клеток

siRNA (small interfering ribonucleic acid) - малые интерферирующие РНК

Соискатель

Аксененко М.Б.

На правах рукописи

АКСЕНЕНКО Мария Борисовна

РОЛЬ ПНГИБИ РОВАШ1Я МАТРИКСНОЙ МЕТАЛЛ ОПРОТЕИНАЗЫ-9 В РЕАЛИЗАЦИИ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ЭФФЕКТА В КЛЕТКАХ МЕЛАНОМЫ

КОЖИ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология 14.03.02 - патологическая анатомия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на синскание ученой степени кандидата медицинских наук Новосибирск - 2012

Подписано в печать 6.03.2012 Бумага офсетная 80г/м2 П.л. -1,0 Способ печати - оперативный заказ 11376, тираж 100

Отпечатано ООО ТПК "Старатель" г. Красноярск, ул.Марковского 43, т. 227-50-92